Αφηρημένο

Η αντι-φλεγμονώδης πρωτεΐνη αννεξίνης Α1 (ANXA1) έχει συσχετιστεί με τον καρκίνο εξέλιξη και μετάσταση, γεγονός που υποδηλώνει το ρόλο της στην ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού όγκου. Ερευνήσαμε το μηχανισμό της ANXA1 αλληλεπίδρασης με φορμυλιωμένο πεπτίδιο υποδοχέα 2 (FPR2 /ALX) στον έλεγχο, περιογκική και του λάρυγγα όγκου δείγματα ιστών από 20 ασθενείς, για να ποσοτικοποιηθεί η ουδετερόφιλα και ιστιοκύτταρα, και να αξιολογηθεί η έκφραση πρωτεΐνης και συν-εντοπισμό των ANXA1 /FPR2 σε αυτά τα φλεγμονώδη κύτταρα και λαρυγγική πλακώδη κύτταρα με ανοσοκυτταροχημεία. Επιπλέον, εκτελέσαμε πειράματα in vitro για την περαιτέρω διερεύνηση του λειτουργικού ρόλου του ANXA1 /FPR2 στον πολλαπλασιασμό και τη μετάσταση των κυττάρων Hep-2, μια κυτταρική γραμμή από καρκίνωμα λάρυγγα επιδερμοειδές, μετά από θεραπεία με ANXA1

2-26 (ανεξίνη Α1 Ν-τερματικό πεπτίδιο προερχόμενο), Βοο 2 (ανταγωνιστής του FPR) και /ή δεξαμεθαζόνη. Κάτω από αυτές τις θεραπείες, το επίπεδο του πολλαπλασιασμού Hep-2 κυττάρων, προ-φλεγμονώδεις κυτοκίνες, ANXA1 /FPR2 συν-εντοπισμό, και την σηματοδότηση προσταγλανδίνης αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ELISA, ανοσοκυτοχημεία και σε πραγματικό χρόνο PCR. Μια εισροή των ουδετερόφιλων και αποκοκκιωμένα μαστοκύτταρα ανιχνεύθηκε σε δείγματα όγκου. Σε αυτά τα φλεγμονώδη κύτταρα του περινεοπλασματικής και όγκων δειγμάτων, η έκφραση ANXA1 /FPR2 ήταν σημαντικά επιδεινώθηκε, ωστόσο, σε κύτταρα καρκινώματος του λάρυγγα, αυτή η έκφραση ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω. ANXA1

2-26 θεραπεία μείωσε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων Hep-2, μια επίδραση που έχει αποκλειστεί από Βοο 2, και επάνω ρυθμισμένη έκφραση ANXA1 /FPR2. ANXA1

2-26 αγωγή μείωσε επίσης τα επίπεδα της προ-φλεγμονωδών κυτοκινών και επηρέαζαν την έκφραση των μεταλλοπρωτεϊνασών και υποδοχέων ΕΡ, τα οποία εμπλέκονται στην σηματοδότηση προσταγλανδίνης. Συνολικά, αυτή η μελέτη προσδιόρισε δυνητικούς ρόλους για τον μοριακό μηχανισμό του /FPR2 αλληλεπίδραση ANXA1 στο λάρυγγα του καρκίνου, συμπεριλαμβανομένης της σχέσης της με την οδό προσταγλανδίνης, παρέχοντας πολλά υποσχόμενη αφετηρία για μελλοντική έρευνα. ANXA1 μπορεί να συμβάλλει στη ρύθμιση της ανάπτυξης του όγκου και της μετάστασης μέσω παρακρινούς μηχανισμών που διαμεσολαβούνται από FPR2 /ALX. Τα στοιχεία αυτά μπορεί να οδηγήσουν σε νέες βιολογικές στόχους για θεραπευτική παρέμβαση σε ανθρώπινο καρκίνο του λάρυγγα

Παράθεση:. Gastardelo TS, Cunha BR, Raposo LS, Maniglia JV, Cury μμ, Lisoni FCR, et al. (2014) Φλεγμονή και Καρκίνος: Ο ρόλος της αννεξίνης Α1 και FPR2 /ALX στον πολλαπλασιασμό και μετάσταση στο Ανθρώπινο λάρυγγα πλακωδών κυττάρων καρκίνωμα. PLoS ONE 9 (12): e111317. doi: 10.1371 /journal.pone.0111317

Επιμέλεια: Hiroshi Miyazaki, Βιρτζίνια Πανεπιστήμιο της Κοινοπολιτείας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 6 Δεκεμβρίου 2013? Αποδεκτές: 30 Σεπτεμβρίου, 2014? Δημοσιεύθηκε: 9 Δεκεμβρίου 2014

Copyright: © 2014 Gastardelo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Fundação de Amparo à Pesquisa κάνει Estado de São Paulo – FAPESP (επιχορηγήσεις 2008 /08187-4 σε ΠΕΑ και 2008 /01655-2 για ΕΠΠΕ) και Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Τεχνολογικό – CNPq (επιχορήγηση 302.768 /2010- 6 έως ΠΕΑ). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνο του λάρυγγα είναι ένα από τα πιο κοινά είδη καρκίνου κεφαλής και τραχήλου, που έχει υψηλό ποσοστό θνησιμότητας και κακή πρόγνωση [1]. Περισσότερες από 12.500 νέες περιπτώσεις καρκίνου του λάρυγγα διαγιγνώσκονται κάθε χρόνο και να παρουσιαστεί 3560 ετήσιων θανάτων [2]. Η ανάπτυξη της καλύτερης θεραπείας, καθώς και καλύτερες διαγνωστικές και προληπτικές προσεγγίσεις απαιτεί μια βελτιωμένη κατανόηση της πολύπλοκης διαδικασίας της λάρυγγα ογκογένεσης.

Μόνο το 5% έως 10% όλων των καρκίνων προκαλούνται από την κληρονομιά των μεταλλαγμένων γονιδίων, ενώ το υπόλοιπο 90% έως 95% των περιπτώσεων έχουν συνδεθεί με γενετικές και επιγενετικές μεταβολές που προκαλούνται από τον τρόπο ζωής και περιβαλλοντικούς παράγοντες, όπως το κάπνισμα τσιγάρων και αλκοόλ [3], [4]. Είναι πλέον γνωστό ότι η φλεγμονή είναι ένας παράγοντας κινδύνου για τους περισσότερους τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων των καρκινωμάτων του λάρυγγα [5], [6]. Η χρόνια φλεγμονή έχει συνδεθεί με διάφορα βήματα που εμπλέκονται στην ογκογένεση, συμπεριλαμβανομένων κυτταρικό μετασχηματισμό, την προώθηση, τον πολλαπλασιασμό, την εισβολή, αγγειογένεση, μετάσταση και [7], [8]. Hanahan και Weinberg, σε πρόσφατη ανασκόπηση τους [9], η οποία αναγνωρίζεται φλεγμονή ως ένα νέο χαρακτηριστικό γνώρισμα του καρκίνου που προωθεί πολλαπλές λειτουργίες του όγκου.

Τα φλεγμονώδη κύτταρα εκκρίνουν πολλές κυτοκίνες, χημειοκίνες και αυξητικοί παράγοντες που μπορούν να διεγείρουν τον πολλαπλασιασμό, αναστέλλουν την απόπτωση, επάγουν μορφογένεση και παράγουν δραστικά είδη οξυγόνου προκαλούν βλάβη στο DNA [7], διευκολύνοντας γενωμική αστάθεια [10]. Επιπλέον, αυτά τα κύτταρα συνθέτουν αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF), angiopoetin, μεταλλοπρωτεϊνασών και άλλων πρωτεϊνών που μπορούν να διεγείρουν αγγειακή μίτωση των ενδοθηλιακών κυττάρων και εξωκυττάριας μήτρας αναδιαμόρφωση [11]. Ως εκ τούτου, η φλεγμονή παράγει όχι μόνο τις αλλαγές στο μικροπεριβάλλον για την προώθηση του καρκίνου, αλλά και τις αλλαγές που διεγείρουν νεοπλασματικών εξέλιξη.

Έχει αποδειχθεί ότι τα μαστοκύτταρα και τα ουδετερόφιλα μπορούν να προσλαμβάνονται από τα κύτταρα του όγκου. Οι αυξημένοι αριθμοί των μαστοκυττάρων έχουν αναφερθεί σε μαστικούς [12] και καρκινώματα του πνεύμονα [13], μεταξύ άλλων όγκων. Πειραματική απόδειξη έδειξε ότι ενεργοποιημένα μαστοκύτταρα απελευθερώνουν αγγειογόνους αυξητικούς παράγοντες και ρυθμιστές, προσταγλανδίνη, μεταλλοπρωτεϊνάσες και κυτοκίνες [14], και μπορεί να παίζει ένα διπλό ρόλο στην προαγωγή ή την αναστολή της ανάπτυξης του όγκου ανάλογα με τις τοπικές συνθήκες στρωματικά [15], [16]. Από τους τύπους κυττάρων που κατοικούν στο μικροπεριβάλλον του όγκου, ουδετερόφιλα σχετίζονται με τον όγκο (μαυρίζει) έχουν λάβει λίγη προσοχή [17]. Αν και υπάρχουν στοιχεία που δείχνουν ένα ρόλο για τα ουδετερόφιλα στην ενισχυμένη εξέλιξη της νόσου σε συγκεκριμένους ανθρώπινους όγκους, η σχέση μεταξύ της διείσδυσης των ουδετερόφιλων και την πρόγνωση στον καρκίνο του ανθρώπου δεν έχει ερευνηθεί συστηματικά [18]. Ο ρόλος των ουδετερόφιλων στην πρόοδο του όγκου παραμένει αμφιλεγόμενη [19] σε μεγάλο βαθμό επειδή τα κύτταρα αυτά έχουν τόσο προαγωγής όγκων και ογκοκτόνο λειτουργίες ανάλογα με την παρουσία του αυξητικού παράγοντα μετασχηματισμού βήτα (ΤΟΡ-β) [20], [21].

Από τις μελέτες αυτές, είναι σαφές ότι διάφορες φλεγμονώδεις μεσολαβητές εκφράζονται διαφορικά σε διάφορα καρκίνους και μπορεί να διεγείρει εξέλιξη της νόσου [22]. Έτσι, παράγοντες που καταστέλλουν αυτούς τους φλεγμονώδεις μεσολαβητές εκπροσωπούν τους δυνητικούς στόχους για την θεραπεία του καρκίνου. Η αντι-φλεγμονώδης πρωτεΐνη αννεξίνης 1 (ANXA1), ένα μέλος 37 kDa της υπεροικογένειας αννεξίνης, είναι ένα στεροειδές-ρυθμιζόμενη πρωτεΐνη που εμπλέκεται στη διαμεσολάβηση μερικά από τα ευεργετικά δραστηριότητες των γλυκοκορτικοειδών [23], συμπεριλαμβανομένης της ρύθμισης του κυτταρικού πολλαπλασιασμού [ ,,,0],24], η διαφοροποίηση [25] και τη μετάσταση [26].

Δυσλειτουργία του ANXA1 έχει αναφερθεί σε πολλές νεοπλάσματα, υποδηλώνοντας ότι αυτή η πρωτεΐνη μπορεί να παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και την εξέλιξη [27] του όγκου. ANXA1 υπερεκφράζεται στον καρκίνο του μαστού [28] και ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [29], αλλά είναι σαφώς κάτω-ρυθμίζονται σε οισοφαγικό [30], [31] και κεφαλής και λαιμού καρκίνωμα [32]. Ωστόσο, οι μοριακοί μηχανισμοί με τους οποίους ANXA1 ρυθμίζει τις κυτταρικές απαντήσεις δεν έχουν πλήρως καθοριστεί.

Προκαταβολές σε αυτόν τον τομέα έχουν δείξει μια λειτουργική σχέση μεταξύ των αντι-φλεγμονώδεις ιδιότητες των ANXA1 και υποδοχέα για φορμύλιο-Met-Leu-Phe (fMLP) FPR [33], μια ειδική κατηγορία συζευγμένου με πρωτεΐνη 7-διαμεμβρανικών υποδοχέων [34]. Στους ανθρώπους, έχουν τρία μέλη της οικογένειας έχουν ταυτοποιηθεί, FPR1, FPR2 /ALX (FPRL1) και FPR3 (FPRL2) [35]. Μερικά από τα αποτελέσματα των εξωγενών ANXA1 μπορεί να ελαττωθεί με Βοο 2, έναν ανταγωνιστή αμφοτέρων FPR1 και FPR2 [33]. Πρόσφατα, έχει δειχθεί ότι η ANXA1 Ν-τερματικό πεπτίδιο, ANXA1

2-26, προωθεί την μετανάστευση των WS1 ινοβλάστες ανθρώπινου δέρματος [36], και την ικανότητα εισβολής των SKCO-15 ορθοκολικού κύτταρα αδενοκαρκινώματος [24] μέσω της αλληλεπίδρασης με FPRs. Ωστόσο, δεν υπάρχουν διαθέσιμα στοιχεία σχετικά με το ρόλο των ANXA1 και FPRs στο λάρυγγα ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα.

Πολλά μονοπάτια σηματοδότησης διαμεσολαβεί για την φλεγμονή που σχετίζεται με ογκογένεση. Για παράδειγμα, της κυκλοοξυγενάσης-2 (COX-2), ένα ένζυμο που εμπλέκεται στη μετατροπή του αραχιδονικού οξέος σε προσταγλανδίνες, θεωρείται ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου με ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και άλλες σημαντικές βιολογικές διεργασίες μέσω των μεταβολιτών τους, συζευγμένου με πρωτεΐνη υποδοχείς και κατάντη επενεργητές [37]. COX-2 είναι πάνω ρυθμισμένα σε διάφορες κακοήθειες [38] – [40], συμπεριλαμβανομένων κεφαλής και λαιμού καρκίνωμα [41]. Στην πραγματικότητα, Abrahao et al. (2010) έδειξαν ότι η προ-φλεγμονώδης COX-2 μεταβολίτη προσταγλανδίνη Ε2 και του υποδοχέα ΕΡ3 του μπορεί να ενεργοποιήσει το κεφάλι και το λαιμό καρκινώματος κύτταρα να πολλαπλασιάζονται και είναι ένας πιθανός στόχος για προληπτικών προσεγγίσεων. Λαμβάνοντας υπόψη ότι τα γλυκοκορτικοειδή είναι ιδιαίτερα αποτελεσματικοί αναστολείς της COX-2 έκφρασης [42], το στεροειδές ρυθμιζόμενη Α1 πρωτεΐνη αννεξίνης, η οποία εμπλέκεται στη διαμεσολάβηση μερικές από τις δραστηριότητες των γλυκοκορτικοειδών, μπορεί επίσης να εμπλέκεται στη φλεγμονώδη δίκτυο που συνδέεται με την COX-2.

Δεδομένου ο πιθανός ρόλος για ANXA1 σε πολλαπλές νεοπλάσματα όπως η ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, της διαφοροποίησης και μετάσταση, εστιάσαμε στους μοριακούς μηχανισμούς με τους οποίους ANXA1 διαμορφώνει αυτές τις κυτταρικές αποκρίσεις. Στην έκθεση αυτή, δείξαμε ότι ANXA1 πρωτεΐνη ρυθμίζεται προς τα κάτω σε καρκίνωμα του λάρυγγα και μπορεί να ρυθμίσει την ανάπτυξη του όγκου σε ένα παρακρινή τρόπο που διαμεσολαβείται από τον υποδοχέα FPR2 /ALX. Αυτή η έρευνα καταδεικνύει τη δυνητική σημασία αυτού του ANXA1 /FPR2 αλληλεπίδραση στην ογκογένεση. Συνολικά, αυτή η μελέτη προσδιόρισε δυνητικούς ρόλους για τον μοριακό μηχανισμό της πρωτεΐνης αυτής της αλληλεπίδρασης στο λάρυγγα του καρκίνου, συμπεριλαμβανομένης της σχέσης της με την οδό προσταγλανδίνης, παρέχοντας στοιχεία για το δυναμικό της ANXA1 ως θεραπευτικό στόχο και ελπιδοφόρα αφετηρία για μελλοντική έρευνα.

Υλικά και Μέθοδοι

τα δείγματα ιστών

Ανθρώπινο επεμβατική λάρυγγα καρκινικούς ιστούς ελήφθησαν από 20 ασθενείς με λάρυγγα πλακώδες καρκίνωμα που έλαβαν στο Νοσοκομείο de Βάση στο São José do Rio Preto, Βραζιλία . Οι ασθενείς ήταν άνδρες, τα αλκοολούχα καπνιστές, η ηλικία τους κυμαινόταν από 50 έως 80 χρόνια, και κανένας από αυτούς δεν είχαν λάβει ακτινοθεραπεία ή χημειοθεραπεία πριν την επέμβαση. Σε κάθε ασθενή (n = 20), οι χειρουργικές δείγματα όγκου συλλέχθηκαν από το κέντρο του λαρυγγικού όγκου, περινεοπλαστικό δείγματα συλλέχθηκαν από την περιφέρεια του όγκου, και τα δείγματα ελέγχου συλλέχθηκαν από την περιοχή ελεύθερη κυττάρων όγκου. Λόγω της υψηλής ετερογένειας του καρκινώματος του λάρυγγα, οι ιστοί του όγκου αποκόπηκαν και επανεξετάζονται από έναν ανώτερο παθολόγο και χαρακτηρίστηκαν ως μετρίως διαφοροποιημένων, διηθητικά καρκινώματα. Αυτά τα δείγματα ιστού χρησιμοποιήθηκαν σε μια προηγούμενη μελέτη που διεξήχθη στο εργαστήριο μας, και ο αριθμός των ασθενών ήταν επαρκής για να ληφθεί στατιστικώς σημαντικά δεδομένα [32]. Το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από την Επιτροπή Ηθικής στην Έρευνα της Ομοσπονδιακό Πανεπιστήμιο του Σάο Πάολο, της Ιατρικής Σχολής, Βραζιλία (CEP-0300/08), και γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς που συμμετέχουν.

Cell Culture

Η κυτταρική γραμμή Hep-2, η οποία δημιουργήθηκε αρχικά από μία επιδερμοειδούς καρκινώματος του λάρυγγα, χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα μελέτη (ATCC, Rockville, Maryland, USA). ταυτότητας της γραμμής κυττάρων έγινε με τη χρήση του AmpFLSTR Identifiler Ενίσχυση PCR Kit (Life Technologies) στο Εργαστήριο ειδικές τεχνικές, Νοσοκομείο Israelita Άλμπερτ Αϊνστάιν (τέλη -HIAE), Σάο Πάολο. Βρήκαμε 100% ταυτότητα του κυτταρικής γραμμής μας σε σχέση με τη βάση δεδομένων American Type Culture Collection (ATCC). Τα κύτταρα εμβολιάστηκαν σε πυκνότητα 2 × 10

6 κυττάρων σε ένα εκατοστό 75

φιάλη καλλιέργειας 2 (Corning, ΝΥ, USA) και επωάστηκαν σε μέσο ΜΕΜ-Earle (Cultilab, Campinas, SP, Βραζιλία) , ρΗ 7,5, συμπληρωμένο με ορό 20% εμβρυϊκό ορό (Cultilab), 1% μη απαραίτητα αμινοξέα, και 0,1% αντιβιοτικό /αντιμυκητιακό διάλυμα (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA), στους 37 ° C σε υγρή ατμόσφαιρα 5% CO

2 [43].

Drug Θεραπεία

Για τους φαρμακολογικά πειράματα, Hep-2 κύτταρα σπάρθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Είκοσι-τέσσερις ώρες αργότερα, αφού τα κύτταρα είχαν ήδη προσκολληθεί, επωάστηκαν σε μέσο ελεύθερο ορού για τον συγχρονισμό του κυτταρικού κύκλου. Μετά επιπλέον 24 ώρες, το μέσο αντικαταστάθηκε με πλήρες μέσο ανάπτυξης που περιέχει τα ακόλουθα: (α) 1 μΜ ANXA1

2-26 πεπτίδιο (Ac-AMVSEFLKQAWFIENEEQEYVQTVK) (Invitrogen)? (Β) 1 μΜ ANXA1

2-26 πεπτίδιο και 10 μΜ Βοο 2, ένα μη επιλεκτικό ανταγωνιστή FPR (Ν-t-BOC-met-leu-Phe) (ΜΡ Biomedicals, Aurora, ΟΗ)? (Γ) 0,01 μΜ δεξαμεθαζόνη (γλυκοκορτικοειδή? Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ, USA)? (Δ) 0,01 μΜ δεξαμεθαζόνη και 10 μΜ Βοο 2? ή (ε) 10 μΜ Βοο 2 μόνο. Τα φάρμακα διαλύθηκαν πρώτα σε μικρές ποσότητες διμεθυλοσουλφοξειδίου (DMSO) και κατόπιν αραιώθηκαν σε μέσο (η τελική συγκέντρωση του DMSO δεν υπερέβη ποτέ το 1%). επιλεγμένα Οι συγκεντρώσεις των φαρμάκων βασίστηκαν σε προκαταρκτικά πειράματα και τα δεδομένα της βιβλιογραφίας [32], [44]. Τα κύτταρα μάρτυρες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με πλήρες μέσο με την ίδια συγκέντρωση του DMSO που χρησιμοποιείται για την αραίωση των φαρμάκων. Κάθε 2 ημέρες, το μέσο αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο που περιείχε τα φάρμακα στην ίδια δόση? η κυτταρική μορφολογία παρατηρήθηκε κάθε ημέρα [43]. Μετά από 6, 24, 48, 72 και 96 ώρες, τον έλεγχο και τα επεξεργασμένα κύτταρα συλλέχθηκαν και μετρήθηκαν με τη χρήση του μετρητή κυττάρων κοντέσα Αυτοματοποιημένο (Invitrogen).

Σταθεροποίηση, Επεξεργασία και Ενσωμάτωση για Φως και Ηλεκτρονικής Μικροσκοπίας

δείγματα λάρυγγα και των κυττάρων Hep-2 σταθεροποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη, 0,5% γλουταραλδεΰδη, και ρυθμιστικό διάλυμα κακοδυλικού 0,1 mol /L νάτριο (ρΗ 7.4) για 24 ώρες στους 4 ° C, πλύθηκαν σε κακοδυλικό νάτριο, αφυδατώθηκαν μέσω διαβαθμισμένης ποσοστά αιθανόλης, και ενσωματωμένα σε LRGold (London Resin Co., Reading, UK). Για ιστοπαθολογική και μορφολογικές αναλύσεις, ιστικές τομές (πάχους 0.5-μm) κόπηκαν σε υπερμικροτόμο (Reichert Ultracut? Leica, Αυστρία), βάφονται με 1% μπλε τολουϊδίνης σε διάλυμα βόρακα 1% (TAAB Laboratories, Aldermaston, UK) και εξετάστηκε χρησιμοποιώντας ένα Axioskop 2-Mot Plus ZEISS μικροσκόπιο (Carl Zeiss, Jena, Germany). Για ηλεκτρονική μικροσκοπία, τα τμήματα (-90 nm) κόπηκαν σε υπερμικροτόμου και τοποθετήθηκαν σε πλέγματα νικελίου για την επισήμανση immunogold [45].

ανοσολογική επισήμανση των μετα-ενσωματωμένο ιστούς

αντίδραση Ανοσοκυτοχημεία (διπλό σήμανση) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση της έκφρασης και συν-εντοπισμό των ANXA1 και FPR2 /ALX σε ιστιοκύτταρα, ουδετερόφιλα και κύτταρα ελέγχου και όγκων από ιστούς του λάρυγγα και Hep-2 κυττάρων.

Τα κύτταρα Hep-2 ήταν επωάστηκαν με μέσο ελέγχου, ANXA1

2-26 και ANXA1

2-26 + Βοο 2. Μετά από 48 ώρες, η καλλιέργεια συλλέχθηκε και τα κύτταρα ενσωματώνονται σε LRGold ρητίνη για ανοσοκυτταροχημική ανάλυση. Υπέρλεπτων τμήματα ιστών του λάρυγγα και των κυττάρων Hep-2 επωάστηκαν σε ένα βήμα-βήμα τρόπο χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα αντιδραστήρια και /ή συνθήκες σε θερμοκρασία δωματίου: 1) απεσταγμένο νερό? 2) ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού 0,1 mol /l που περιέχει 1% αλβουμίνη αυγού (PBEA)? 3) 0,1 mol /L PBS που περιέχει 5% PBEA για 30 λεπτά? 4) LCPS1 πολυκλωνικό αντίσωμα προβάτου, που εγείρεται έναντι του Ν-τερματικού τμήματος του ANXA1 (1:500 σε PBEA) και πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού FPR2 /ALX (Abcam, Cambridge, UK) (1:500 σε PBEA) για 2 ώρες? κανονική πρόβατα και κουνέλια οροί χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος (1:500)? 5) τρεις εκπλύσεις σε PBEA περιέχει 0,01% Tween 20? 6), γάιδαρο IgG αντι-προβάτου (Fc θραύσμα ειδικό) αντίσωμα (1:100 σε PBEA) συζευγμένο με 15 nm κολλοειδούς χρυσού (British Biocell, UK) προστέθηκε για να ανιχνεύσει ANXA1, και κατσίκα αντι-κουνελιού IgG (Fc θραύσμα -ειδικές) αντίσωμα (1:100 σε PBEA) συζευγμένο με 10 nm κολλοειδούς χρυσού (British Biocell) προστέθηκε για να ανιχνεύσει FPR2 /ALX). Μετά από 1 ώρα, οι τομές πλύθηκαν σε PBEA που περιέχει 0.01% Tween 20, και στη συνέχεια σε απεσταγμένο νερό [46]. Οι τομές χρωματίστηκαν με οξικό ουρανύλιο και κιτρικό μόλυβδο πριν από την εξέταση σε ένα ZEISS LEO 906 ηλεκτρονικό μικροσκόπιο (Carl Zeiss, Jena, Germany).

Multiplex Αναλύσεις

Για να ποσοτικοποιηθούν οι προ-φλεγμονώδεις κυτοκίνες ιντερλευκίνες 6 (IL-6) και IL-8, καθώς και χημειοτακτικής πρωτεΐνης μονοκυττάρων-1 (MCP-1), στα υπερκείμενα Hep-2 κυτταρική καλλιέργεια, χρησιμοποιήσαμε την πολυπλεξία όργανο Luminex xMAP MAGPIX (Millipore Corporation, Billerica, ΜΑ, USA) . Τα κύτταρα επωάστηκαν με μέσο ελέγχου, ANXA1

2-26, ANXA1

2-26 + Βοο 2, Δεξά, Δεξά + Βοο 2 ή Βοο 2. Μετά από 48 ώρες επεξεργασίας, τα υπερκείμενα καλλιέργειας απομακρύνθηκαν, φυγοκεντρήθηκαν και αποθηκεύτηκαν στους -20 ° C. Αντίσωμα χάντρες, ελέγχου, ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης, μήτρα ορού και πρότυπα παρασκευάσθηκαν ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή (κιτ MILLIPLEX HCYTOMAG-60Κ). Στη συνέχεια, 200 μι ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο μιας μαγνητικής πλάκας 96 φρεατίων και αναμείχθηκαν σε έναν αναδευτήρα για 10 λεπτά. Το ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης αποχύθηκε, και 25 μΙ προτύπων, ελέγχων και δείγματα προστέθηκαν στα φρεάτια. Στη συνέχεια, 25 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος προσδιορισμού προστέθηκε στα δείγματα, και 25 μΙ μήτρας ορού προστέθηκε στα πρότυπα. Τέλος, 25 μΐ μαγνητικών σφαιριδίων (επικαλυμμένα με ένα ειδικό αντίσωμα σύλληψης) προστέθηκε σε όλα τα φρεάτια και επωάστηκαν για μία νύχτα σε 4 ° C σε έναν αναδευτήρα. Την επόμενη μέρα, η πλάκα πλύθηκε με ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης και επωάστηκαν με 25 μΙ αντισώματα ανίχνευσης για 1 ώρα σε συσκευή ανακίνησης. Στη συνέχεια, 25 μλ στρεπταβιδίνη-φυκοερυθρίνη προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκαν για 30 λεπτά σε αναδευτήρα. Η πλάκα πλύθηκε και επωάστηκε με 150 μΐ του ρευστού κίνησης για 5 λεπτά σε αναδευτήρα. Τέλος, η πλάκα αναλύθηκε χρησιμοποιώντας MAGPIX με το λογισμικό xPONENT [47].

Real-time PCR

Τα κύτταρα Hep-2 επωάστηκαν με μέσο ελέγχου, ANXA1

2-26 ή ANXA1

2-26 + Βοο 2 και συλλέχθηκαν μετά από 48 ώρες. Ολικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Το γονιδιωματικό DNA απομακρύνθηκε με κατεργασία ϋΝάσης σύμφωνα με την περιγραφή του κατασκευαστή (Promega). Κλάσματα (2 μα) του ολικού RNA από τον έλεγχο και τα επεξεργασμένα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για την σύνθεση δίκλωνου cDNA χρησιμοποιώντας High Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τέσσερις διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων (

ΕΡ3

ή

PTGER3

,

EP4

ή

PTGER4

,

ΜΜΡ2

και

MMP9

) επιλέχθηκαν για ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου πειράματα σύμφωνα με την άμεση ή έμμεση συμμετοχή τους σε φλεγμονώδεις και μεταστατικές διαδικασίες που βασίζονται στη βάση δεδομένων Gene Ontology (https://www.geneonthology.org/). Real-time PCR πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν χρησιμοποιώντας μια 7500 Fast PCR Πραγματικού χρόνου System (Applied Biosystems). Το μίγμα της αντίδρασης αποτελούνταν από ένα 20-μΙ συνολικός όγκος διαλύματος που περιέχει 10 μΙ Ισχύος SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems), ένα 1 μΜ διάλυμα του κάθε εκκινητή και 20 ng του cDNA. Οι συνθήκες PCR ήταν 50 ° C για 2 λεπτά και 95 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 40 κύκλους των 95 ° C για 15 s και 60 ° C για 1 λεπτό. Ανάλυση καμπύλης τήξης διεξήχθη για κάθε γονίδιο να ελέγχει την ειδικότητα και την ταυτότητα των προϊόντων RT-PCR. Για κάθε σετ εκκινητή, η βελτίωση της αποτελεσματικότητας της PCR σε πραγματικό χρόνο (Ε) μετρήθηκαν εις τριπλούν σε διαδοχικές αραιώσεις του ίδιου δείγματος cDNA χρησιμοποιώντας τον τύπο Ε = [10 (-1 /κλίση)]. Οι προκύπτουσες τιμές κυμαίνονται 1,96 – 2,02. Κάθε επίπεδο μεταγραφής κανονικοποιήθηκε προς το εσωτερικό πρότυπο

GAPDH

, και οι τιμές ήταν Log2-μετασχηματισμένα (άξονας γ), έτσι ώστε όλα τα παρακάτω -1 τιμές που υποδεικνύονται κάτω ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης, ενώ τιμές πάνω από 1 εκπροσωπούμενη πάνω ρύθμιση σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου [43].

Στατιστική Ανάλυση

οι τιμές που αφορούν την ποσοτικοποίηση των μαστοκυττάρων και των ουδετερόφιλων των δειγμάτων ιστού in vivo εκφράστηκαν ως η μέση τιμή ± SEM του ο αριθμός των κυττάρων ανά mm

2 σε τρία τμήματα του 0.5 μm (αφήνοντας ένα διάστημα 40 μm μεταξύ κάθε τμήματος) για κάθε ασθενή (n = 20 ασθενείς).

Hep-2 κύτταρα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ο μετρητής κυττάρων κοντέσα Αυτοματοποιημένο (Invitrogen). Η συγκέντρωση των κυτοκινών προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό MAGPIX Xponent (Millipore Corporation). Η in vitro αναλύσεις επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές.

Ο υπερδομικές και ανοσοκυτταροχημεία έκφραση ANXA1 και FPR2 προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας δέκα κύτταρα για κάθε ομάδα διερευνηθεί. Η περιοχή του κάθε διαμερίσματος κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό απεικόνισης Axiovision (Zeiss). Στον πυρήνα και το κυτταρόπλασμα, η πυκνότητα του σωματίδια κολλοειδούς χρυσού υπολογίστηκε ως η μέση τιμή ± SEM για τον αριθμό των σωματιδίων ανά μm

2. Στην μεμβράνη πλάσματος, η πυκνότητα του σωματίδια κολλοειδούς χρυσού υπολογίστηκε ως η μέση τιμή ± SEM για τον αριθμό των σωματιδίων ανά μm.

Οι σημαντικές διαφορές μεταξύ των μέσων προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας ανάλυση της διακύμανσης. Η δοκιμή αυτή ακολουθήθηκε από το τεστ post-hoc Bonferroni σε επιλεγμένες πειραματικές ομάδες χρησιμοποιώντας Graph-Pad Prism 4.0 (Graph-Pad, San Diego, CA, USA). Μια τιμή πιθανότητας μικρότερη από 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα

Η παρουσία του αποκοκκοποιημένα Mast κύτταρα και την εισροή των ουδετερόφιλων Δείχνει Φλεγμονή στο μικροπεριβάλλον του όγκου

Για να επαληθεύει την αλληλεπίδραση των φλεγμονωδών κυττάρων με λαρυγγική κύτταρα όγκου, πραγματοποιήσαμε ιστολογικών αναλύσεων σε δείγματα ιστών λάρυγγα να ποσοτικοποιηθούν τα μαστοκύτταρα και τα ουδετερόφιλα, σημαντικά κύτταρα της φλεγμονώδους απόκρισης. Σε δείγματα ελέγχου, παρατηρήσαμε άθικτα μαστοκύτταρα με μεταχρωματική κόκκους πολύ κοντά σε αιμοφόρα αγγεία (Εικ. 1Α). Στην περινεοπλαστικό και όγκου στρώματος, επαληθεύσαμε την παρουσία αποκοκκιωμένα ιστιοκυττάρων (Σχ. 1, Β και C). Επιπλέον, παρατηρήσαμε ουδετερόφιλα που είχαν transmigrated σε τμήματα του όγκου (Εικ. 1ϋ).

(Α-Δ) Αντιπροσωπευτικές εικόνες (αρχική μεγέθυνση, × 63) του Μπλε Τολουϊδίνης-χρωματισμένες τομές ιστού από δείγματα του λάρυγγα. (Α) Ο έλεγχος του δείγματος λάρυγγα δείχνει ανέπαφα τα σιτευτικά κύτταρα (βέλη καμπύλη) κοντά στα αιμοφόρα αγγεία. Περινεοπλασματικής (Β) και του όγκου (Γ) δείγματα με αποκοκκιωμένα μαστοκύτταρα (βέλη ανοιχτό καμπύλη). (D) τα καρκινικά κύτταρα με μιτωτική δραστηριότητα (ανοιχτό βέλος) και φλεγμονώδη κύτταρα, όπως ουδετερόφιλα εξωαγγειακή (βέλη). (Ε) Συνολικός αριθμός των μαστοκυττάρων. (F) άθικτη και αποκοκκιωμένα σιτευτικά κύτταρα. (G) Συνολικός αριθμός των ουδετερόφιλων. (H) Extra και ενδοαγγειακή ουδετερόφιλα. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SEM για τον αριθμό των κυττάρων ανά mm

2 (n = 20 ασθενείς ανά ομάδα). Η μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από δοκιμή Bonferroni αποκάλυψαν μια σημαντική διαφορά μεταξύ των ομάδων. ***

P

& lt? 0.001

vs

ελέγχου, ###

P

& lt?.. 0,001

vs

περινεοπλαστικό. Ράβδοι κλίμακας:. 5 μm

Η

Η στατιστική ανάλυση έδειξε ότι υπήρχαν υψηλοί αριθμοί των μαστοκυττάρων στα τμήματα ελέγχου του λάρυγγα και σημαντικά λιγότερα μαστοκύτταρα στο περινεοπλαστικό και του όγκου των περιφερειών (

P

& lt? 0.001? Σχ. 1Ε). Επιπλέον, άθικτα τα σιτευτικά κύτταρα ήταν πιο πλούσια σε δείγματα ελέγχου και σημαντικά χαμηλότερη σε περινεοπλασματικής και όγκου τμήματα (

P

& lt? 0.001? Εικ. 1F). Χρησιμοποιώντας ποσοτική ανάλυση των ουδετερόφιλων, διαπιστώσαμε ότι υπήρξε μια σημαντική αύξηση σε αυτά τα κύτταρα στους ιστούς όγκου (

P

& lt? 0.001) σε σύγκριση με τον έλεγχο και την περιογκική ιστούς (Εικ 1G.). Η εξέταση των ουδετερόφιλων στον έλεγχο και περιογκική τμήματα έδειξε ότι τα περισσότερα από αυτά τα κύτταρα εντοπίστηκαν στα αιμοφόρα αγγεία (Εικ. 1). Αντίθετα, στα δείγματα όγκου, παρατηρήσαμε ένα σημαντικό αριθμό transmigrated ουδετερόφιλων στο στρώμα (

P

& lt? 0.001 σε σύγκριση με τον έλεγχο και την περιογκική δείγματα). (Εικ. 1)

Up -Κανονισμός του ANXA1 /FPR2 στην φλεγμονώδη κύτταρα ανθρώπινης λαρυγγικό Όγκων

Υπερδομική ανοσοκυτταροχημεία έδειξε για πρώτη φορά η έκφραση του FPR2 /ALX και συν-εντοπισμό της με ANXA1 σε ιστιοκύτταρα (Σχ. 2, Α- ΝΤΟ). Τα μαστοκύτταρα και τα ουδετερόφιλα εμφανίζονται ANXA1 και FPR2 /ALX ανοσοαντιδραστικότητα στην πλασματική μεμβράνη, κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα (Εικ. 2, Α-Ρ). Δεν επισήμανση immunogold ανιχνεύθηκε σε τομές που επωάστηκαν με μη άνοσο ορό (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σε αυτά τα φλεγμονώδη κύτταρα, επαληθεύσαμε μια σημαντική προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης ANXA1 και FPR2 /ALX στις περινεοπλασματικής και όγκων δειγμάτων σε σύγκριση με τα αντίστοιχα ιστούς ελέγχου (Εικ. 2, G-L).

ανοσοσήμανση με 10 -nm (FPR2 /ALX) και 15-nm (ANXA1) κολλοειδή σωματίδια χρυσού. Τα μαστοκύτταρα (A-C) και των ουδετερόφιλων (D-F) δείχνει υποκυτταρική εντόπιση του ANXA1 (βέλη) και FPR2 /ALX (αιχμές βελών), και συν-εντοπισμού (βέλη καμπύλη) στην μεμβράνη του πλάσματος, κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα (Ν) ελέγχου, περιογκική και καρκινικών ιστών. Η πυκνότητα των σωματιδίων χρυσού συζευγμένο με ANXA1 και FPR2 /ALX σε ιστιοκύτταρα (G-I) και των ουδετερόφιλων (J-L). Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SEM των κολλοειδών σωματιδίων χρυσού ανά μm στη μεμβράνη του πλάσματος και ανά μm

2 στο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα των κυττάρων (η = 10 κύτταρα ανά ομάδα). Η μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από δοκιμή Bonferroni αποκάλυψαν μια σημαντική διαφορά μεταξύ των ομάδων. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01, ***

P

& lt?. 0,001

vs

ελέγχου, ##

P

& lt? 0,01, ###

P

& lt?. 0,001

vs

περινεοπλαστικό. Χρωματίστηκαν με οξικό ουρανύλιο και κιτρικό μόλυβδο. Ράβδοι κλίμακας: 1 μm

Η

Η ποσοτική ανάλυση αποκάλυψε ότι υπάρχει υψηλότερη έκφραση του ANXA1 και του υποδοχέα της στο κυτταρόπλασμα και στον πυρήνα σε σύγκριση με ότι στη μεμβράνη του πλάσματος (Σχήμα 2, G-L.).. Συν-εντοπισμό των ANXA1 και FPR2 /ALX παρατηρήθηκε στην πλασματική μεμβράνη, κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα των μαστοκυττάρων και των ουδετερόφιλων (Σχ 2, G-L.)? Ωστόσο, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μόνο στη μεμβράνη των περινεοπλασματικής ουδετερόφιλων στο πλάσμα (Σχ. 2J).

ANXA1

2-26 Αναστέλλει FPR2 /ALX μεσολάβηση υποδοχέα πολλαπλασιασμό των κυττάρων Hep-2 λάρυγγα Καρκίνος

Περίπου το 87% έως 97% των κυττάρων Hep-2 ήταν βιώσιμα κάτω από τις πειραματικές συνθήκες (έλεγχος, ANXA1

2-26, ANXA1

2-26 + Βοο 2, Δεξά, Δεξά + Βοο 2 και Βοο 2) ( S1 Σχήμα). Ωστόσο, η καμπύλη ανάπτυξης αυτών των κυττάρων έδειξαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των προϋποθέσεων που μελετήθηκαν (Εικ. 3).

Η θεραπεία με ANXA1

2-26 μείωσε την κυτταρική ανάπτυξη. Ο ανταγωνιστής Βοο 2 παρεμπόδισε εν μέρει την αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση του ANXA1

2-26. Τα κύτταρα κατεργασμένα με Βοο 2 μόνος αποκάλυψε ότι το επίπεδο του πολλαπλασιασμού παρόμοια προς εκείνη του μάρτυρα. Τα κύτταρα Hep-2 εμβολιάστηκαν σε μέσο ΜΕΜ-Earle σε πυκνότητα 2 × 10

6 κύτταρα σε 75 cm-

φιάλη των 2 καλλιέργεια, και στη συνέχεια επωάστηκαν με μέσο 24 ώρας άνευ ορού πριν από την προσθήκη του ANXA1

2-26 (1 μΜ), ANXA1

2-26 (1 μΜ) + Boc (10 μΜ) ή Boc (10 μΜ) μόνη. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν για την επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SEM για τον αριθμό των κυττάρων × 10

6. **

P

& lt? 0,01 και ***

P

& lt? 0.001

vs

ελέγχου, ##

P

& lt?. 0.01 και # ##

P

& lt? 0.001

vs

ANXA1

2-26 + Boc

η

η θεραπεία με το πεπτίδιο ANXA1

2-26.. μείωσε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων Hep-2 λαρυγγική σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (

P

& lt? 0.001 στις 48 και 96 ώρες, και

P

& lt? 0,01 σε 72 ώρες). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν μετά τη θεραπεία με Δεξά και Dexa + Βοο 2 (S2 Σχήμα). Ωστόσο, ο συνδυασμός της θεραπείας με ANXA1

2-26 και Βοο 2 (ANXA1

2-26 + Boc) αύξησε σημαντικά την ανάπτυξη των κυττάρων σε σύγκριση με ANXA1

2-26-κατεργασμένων κυττάρων (

P

& lt ? 0,01 στις 48 και 72 ώρες, και

P

& lt? 0.001 σε 96 ώρες), αποδεικνύοντας ότι Βοο 2 εξασθένησε την αντιπολλαπλασιαστική δραστικότητα ANXA1

2-26. κύτταρα Βοο 2 ασθενείς είχαν μία πολλαπλασιαστική ρυθμό που ήταν παρόμοια με εκείνη των κυττάρων ελέγχου (Σχ. 3).

Απώλεια ANXA1 /FPR2 Πρωτεΐνη σε λαρυγγικό καρκινικούς ιστούς και Up-ρύθμιση μετά

In Vitro

η θεραπεία με το ANXA1

2-26 Peptide

τα επιθηλιακά κύτταρα του ελέγχου, περιογκική και καρκινικών ιστών λαρυγγική εμφανίζεται ανοσοαντιδραστικότητα να ANXA1 και FPR2 /ALX, καθώς και συν-εντοπισμοί των πρωτεϊνών, στην μεμβράνη του πλάσματος, κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα (Εικ. 4, A-C). Στα περινεοπλασματικής και όγκων δειγμάτων, παρατηρήσαμε μια σημαντική μείωση του ANXA1 και η έκφραση πρωτεΐνης FPR2 /ALX σε σύγκριση με τα αντίστοιχα ιστούς ελέγχου (Εικ. 4, Η και Ι). Ποσοτική ανάλυση αποκάλυψε ότι υπήρχε υψηλότερη έκφραση του ANXA1 και του υποδοχέα της στο κυτταρόπλασμα και στον πυρήνα και χαμηλότερη έκφραση στην πλασματική μεμβράνη (Εικ. 4, G-I). Οι διαφορές ως προς το βαθμό της ANXA1 /FPR2 συν-εντοπισμός δεν ήταν στατιστικά σημαντική μεταξύ των δειγμάτων του λάρυγγα (Εικ. 4, G-I).

ανοσοσήμανση με 10-nm (FPR2 /ALX) και 15-nm (ANXA1) σωματίδια κολλοειδούς χρυσού. (Α-Γ) Τα επιθηλιακά ελέγχου, περιογκική και καρκινικά κύτταρα από λαρυγγική ιστούς. (D-E) Hep-2 κύτταρα τα οποία εμφανίζουν ανοσοαντιδραστικότητα προς ANXA1 (βέλη), FPR2 (αιχμές βελών), και συν-εντοπισμούς (βέλη καμπύλη) στην μεμβράνη του πλάσματος, κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα (Ν). Οι δεσμοσώματα (βέλη ανοιχτή καμπύλη) ανιχνεύεται μεταξύ αυτών των κυττάρων. (F) Η απουσία ανοσοδραστικότητας να ANXA1 και FPR2 /ALX σε κύτταρα επωάζονται με μη άνοσο ορό. Η πυκνότητα των σωματιδίων χρυσού συζευγμένο με ANXA1 και FPR2 /ALX σε επιθηλιακά κύτταρα (G-I) και τα κύτταρα Hep-2 (J-L). κύτταρα Hep-2 εμβολιάστηκαν σε μέσο ΜΕΜ-Earle σε πυκνότητα 2 × 10

6 κύτταρα σε 75-cm

2 φιάλες καλλιέργειας, και στη συνέχεια επωάστηκαν με μέσο χωρίς ορό 24 ώρες πριν από την προσθήκη του ANXA1

2-26 (1 μΜ) και ANXA1

2-26 (1 μΜ) + Βοο 2 (10 μΜ). Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SEM των κολλοειδών σωματιδίων χρυσού ανά μm στη μεμβράνη του πλάσματος και ανά μm

2 στο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα των κυττάρων (η = 10 κύτταρα ανά ομάδα). Η μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από δοκιμή Bonferroni αποκάλυψαν μια σημαντική διαφορά μεταξύ των ομάδων. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01, ***

P

& lt?. 0,001

vs

ελέγχου, #

P

& lt? 0,05, ##

P

& lt? 0,01, ###

P

& lt? 0.001

vs

ANXA1

2. 26. Χρωματίστηκαν με οξικό ουρανύλιο και κιτρικό μόλυβδο. Ράβδοι κλίμακας:. 1 μm

Η

Hep-2 κύτταρα που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ANXA1

2-26 ή ANXA1

2-26 συν Βοο 2 έδειξε ανοσολογική αντίδραση για ANXA1 και FPR2 /ALX (Εικ . 4, D και Ε). Συν-εντοπισμό των δύο πρωτεϊνών ανιχνεύθηκε στην πλασματική μεμβράνη, κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα αυτών των κυττάρων αλλά όχι σε Βοο 2-κατεργασμένα κύτταρα (Σχ. 4, D και Ε). Δεν χρυσός επισήμανση ανιχνεύθηκε σε κύτταρα που επωάστηκαν με μη άνοσο ορό (Εικ. 4 F). έκφραση ANXA1 /FPR2 ήταν ρυθμισμένη προς τα κάτω στην πλασματική μεμβράνη αλλά αυξήθηκε στο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα των κυττάρων Hep-2 (Σχ. 4, J-L). Η θεραπεία με ANXA1

2-26 εμφανίζεται πάνω ρύθμιση του ANXA1 και FPR2 στο κυτταρόπλασμα και στον πυρήνα σε σύγκριση με τα αντίστοιχα κύτταρα-μάρτυρες (Εικ. 4, J-L). Επιπλέον, εντοπίστηκε σημαντική μείωση των ANXA1 πρωτεΐνης και του υποδοχέα του μετά ANXA1

2-26 + θεραπεία Βοο 2 σε σύγκριση με ANXA1

2-26 επεξεργασμένα κύτταρα (Εικ. 4, J-L).