Αφηρημένο

Cdc7-Dbf4 κινάσης ή DDK (Dbf4-εξαρτώμενη κινάση) είναι υποχρεωμένη να κινήσει την αντιγραφή του DNA με φωσφορυλίωση και ενεργοποίηση της αντιγραφικής ελικάσης Mcm2-7 DNA. DDK υπερεκφράζεται σε πολλά καρκινικά κύτταρα και είναι μια αναδυόμενη χημειοθεραπευτικός στόχος διότι η αναστολή DDK προκαλεί απόπτωση των διαφόρων τύπων καρκινικών κυττάρων αλλά όχι των φυσιολογικών κυττάρων. ΡΗΑ-767491 και XL413 είναι μεταξύ ενός αριθμού ισχυρών αναστολέων DDK με χαμηλή νανομοριακή IC

50 τιμές έναντι της καθαρισμένης κινάσης. Παρά το γεγονός ότι XL413 είναι άκρως επιλεκτική για DDK, η δραστηριότητά της δεν έχει χαρακτηριστεί εκτενώς σε κυτταρικές σειρές. Μετρήσαμε αντι-πολλαπλασιαστική και αποπτωτικά αποτελέσματα του XL413 σε ένα πάνελ κυτταρικών γραμμών όγκου σε σύγκριση με ΡΗΑ-767491, της οποίας η δραστηριότητα είναι καλά χαρακτηρισμένο. Και οι δύο ενώσεις ήταν αποτελεσματικές βιοχημικές αναστολείς DDK, αλλά εκπληκτικά, τις δραστηριότητές τους σε κυτταρικές σειρές ήταν εξαιρετικά αποκλίνουσες. Σε αντίθεση με PHA-767491, XL413 είχε σημαντική αντι-πολλαπλασιαστική δραστικότητα έναντι μόνο μία από τις δέκα κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν. Επειδή XL413 δεν αναστέλλει αποτελεσματικά DDK σε πολλαπλές κυτταρικές σειρές, η ένωση αυτή πιθανόν έχει περιορισμένη βιοδιαθεσιμότητα. Για τον εντοπισμό δυνητικών οδηγεί για επιπλέον αναστολείς DDK, ελέγξαμε επίσης την διασταυρούμενη αντιδραστικότητα των -400 γνωστών αναστολέων της κινάσης κατά DDK χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία μετατόπισης θερμική σταθερότητα DDK (TSA). Εντοπίσαμε 11 ενώσεις που σταθεροποιείται σημαντικά DDK. Αρκετές ανέστειλε DDK με συγκρίσιμη ισχύ με την PHA-767491, συμπεριλαμβανομένων των Chk1 και αναστολείς κινάσης PKR, αλλά είχε αποκλίνουσες χημική ικριώματα από γνωστούς αναστολείς DDK. Στο σύνολό τους, τα στοιχεία αυτά δείχνουν ότι πολλά γνωστά αναστολείς κινάσης διασταυρούμενη αντίδραση με DDK και υπογραμμίζουν επίσης την ευκαιρία να σχεδιάσουν πρόσθετες ειδικές, βιολογικά ενεργά αναστολείς DDK για χρήση ως χημειοθεραπευτικούς παράγοντες

Παράθεση:. Sasi NK, Tiwari Κ, Σύντομα FF, Bonte D, Wang Τ, Melcher K, et al. (2014) Η Ισχυροί Cdc7-Dbf4 (DDK) κινάσης αναστολέα XL413 έχει περιορισμένη δραστηριότητα σε πολλές γραμμές καρκινικών κυττάρων και της Discovery πιθανών νέων DDK Αναστολέας σκαλωσιές. PLoS ONE 9 (11): e113300. doi: 10.1371 /journal.pone.0113300

Επιμέλεια: Ιρίνα Β Λεμπέντεβα, το Πανεπιστήμιο Columbia, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 30 του Ιουνίου 2014? Αποδεκτές: 23, Οκτωβρίου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 20 Νοέμβρη του 2014

Copyright: © 2014 Sasi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από τον Van Andel Ινστιτούτο (KM HEX MW) και το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (R01-DK071662 HEX). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Κανένας από τους συγγραφείς έχει καμία σχέση με τον Δρ Tong Wang ή την εταιρεία Μεταγραφική Φαρμάκων ανάπτυξης, Inc. πλην μέσω της παροχής βοήθειας επινόηση Δρ Wang και το συντονισμό της σύνθεσης των δύο ενώσεων οι συγγραφείς χρησιμοποίησαν στη μελέτη, για το οποίο είναι ένα coauthor σε αυτό το χειρόγραφο. Επίσης, δεν υπάρχουν περιορισμοί για την ανταλλαγή δεδομένων ή υλικά.

Εισαγωγή

Η έναρξη της αντιγραφής του DNA είναι χρονικά χωρίζεται σε δύο φάσεις κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου. Πρώτον, μια αδρανής μορφή της αντιγραφικής MCM (συντήρηση mini-χρωμόσωμα) ελικάσης φορτώνεται DNA προέλευσης στη φάση G1 και, στη συνέχεια, ενεργοποιείται κατά την είσοδο και κατά την S φάση από δύο σύνολα κινασών: εξαρτώμενη από κυκλίνη κινάση και Dbf4 εξαρτώμενη κινάση ( DDK) [1]. DDK είναι ένα δύο-υπομονάδα Ser /Thr κινάση που αποτελείται από την κινάση Cdc7 και Dbf4 ρυθμιστικές υπομονάδες. DDK μεσολάβηση φωσφορυλίωση του ελικάση έξι-υπομονάδα Mcm2-7 (MCM) πιστεύεται ότι επιφέρει μια διαμορφωτική αλλαγή στη δομή του που οδηγούν στην ενεργοποίηση ελικάση [2], [3]. ενεργοποίηση MCM ακολουθείται από εντοπισμένη DNA ξετύλιγμα, την πρόσληψη των μηχανημάτων replisome και την έναρξη σύνθεσης αμφίδρομης DNA [1]. Άλλες λειτουργίες του DDK περιλαμβάνει τη διευκόλυνση των χρωμοσωμικών διαχωρισμού σε μίτωσης και της μείωσης [4], [5], την έναρξη του μειωτικού ανασυνδυασμού [6], [7], και την ενεργοποίηση των μονοπατιών επιδιόρθωσης του DNA, συμπεριλαμβανομένων επιδιόρθωσης του DNA trans-βλάβη [8], [9].

δραστηριότητα κινάσης Cdc7 εξαρτάται από την συνεργασία με τη ρυθμιστική υπομονάδα του, Dbf4 [10], [11]. Dbf4 είναι μία ρυθμιζόμενη πρωτεΐνη του κυτταρικού κύκλου του οποίου η αφθονία κορυφές κατά τη διάρκεια της φάσης S και, στη συνέχεια, αποικοδομείται από τέλος της μίτωσης [12] – [14]. Αλληλεπίδραση με Dbf4 είναι απαραίτητη για την πρόσδεση Cdc7 ΑΤΡ και αναγνώρισης υποστρώματος [15]. Όπως όλα κινάσες πρωτεΐνης, η κρυσταλλική δομή DDK αποκαλύπτει μια δραστική θέση σε μια βαθιά σχισμή μεταξύ του Ν- και Ο-τερματικό λοβούς [16], [17]. Η Dbf4 Ζη-δακτύλου ( «μοτίβο C») συνδέεται με το Ν-τελικό λοβό του DDK και είναι απαραίτητη για την δραστηριότητα του ανθρώπου DDK αλλά δεν είναι απαραίτητη για την εκβλάστηση ή δραστικότητα κινάσης DDK σχάσης ζύμη [18] – [20]. Dbf4 μοτίβο M ενισχύει τη σύνδεσή του με την υπομονάδα Cdc7 και απαιτείται για την πλήρη δραστικότητα της κινάσης σε ζυμομύκητες και σε ανθρώπους [16], [18], [19], [21]. DDK φωσφορυλιώνει πολλαπλές υπομονάδες του ελικάση MCM [22] – [24]. Και μια πρόσφατη μελέτη σε εκκολαπτόμενους μαγιά δείχνει ότι Cdc7 και Dbf4 φυσικά αλληλεπιδρούν με ξεχωριστές υπομονάδες του Mcm2-7 συγκρότημα [25]

DDK είναι υπερεκφράζεται σε έναν αριθμό πρωτογενών όγκων και κυτταρικών γραμμών όγκου [26] – [32]. DDK υπερέκφραση έχει επίσης συσχετιστεί με φτωχή πρόγνωση σε καρκίνους του μαστού [33], η προηγμένη κλινικό στάδιο σε καρκίνωμα των ωοθηκών [34], και με την επιθετική φαινοτύπου σε θηλώδεις καρκινώματα του θυρεοειδούς [35]. Η ρύθμιση των επιπέδων των DDK σε καρκινικά κύτταρα είναι μια ελκυστική θεραπευτική στρατηγική του όγκου. Χρησιμοποιώντας αντισώματα εξουδετέρωσης, Hunter και οι συνεργάτες ήταν η πρώτη που δείχνει ότι εξάντληση DDK οδηγεί σε σοβαρή διαταραχή της αντιγραφής του DNA σε κύτταρα HeLa [10]. Χρησιμοποιώντας μικρά RNAs παρεμβολής, Santocanale και οι συνεργάτες έδειξαν περαιτέρω ότι εξάντληση DDK οδήγησε σε ρ53-ανεξάρτητη απόπτωση σε κύτταρα HeLa ενώ ένα φυσιολογικό ανθρώπινο δερματικό κυτταρική γραμμή ινοβλαστών υποβλήθηκε σε μια αναστρέψιμη διακοπή του κυτταρικού κύκλου [36]. κύτταρα HeLa δεν ήταν σε θέση να συλλάβουν κατά τη μετάβαση φάσης G1-S, προχωρεί μέσα από ένα θανατηφόρο φάση S με αποτέλεσμα κυτταρικό θάνατο μέσω απόπτωσης. Αυτό το εύρημα έχει επιβεβαιωθεί σε ένα αριθμό διαφορετικών κυτταρικών γραμμών [37] – [39]. Σημαντικά, θάνατος κυττάρου όγκου που προκαλείται από την εξάντληση του DDK δεν συνοδεύεται από την επαγωγή των γνωστών δεικτών ελέγχου. Παρόμοιες κυτταρικές αποκρίσεις που φαίνεται κατά την εξάντληση των άλλων συστατικών της μηχανής έναρξης αντιγραφής, συμπεριλαμβανομένων των Cdc6, Cdc45 και MCM2 υπομονάδες [40], [41]. Η ειδική θανάτωση των καρκινικών κυττάρων που παρατηρείται από την εξάντληση των DDK προκάλεσε το ενδιαφέρον ως φαρμακευτικό στόχο για τη θεραπεία του καρκίνου. Οι προσπάθειες από πολλαπλές φαρμακευτικές εταιρείες έχουν οδηγήσει σε μια σειρά από μικρού μορίου αναστολέων DDK (Σχήμα 1).

Η

Ο πρώτος αναστολέας καλά χαρακτηρίζεται DDK ήταν ένα μόριο pyrrolopyridinone (PHA-767491, Εικόνα 1) [42 ], [43]. Είναι ένας ισχυρός αναστολέας DDK με IC

50 10 ηΜ χρησιμοποιώντας καθαρισμένη κινάση. ΡΗΑ-767491 είναι επίσης ένας αποτελεσματικός αναστολέας της κυτταρικής ανάπτυξης, με μέσο όρο IC50 = 3.14 μΜ μεταξύ 61 κυτταρικές γραμμές όγκου [43]. ΡΗΑ-767491 αναστέλλει επίσης καθαρισμένο CDK9 με IC

50 από 34 nm και είναι μια πολύ λιγότερο ισχυρός αναστολέας πολλών άλλων κινασών δοκιμαστεί [43]. Ως εκ τούτου, PHA-767491 είναι ένας διπλός αναστολέας DDK /CDK9. Πρόσφατες μελέτες έχουν προτείνει ότι η αναστολή της CDK9, μια κινάση που στοχεύει RNA πολυμεράση II, θα μπορούσαν να ενισχύσουν την αποπτωτική απόκριση που επάγεται από ΡΗΑ-767491 σε ορισμένες κυτταρικές γραμμές [43] – [45]. Τροποποιήσεις αυτής της ένωσης οδήγησε στην ταυτοποίηση πολλών άλλων ισχυρών αναστολέων του DDK με κάποια εμφανίζουν ανώτερη επιλεκτικότητα και ευαισθησία [46] – [48]. XL413, μία δομικά διακριτή αναστολέας DDK, είναι μια ένωση που βασίζεται benzofuropyrimidinone με μια αναφερόμενη IC

50 3,4 nM έναντι καθαρίζεται DDK και αναστέλλει πολλαπλασιασμού των κυττάρων του Colo-205 κύτταρα με ένα IC

50 των 2,69 μΜ [49] . Ήταν επίσης άκρως επιλεκτική για DDK όταν δοκιμάστηκε έναντι ενός πάνελ 100 κινασών [49].

Η αυξημένη δραστικότητα και εκλεκτικότητα του XL413 επί ΡΗΑ-767491 ήταν ορθολογικά από την κρυσταλλική δομή του DDK σε σύμπλοκο με δύο DDK αναστολείς [16]. Ένας λόγος XL413 μπορεί να είναι μια πιο συγκεκριμένη αναστολέας είναι ότι έκανε επαφές με τρεις από τις πιο παραλλαγής υπολείμματα στην δραστική θέση κινάσης όταν συγκρίνεται με ΡΗΑ-767491, το οποίο αλληλεπιδρά με δύο από αυτά τα υπολείμματα. Επομένως, ήταν αναμενόμενο να βρεθεί ότι XL413 δεν ήταν ιδιαίτερα ισχυρός αναστολέας της κυτταρικής ανάπτυξης στις περισσότερες από τις κυτταρικές σειρές που εξετάσαμε, αφού Cdc7 είναι απαραίτητη για την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. XL413 ανέστειλε πολλαπλασιασμό και την απόπτωση που επάγεται σε Colo-205 κύτταρα όπως δείχνεται προηγουμένως [49] αλλά είχαν περιορισμένη δραστικότητα σε 9 άλλες κυτταρικές γραμμές όγκου που εξετάστηκαν. Παρά το γεγονός ότι και οι δύο ενώσεις είναι συγκρίσιμες βιοχημικές αναστολείς DDK, PHA-767491 επέδειξε ανώτερη δραστηριότητα σε XL413 σε κυτταρικές σειρές. Ανάλυση DDK-ειδικά επίπεδα φωσφορυλίωσης MCM2 προτείνει ότι XL413 μπορεί να έχει μικρή βιοδιαθεσιμότητα σε αυτές και σε άλλες καρκινικές κυτταρικές σειρές. Για να βοηθηθεί η ανάπτυξη επιπρόσθετων αναστολέων DDK, ελέγξαμε εάν αναστολείς κινάσης γνωστής πρωτεΐνης (δηλαδή, αυτά που δεν έχουν σχεδιαστεί για την αναστολή DDK) εμφάνισαν διασταυρούμενη αντίδραση με DDK. Εμείς διαλογή ~ 400 ενώσεις χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία μετατόπισης θερμική σταθερότητα (TSA) και προσδιόρισε 12 μόρια που μετατόπισε τη θερμική σταθερότητα του DDK, αρκετές με αποκλίνουσες χημική ικριώματα και με σχεδόν ισοδύναμη δραστικότητα ως ΡΗΑ-767491. Αυτές οι ενώσεις συνεπώς είναι απίθανο να είναι εξαιρετικά ειδικό για ένα μόνο στόχο. Τα δεδομένα μας υπογραμμίζουν την ευκαιρία να σχεδιάσουν πρόσθετες ειδικές, βιολογικά ενεργά αναστολείς DDK για χρήση ως χημειοθεραπευτικούς παράγοντες.

Υλικά και Μέθοδοι

Σύνθεση PHA-767491 και XL413

Το DDK αναστολείς, PHA-767491 και XL413, συνετέθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [42], [49]. Η ανάλυση HPLC και φασματομετρία μάζας πραγματοποιήθηκαν σε δύο ενώσεων, η οποία επιβεβαίωσε την σωστή μοριακή μάζα και ένα υψηλό επίπεδο καθαρότητας (& gt? 99%) και για τις δύο

Οι κυτταρικές σειρές

κύτταρα HeLa (ATCC. ) καλλιεργήθηκαν σε ΜΕΜ συμπληρωμένο με άλατα Earle, 2 mM γλουταμίνη, 10% ορό απενεργοποιημένο με θέρμανση εμβρυϊκό ορό (ΗΙ FBS), 1,5 g όξινου ανθρακικού /L νάτριο, 0,1 mM μη-απαραίτητα αμινοξέα, 1 mM πυροσταφυλικό νάτριο, 50 μονάδες /ml πενικιλλίνης, και 50 μg /ml στρεπτομυκίνης. κύτταρα MDA-MB-453 (ATCC) αναπτύχθηκαν σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 4,5 g /L ϋ-γλυκόζη, 4 mM L-γλουταμίνη, 110 mg /L πυρουβικό νάτριο, 10% ΗΙ FBS, 50 μονάδες /ml πενικιλλίνης, και 50 μg /ml στρεπτομυκίνης. HCC1954 (ATCC), HCC1187 (ATCC), ΒΤ-549 (NCI-60), MCF-7 (NCI-60), και Colo-205 (NCI-60) κύτταρα ήταν όλα καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% ΗΙ FBS, 50 μονάδες /ml πενικιλλίνης, και 50 μg /ml στρεπτομυκίνης. HCT-116 p53

+ /+ και p53

– /- κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε μέσο McCoy 5Α συμπληρωμένο με 10% FBS ΗΙ, 50 μονάδες /ml πενικιλλίνης, και 50 μg /ml στρεπτομυκίνης. Όλα τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C με 5% CO

2 σε υγροποιημένο επωαστή.

DDK επαγωγή πρωτεΐνης

pKT37 είναι ένα pETDuet-1 (Novagen) -φορέα ότι συν- εκφράζει His6-Smt3-HsCdc7 (κωδικόνιο βελτιστοποιημένο, Genescript) και τα κατάλοιπα 341 έως 674 Dbf4, το οποίο περιέχει μοτίβα M και C που απαιτούνται να δεσμεύσει και να ενεργοποιήσει Cdc7.

Ε. coli BL21

-RIPL μετασχηματίστηκε με pKT37 και ένα φρέσκο ​​αποικία αναπτύχθηκε όλη τη νύκτα σε LB που περιέχει 150 μg /ml αμπικιλλίνη, 50 μg /ml χλωραμφενικόλης και 1% γλυκόζη. Δύο λίτρα LB που περιέχει 150 μg /ml αμπικιλλίνη και 50 μg /ml χλωραμφαινικόλη ενοφθαλμίστηκαν με ~ 60 ml από ολονύκτια καλλιέργεια για να δώσει ένα OD

600 0,1. Η καλλιέργεια αναπτύχθηκε σε OD

600 0,8 και στη συνέχεια επάγονται για 6 ώρες με 0,5 mM IPTG, στους 25 ° C. Το κυτταρικό ίζημα αιωρήθηκε σε 20 mls Νί-ΝΤΑ ρυθμιστικό διάλυμα Α (20 mM HEPES-NaOH (ρΗ 7.4), 250 mM NaCl, 10% γλυκερίνη) με κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης 1X (Roche) και 1 mM β-μερκαπτοαιθανόλη. Ένα μικρο ρευστοποιητή χρησιμοποιήθηκε για να λυθούν τα κύτταρα, που ακολουθείται από φυγοκέντρηση 30 λεπτό (12.000 rpm, στροφείο F13) στους 4 ° C.

DDK καθαρισμό

DDK καθαρίστηκε βαθμηδόν χρησιμοποιώντας νικέλιο ΝΤΑ, SP Fast Flow, και S-200 στήλες. Το κυτταρόλυμα που περιέχει 35 mM ιμιδαζόλη εφαρμόστηκε σε μία στήλη Νί-ΝΤΑ 25 ml, πλένεται με 20 όγκους στήλης, και στη συνέχεια εκλούεται με ένα 250 ml 35 mM-150 mM ιμιδαζολίου κλίση. πρωτεϊνικά κλάσματα DDK (~115 mM ιμιδαζόλη) συνενώθηκαν και υποβλήθηκαν σε διαπίδυση όλη τη νύκτα στους 4 ° C έναντι 20 mM HEPES-NaOH, ρΗ 7,4, 1 mM EDTA, 10% γλυκερόλη, χωρίς ιμιδαζόλιο. Το προϊόν της διαπίδυσης στη συνέχεια πέρασε πάνω από τρεις στήλες 5 ml Ταχείας Ροής SP (συνδεδεμένο σε σειρά), πλύθηκε και εκλούστηκε με mM-0,5 βαθμίδα 100 ml 100 Μ NaCl. κλάσματα DDK πρωτεΐνη (~ 0,2 Μ) συνενώθηκαν, MgCl

2 προστέθηκε στην ομαδοποιημένη πρωτείνη για τη χηλικοποίηση EDTA, και επωάστηκαν με PP2C (6His-GST-Hab1) φωσφατάσης χρησιμοποιώντας μία ισοδύναμη ποσότητα χιλιοστόγραμμο προς τη συνολική πρωτεΐνη στην πισίνα , και 1/100 ισοδύναμη ποσότητα χιλιοστόγραμμο πρωτεάσης Ulp1 να διασπαστεί η ετικέτα His6-Smt3 (Sumo) στους 16 ° C όλη τη νύκτα. DDK αναλύθηκε επί 15% SDS γέλη για να ελέγξει την έκταση της αποφωσφορυλίωσης και της διάσπασης Sumo (το οποίο ήταν συνήθως μεγαλύτερη από 95%). Η πισίνα πρωτεΐνη φορτώθηκε σε μία δεύτερη στήλη Νί-ΝΤΑ (χωρίς ιμιδαζόλιο) και ρέει μέσω κλάσματα που περιέχουν DDK συνενώθηκαν, 1 mM EDTA προστέθηκε στο χηλικό δωρεάν Ni

++, και υποβλήθηκε σε διαπίδυση όλη τη νύκτα στους 4 ° C έναντι 20 mM HEPES (ρΗ 7,4), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA. Η πρωτεΐνη συμπυκνώθηκε χρησιμοποιώντας 30.000 MWCO σπιν (Amicon Ultra, Millipore) στους 4 ° C σε ένα τελικό όγκο 10 ml. Συμπυκνωμένη πρωτεΐνη φορτώθηκε σε στήλη αποκλεισμού γέλης 300 ml S-200 (Amersham-Pharmacia). HsCdc7-Dbf4 εκλούεται σε -150 kDa, κοντά στην τιμή διμερές 110 kDa. Η συνολική απόδοση ήταν τυπικά 6 έως 8 mg.

In vitro

δοκιμασίες ενεργοποίησης κινάσης

20 ng καθαρισμένου ανθρώπινου DDK προ-επωάστηκε με αυξανόμενες συγκεντρώσεις κάθε αναστολέα DDK για 5 min. Στη συνέχεια, 10 μCi (γ) –

32Ρ ΑΤΡ και 1,5 μΜ ψυχρού ΑΤΡ προστέθηκαν σε ένα ρυθμιστικό που περιέχει 50 mM Tris-HCl (ρΗ 7.5), 10 mM MgCl

2, και 1 mM DTT και επωάστηκε για 30 λεπτά στους 30 ° C. Οι πρωτεΐνες μετουσιώθηκαν σε ρυθμιστικό 1Χ Laemmli στους 100 ° C ακολουθούμενη από SDS-PAGE και αυτοραδιογραφία επί HyBlot CL φιλμ (Denville Scientific, Inc.). Auto-φωσφορυλίωση DDK χρησιμοποιήθηκε ως δείκτης της δραστικότητας της κινάσης του.

32Ρ-σημασμένο ζώνες ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ImageJ και το IC

50 τιμές υπολογίστηκαν με χρήση GraphPad (Prism 6).

Ανάλυση κυτταρικής βιωσιμότητας

Για δοκιμασίες σε πλάκες 96 φρεατίων 2500 κύτταρα τοποθετήθηκαν ανά φρεάτιο. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αναστολείς μικρού μορίου και επωάστηκαν για 72 ώρες στους 37 ° C. Ακολούθως τα κύτταρα λύθηκαν και η περιεκτικότητα σε ΑΤΡ μετρήθηκε ως δείκτης της μεταβολικά ενεργά κύτταρα χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία CellTiter-Glo (Promega). IC

50 τιμές υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό GraphPad. Για δοκιμασίες σε έξι φρεατίων, 100.000 κύτταρα τοποθετήθηκαν ανά φρεάτιο. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αναστολείς μικρού μορίου και επωάστηκαν για διάφορες χρονικές στιγμές. Τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και ένα εναιώρημα έγινε σε 5 ml αλατούχου φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος. 30 μΙ αυτού του αιωρήματος αναμίχθηκε με 30 μΙ αντιδραστηρίου CellTiter-Glo που ακολουθείται από μια επώαση 10 λεπτών σε θερμοκρασία δωματίου. Η φωταύγεια μετρήθηκε χρησιμοποιώντας EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) και BioTek Synergy Neo Microplate Reader.

Ανάλυση της δραστηριότητας κασπάσης 3/7

5000 κύτταρα ανά πηγάδι στρώθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αναστολείς μικρού μορίου και επωάστηκαν για 24 ώρες στους 37 ° C. Κασπάση 3/7 δραστηριότητα και αριθμού βιώσιμων κυττάρων στη συνέχεια μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία κασπάση-Glo 3/7 (Promega) και δοκιμασία CellTiter-Glo (Promega), αντίστοιχα. Η «δραστικότητα Caspase ανά κύτταρο» ελήφθη με ομαλοποίηση συνολική δραστηριότητα κασπάσης με τον αριθμό των κυττάρων.

Ανάλυση ανοσοκηλιδώσεως

ολόκληρου κυτταρικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν με εκ νέου εναιώρηση των σφαιριδίων σε ρυθμιστικό διάλυμα RIPA (150 mM NaCl , 1% που περιέχει αναστολείς πρωτεάσης (100 μΜ PMSF, 1 mM βενζαμίδιο, 2,5 μg ΝΡ-40, 0.5% δεοξυχολικό νάτριο, 0,1% SDS, 50 mM Tris HCl, ρΗ 8) /ml πεπστατίνη Α, 10 μg /ml λευπεπτίνη, και Οι αναστολείς 10 μg /ml απροτινίνης) και φωσφατάσης (1 mM το καθένα NaF, Na

3νο

4 και Na

4P

2O

7). Η συγκέντρωση πρωτεΐνης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης BCA (Pierce) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μια μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (Millipore). αποτελεσματικότητα της μεταφοράς και της ίσης φόρτωσης επιβεβαιώθηκε με χρώση Ponceau S. Μετά την πρωτοβάθμια και δευτεροβάθμια θεραπείες αντισωμάτων, πρωτεΐνες έγιναν ορατές χρησιμοποιώντας SuperSignal West Pico λύσεις (Thermo Scientific). Anti-MCM2 και αντι-S53-φωσφο-MCM2 αντισώματα αγοράστηκαν από Bethyl Laboratories? αντι-β-ακτίνης ήταν από τη Sigma? αντι-ποντικού και αντισωμάτων HRP αντι-κουνελιού ήταν από την GE Healthcare? και αντι-Cdc7 και αντι-Dbf4 αντισώματα έχουν περιγραφεί προηγουμένως [26].

Θερμική σταθερότητα Shift Assay (TSA)

Όλες οι αντιδράσεις επωάστηκαν σε 10 μΐ τελικό όγκο και αναλύθηκε σε 96- φρεατίων χρησιμοποιώντας 20 χ SYPRO Orange (Invitrogen) και 200 ​​μg /ml καθαρισμένου DDK [50]. Οι αντιδράσεις επωάστηκαν με ενώσεις αναστολέα σε πάγο για 30 λεπτά. Ενώσεις από τέσσερις βιβλιοθήκες αναστολέα κινάσης (Calbiochem I, II, III, Tocriscreen Αναστολέας Εργαλειοθήκη) εξετάστηκαν στα 20 μΜ για Τ

m αυξάνεται με συνολική συγκέντρωση DMSO 2% ή λιγότερο. Πειράματα θερμικής τήξης διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το StepOnePlus PCR Πραγματικού χρόνου System (Applied Biosystems) πρόγραμμα καμπύλη λιώσει με ρυθμό κλιμάκωσης 1 ° C και περιοχή θερμοκρασίας 15 ° C έως 85 ° C. Μεταγενέστερες TSAs στις 12 συμπτώσεων που λαμβάνονται πραγματοποιήθηκαν όπως παραπάνω, αλλά εις τριπλούν και χρησιμοποιώντας ένα 200-πλάσια περιοχή συγκεντρώσεων αναστολέα. Η ανάλυση των δεδομένων διεξήχθη όπως περιγράφεται [50]. θερμοκρασίες τήξης (Τ

m) υπολογίστηκαν με την τοποθέτηση της σιγμοειδούς καμπύλης τήξης με την εξίσωση Boltzmann χρησιμοποιώντας GraphPad Prism, με R

2 τιμές του & gt? 0.99. Η διαφορά σε Τ

m τιμές που υπολογίζονται για τις αντιδράσεις με και χωρίς ενώσεις είναι ΔΤ

m.

Αποτελέσματα

DDK αναστολείς παρουσιάζουν πολύ διαφορετικές κυτταρικές ισχύς

διαλογή ένα πάνελ καρκινικών κυτταρικών γραμμών 15 του μαστού για έκφραση Cdc7 και Dbf4 χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων έναντι κάθε υπομονάδα [26]. Η πλειοψηφία αυτών εκφράζουν οι υπομονάδες DDK ισοδύναμη με ή υψηλότερη από ΜΟΡ10Α, αθανατοποιημένη αλλά μη ογκογόνων μαστική επιθηλιακή κυτταρική γραμμή που χρησίμευσε ως έλεγχος μη-όγκου (Σχήμα 2). Χρησιμοποιήσαμε PHA-767491 και XL413 να αναστέλλουν DDK σε ένα πάνελ καρκινικών κυτταρικών γραμμών έξι μαστού που υπερεκφράζουν DDK σε διάφορα επίπεδα (που σημειώνονται με αστερίσκους στο Σχήμα 2). Αμφότερες οι ενώσεις έχουν αναφερθεί ότι έχουν αντι-πολλαπλασιαστικές δραστηριότητες στο χαμηλό μικρομοριακό εύρος [43], [49]. Ως έλεγχοι, συγκρίναμε αυτά τα αποτελέσματα σε ΡΗΑ-767491 θεραπεία των κυττάρων HeLa και θεραπεία XL413 του Colo-205 κύτταρα, τα οποία αναστέλλουν την DDK και επάγουν κυτταρικό θάνατο. Από Cdc7 κινάση είναι ένα ουσιαστικό πρωτεΐνη, αναστέλλοντας τη δράση του θα πρέπει πολλαπλασιασμό σημαντικά αργή ή τη σύλληψη των κυττάρων. ΡΗΑ-767491 ανέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό σε όλες τις κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν (Εικόνα 3Α, οι τιμές απεικονίζονται σε σχέση με τους μάρτυρες οχήματος). ΡΗΑ-767491 ήταν πιο αποτελεσματικός στις κυτταρικές σειρές HeLa και HCC1187 και είχαν τη μικρότερη επίδραση στην MCF-7 [43] και τις κυτταρικές γραμμές MDA-MB-453: 2-φορές και 2,5 φορές αναστέλλεται, αντίστοιχα. Σε αντίθεση, XL413 ήταν αντι-πολλαπλασιαστική μόνο στα κύτταρα Colo-205 (Σχήμα 3Α).

ανοσοστυπώματα που δείχνει τα επίπεδα έκφρασης του Cdc7 και Dbf4 σε κυτταρικές γραμμές όγκου. β-ακτίνης επίπεδα υποδεικνύουν ίση φόρτωση πρωτεϊνών.

Η

(Α) κυτταρικές σειρές Οκτώ όγκου υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 μΜ του κάθε αναστολέα DDK και η κυτταρική βιωσιμότητα μετρήθηκε 72 ώρες μετά την προσθήκη του φαρμάκου. Για τον προσδιορισμό της IC

50 τιμές, HCC1954 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις ΡΗΑ-767491 ή XL413 (Β) και η κυτταρική βιωσιμότητα μετρήθηκε 72 ώρες μετά την προσθήκη του φαρμάκου. Colo-205 κύτταρα κατεργάστηκαν με αυξανόμενες συγκεντρώσεις ΡΗΑ-767491 ή XL413 (D) και η κυτταρική βιωσιμότητα μετρήθηκε 72 ώρες μετά την προσθήκη του φαρμάκου. Η έκταση της απόπτωσης που επάγεται από τις ενώσεις σε κάθε κυτταρική σειρά σε σχέση με τον έλεγχο του οχήματος μετρήθηκε με δραστικότητα κασπάσης 3/7 και υποδεικνύεται στο (C, E). Όλα τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή τουλάχιστον τριών διαφορετικών μετρήσεων +/- SD και ήταν ιδιαίτερα αναπαραγώγιμη σε ξεχωριστές ημέρες.

Η

Στη συνέχεια εξετάστηκαν τα προφίλ δραστικότητας των δύο ενώσεων με περισσότερες λεπτομέρειες χρησιμοποιώντας τα XL413-ευαίσθητα ( Colo-205) και XL413 ανθεκτικά (HCC1954) κυτταρικές σειρές. Τα κύτταρα επωάστηκαν σε παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων των αναστολέων για 72 ώρες στους 37 ° C ακολουθούμενη από μετρήσεις κυτταρικής βιωσιμότητας. ΡΗΑ-767491 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό και στις δύο κυτταρικές σειρές με IC

50 από 0,64 μΜ σε HCC1954 κύτταρα και 1,3 μΜ σε Colo-205 κύτταρα (Σχήμα 3, Β και D), σε συνέπεια με το μέσο όρο 3,17 μΜ IC

50 αξία υπολογίζεται χρησιμοποιώντας ένα πάνελ 61 κυτταρικών γραμμών όγκου [43]. Σε αντίθεση, XL413 είχε IC

50 από 22,9 μΜ σε HCC1954 κύτταρα και 1,1 μΜ σε Colo-205 κύτταρα (Σχήμα 3, Β και D). Σε αντιστοιχία με τα δεδομένα βιωσιμότητας, PHA-767491 επαγόμενη απόπτωση τόσο στην HCC1954 και Colo-205 κύτταρα, αλλά XL413 επαγόμενη απόπτωση μόνο στα κύτταρα Colo-205 (Εικόνα 2, C και Ε). XL413 δεν ήταν ένας ειδικός αναστολέας της ορθοκολικού γραμμών όγκου επειδή είχε περιορισμένη επίπτωση στις δύο πρόσθετες κυτταρικές σειρές ορθοκολικού όγκου: XL413 έπρεπε 40- έως 60-φορές υψηλότερη IC

50 τιμές από ΡΗΑ-767491 στις γραμμές αυτές (Σχήμα S1 στο Αρχείο S1).

PHA-767491 και Xl413 είναι ισχυροί αναστολείς DDK

in vitro

η

η φτωχή δραστικότητα των XL413 στις περισσότερες κυτταρικές σειρές όγκου θα μπορούσε να είναι επειδή η παραγόμενη ένωση δεν είναι ένας αποτελεσματικός αναστολέας κινάσης. Για να ελεγχθεί αυτή η πιθανότητα, καθαρίσαμε ανασυνδυασμένη DDK και στη συνέχεια μετρήθηκε το IC

50 τιμές τόσο XL413 και ΡΗΑ-767491 επί καθαρισμένη κινάση. Εμείς συνυπάρχουσα εκφράζεται His6-SUMO-Cdc7 και Dbf4 σε βακτηριακά κύτταρα και στη συνέχεια καθαρίζεται το συγκρότημα όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Εν συντομία, DDK συνδέθηκε σε μία στήλη Νί-ΝΤΑ που ακολουθείται από έκλουση και απομάκρυνση της ετικέτας His6-SUMO. Χωρίς ετικέτα DDK ήταν τότε κλασματοποιήθηκε πάνω από μια στήλη Ταχείας Ροής SP που ακολουθείται από διαχωρισμό σε μία στήλη διήθησης πηκτής S-200. Κινάσης δοκιμασίες διεξήχθησαν με καθαρισμένο DDK (Σχήμα 4Α) παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων του κάθε αναστολέα (Σχήμα 4, Β και C). Τόσο PHA-767491 και XL413 ήταν αποτελεσματικοί αναστολείς DDK

in vitro

όπως φαίνεται στο παρελθόν [16], [42], [49] με IC

50 τιμές των 18,6 nM και 22,7 nM, αντίστοιχα. Δεδομένου ότι και οι δύο ενώσεις είναι αποτελεσματικοί αναστολείς DDK, οι σχετικές προφίλ κυτταρικής βιωσιμότητας δείχνουν ότι XL413 είναι ελλιπής σε ενεργεί στο στόχο του στο εσωτερικό του κυττάρου.

(Α) Coommassie χρώση πηκτώματος που δείχνει 1 μα καθαρισμένου DDK από βακτηριακά κύτταρα. (Γ) –

32Ρ ΑΤΡ DDK δοκιμασίες κινάσης σε παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων του ΡΗΑ-767491 (Β) ή XL413 (C). Κινάσης δραστηριότητες αντιπροσωπεύουν τον μέσο όρο των τεσσάρων ανεξάρτητων μετρήσεων +/- SD σε ξεχωριστές ημέρες.

Η

XL413 είναι ελαττωματικό στην αναστολή DDK-εξαρτώμενη φωσφορυλίωση MCM2 σε HCC1954 κύτταρα

Η αποτελεσματική κυτταρική πρόσληψη του αναστολέας DDK θα πρέπει να συμβιβαστεί δραστηριότητα DDK

in vivo

. Μεταξύ των πολλών στόχων DDK είναι συστατικά της αντιγραφικής ελικάσης Mcm2-7. Σερίνη 53 του MCM2 υπομονάδα είναι μια καλά χαρακτηρισμένη θέση στόχο για φωσφορυλίωση DDK μεσολάβηση [24]. Εμείς ποσοτικοποιηθεί επίπεδα φωσφορυλίωσης σε αυτό το site ως ένα μέτρο της δραστηριότητας DDK

in vivo

. HCC1954 κύτταρα επωάστηκαν σε παρουσία 1 μΜ ΡΗΑ-767491, 2 μΜ ΡΗΑ-767491 ή 5 μΜ XL413. Τα κύτταρα στη συνέχεια συλλέχθηκαν σε 0, 24, 48, και 72 ώρες μετά την προσθήκη του φαρμάκου για τη μέτρηση βιώσιμων κυττάρων και φωσφορυλίωση MCM2 με ανοσοστύπωση.

2 μΜ ΡΗΑ-767491 καταργήθηκε πλήρως MCM2 φωσφορυλίωση από 24 ώρες σε HCC1954 κύτταρα (Σχήμα 5Α), που αντιστοιχεί με του επίδραση στην κυτταρική ανάπτυξη και βιωσιμότητα (Σχήμα 5Β). Στην ίδια γραμμή κυττάρων, 1 μΜ ΡΗΑ-767491 είχε σαν αποτέλεσμα πολύ λίγο υπολειμματικό MCM2 φωσφορυλίωση 24 μέχρι 72 ώρες και ήταν επίσης αποτελεσματική στην αναστολή της βιωσιμότητας των κυττάρων και να επάγει τον κυτταρικό θάνατο. Σε αντίθεση, XL413 δεν ανέστειλε φωσφορυλίωση MCM2 στις 24 ώρες, ακόμη και σε υψηλότερη συγκέντρωση 5 μΜ (Εικόνα 5Α) και υπήρχε μόνο μια μέτρια μείωση στην φωσφορυλίωση MCM2 στις 72 ώρες. Αυτή η επίδραση παρατηρήθηκε επίσης στην δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας, όπου XL413 κατεργασμένα κύτταρα αυξήθηκαν ελαφρώς μόνο φτωχότερη από τα κύτταρα που έλαβαν φορέα (Σχήμα 5Β).

(Α) ανοσοστυπώματα που δείχνει τη φωσφορυλίωση MCM2 σε HCC1954 κύτταρα ή (Γ) Colo -205 κύτταρα παρουσία του DMSO, ΡΗΑ-767491, ή XL413. προφίλ (Β) Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων του HCC1954 κυττάρων ή (D) Colo-205 κύτταρα σε παρουσία DMSO, ΡΗΑ-767491, ή XL413. Τα δεδομένα βιωσιμότητας κυττάρων αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή δύο τουλάχιστον μετρήσεων +/- SD και ήταν ιδιαίτερα αναπαραγώγιμη σε διαφορετικές ημέρες.

Η

Δεδομένου ότι και οι δύο ενώσεις ήταν αποτελεσματικοί αναστολείς στα κύτταρα Colo-205, εξετάσαμε φωσφορυλίωση MCM2 σε αυτά τα κύτταρα μετά την προσθήκη του φαρμάκου. Και πάλι, 5 μΜ PHA-767491 καταργούνται πλήρως φωσφορυλίωση MCM2 από 24 ώρες και ήταν πολύ αποτελεσματική στην πρόκληση του θανάτου των κυττάρων (Σχήμα 5, C και D). Ωστόσο, σε αντίθεση με HCC1954 κύτταρα, XL413 ήταν ένας πολύ αποτελεσματικός αναστολέας της δραστηριότητας DDK σε Colo-205 κύτταρα. 5 μΜ XL413 καταργούνται πλήρως φωσφορυλίωση MCM2 στις 24 ώρες και ήταν εξίσου αποτελεσματικό με ΡΗΑ 767.491 στην επαγωγή κυτταρικού θανάτου (Σχήμα 5, C και D). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η αναστολείς δύο DDK παρουσιάζουν πολύ διαφορετικά προφίλ σε κυτταρικές γραμμές, παρά το γεγονός ότι και οι δύο ενώσεις είναι πολύ αποτελεσματικές αναστολείς κινάσης

in vitro

. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι XL413 δεν έχει ληφθεί μέχρι αποτελεσματικά σε πολλές κυτταρικές σειρές ή μεταβολίζεται γρήγορα ή να τροποποιηθεί σε ένα ανενεργό μορφή.

Οθόνη για να καθορίσει διασταυρούμενη αντιδραστικότητα των γνωστών αναστολέων της κινάσης με DDK

Για την αναγνώριση πρόσθετες χημικές δομές που είναι ικανές να αναστέλλουν DDK, ελέγξαμε μια ομάδα ~ 400 κινάσης αναστολέων έναντι καθαρισμένου DDK σε μία δοκιμασία θερμικής σταθερότητας μετατόπισης (TSA) [50]. Σε αυτή τη δοκιμασία, οι ενώσεις αναστολέα επωάστηκαν με καθαρισμένη DDK και έπειτα σε διαλογή με μία αυξανόμενη κλίση θερμοκρασίας να προσδιοριστεί το σημείο στο οποίο μετουσιώνουν (σε σχέση με DDK μόνο) ακολουθώντας τις αλλαγές φθορισμού της χρωστικής SYPRO Orange, η οποία δεσμεύεται σε υδρόφοβες επιφάνειες επί εκτυλίχθηκε πρωτεΐνες. Οι ενώσεις αναστολέα που προσδένονται εντός του θύλακα σύνδεσης ΑΤΡ DDK προβλέπεται για τη σταθεροποίηση της κινάσης, και ΔΤ

τιμές m (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι) του 2 ° C ή μεγαλύτερες θεωρούνται σημαντικές επιτυχίες. Τα πειραματικά αποτελέσματα της ένωσης 400 οθόνη που παρατίθεται στην Εικόνα S2 σε S1 αρχείου. Εντοπίσαμε 12 ενώσεις που προκάλεσε σημαντικές μεταβολές της θερμοκρασίας:. 11 ενώσεις αύξησε την Τ

m, και 1 ένωση (Γενιστεΐνη) μειώθηκε το Τ

m (Πίνακας S1 στο S1 αρχείου)

Για να εκτιμηθεί η συγγένεια της κάθε ένωσης για DDK μετρήσαμε ΔΤ

τιμές m για αυτές τις 12 ενώσεις σε μια 200-πλάσια περιοχή συγκεντρώσεων αναστολέα και συγκρίνονται αυτές τις τιμές σε ΡΗΑ-767491 (ένας ειδικός αναστολέας DDK), σταυροσπορίνη (έναν αναστολέα κινάσης πρωτεΐνης ευρύ φάσμα ), και DMSO σαν ένας έλεγχος του οχήματος. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται στην Εικόνα 6 αντιπροσωπεύουν κατά μέσο όρο τρεις ανεξάρτητες μετρήσεις. Η ένωση genistein, η οποία είναι ένας αναστολέας του EGFR, ήταν ασυνήθιστο το ότι αυξήθηκε ΔΤ

m σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις αναστολέα και στη συνέχεια μειώθηκε ΔΤ

m στα 5, 10 και 20 μΜ συγκεντρώσεις. Η αρχική οθόνη διεξήχθη με 20 μΜ αναστολέα και εξηγεί γιατί genistein βαθμολογήθηκε ως μείωση του Τ

m. Ίσως αυτή η ένωση συνδέεται με την DDK ΑΤΡ θύλακα σύνδεσης αλλά σε υψηλότερες συγκεντρώσεις διαταράσσει δεσμευτικός Cdc7-Dbf4. Κάθε μία από τις άλλες 11 ενώσεις έχει θετική ΔΤ

ms. Η εξέταση των τιτλοδοτήσεων ένωσης αποκαλύπτει ότι τρεις αναστολείς είχαν συγκρίσιμα προφίλ σε ΡΗΑ-767491 στο ότι προκάλεσε μία ΔΤ

m από ~ 2 ή περισσότερο αρχή σε μια συγκέντρωση 1 μΜ: έναν αναστολέα κινάσης Rho (Rockout), μια πρωτεϊνική κινάση R (PKR) αναστολέα, και ενός αναστολέα κινάσης Chk1 (SB218078). Τέσσερα επιπλέον ενώσεις, ο αναστολέας JAK3 VI, ΡΙ3-Κα αναστολέα VIII, UCN-01, και Κ-252α έδωσε 3-πλάσια ή υψηλότερη ΔΤ

m στα 5, 10 και 20 μΜ συγκεντρώσεις.

αυξανόμενες συγκεντρώσεις των 12 ενώσεων χτύπημα ανακαλύφθηκε σε μια 400 ένωση οθόνη (Πίνακας S1 στο αρχείο S1) ελέγχθηκαν έναντι καθαρού DDK χρησιμοποιώντας την TSA. ΡΗΑ-767491 (DDK ειδικός αναστολέας), σταυροσπορίνη (ευρεία αναστολέα κινάσης φάσματος) και DMSO εμφανίζονται ως έλεγχοι. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή τριπλών μετρήσεων +/- SEM.

Η

Οι δομές των κορυφαίων ενώσεων στην οθόνη TSA φαίνεται στο Σχήμα 7, αποκαλύπτοντας ένα ευρύ φάσμα δομικών κατηγοριών. K-252a είναι φυσικά αλκαλοειδές που σχετίζονται με σταυροσπορίνη που αναστέλλει μια ευρεία ποικιλία πρωτεϊνικών κινασών, συμπεριλαμβανομένων κινασών σερίνης /θρεονίνης και τις κινάσες τυροσίνης της οικογένειας Trk [51], [52]. Έτσι, η συμπερίληψη της K-252a σε αυτή τη λίστα (όπως σταυροσπορίνη) είναι ίσως δεν αποτελεί έκπληξη. Δεδομένου ότι είναι πολύ πιθανό ότι οι αναστολείς που ανακτώνται στην οθόνη TSA σταθεροποίηση DDK από την ικανότητά τους να δεσμεύουν το ΑΤΡ θύλακα σύνδεσης και αναστέλλουν DDK, πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς κινάσης χρησιμοποιώντας τις κορυφαίες έξι ενώσεις. Κινάσης αναλύσεις αποκάλυψαν ότι είναι πράγματι αναστολείς DDK (Σχήμα S3 στο αρχείο S1). Η Chk1 (SB218078) και οι αναστολείς PKR ήταν οι καλύτερες ενώσεις

in vitro

και ανέστειλε DDK με IC

’50 19,3 nM και 67,5 nM, αντίστοιχα (Σχήμα 8Α και το Σχήμα S3 στο S1 αρχείου). Είναι ενδιαφέρον ότι οι ΔΤ

m προφίλ των αναστολέων Chk1 και PKR φαίνονται εντυπωσιακά σαν PHA-767491, αυξάνοντας την πιθανότητα ότι αυτές οι ενώσεις αναστέλλουν DDK στα κύτταρα. Αν και SB218078 προέρχεται από σταυροσπορίνη, είναι ένας ισχυρός αναστολέας της Chk1 [53]. Οι δομές των άλλων κορυφαία hits, τον αναστολέα PKR και Rockout, δεν προέρχονται από σταυροσπορίνη και επίσης διαφέρουν από γνωστούς αναστολείς DDK (Σχήμα 1).

Οι δομές των 7 κορυφαίες ενώσεις από τις ογκομετρήσεις αναστολέα TSA είναι εμφανίζονται μαζί με PHA-767491 και XL413 δομές για σύγκριση (βλέπε κείμενο και τον πίνακα S1 στο αρχείο S1 για περισσότερες λεπτομέρειες). Τρεις ενώσεις που προέρχονται από σταυροσπορίνη (κάτω σειρά), αλλά οι υπόλοιποι τέσσερις ενώσεις εμπίπτουν σε διακριτές δομικές κατηγορίες.

Η

IC

50 τιμές για τον αναστολέα PKR (φαίνεται στο Σχήμα 7) προσδιορίστηκαν έναντι καθαρισμένου DDK (Α) και HCC1954 κύτταρα (Β). (Γ) Κασπάση 3/7 δοκιμασίες που δείχνουν ότι η απόπτωση που επάγεται έντονα στις 24 ώρες μετά την προσθήκη αναστολέα της PKR και αυτό εξαλείφεται με τη χρήση του αναστολέα της παν-κασπάσης z-VAD. Ο αναστολέας PKR προκαλεί μια παρόμοια μείωση στην βιωσιμότητα σε HCC1954 κυττάρων σε ΡΗΑ-767491 πάροδο του χρόνου (D) και επίσης αναστέλλει φωσφορυλίωση MCM2 σε κύτταρα, ένας γνωστός στόχος DDK (Ε). Οι μετρήσεις σε πίνακες Α-D αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους των δύο τουλάχιστον μετρήσεων +/- SD και ήταν πολύ επαναλήψιμη.

Η

Εμείς ελεγχθεί κατά πόσον οι αναστολείς PKR και Chk1 θα αλλάξει την ανάπτυξη των κυττάρων και αναστέλλουν φωσφορυλίωση MCM2 στην η κυτταρική σειρά καρκίνου του μαστού HCC1954, η οποία θα είναι ισχυρή απόδειξη ότι αναστέλλουν DDK στα κύτταρα. Αυξανόμενες ποσότητες του αναστολέα PKR επωάστηκαν με HCC1954 κύτταρα επί 72 ώρες, πράγμα που οδήγησε σε μεγάλη μείωση του αριθμού των βιώσιμων κυττάρων σε σχέση με τον έλεγχο οχήματος (Σχήμα 8Β, IC

50 1,7 μΜ).