Αφηρημένο

Το

SEMA3B

γονίδιο βρίσκεται στην περιοχή 3p21.3 LUCA, το οποίο επηρεάζεται συχνά σε διαφορετικών τύπων καρκίνου. Ο στόχος της μελέτης μας ήταν να επεκτείνουν τις γνώσεις μας για το

SEMA3B

γονίδιο ως καταστολέας των όγκων και των μηχανισμών της αδρανοποίησης του. Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήθηκαν διάφορες πειραματικές προσεγγίσεις: αναλύσεις ανάπτυξης του όγκου και προσδιορισμούς απόπτωσης

in vitro

και σε ποντίκια SCID, δοκιμασίες έκφρασης και μεθυλίωση και άλλα. Με τη χρήση του μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα U2020 κυτταρική σειρά καρκίνου επιβεβαιώσαμε την λειτουργία

SEMA3B

ως καταστολέας όγκου, και έδειξε ότι η καταστολή μπορεί να επιτευχθεί μέσω της επαγωγής της απόπτωσης και, ενδεχομένως, που συνδέεται με την αναστολή της αγγειογένεσης. Επιπλέον, για πρώτη φορά, υψηλές συχνότητες μεθυλίωση έχουν παρατηρηθεί τόσο ιντρονική (32-39%) και προαγωγό (44-52%) CpG-νησιών σε 38 μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα, συμπεριλαμβανομένων 16 καρκινώματα πλακωδών κυττάρων (SCC ) και 22 αδενοκαρκινώματα (ADC), και σε 83 σαφή καρκινώματα νεφρικών κυττάρων κύτταρο (ccRCC). Οι συσχετίσεις μεταξύ των συχνοτήτων μεθυλίωση του υποκινητή και τις ιντρονικές CpG-νησιά του

SEMA3B

με το στάδιο του όγκου και της ποιότητας έχουν αποκαλυφθεί για SCC, ADC και ccRCC. Η συσχέτιση μεταξύ της μείωσης του

SEMA3B

επίπεδο mRNA και υπερμεθυλίωση του υποκινητή και τις ιντρονικές CpG-νησιά έχει εκτιμηθεί σε ασθενείς με νεφρική πρωτογενείς όγκους (

P

& lt? 0,01). Χρησιμοποιώντας qPCR, παρατηρήσαμε στο μέσο όρο 10- και 14-φορές μείωση της

SEMA3B

επίπεδο mRNA σε SCC και ADC, αντίστοιχα, και μία 4-φορές μείωση στην ccRCC. Η συχνότητα αυτού του αποτελέσματος ήταν υψηλή σε αμφότερα πνεύμονα (92-95%) και νεφρικές (84%) δείγματα όγκων. Επιπλέον, δείξαμε μια σαφή διαφορά (

P

& lt? 0,05) από το

SEMA3B

σχετικά επίπεδα mRNA σε ADC με και χωρίς μεταστάσεις στους λεμφαδένες. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η ανώμαλη έκφραση και μεθυλίωση του

SEMA3B

θα μπορούσε να προταθεί ως δείκτες των πνευμόνων και της εξέλιξης του καρκίνου του νεφρού

Παράθεση:. Loginov VI, Dmitriev ΑΑ, Senchenko VN, Pronina IV, Khodyrev DS, Kudryavtseva AV, et al. (2015) Ογκοκατασταλτικής Λειτουργία του

SEMA3B

Gene σε ανθρώπινο πνεύμονα και των νεφρών Καρκίνοι. PLoS ONE 10 (5): e0123369. doi: 10.1371 /journal.pone.0123369

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Hiromu Suzuki, Σαπόρο Ιατρικό Πανεπιστήμιο, ΙΑΠΩΝΙΑ

Ελήφθη: 16 Ιουλίου 2014? Αποδεκτές: 5 Φλεβάρη 2015? Δημοσιεύθηκε: May 11, 2015

Copyright: © 2015 Loginov et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από τις επιχορηγήσεις 13-04-00828a, 13-04-02072a και 14-04-32084 mol_a από το ρωσικό Ίδρυμα βασικής Έρευνας ? χορηγήσει 28.12.07-6888 από Istituto Toscano Tumori? μια επιχορήγηση από το CNR-RAS κοινά σχέδια 2008-2010? η επιχορήγηση από το RAS προεδρείο Πρόγραμμα «Μοριακή και Κυτταρική Βιολογία»? Συμβάσεις 14.604.21.0117 (μοναδική RFMEFI60414X0117 έργου αναγνωριστικό) και 14.621.21.0001 (μοναδικό αναγνωριστικό RFMEFI62114X0001 έργου) από το Υπουργείο Παιδείας και Επιστημών της Ρωσικής Ομοσπονδίας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς επιβεβαιώνουν την απουσία ανταγωνιστικών συμφερόντων, αλλά δηλώνουν συνεταιρισμό με Affina βιοτεχνολογίες. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

σημαφορίνες είναι αρνητικά μεσολαβητές αξονική καθοδήγηση στο κεντρικό νευρικό σύστημα [1]. Σεμαφορίνες περιλαμβάνουν μια μεγάλη οικογένεια των γλυκοπρωτεϊνών (8 κατηγορίες, συμπεριλαμβανομένων των 5 κατηγοριών σπονδυλωτών, περισσότερα από 30 μέλη), αλλά μόνο κατηγορίας 3 (SEMA3) αντιπροσωπεύει εκκρίνεται διαλυτά μόρια. Μέλη της οικογένειας SEMA εκφράζονται διαφορικά σε καρκίνο, και είτε προάγουν ή να καταστείλουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, τη μετανάστευση και την αγγειογένεση, και την επαγωγή της ανθεκτικότητας στα φάρμακα. Έτσι, οι ρόλοι των χωριστών μελών της σημαφορίνης οικογένεια μπορεί να είναι αρκετά διαφορετική [2-9].

3 σεμαφορίνες Class (SEMA3s, επίσης γνωστή ως collapsins) περιλαμβάνουν μία από τις πέντε οικογένειες σπονδυλωτών σημαφορινών και παίζουν σημαντικό ρόλο στη βιολογία του όγκου, συμπεριλαμβανομένων ρύθμιση κυτταρικών διεργασιών, όπως πολλαπλασιασμό ενδοθηλιακών κυττάρων, την απόπτωση, τη μετανάστευση και την αγγειογένεση [10]. Πρόσφατα, η συμμετοχή αυτής της κατηγορίας πρωτεϊνών στην καρκινογένεση έχει εντατικά μελετηθεί. SEMA3s εκκρίνονται από τα κύτταρα των πολλαπλών σειρών, περιλαμβανομένων των επιθηλιακών κυττάρων, νευρώνων, και ειδικά κύτταρα όγκου [10]. Neuropilins (ΕΠΜ) αντιπροσωπεύουν τις πρωτογενείς δέκτες των SEMA3s. Η σύνδεση του SEMA3s να NRP1 /2 εκκινεί κατάντη σηματοδότησης τους, αλλά εμποδίζει την αλληλεπίδραση μεταξύ NRP1 /2 και αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) και την επακόλουθη επαγωγή ενός προ-αγγειογενετική μεταγραφικό πρόγραμμα. Ωστόσο, δεν είναι σαφές εάν SEMA3s αναστέλλουν την ανάπτυξη του όγκου με ανταγωνισμό με VEGF για neuropilins θέσεις δέσμευσης συνδέτη, ενεργώντας ανεξάρτητα από VEGF, ή με συνδυασμό αυτών των αποτελεσμάτων [10-13].

Προηγούμενες μελέτες, συμπεριλαμβανομένων δική μας, του ανθρώπινου χρωμοσώματος 3 στα νεφρικά, των πνευμόνων, του μαστού και του τραχήλου της μήτρας καρκινώματα αποκάλυψε συχνή αλληλόμορφη απώλειες (έως 40%) στην περιοχή LUCA (3p21.3), που φιλοξενεί δύο σεμαφορίνες-SEMA3B και SEMA3F. Αυτή η περιοχή (hg38 /CHR3: 50.0-50.5Mb) αποτελείται από 445 Kb περιέχει περίπου 20 καταστολείς όγκων (ΕΠΠΕ) και ΕΠΠΕ-υποψήφιοι:

RASSF1

,

NPRL2

,

TUSC2

,

CACNA2D2

και άλλοι. Απροσδόκητα, αυτά τα γονίδια παίζουν ρόλους σε κυτταρικές διαδικασίες και ασκώντας καταστολή όγκου με πολλούς διαφορετικούς τρόπους (μπλοκ του κυτταρικού κύκλου, την αναστολή της αγγειογένεσης, επαγωγή της απόπτωσης, κλπ) που βρίσκονται στην compact περιοχή [14-18].

Σημαντικές ενδείξεις δραστηριότητας καταστολέα όγκου περιλαμβάνει τον εντοπισμό του κυττάρου ρυθμιστικών μονοπατιών και άλλων μηχανισμών που επηρεάζονται από SEMA3B. Χρησιμοποιώντας MDA-ΜΒ435 (καρκίνωμα μαστού) και Α549 (αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα) κύτταρα είχε προηγουμένως δείξει ότι SEMA3B κατέστειλε την ανάπτυξη του όγκου αλλά το έναυσμα για μια προ-μεταστατικό πρόγραμμα με απελευθέρωση ιντερλευκίνης 8 [19, 20]. Επιπλέον, διαπιστώθηκε ότι η επαγωγή απόπτωσης από SEMA3B σε κύτταρα όγκου που προκαλείται από την απενεργοποίηση του μονοπατιού σηματοδότησης Akt [21]. Ως εκ τούτου, είναι σημαντικό να διευκρινίσει περαιτέρω τις ιδιαίτερες πτυχές της καταστολής SEMA3B όγκου.

Η μεθυλίωση είναι ένας σημαντικός μηχανισμός του

SEMA3B

απενεργοποίηση του γονιδίου [17, 22]. Ωστόσο, η πλειοψηφία των προηγούμενων έρευνα επικεντρώθηκε σε μελέτες μεθυλίωση του εσωνίου CpG-νησί, που είχε λανθασμένα θεωρηθεί βρίσκεται στην περιοχή του υποκινητή.

Ο στόχος της μελέτης μας ήταν να διαφωτίσει τους διακριτούς ρόλους των SEMA3B σε όγκο καταστολή, ιδιαίτερα στην απόπτωση και την αγγειογένεση. Επιπλέον, έχουμε ως στόχο να αξιολογήσει τις συχνότητες του υποκινητή (hg38 /CHR3: 50,267,308-50,267,797) και ιντρονικές (hg38 /CHR3: 50,268,972-50,269,271) συσχετίσεις CpG-νησί υπερμεθυλίωση με

SEMA3B

έκφρασης, και την εξέλιξη του όγκου στον πνεύμονα και των νεφρών καρκίνοι

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές

Γονιδιωματικό DNA απομονώθηκε από τις κυτταρικές σειρές 14 καρκίνου:. 3 πλακώδους καρκίνοι του πνεύμονα (SCLC: ACC-LC5, NCI-N417 , U2020), 2 μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC: ΝΟΙ-Η157, ΝΟΙ-H647), και 9 καρκίνοι νεφρικών κυττάρων (RCC: Α498, ACHN, Caki-1, Caki-2, ΗΝ-51, KH-39, KRC /Υ, ΤΚ-10, TK-164). Η κυτταρική σειρά U2020 περιγράφηκε προηγουμένως [23]. Η κυτταρική γραμμή ACC-LC5 που φέρει μία εξάλειψη στο 3p21.3 [24] παρασχέθηκε ευγενώς από τον Dr. Yusuke Nakamura (Πανεπιστήμιο του Τόκυο, Τόκιο, Ιαπωνία). Νεφρική Α498, κυτταρικές σειρές Caki1, και Caki2 και των πνευμόνων ΝΟΙ-N417, ΝΟΙ-Η157, και NCI-H647 αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Κυτταρικές σειρές KRC /Υ, ACHN, TK-164, HN-51, ΤΚ-10, και KH-39 ελήφθησαν από το Ινστιτούτο Καρολίνσκα (Στοκχόλμη, Σουηδία) συλλογή κυτταρική γραμμή [25]. Όλες οι ανθρώπινες κυτταρικές σειρές αναπτύχθηκαν όπως μονοστρωματικές καλλιέργειες σε IMDM /RPMI ή DMEM (με 4,5 g /l γλυκόζη) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FCS).

Δείγματα ιστών

Συνολικά , 70 ζεύγη όγκου /φυσιολογικά δείγματα των NSCLC (29 ADC και 41 SCC) και 133 διαυγοκυτταρικό RCC (ccRCC) ελήφθησαν από την ΝΝ Blokhin Cancer Research Center, Ρωσικής Ακαδημίας Ιατρικών Επιστημών (Μόσχα, Ρωσία). Το σύνολο των 38 NSCLC (16 ADC και 22 SCC) και 83 ccRCC χρησιμοποιήθηκε στις μελέτες μεθυλίωση και η έκφραση ή αριθμό αντιγράφων μελέτες από ημι-ποσοτική RT-PCR. Το πρόσθετο σύνολο των 32 NSCLC (13 ADC και 19 SCC) και 50 ccRCC χρησιμοποιήθηκε για την επικύρωση από μελέτες έκφρασης qPCR. Οι πληροφορίες δείγματος παρουσιάζονται στον Πίνακα 1 και Πίνακα S1. Τα δείγματα συλλέχθηκαν σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές που εκδίδονται από την Επιτροπή Δεοντολογίας της Ν.Ν. Blokhin Cancer Research Center, Ρωσικής Ακαδημίας Ιατρικών Επιστημών (Μόσχα, Ρωσία). Όλοι οι ασθενείς έδωσαν γραπτή συγκατάθεση (διαθέσιμο κατόπιν αιτήματος). Η Επιτροπή Δεοντολογίας της Ν.Ν. Blokhin Cancer Research Center, Ρωσικής Ακαδημίας Ιατρικών Επιστημών, που εγκρίθηκε ειδικά αυτή τη μελέτη. Η μελέτη διεξήχθη σύμφωνα με τις αρχές που περιγράφονται στη Διακήρυξη του Ελσίνκι. ιστούς όγκων και αντιστοιχισμένο μορφολογικά φυσιολογικών ιστών ελήφθησαν από ασθενείς μετά από χειρουργική εκτομή πριν σε ακτινοβολία ή χημειοθεραπεία και αποθηκεύτηκαν σε υγρό άζωτο. Η διάγνωση επιβεβαιώθηκε με ιστοπαθολογική, και μόνο δείγματα με περισσότερο κύτταρα όγκου 70-80% ή χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη. έλεγχοι «Normal» ελήφθησαν σε ένα ελάχιστο 2 cm από τον όγκο και επιβεβαιώθηκαν ιστολογικά ως φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα. δείγματα όγκων χαρακτηρίζονται σύμφωνα με το διεθνές σύστημα ταξινόμησης των όγκων, με βάση τον όγκο-κόμβο-μετάσταση (TNM) και σταδιοποίηση ταξινόμηση της Ένωσης για Θέματα Διεθνούς Ελέγχου του Καρκίνου (UICC, έκδοση 2002) [26] και η Παγκόσμια Οργάνωση Υγείας (WHO ) κριτήρια ταξινόμησης [27, 28]. Δείγματα αίματος από 15 υγιείς δότες χρησιμοποιήθηκαν επίσης στην μελέτη.

Η

ποντίκια SCID

ποντίκια SCID Δώδεκα χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα. Οι ποντικοί ελήφθησαν από Scanbur (Sollentuna, Σουηδία). ευθανασία των ζώων πραγματοποιήθηκε με CO

2 ασφυξία ακολουθούμενη από αυχενική εξάρθρωση. Η μελέτη αυτή πραγματοποιήθηκε σε αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις στον Οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου (NRC 2011), την Ευρωπαϊκή Σύμβαση για την Προστασία των σπονδυλωτών ζώων που χρησιμοποιούνται για πειραματικούς και άλλους επιστημονικούς σκοπούς, του Συμβουλίου της Ευρώπης (ETS 123 ), και οι κατευθυντήριες γραμμές της επιτροπής δεοντολογίας της Βόρειας Στοκχόλμης για τη Φροντίδα και Χρήση των ζώων Εργαστηρίου. Τα πειράματα με τα ποντίκια SCID εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Δεοντολογίας της Βόρειας Στοκχόλμης.

Η επιμόλυνση και την επιλογή των σταθερά επιμολυσμένων

SEMA3B

-U2020 κυτταρικούς κλώνους

Το cDNA που κωδικοποιεί το

SEMA3B

γονίδιο κλωνοποιήθηκε σε ένα ρυθμιζόμενη από τετρακυκλίνη επισωμικό υποδοχέα, Πιτ. Το προκύπτον πλασμίδιο αλληλουχήθηκε. Για να αποκτήσετε σταθεροί κλώνοι κυττάρου που εκφράζει

SEMA3B

, U2020 κύτταρα (SCLC) επιμολύνθηκαν με άδειο Pete ή Pete /

SEMA3B

πλασμιδιακό DNA (0,5 mg DNA ανά φρεάτιο) σε 12-φρεατίων χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη και αντιδραστηρίου Plus (Invitrogen, CA, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Παροδικά Pete /

SEMA3B

-U2020 και τα κύτταρα Πιτ-U2020 καλλιεργήθηκαν για 2-3 εβδομάδες σε μέσο ΙΜϋΜ που περιέχει Bsd (5 μg /ml) για να επιλέξετε σταθερούς κλώνους. Η έκφραση του

SEMA3B

ρυθμιζόταν από δοξυκυκλίνη.

Colony δοκιμασία σχηματισμού

παροδικά επιμολυσμένα κύτταρα U2020 (με τον Pete και Pete /

SEMA3B

) γδύθηκαν 24-48 ώρες μετά την επιμόλυνση και απλώθηκε σε 100 mm

2 πιάτα κυτταρικής καλλιέργειας σε μια πυκνότητα 500-1000 κυττάρων ανά πλάκα. Μετά την επιλογή με Bsd (5 μg /ml), Giemsa χρώση αποικίες φωτογραφήθηκαν και μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας Ποσότητα Ένα λογισμικό (έκδοση 4.4.0? Bio-Rad, Hercules, CA, USA). βιωσιμότητες κυττάρου εκτιμήθηκε με ανάλυση FACS με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ-FACS), ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή (FACSCalibur, BD Bioscience).

Η ανάπτυξη των όγκων σε ποντίκια SCID

Η καρκινογένεση από Pete /

SEMA3B

επιμολυσμένα U2020 και κενός Pete-επιμολυσμένα κύτταρα U2020 (έλεγχος) εκτιμήθηκε με την υποδόρια έγχυση των κυττάρων σε 6-8 εβδομάδων ποντίκια SCID, όπως περιγράφεται προηγουμένως [29]. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση στις 800 rpm για 2 λεπτά και επαναιωρήθηκαν σε μέσο ΙΜϋΜ ελεύθερο ορού σε συγκέντρωση 2-3 χ 10

6 κύτταρα ανά 100 μΙ ένεση. Τα κύτταρα ενσωματωμένα σε μια μήτρα Matrigel (BD Biosciences, Erembodegem, Belgium), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Οι ποντικοί παρατηρήθηκαν για σχηματισμό όγκου δύο φορές την εβδομάδα και το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε με τη χρήση παχύμετρο. Στη συνέχεια χρησιμοποιήσαμε το τεστ απενεργοποίηση πολλών γονιδίων (MGIT) για τρία γονίδια (

ZMYND10 /BLU

,

TUSC2 /FUS1

και

SEMA3B

) σε SCID ποντίκια. MGIT βασίζεται στην παρακολούθηση των ογκοκατασταλτικό υποψήφιου γονιδίου αδρανοποίησης σε κύτταρα και όγκους. Είναι πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με μια δημοσιευμένη μέθοδο [29, 30]. Εν συντομία, U2020 κύτταρα επιμολυσμένα είτε με τον Pete /

SEMA3B

, Pete /

ZMYND10

, Pete /

TUSC2

ή άδειο Pete πλασμίδια. Μείγματα των κυτταρικών κλώνων εγχύθηκαν υποδορίως σε ποντίκια SCID. Στη συνέχεια, εάν σχηματιστεί ένας όγκος, η έκφραση του

SEMA3B

,

ZMYND10

και

TUSC2

αξιολογείται. Το νοκ-κάτω από τα γονίδια που προτείνει η σημασία τους για την καταστολή του όγκου.

Ανοσοϊστοχημική ανάλυση των SCLC κυττάρων του όγκου σειρά U2020 και την αγγειογένεση των όγκων σε ποντίκια SCID

Το πλασμίδιο Pete /

SEMA3B

εισήχθη SCLC κυτταρική σειρά U2020, το οποίο συστατικά που παράγονται έναν διενεργοποιητή τετρακυκλίνης (ΙΤΑ) [29]. Το προκύπτον υπο-line εμβολιάστηκε υποδορίως σε ποντίκια SCID. Οι ποντικοί έλαβαν πόσιμο νερό με δοξυκυκλίνη (+ DOX, γονίδιο είναι OFF) ή χωρίς (-ΟΟΧ, γονίδιο είναι ΟΝ). Οι ποντικοί υποβλήθηκαν σε ευθανασία μετά από 1 μήνα. Οι όγκοι ή οι τόποι ενέσεις κυττάρων αποκόπηκαν και τα ενσωματωμένα με παραφίνη. Οι τομές 5 μm σε πάχος. Παραφίνη διαλύθηκε σε ξυλόλιο (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ, USA), και οι τομές ιστού υποβλήθηκαν σε επεξεργασία διαδοχικά με 99, 95, 75 και 30% αιθανόλη. Επίτοποι ανακτήθηκαν με θέρμανση σε φούρνο μικροκυμάτων για 5 λεπτά σε ρυθμιστικό διάλυμα κιτρικού. Αντι-CD31 αντίσωμα ποντικού, μαζί με κουνελιού αντι-ποντικού συζευγμένο με FITC δεύτερο αντίσωμα (Dako, Karlstrup, Δανία), χρησιμοποιήθηκε για τη χρώση μικροαγγείων. Η δοκιμασία TUNEL (in situ κυτταρικού θανάτου Detection Kit, Boehringer Mannheim, Germany) για την ανίχνευση της απόπτωσης διεξήχθη σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

DNA και συνολική απομόνωση RNA, αντίστροφη μεταγραφή-ΡΟΚ

άζωτο κατεψυγμένοι ιστοί διασπάστηκαν χρησιμοποιώντας έναν Mikro-Dismembrator (Sartorius, Germany). Το DNA από ανθρώπινους ιστούς και κυτταρικές καλλιέργειες απομονώθηκε με εκχύλιση με φαινόλη, σύμφωνα με τις τυποποιημένα πρωτόκολλα. Ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ RNeasy μίνι όπως συνιστάται από Qiagen (Κάτω Χώρες). Το καθαρισμένο RNA ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας NanoDrop-1000 (NanoDrop Technologies Inc., DE, USA). ποιότητα του RNA εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας 28S και 18S rRNA ζωνών μετά από ηλεκτροφόρηση σε μια 1% μετουσιωτική πηκτή αγαρόζης και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, CA, USA). Η έλλειψη μόλυνσης DNA ελέγχθηκε με ημι-ποσοτική PCR με εκκινητές για τον κύριο γονίδιο συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας Ι (

MHCI

, σχεδιάστηκε χρησιμοποιώντας Vector ΝΤΙ, βλέπε S2 Πίνακα). Όλα τα δείγματα RNA υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με RNase-free DNase Ι (Fermentas, Lithuania). Δείγματα RNA που περιέχει πάνω από 0,1% του DNA απορρίφθηκαν. Το cDNA συνετέθη από 1 μα ολικού RNA χρησιμοποιώντας Μ-ΜυΙ_ν ανάστροφη μεταγραφάση και τυχαία εξαμερή, σύμφωνα με το πρωτόκολλο του προτύπου κατασκευαστή (Fermentas, Lithuania).

Bisulfite αλληλουχίας του υποκινητή CpG-νησί της

SEMA3B

γονίδιο

μετατροπή διθειώδους DNA διεξήχθη όπως περιγράφεται στο [31, 32] με τη χρήση 1-2 μα DNA (πνεύμονα και νεφρών γραμμές και όγκου /φυσιολογικούς ιστούς). Το τροποποιημένο DNA καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας ένα PCR JETquick καθαρισμός Spin Kit (Genomed, Σουηδία). Τροποποιημένου DNA διατηρήθηκε στους -20 ° C και χρησιμοποιήθηκε ως πρότυπο για PCR με τα αρχικά τεμάχια σχεδιασμένα (παρατίθενται στο S2 Πίνακα), του οποίου το προϊόν αλληλουχήθηκε. Ενίσχυση του

SEMA3B

θραύσμα υποκινητή CpG-νησί διεξήχθη σε ένα μίγμα αντίδρασης 50 μΐ που περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα PCR (67 mM Tris-HCl ρΗ 8,8, 16,6 mM θειικό αμμώνιο, 0.01% Tween 20)? 2.0 mM MgCl

2? 0,25 mM του κάθε dNTP? 25 ρΜ του κάθε εκκινητή? 1 μονάδα Hot Start Taq DNA πολυμεράσης (SibEnzyme, Ρωσία)? και 5-20 ng τροποποιημένου DNA σε DNA Engine Dyad Cycler (Bio-Rad, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής) χρησιμοποιώντας το ακόλουθο πρόγραμμα: 95 ° C, 5 λεπτά? 35 κύκλοι των 95 ° C, 15 s? 62 ° C, 30 s? 72 ° C, 30 s και 72 ° C, 7 λεπτά. Το ενισχυμένο PCR προϊόν καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης 1,5% και το JETquick Gel Extraction Spin Kit (Genomed, Σουηδία). Για προσδιορισμό της αλληλουχίας, χρησιμοποιήθηκαν 5-10 ng του καθαρισμένου θραύσματος DNA και 25 ρΜ ενός από τους εκκινητές. Αλληλούχιση διεξήχθη χρησιμοποιώντας αυτόματο μηχάνημα αλληλουχίας (Beckman-Coulter).

μεθυλίωσης ειδική PCR (MSP)

Ο κατεργασμένου με όξινο θειώδες DNA, διαλύθηκε σε δις-απεσταγμένο νερό, χρησιμοποιήθηκε επίσης ως πρότυπο για τον ΘΧΣ. Οι συνθήκες PCR και εκκινητές για την μεθυλιωμένων και μη-μεθυλιωμένων αλληλόμορφο εσωνίων [17] και προαγωγό (σχεδιάστηκε από DNASTAR Lasergene πρόγραμμα 2000) CpG-νησιά δίδεται στο S2 Πίνακα. Στην περίπτωση του προαγωγού CpG-νησί, 6 CpG δινουκλεοτίδια-αναλύθηκαν (2 από την προς τα εμπρός εναρκτήρα και 4 με την αντίστροφη), και σε περίπτωση του εσωνίου-3 (1 από την προς τα εμπρός εκκινητή και 2 με την αντίστροφη). PCR πραγματοποιήθηκε σε έναν ενισχυτή DNA Engine Dyad Cycler (Bio-Rad, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής) χρησιμοποιώντας το ακόλουθο πρόγραμμα: 95 ° C, 5 λεπτά? 35 κύκλοι των 95 ° C, 10 s? Τ

ann (βλέπε Πίνακα S2), 20 s? 72 ° C, 30 s και 72 ° C, 3 λεπτά. Η απουσία του PCR προϊόντος σε μη μετατραπείσες DNA ελέγχθηκε για κάθε ζεύγος εκκινητών. DNA της ανθρώπινης ινοβλάστης κυτταρική γραμμή L-68 χρησιμοποιήθηκε ως μη-μεθυλιωμένο αλλήλιο ελέγχου? L-68 DNA SSSI από L-68 ινοβλάστες αντιμετωπίζονται με SSSI μεθυλοτρανσφεράσης (SibEnzyme, Ρωσία) χρησίμευσε ως θετικός μάρτυρας για το 100% μεθυλίωση.

Ημι-ποσοτική RT-PCR

Για τον έλεγχο της αντίστροφη μεταγραφή, εκκινητές για την μεταγραφή του β2-μικροσφαιρίνη (

Β2Μ

) χρησιμοποιήθηκαν γονίδιο [33]. Ημι-ποσοτική RT-PCR πραγματοποιήθηκε με ίσες ποσότητες cDNA χρησιμοποιώντας τους εκκινητές και τις συνθήκες που αναφέρονται στον Πίνακα S2. Multiplex PCR με εκκινητές για την

SEMA3B

[17] και

Β2Μ

γονίδια διεξήχθη υπό συνθήκες βελτιστοποιηθεί για τις

SEMA3B

εκκινητές, και η συγκέντρωση του

Β2Μ

εναύσματα ήταν 1,5 φορές χαμηλότερη. Τα προϊόντα της RT-PCR διαχωρίστηκαν σε πηκτώματα 2% αγαρόζης, και το πρότυπο συγκρότημα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό GelImager (DNA Technology, Ρωσία). Μία δοκιμασία αριθμός αντιγράφου ημι-ποσοτικό για τους δείκτες της περιοχής LUCA χρησιμοποιήθηκε όπως περιγράφεται αλλού [14].

qPCR

Ποσοτική PCR διεξήχθη με τους εκκινητές και ανιχνευτές TaqMan απαριθμούνται στο S2 Πίνακα χρησιμοποιώντας ένα 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, CA, USA). Κάθε αντίδραση επαναλήφθηκε τρεις φορές. Οι αλληλουχίες νουκλεοτιδίων των αμπλικονίων επαληθεύθηκαν με αλληλούχιση σε ένα 3730 DNA Analyzer αυτοματοποιημένο αλληλουχητή (Applied Biosystems, CA, USA). δεδομένα QPCR αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το αναφοράς γονιδίων

GAPDH

,

GUSB

και

RPN1

[34] και τη σχετική ποσοτικοποίηση ή ΔΔCt-μέθοδο όπως περιγράφηκε προηγουμένως [35]. Τουλάχιστον 2-φορές αλλαγές επίπεδο mRNA θεωρήθηκαν ως σημαντική λόγω του mRNA επίπεδο μεταβλητότητας των γονιδίων αναφοράς.

Στατιστική ανάλυση

Η μη παραμετρική δοκιμή Wilcoxon χρησιμοποιήθηκε για να συγκριθούν οι διαφορές έκφραση του mRNA του στόχου και τα γονίδια αναφοράς στα δείγματα ccRCC και NSCLC. Kruskal-Wallis και Mann-Whitney τεστ rank-sum, το ακριβές τεστ του Fisher και χ

2 κριτήρια χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση των αλλαγών επίπεδο του mRNA και της κατάστασης μεθυλίωσης στο ccRCC και NSCLC ομάδες με διαφορετικές παθολογικές και ιστολογικές χαρακτηριστικά. t-test του Student χρησιμοποιήθηκε για την σύγκριση των δεδομένων που λαμβάνονται για τις ομάδες των επαναλήψεων. Ρ-τιμές ≤ 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές. ο συντελεστής Spearman του (

r

s

) χρησιμοποιήθηκε για την αποκάλυψη συσχετίσεων.

Αποτελέσματα

In vitro

καταστολή της ανάπτυξης των SCLC κυττάρων U2020 από

SEMA3B

Η

Η κυτταρική γραμμή καρκινώματος μικρών κυττάρων του πνεύμονα U2020 ήταν επιμολυσμένα με τον Pete

/SEMA3B

ή Pete ως μάρτυρας. Τα διαμολυσμένα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 15 ημέρες. Ο ρυθμός αύξησης των U2020 κυττάρων που εκφράζουν

SEMA3B

ήταν χαμηλότερη από ό, τι τον έλεγχο (

P

& lt? 0.01 από την ημέρα 5, βλέπε Σχήμα 1Α). Η δοκιμασία σχηματισμού αποικίας έδειξε ότι ο αριθμός των αποικιών των κυττάρων που περιέχουν U2020 Pete /

SEMA3B

ήταν χαμηλότερη μετά την εκ νέου έκφραση του δοξυκυκλίνης-καταστέλλεται

SEMA3B

γονίδιο σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (890 ± 60 vs 190 ± 40,

P

& lt? 0.01, Σχήμα 1Β). Με βάση την ανάλυση PI-FACS, η αφθονία των αποπτωτικών και νεκρωτικών κυττάρων που εκφράζουν

SEMA3B

(χωρίς δοξυκυκλίνη) αυξήθηκε σημαντικά σε σύγκριση με το

SEMA3B

-off κύτταρα (με δοξυκυκλίνη): από (7 ± 2) × 10

2 (49 ± 5) × 10

2

P

& lt? 0.01, βλέπε Σχ 1C. Στο σύνολό τους, τα στοιχεία αυτά δείχνουν ότι

SEMA3B

είναι ο αναστολέας της ανθρώπινης ανάπτυξης SCLC κύτταρα μέσω επαγωγής της απόπτωσης

in vitro

Η

Α-Ο ρυθμός αύξησης των U2020 κυττάρων.: διακεκομμένη γραμμή με τετράγωνα-U7111 κλώνος με τον Pete /

SEMA3B

, συνεχής γραμμή με κύκλους-U2020 κύτταρα με τον Pete (έλεγχος)? δοκιμασία σχηματισμού Β-αποικία? Ανάλυση C-ΡΙ-FACS των κυττάρων με και χωρίς την έκφραση του

SEMA3B

. Οι μέσες τιμές ± τυπικές αποκλίσεις για 4 επαναλήψεις εκπροσωπείται σε κάθε περίπτωση.

Η

δοκιμή αδρανοποίησης πολλαπλών γονιδίων σε ποντίκια SCID

Έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν ότι η τεχνική GIT επιτρέπει την αποτελεσματική και ελεγχόμενη επαγωγή διαφόρων γονιδίων στα κύτταρα [29, 30]. Για το πείραμα MGIT, χρησιμοποιήσαμε το SCLC U2020 κυτταρική γραμμή για την υπό όρους έκφραση τριών TSG-υποψήφιοι που βρίσκεται στην 3p21.3:

ZMYND10

(

BLU

),

TUSC2

(

FUS1

) και

SEMA3B

. Μείγματα των κυτταρικών κλώνων που φέρουν διαφορετικά γονίδια εμβολιάσθηκαν υποδορίως σε έξι εβδομάδων ποντίκια SCID χρησιμοποιώντας Matrigel (μεμβράνη μήτρα υπόγειο) τεχνική εμφύτευσης απουσία δοξυκυκλίνης (τα γονίδια ήταν ON).

Ένα PCR-based σύγκριση των SCID όγκους ποντικών και κλώνοι πρωτογενές κύτταρο έδειξε σαφώς ότι

SEMA3B

επιλεκτικά νοκ-κάτω σε όλες τις τρεις όγκους αυξηθεί

in vivo

(δείτε δείγματα 8-10 στο Σχήμα 2), ενώ η έκφραση του

ZMYND10

και

TUSC2

γονίδια δεν άλλαξε κάτω από αυτές τις συνθήκες. Αυτά τα δύο γονίδια πιθανότατα δεν ανταγωνίζονται την ανάπτυξη του όγκου των U2020 κυττάρων σε ποντίκια SCID (αφήνουμε ανοικτό το ζήτημα αυτό, διότι η αναζήτηση για μετάλλαξη μέσω διατήρησε τα γονίδια δεν είχε συμπεριληφθεί στην MGIT). Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι SEMA3B είναι ένας αναστολέας της ανάπτυξης των ανθρώπινων κυττάρων SCLC

in vivo

.

ηλεκτροφόρημα των multiplex PCR από τα πλασμίδια, κλώνοι και SCID ποντίκια όγκους των τριών γονιδίων. Μ-δείκτη, 1-PCR από το πλασμίδιο Pete /

SEMA3B

, 2-PCR από το πλασμίδιο Pete /

TUSC2

, 3-PCR από το πλασμίδιο Pete /

ZMYND10

, 4 -PCR από U7111 /

SEMA3B

κυτταρικού κλώνου 1, 5-PCR από U7111 /

TUSC2

κυτταρικού κλώνου 3, 6-PCR από U7111 /

ZMYND10

κυτταρικό κλώνο 4, 7-μικτή κλώνους κυττάρων, 8-PCR από όγκου 1, 9-PCR από όγκο 2, 10-PCR από όγκο 3, 11-αρνητικού μάρτυρα.

Η

Επίδραση του

SEMA3B

διαγονίδια για την ανάπτυξη του όγκου σε SCID ποντίκια και αγγειογένεση

το U2020 υπο-line με όρους

SEMA3B

έκφραση υπό έλεγχο δοξυκυκλίνη εμβολιάστηκε σε SCID ποντίκια υποδορίως. Τέσσερα ποντίκια έλαβαν δοξυκυκλίνη στο πόσιμο νερό (+ ποντικοί DOX, έλεγχος) και πέντε δεν χορηγήθηκαν δοξυκυκλίνη (-ΟΟΧ ποντίκια). Η έναρξη των συμπαγών όγκων που εκφράζουν ενεργά

SEMA3B

δεν παρατηρήθηκε σε 4 από τα 5 περιπτώσεις (Σχήμα 3, κόκκινη γραμμή). Στην ενεργή ανάπτυξη όγκου ποντικού πέμπτης DOX (Σχήμα 3, κίτρινη γραμμή) άρχισε μία εβδομάδα αργότερα σε σύγκριση με τον έλεγχο (Εικόνα 3, μπλε γραμμή), παρά την παρουσία του

SEMA3B

στο κατασκεύασμα. Ωστόσο, η έκφραση του

SEMA3B

γονίδιο δεν ανιχνεύτηκε σε αυτόν όγκου σύμφωνα με ανάλυση κηλίδος Northern (δεδομένα δεν παρουσιάζονται) υποδηλώνοντας απώλεια του

SEMA3B

σε αυτά τα κύτταρα. Οι όγκοι (που παρατηρήθηκαν σε

SEMA3B

-OFF ποντικοί) είχαν τομείς του πολλαπλασιασμού των κυττάρων δραστικής, σε αντίθεση με τους ιστούς που λαμβάνονται από τις περιοχές των ενέσεων κυττάρου (σε

SEMA3B

-ON ποντίκια), στην οποία παρατηρήθηκαν άφθονη ινώδης και ανεπαρκώς διαφοροποιημένο κυτταρικό στρώμα και νεκρωτικές περιοχές. Τα στοιχεία αυτά καταδεικνύουν την δυνατότητα

SEMA3B

καταστολή του όγκου δραστηριότητας σε ποντίκια SCID

Ο ρυθμός αύξησης των U2020 κυττάρων (U7111 κλώνος) σε ποντίκια SCID:. Blue line-U2020 κύτταρα χωρίς να

SEMA3B

έκφραση (+ δοξυκυκλίνη, 4 ποντίκια), κόκκινη και κίτρινη γραμμή-U2020 κύτταρα με

SEMA3B

έκφρασης (- δοξυκυκλίνη, 4 ποντίκια και 1 ποντίκι αντίστοιχα). * -δεν Έκφραση του

SEMA3B

γονιδίου σύμφωνα με την κηλίδα Northern (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Μία + DOX και ένα-ϋΟΧ ποντικοί αποσύρθηκαν από την μελέτη μετά από ένα μήνα

Η

Οι ιστοί από δύο θέσεις του U2020 κύτταρα εμβολιασμό αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας χρώση CD31 και δοκιμασία TUNEL:. Ένα SEMA3B αρνητικά (Σχ 4Α και 4Β) και ένα SEMA3B-θετικών (Σχήμα 4C και 4D) ποντικού. αντισώματα ποντικού αντι-CD31 χρησιμοποιήθηκαν για να βάψουν μικροαγγείων αίματος. Ένα πολύ μικρό αριθμό μικροαγγείων ανιχνεύθηκε σε SEMA3B-θετικούς ιστούς. Ένα θραύσμα που περιέχει μία από τις μικροαγγείων-σαν αντικείμενα παρουσιάζεται στο σχήμα 4Γ. σήμα μικροαγγείων (πράσινο κανάλι) συν-εντοπισμένη με σήμα από ερυθροκύτταρα (ερυθρά κανάλι) με αποτέλεσμα να κίτρινου χρώματος περιοχές στο Σχ 4Α. Ωστόσο, SEMA3B αρνητικά συμπαγείς όγκους αποδειχθεί αφθονία επίμηκες, συμπιεσμένα αγωγούς αίματος με φθορισμό τυπικό να επιθήλια. Αυτές οι αγωγοί του όγκου ήταν επίσης συν-εντοπισμένη με ερυθροκύτταρα (Εικόνα 4Α). Αυτό θα μπορούσε να υποστηρίξει ένα ρόλο της SEMA3B ως αναστολέας της αγγειογένεσης. Ωστόσο, απαιτούνται περαιτέρω πειράματα σχετικά με την εκτεταμένη δειγματοληψία που απαιτείται για να αποδείξει αυτή την πρόταση

(Α, Β). –

SEMA3B

είναι OFF (ποντικός έλαβε δοξυκυκλίνη στο πόσιμο νερό). (C, D) –

SEMA3B

είναι ON (ποντίκι δεν χορηγήθηκαν δοξυκυκλίνη). (A, C) -χρώση με αντι-CD31 για την παρακολούθηση των αιμοφόρων αγγείων (πράσινο σήμα). Όταν

SEMA3B

είναι OFF, οι περιοχές γεμίζουν με ερυθροκύτταρα (κόκκινο σήμα) δει. Κίτρινο σήμα δείχνει συν-εντοπισμό του πράσινου και του κόκκινου σήματα. Μπλε σήμα αντιστοιχεί στο DNA. δοκιμασία -TUNEL (Β, D). Παρατηρήστε την περιοχή με αποπτωτικά κύτταρα (πράσινο σήμα), όπου το

SEMA3B

γονίδιο εκφράζεται.

Η

Υποθέσαμε ότι οι SEMA3B-θετικών κυττάρων στις περιοχές χωρίς αιμοφόρα αγγεία και τα ερυθροκύτταρα υποβάλλονται κυτταρικό θάνατο. Για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, τα τμήματα των ίδιων θραυσμάτων ιστού αναλύθηκαν με μία δοκιμασία TUNEL, μία τεχνική που επιτρέπει την ανίχνευση αποπτωτικών κυττάρων. (Σχήμα 4Β, 4D). Μια τεράστια έκταση των αποπτωτικών κυττάρων παρατηρήθηκε σε δείγμα ιστού SEMA3B θετικά ενώ δεν αποπτωτικών περιοχή παρατηρήθηκε σε SEMA3B-αρνητικούς όγκους. Σε αυτή την περίπτωση, υποθέσαμε ότι η έκφραση του

SEMA3B

ανάπτυξη καταστέλλεται όγκου

in vivo

, πιθανόν από την επαγωγή της απόπτωσης. Η αναστολή της αγγειογένεσης θα μπορούσε να προταθεί επίσης.

Η μεθυλίωση του υποκινητή και εσωνίου

SEMA3B

CpG-νησιά του πνεύμονα και νεφρικών κυττάρων και σε πρωτογενή όγκων με όξινο θειώδες αλληλουχίας και μεθυλίωσης-ειδική PCR

το

SEMA3B

γονίδιο αποτελείται από 18 εξώνια και περιέχει δύο CpG-νησιά: το ένα βρίσκεται στην περιοχή του υποκινητή (1-ος CpG-νησί, hg38 /CHR3: 50,267,308-50,267,797, 22 CpG- δινουκλεοτίδια) και το άλλο στο πρώτο ιντρόνιο (2-ος CpG-νησί, hg38 /CHR3: 50,268,972-50,269,271, 12 CpG-δινουκλεοτίδια). Αναλύσαμε το προφίλ μεθυλίωση του 16-CpG δινουκλεοτίδια του προαγωγού CpG-νησί σε καρκινικές κυτταρικές γραμμές 5 πνεύμονα (SCLC 3 και 2 NSCLC) και 12 NSCLC πρωτογενείς όγκους χρησιμοποιώντας διθειώδους αλληλουχίας (5 ADC και 7 SCC, βλέπε Σχήμα 5Α). Πυκνά μεθυλίωση (& gt? Το 40% των αναλυθέντων CpGs ήταν μεθυλιωμένα) του προαγωγού CpG-νησί του

SEMA3B

γονίδιο παρατηρήθηκε σε 2 από 3 SCLC κυτταρικές γραμμές, αλλά σε καμία από τις κυτταρικές σειρές NSCLC (NCI -H157 και NCI-H647). Ωστόσο, σε όλες 7 SCC πρωτογενείς όγκους και σε 2 από 5 ADC πρωτογενών όγκων, μεθυλίωση ανιχνεύθηκε σε 2-12 των CpGs. Επιπλέον, εξετάσαμε το προφίλ μεθυλίωσης σε 9 νεφρικών καρκινικών κυτταρικών γραμμών και 25 πρωτογενείς όγκους ccRCC (Σχήμα 5Β). Πυκνά μεθυλίωση του υποκινητή CpG-νησί παρατηρήθηκε σε 8 από τα 9 κυτταρικές σειρές και 11 της 25 ccRCC πρωτογενών όγκων. Μεταξύ συμφωνημένα ιστολογική φυσιολογικούς ιστούς, μεθυλιωμένα CpGs ανιχνεύθηκαν μόνο σε 2 από 25 περιπτώσεις ccRCC και σε καμία από 12 περιπτώσεις NSCLC (Σχήμα 5Α και 5Β).

δεδομένα Bisulfite αλληλούχιση, 16 CpG δινουκλεοτίδια-(2-17) του CpG-νησί είναι δεδομένη. Γκρι τετράγωνα δείχνουν μεθυλιωμένων CpG δινουκλεοτιδίων-, λευκά τετράγωνα-μεθυλιωμένη. Οι αριθμοί των πρωτογενών όγκων αντιστοιχούν σε εκείνα του Πίνακα S1. Οι τολμηρές αριθμοί των CpG-δινουκλεοτίδια (3-4 και 9-12) υποδεικνύουν τη θέση των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για τη μέθοδο MSP.

Η

Στη συνέχεια, αξιολογήσαμε τις συχνότητες μεθυλίωση των δύο CpG-νησιά του

SEMA3B

γονίδιο με τη μέθοδο MSP χρησιμοποιώντας ένα αντιπροσωπευτικό σύνολο των πρωτογενών όγκων. Η συχνότητα της μεθυλίωσης του υποκινητή CpG-νησί ήταν 44% (7/16) στην ADC, 45% (10/22) στην SCC και 52% (43/83) στην ccRCC. Η ιντρονική CpG-νησί μεθυλιώθηκε ελαφρώς μικρότερη από την νησί υποκινητή σε δύο ιστολογικών τύπων του NSCLC (ADC -38%, 6/16? SCC -32%, 7/22), και ccRCC (39%, 32/83? Πίνακας 2). Οι συχνότητες μεθυλίωση των δύο νησιών ήταν σημαντικά υψηλότερα σε καρκινικούς ιστούς από ό, τι σε ζεύγη ιστολογικά φυσιολογικούς ιστούς (

P

≤ 0,04, βλέπε Πίνακα 2). Έτσι, η μεθυλίωση των δύο CpG-νησιά του

SEMA3B

γονίδιο είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα του πνεύμονα και καρκίνο του νεφρού. Όπως ήταν αναμενόμενο, η μεθυλίωση του ούτε η 1-ου, ούτε η 2-ου

SEMA3B

CpG-νησί ανιχνεύθηκε σε οποιαδήποτε δείγματα DNA που απομονώθηκε από λεμφοκύτταρα αίματος από υγιείς δότες (n = 15). Τα δεδομένα MSP ήταν σε συμφωνία με τα αποτελέσματα αλληλούχισης οξίνου θειώδους για κάθε τύπο καρκίνου διερευνηθεί.

Η

Η χρήση ενός αντιπροσωπευτικό σύνολο των πρωτογενών όγκων μας επέτρεψε να αποκαλύψει πιθανές συσχετίσεις μεταξύ της συχνότητας μεθυλίωση του υποκινητή και ιντρονική CpG-νησιά με τις παθολογικές και ιστολογικές παραμέτρους των όγκων. Σύνθετη ccRCC και NSCLC όγκοι είχαν υψηλότερη συχνότητα CpG-νησί μεθυλίωσης σε σύγκριση με τα αρχικά στάδια (Πίνακες 2 και 3). Η ισχυρότερη συσχέτιση παρουσιάστηκε για SCC (συντελεστές συσχέτισης Spearman rank ήταν ίση 0.37,

P

= 0.09 και 0.60,

P

& lt? 0,01, για την 1-ος και για το 2- nd CpG-νησί, αντίστοιχα). Μια θετική συσχέτιση παρατηρήθηκε μεταξύ του βαθμού του όγκου και της συχνότητας των CpG-νησί μεθυλίωσης για NSCLC και ccRCC (Πίνακας 3). Η συσχέτιση αυτή ήταν ισχυρότερη από την συσχέτιση μεταξύ το στάδιο του όγκου και της συχνότητας των CpG-νησί μεθυλίωση για τις δύο ιστολογικών τύπων του NSCLC και σχεδόν ίσες με εκείνες για ccRCC (Πίνακας 3).