Αφηρημένο

Αν και έχουν αναπτυχθεί πολλά χημειοθεραπευτικά στρατηγικές κατά του καρκίνου, καρκίνος του παγκρέατος είναι μια από τις πιο επιθετική και δυσεπίλυτο τύπους κακοηθειών. Ως εκ τούτου, οι νέες στρατηγικές και αντικαρκινικών παραγόντων είναι απαραίτητες για την αντιμετώπιση αυτής της νόσου. Η μετφορμίνη είναι ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο φάρμακο για το διαβήτη τύπου-2, και είναι επίσης γνωστή ως αντι-καρκινικό παράγοντα υποσχόμενος υποψήφιος από πρόσφατες μελέτες

in vitro

και

in vivo

. Ωστόσο, οι μηχανισμοί της αντικαρκινικές επιδράσεις μετφορμίνη δεν έχουν διευκρινισθεί. Δείξαμε ότι η μετφορμίνη κατέστειλε την έκφραση του miR-221, ένα από τα πιο γνωστά ογκογόνο microRNAs, σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος PANC-1. Επιπλέον, δείξαμε ότι η ρύθμιση προς τα κάτω του miR-221 από τη μετφορμίνη προκάλεσε τη σύλληψη G1 φάσης μέσω του up-ρύθμιση του p27, ένας από τους άμεσους στόχους του miR-221. Νέκρωσης όγκου παράγοντα που σχετίζονται με συνδέτη που επάγει απόπτωση (TRAIL) είναι επίσης ένα υποσχόμενο μέσο για τη θεραπεία του καρκίνου. Ενώ πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι η θεραπεία με μόνο TRAIL δεν ήταν αποτελεσματική έναντι παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, τα παρόντα δεδομένα έδειξαν ότι η μετφορμίνη ευαισθητοποιημένα ρ53 μεταλλαγμένη παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα να TRAIL. Η μετφορμίνη επαγόμενη τις εκφράσεις του υποδοχέα θανάτου 5 (DR5), έναν υποδοχέα για TRAIL, και ΒΙΜ με προ-αποπτωτική λειτουργία στην κατάντη του TRAIL-DR5 οδό. Προτείνουμε ότι η αυξητική ρύθμιση αυτών των πρωτεϊνών μπορεί να συμβάλει στην ευαισθητοποίηση του TRAIL-επαγώμενη απόπτωση. Η θεραπεία συνδυασμού μετφορμίνης και TRAIL μπορεί επομένως να είναι αποτελεσματική στη θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος

Παράθεση:. Tanaka R, Tomosugi Μ, Horinaka Μ, Sowa Υ, Sakai Τ (2015) μετφορμίνη προκαλεί διακοπή G1 φάσης μέσω Down-κανονισμός of Mir-221 και ενισχύει TRAIL Ευαισθησία μέσω DR5 Up-κανονισμός σε κύτταρα καρκίνου του παγκρέατος. PLoS ONE 10 (5): e0125779. doi: 10.1371 /journal.pone.0125779

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Α Ε Μ Ruhul Amin, Winship Cancer Institute του Πανεπιστημίου Emory, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 8 του Δεκ 2014? Αποδεκτές: 25 Μαρτίου, 2015? Δημοσιεύθηκε: May 8, 2015

Copyright: © 2015 Tanaka et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από JSPs KAKENHI (https://www.jsps.go.jp/english/e-grants/index.html) Αριθμός Grant 24689031. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του παγκρέατος είναι μια πυρίμαχη καρκίνος και η τέταρτη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στις Ηνωμένες Πολιτείες [1]. Η μόνη θεραπευτική αγωγή για αυτή την κακοήθη όγκο είναι η χειρουργική επέμβαση και η πενταετής σχετική επιβίωση των ασθενών με καρκίνους του παγκρέατος ήταν 2-6% στις Ηνωμένες Πολιτείες από το 1975 έως το 2009. Η γεμσιταβίνη ιδρύθηκε ως χημειοθεραπεία πρώτης γραμμής στη δεκαετία του 1990 [2] . FOLFIRINOX (οξαλιπλατίνη, ιρινοτεκάνη, leucovorin, και φθοροουρακίλη) ή θεραπεία συνδυασμού της γεμσιταβίνης και erlotinib, ένας εκλεκτικός αναστολέας της τυροσίνης κινάσης του EGFR, μερικώς βελτιωμένη συνολική επιβίωση, αλλά δεν αρκεί [2-4]. Ως εκ τούτου, είναι πιο αποτελεσματικά φάρμακα ή θεραπείες συνδυασμού για καρκίνων του παγκρέατος χρειάζεται.

Η μετφορμίνη έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως σαν ένα φάρμακο για το διαβήτη τύπου 2 για μεγάλο χρονικό διάστημα [5]. Σήμερα, η μετφορμίνη θεωρείται η πρώτη επιλογή για την από του στόματος θεραπεία για το διαβήτη τύπου 2, διότι δεν υπάρχουν σημαντικές αντενδείξεις και το κόστος του φαρμάκου είναι χαμηλή [6]. Εν τω μεταξύ, πρόσφατες αναφορές έχουν δείξει ότι η μετφορμίνη είναι χρήσιμη στην πρόληψη και τη θεραπεία του καρκίνου [7]. Αρκετές κλινικές μελέτες της μετφορμίνης σε ασθενείς με καρκίνους βρίσκονται σε εξέλιξη [8, 9]. Η μετφορμίνη μειώνει την παραγωγή γλυκόζης στο ήπαρ, ενεργοποιεί την κινάση ήπατος Β1 (LKB1) /ΑΜΡ κινάση (ΑΜΡΚ) άξονα και αναστέλλει τον στόχο της ραπαμυκίνης στα θηλαστικά σύμπλοκο 1 (mTORC1). Αναστέλλει επίσης παράγοντα ανάπτυξης ινσουλίνης-1 (IGF-1) [10-13]. Επιπλέον, η μετφορμίνη ρυθμίζει διάφορες εκφράσεις microRNA [14] και στοχεύει καρκινικά βλαστικά κύτταρα [12, 15]. Μια θεραπεία με μετφορμίνη ανέστειλε την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων μέσω επαγωγής σύλληψη G1-φάση μέσω άνω ρύθμιση του p27 [16]. Ωστόσο, οι ακριβείς μηχανισμοί με τους οποίους η μετφορμίνη up-ρυθμίζει ρ27 παραμένουν ασαφείς.

νέκρωσης όγκου παράγοντα που σχετίζονται με συνδέτη που επάγει απόπτωση (TRAIL /Apo2L) προκαλεί απόπτωση όχι σε φυσιολογικά κύτταρα, αλλά επιλεκτικά σε κακοήθη κύτταρα όγκου [17 -19]. Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη TRAIL και αγωνιστικών αντισωμάτων για τους υποδοχείς TRAIL είναι ελκυστικά αντικαρκινικών παραγόντων και αρκετές TRAIL-based κλινικές δοκιμές βρίσκονται σε εξέλιξη [20]. TRAIL επάγει απόπτωση σε διάφορα καρκινικά κύτταρα μέσω του υποδοχέα θανάτου 5 (DR5? Ονομάζεται επίσης TRAIL-R2), ένας από τους πέντε υποδοχείς TRAIL [21-23]. Ωστόσο, υπάρχει ένα σημαντικό πρόβλημα που μερικοί παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα είναι ευαίσθητα στην TRAIL-μεσολαβούμενη απόπτωση [24, 25]. Πρόσφατα, έχουν ειδικές microRNAs έχει αναφερθεί ότι σχετίζεται με την αντίσταση του TRAIL σε καρκινικά κύτταρα [26]. Τα microRNAs είναι μία κατηγορία μικρών RNAs μη κωδικεύουσας που ρυθμίζουν γονιδιακή έκφραση στόχο με μεταφραστική καταστολή και διάσπαση mRNA. έχουν miRNAs έχουν αποδειχθεί ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στη διαδικασία της καρκινογένεσης [27]. Ο ρόλος των microRNAs έχει μελετηθεί σε πολλούς τύπους όγκων, συμπεριλαμβανομένων των καρκίνων του παγκρέατος. Μεταξύ αυτών, miR-221 εμπλέκεται στην ανάπτυξη του όγκου με τη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και συμβάλλει στην αντίσταση TRAIL [28-31]. Η έκφραση του miR-221 είναι αυξημένη σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος [32]. Είναι ενδιαφέρον ότι, μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι miR-221 ανυψώθηκε στους εσωτερικούς μαστικούς αρτηρίες των ασθενών με διαβήτη τύπου 2 και υπήρχε μια σημαντική αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ της από του στόματος δόση μετφορμίνης και το επίπεδο της miR-221 [33].

μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι η μετφορμίνη επάνω ρυθμισμένη DR5 και ενίσχυσε την ευαισθησία TRAIL σε καρκινικά κύτταρα άγριου τύπου ρ53 [34], η οποία δείχνει ότι είναι μια πολλά υποσχόμενη υποψήφια για το ξεπέρασμα αντίσταση TRAIL σε καρκινικά κύτταρα. Ωστόσο, περισσότερο από το ήμισυ των κακοήθων όγκων διαθέτουν αδρανοποίηση μεταλλάξεις στο γονίδιο p53 [35, 36], και ως εκ τούτου πρέπει να εξετάσουμε αν η μετφορμίνη αυξάνει την ευαισθησία στην TRAIL σε ρ53-μεταλλαγμένο καρκινικών κυττάρων.

ο παρούσα μελέτη, διαπιστώσαμε ότι η μετφορμίνη μείωσε miR-221 έκφρασης προκαλώντας έτσι τη σύλληψη G1 φάσης μέσω up-ρύθμιση του p27, άμεσο στόχο του miR-221. Επιπλέον, δείξαμε ότι η μετφορμίνη αυξημένη ευαισθησία TRAIL μέσω αυξητική ρύθμιση του DR5 σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα p53-μεταλλαγμένο.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια

Η μετφορμίνη αγοράστηκε από την Sigma (St. Louis, ΜΟ, USA). Διαλυτό ανασυνδυασμένο ανθρώπινο TRAIL /Apo2L αγοράστηκε από την PeproTech (London, UK). Η ανθρώπινη ανασυνδυασμένη DR5 (TRAIL-R2) /Fc χίμαιρα και αναστολέας παν-κασπάσης,-ίτηκ, αγοράστηκαν από την R &?. D Systems (Minneapolis, ΜΝ, USA)

Κυτταρική καλλιέργεια

Ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος PANC-1 και AsPC-1 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA). Ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος MIAPaCa-2 αγοράστηκαν από την ανθρώπινη επιστήμη Έρευνας Τράπεζα Πόρων (Osaka, Japan). PANC-1 και MIAPaCa-2 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Dulbecco Eagle (ϋΜΕΜ) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου, 4 mM γλουταμίνη, 50 U /mL πενικιλλίνη, και 100 μg /mL στρεπτομυκίνη. κύτταρα AsPC-1 διατηρήθηκαν σε μέσο RPMI1640 συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, 2 mM γλουταμίνη, 50 U /mL πενικιλλίνη, και 100 μg /mL στρεπτομυκίνη. Όλα τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37

oC σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2.

Η ανάπτυξη των κυττάρων δοκιμασία

Ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την κυτταρική Μετρώντας Kit -8 δοκιμασίας σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Molecular Dojindo Technology, Kumamoto, Japan). Μετά από επώαση των κυττάρων για 72 ώρες με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις της μετφορμίνης ή TRAIL, το αντιδραστήριο WST kit-8 προστέθηκε στο μέσο και επωάστηκε για περαιτέρω 4 ώρες. Η απορρόφηση των δειγμάτων (450 nm) προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο σάρωσης πολλαπλών φρεατίων.

Trypan μπλε χρωστική αποκλεισμού δοκιμασία

Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 12 φρεατίων (1 χ 10

4 /Λοιπόν). Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με μετφορμίνη σε υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις για 72 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με την trypan blue δοκιμασία χρωστικής αποκλεισμό.

Ανάλυση της εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου και την ανίχνευση της απόπτωσης

Τα κύτταρα επωάστηκαν με ή χωρίς μετφορμίνη ή TRAIL σε συγκεντρώσεις που υποδεικνύονται και η συγκομιδή. Μετά από πλύση με PBS, τα κύτταρα αιωρήθηκαν σε PBS που περιέχει 0.1% Triton Χ-100, επεξεργασμένο με RNase Α (Sigma), και οι πυρήνες βάφτηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (Sigma). Η περιεκτικότητα σε DNA μετρήθηκε με τη χρήση FACS Calibur (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA). Για κάθε πείραμα, 10.000 κύτταρα αναλύθηκαν. λογισμικού Cell Quest (Becton Dickinson) και το πακέτο λογισμικού V2.0 ModFit LT (Verity Software House, Topsham, ME, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής) χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση των δεδομένων.

ανάλυση Western blot

Cells λύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (50 mM Tris-HCl, 1% SDS, 2 μg /mL λευπεπτίνης, 2 μg /mL απροτινίνη, 0.5 mM PMSF, και 1 mM DTT). Το προϊόν λύσης υποβλήθηκε σε κατεργασία υπερήχων και φυγοκεντρήθηκε στα 15.000 g για 20 λεπτά στους 4 ° C, και το υπερκείμενο συλλέχθηκε. Το εκχύλισμα πρωτεΐνης φορτώθηκε σε 7,5, 10, ή 12,5% SDS-πολυακρυλαμιδίου για ηλεκτροφόρηση, και στυπώθηκαν σε μεμβράνες διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (Millipore, Bedford, ΜΑ, USA). Πολυκλωνικός αντι-DR4, αντι-DR5 (Prosci, Poway, CA, USA), και αντι-CDK4 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) και μονοκλωνικά αντι-Bim (Epitomics, San Diego, CA, USA) και μονοκλωνικά ποντικού αντι- κυκλίνης D1 (MBL, Ναγκόγια, Ιαπωνία) και αντι-β-ακτίνης (Sigma) αντισώματα χρησιμοποιούνται ως πρωτογενή αντισώματα. Τα στυπώματα επωάστηκαν με το κατάλληλο συζευγμένο με HRP δευτερογενές αντίσωμα (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA), και τα σήματα ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Chemilumi-όνη χημειοφωταύγειας kit (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan).

Προσδιορισμός της έκφρασης του υποδοχέα TRAIL

τα κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση, πλύθηκαν μία φορά με παγωμένο PBS, και επαναιωρήθηκαν σε 100 μL PBS με 1% BSA. Στη συνέχεια, προστέθηκε ΡΕ-επισημασμένο αντι-ανθρώπινο DR4 ή DR5 mAb (eBioscience, San Diego, CA, USA). Για την εκτίμηση της μη ειδικής χρώσης, εφαρμόστηκαν ΡΕ-επισημασμένο ισότυπους ελέγχου IgG (eBioscience). Μετά από 30 λεπτά επώαση επί πάγου, 20.000 κύτταρα αναλύθηκαν με FACSCalibur.

RNA ανάλυση

Ολικό RNA από τα κύτταρα εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ απομόνωσης mirVana miRNA (Applied Biosystems, Foster, CA, USA), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR, ολικό RNA (2 μα) μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA σε ένα όγκο αντίδρασης 20 μL χρησιμοποιώντας ένα υψηλής χωρητικότητας κιτ cDNA Αντίστροφη Μεταγραφή (Applied Biosystems) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. ανιχνευτές TaqMan για DR5 και β2-μικροσφαιρίνη (β2MG) αγοράστηκαν από την Applied Biosystems. Τα επίπεδα έκφρασης των mRNAs ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα PCR Πραγματικού χρόνου Applied Biosystems 7300 σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το επίπεδο έκφρασης του DR5 mRNA κανονικοποιήθηκε έναντι του επιπέδου των β2MG mRNA στο ίδιο δείγμα.

ανάλυση έκφρασης microRNA διεξήχθη με τη χρησιμοποίηση προσδιορισμών TaqMan miRNA (Applied Biosystems) για την αξιολόγηση miR-221. Ολικό RNA (10 ng) μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA σε ένα όγκο αντίδρασης 15 μL, χρησιμοποιώντας κάθε ειδικούς εκκινητές και κιτ TaqMan microRNA Αντίστροφη Μεταγραφή (Applied Biosystems). Τα επίπεδα έκφρασης του microRNAs ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα PCR 7300 Real-Time (Applied Biosystems) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα αποτελέσματα κανονικοποιήθηκαν σε σχέση με το γονίδιο του RNA RNU48

μιμείται microRNA διαμόλυνση

Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 5 ηΜ miRIDIAN microRNA Μιμείται (MIR-221 ή αρνητικού ελέγχου # 1?. Dharmacon, Lafayette, CO , USA) χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά από 24 ώρες επιμόλυνσης, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς 40 mM μετφορμίνη. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 24 ώρες μετά την αγωγή για ανάλυση FACS και κηλίδωση Western.

Στατιστική Ανάλυση

Τα δεδομένα είναι τα μέσα ± S.D. τριών προσδιορισμών. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με τη χρήση του μαθητή

t-

δοκιμής και διαφορές θεωρήθηκαν σημαντικές σε Ρ & lt?. 0.05

Αποτελέσματα

Η μετφορμίνη καταστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων του καρκίνου του παγκρέατος κυττάρων

για να διερευνηθεί η επίδραση της μετφορμίνης σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος, εξετάσαμε αν η μετφορμίνη κατέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων χρησιμοποιώντας trypan δοκιμασία αποκλεισμού μπλε βαφής. PANC-1, ΜΙΑ PaCa-2, και τα κύτταρα AsPC-1 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με δεικνυόμενες συγκεντρώσεις της μετφορμίνης για 72 ώρες, και τα βιώσιμα κύτταρα μετρήθηκαν με trypan δοκιμασία αποκλεισμού μπλε βαφής. Όπως φαίνεται στο σχήμα 1, η μετφορμίνη μείωσε την ανάπτυξη αυτών των καρκινικών κυττάρων με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο.

PANC-1, (Β) AsPC-1 κύτταρα (Α) ΜΙΑ PaCa-2, και (Γ) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις της μετφορμίνης. Μετά από επώαση για 72 ώρες, τα κύτταρα μετρήθηκαν με trypan δοκιμασία αποκλεισμού μπλε βαφής. Τα δεδομένα είναι τα μέσα ± SD 3 προσδιορισμών. .

Η

Η μετφορμίνη διεγείρει τη σύλληψη G1 φάσης σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα μέσω της κάτω ρύθμιση του miR-221

επόμενο πραγματοποιηθεί ανάλυση του κυτταρικού κύκλου 0,01? * P & lt? 0.05, ** P & lt χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής μετά από κατεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις μετφορμίνης για 48 ώρες σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, και S1, S2 και S4 Σχήματα, η μετφορμίνη προκάλεσε τη σύλληψη G1-φάση με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Επιπλέον, εξετάσαμε την επίδραση της μετφορμίνης για την έκφραση των πρωτεϊνών G1 φάσης σχετίζονται. Ως αποτέλεσμα, η μετφορμίνη σε 40 mM αύξησε την έκφραση της πρωτεΐνης ρ27 (Σχήμα 2Β). Lee

et al

. προηγουμένως εντόπισε ορισμένα microRNAs με αυξημένη εκφράσεις, συμπεριλαμβανομένων miR-21, -221, -301, -376a, -155, καθώς και άλλοι στα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος [32]. Επιπλέον, η πρωτεΐνη ρ27 ήταν ρυθμισμένη προς τα κάτω με miR-221 σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος [37]. Επομένως, εξετάσαμε την επίδραση της μετφορμίνης για την έκφραση του miR-221. Όπως φαίνεται στο Σχ 2C, μετφορμίνη μείωσε την έκφραση του miR-221 σε έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο.

(Α) κύτταρα PANC-1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις μετφορμίνης για 48 ώρες. Το ποσοστό των κυττάρων σε κάθε φάση του κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής. (Β), (Γ) PANC-1 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις μετφορμίνης για 48 ώρες. (Β) κηλίδωση Western για ρ27. β-ακτίνης είναι ένας έλεγχος φόρτωσης. (C) σε πραγματικό χρόνο RT-PCR ποσοτικοποίηση της έκφρασης miR-221. Ο εσωτερικός έλεγχος ήταν RNU48. Οι τιμές είναι φορές αλλαγή στην έκφραση του miR-221 /RNU48 σύγκριση με μη επεξεργασμένα ελέγχου. (D), κύτταρα (Ε) PANC-1 επιμολύνθηκαν με 5 ηΜ miR-221 μιμούνται ή 5 ηΜ αρνητικό έλεγχο. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα επωάστηκαν με ή χωρίς 40 mM μετφορμίνης για 48 ώρες. (Δ) Το ποσοστό των κυττάρων σε κάθε φάση του κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής. (Ε) κηλίδωση Western για ρ27. β-ακτίνης είναι ένας έλεγχος φόρτωσης. Βέλος, μια μη ειδική ζώνη. Τα δεδομένα είναι τα μέσα ± SD 3 προσδιορισμών. ** P & lt?. 0.01

Η

Για να εξεταστεί κατά πόσον η αλλαγή στην έκφραση του miR-221 συνδέεται με την επαγωγή p27 και τη σύλληψη G1 φάσης με αγωγή με μετφορμίνη, θα επιμολυσμένα PANC-1 κυττάρων με miR -221 μιμούνται πριν από τη θεραπεία με μετφορμίνη και εκτελούνται κυτταρομετρίας ροής και την ανάλυση κηλίδος Western. Η επιμόλυνση των miR-221 μιμούνται μείωσε τον κυτταρικό πληθυσμό στην G1 φάση και η έκφραση της πρωτεΐνης ρ27 που προκαλείται από τη μετφορμίνη, αν και ο πληθυσμός G1 φάση σε μετφορμίνη-μη επεξεργασμένα κύτταρα μειώθηκε επίσης (Σχ 2D και 2Ε? S3 Εικ). Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν ότι η σύλληψη G1 φάσης που επάγεται από τη μετφορμίνη σε 40 mm, μπορούν να προκληθούν από την επαγωγή του ρ27 εν μέρει μέσω της προς τα κάτω ρύθμιση του miR-221.

μετφορμίνη αυξάνει TRAIL επαγόμενη απόπτωση σε TRAIL ανθεκτικών παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα

Πρόσφατα, αναφέρθηκε ότι πάνω ρύθμιση του υποδοχέα θανάτου 5 (DR5) με μετφορμίνη ενισχυμένη TRAIL απόπτωση που επάγεται από ρ53 άγριου τύπου κακοήθη κύτταρα όγκου [34]. Επομένως, εξετάσαμε την επίδραση της μετφορμίνης επί TRAIL ευαισθητοποίηση σε ρ53-μεταλλαγμένο και TRAIL ανθεκτικά καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος. Τρεις κυτταρικές σειρές, PANC-1, AsPC-1 και ΜΙΑ PaCa-2, δοκιμάστηκαν για την ευαισθησία τους στην TRAIL ή /και της μετφορμίνης. Κατά την πρώτη, κατεργάζεται τα κύτταρα με εξωγενή ανασυνδυασμένη ανθρώπινη TRAIL στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις για 72 ώρες και τα βιώσιμα κύτταρα μετρήθηκαν με μία ανίχνευση WST-8. Η ανάπτυξη των κυτταρικών σειρών δεν ανεστάλη έντονα με TRAIL (σχήμα 3Α? S4A Εικ). Στη συνέχεια ερευνήσαμε την επίδραση του TRAIL ή μετφορμίνης σε επαγωγή απόπτωσης με μέτρηση του πληθυσμού υπο-G1. Η μετφορμίνη ή TRAIL μόνος ελαφρώς προκαλούμενη απόπτωση σε αυτά τα τρία παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές (σχήμα 3Β και 3C? S4B και S4C Σχ). Ωστόσο, η συνδυασμένη θεραπεία με μετφορμίνη και TRAIL σημαντικά αυξημένη απόπτωση σε όλες τις δοκιμασμένες κυτταρικές σειρές (Σχήμα 3D? S4B και S4C Σχήματα).

(Α) PANC-1 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις του TRAIL. Μετά από επώαση για 72 ώρες, τα βιώσιμα κύτταρα αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας μία μέτρηση κυττάρων Kit-8. (Β), (Γ) PANC-1 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις του TRAIL (Β) ή μετφορμίνη (C) για 48 ώρες. πληθυσμούς υπο-G1 αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. (D) συνδυασμένα αποτελέσματα των 40 mM μετφορμίνης και /ή 10 ng /mL TRAIL για 48 ώρες. πληθυσμούς υπο-G1 αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Τα δεδομένα είναι τα μέσα ± SD 3 προσδιορισμών. * P & lt? 0.05, ** P & lt?. 0.01

Η

μετφορμίνη up-ρυθμίζει την έκφραση του DR5 σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα

Για να διερευνηθούν οι μηχανισμοί με τους οποίους η μετφορμίνη αυξάνει TRAIL επαγόμενη απόπτωση , εξετάσαμε τις πρωτεΐνες που σχετίζονται με την απόπτωση που ρυθμίζεται από τη μετφορμίνη χρησιμοποιώντας ανάλυση κηλίδος Western. κύτταρα PANC-1 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με μετφορμίνη για 48 ώρες, και εξετάσαμε την έκφραση για τους υποδοχείς TRAIL, DR4 και DR5 και αρκετές πρωτεΐνες που ευαισθητοποιούν καρκινικά κύτταρα σε TRAIL. Όπως φαίνεται στο Σχ 4Α, μετφορμίνη σημαντικά επάνω ρυθμισμένη την έκφραση των πρωτεϊνών DR4, DR5 και Bim. Στη συνέχεια εξετάστηκαν στην κυτταρική επιφάνεια έκφραση DR4 και DR5 σε κύτταρα PANC-1 με κυτταρομετρία ροής. Η μετφορμίνη αύξησε την έκφραση του DR5 κυτταρικής επιφάνειας μόνο (Εικόνα 4Β και 4C). Επιπλέον, εξετάσαμε το επίπεδο DR5 mRNA από ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR μετά από θεραπεία με μετφορμίνη στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις για 48 ώρες. Όπως φαίνεται στο Σχ 4D, η μετφορμίνη αύξησε σημαντικά την έκφραση του DR5 mRNA.

(Α) κύτταρα PANC-1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις μετφορμίνης για 48 ώρες. Western blotting για DR4, DR5 και ΒΙΜ διεξήχθη. β-ακτίνης είναι ένας έλεγχος φόρτωσης. Βέλος, μη ειδική ζώνη. (Β), εκφράσεις (C) στην κυτταρική επιφάνεια των DR4 και DR5 σε PANC-1 κύτταρα επεξεργασμένα με ή χωρίς 40 mM μετφορμίνης για 48 ώρες. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με ισοτυπικό έλεγχο IgG και μονοκλωνικά αντισώματα εναντίον DR4 και DR5. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. (Β) Gray ιστόγραμμα, καμία θεραπεία? λευκό ιστόγραμμα, η θεραπεία με μετφορμίνη. (Γ) Ο Υ-άξονας αντιπροσωπεύει τις γεωμετρικές μέσες τιμές των κυτταρικών πληθυσμών στα ιστογράμματα. Γκρίζα γραμμή, καμία θεραπεία? λευκή γραμμή, η θεραπεία με μετφορμίνη. (D) ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR του DR5 mRNA σε PANC-1 κύτταρα επεξεργασμένα με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις μετφορμίνης για 48 ώρες. Ο εσωτερικός έλεγχος ήταν β2MG. Οι τιμές είναι φορές αλλαγή στην έκφραση του DR5 mRNA β2MG mRNA /σύγκριση με μη επεξεργασμένα ελέγχου. Τα δεδομένα είναι τα μέσα ± SD 3 προσδιορισμών. ** P & lt?. 0.01

Η

Η ενίσχυση της TRAIL επαγόμενη απόπτωση με μετφορμίνη εξαρτάται από κασπάσες και DR5, αλλά όχι miR-221

Για να αναλυθεί η συμμετοχή των κασπασών και DR5 για το μονοπάτι απόπτωση ενισχυθεί με μετφορμίνη σε κύτταρα PANC-1, εξετάσαμε την επίδραση της παν-κασπάσης αναστολέας-ίτηκ ή χιμαιρική πρωτεΐνη DR5 /Ρο με κυρίαρχο αρνητικό λειτουργία κατά DR5. Η απόπτωση που επάγεται από τον συνδυασμό μετφορμίνης και TRAIL ήταν σημαντικά μειωμένη με την προσθήκη της χίμαιρας DR5 /Fc ή-ίτηκ (Σχήμα 5Α). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι το TRAIL απόπτωση που επάγεται ενισχυθεί με μετφορμίνη πυροδοτήθηκε τουλάχιστον εν μέρει σε ένα κασπάσης-εξαρτώμενο τρόπο και την αλληλεπίδραση μεταξύ TRAIL και DR5. Στη συνέχεια, ελέγξαμε κατά πόσο τα κάτω ρύθμιση του miR-221 από τη μετφορμίνη συνέβαλαν στην TRAIL επαγόμενη απόπτωση. Εμείς επιμολυσμένα κύτταρα PANC-1 με miR-221 μιμούνται πριν συν-θεραπεία με μετφορμίνη και TRAIL. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Β, η επιμόλυνση των miR-221 δεν θα μπορούσε να μειώσει τον πληθυσμό απόπτωση με συν-θεραπεία. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι miR-221 δεν είναι υπεύθυνη για την ενίσχυση του TRAIL απόπτωση που επάγεται από τη μετφορμίνη.

(Α) PANC-1 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 40 mM μετφορμίνη ή /και 10 ng /mL για 48 TRAIL ώρα με ή χωρίς την 1 ng /mL DR5 /Fc χίμαιρα, ή τον αναστολέα παν-κασπάσης 20 μΜ-ίτηκ. πληθυσμούς υπο-G1 αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. (Β) κύτταρα PANC-1 επιμολύνθηκαν με 5 ηΜ miR-221 μιμούνται ή 5 ηΜ αρνητικό έλεγχο. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα επωάστηκαν με ή χωρίς 40 mM μετφορμίνη ή /και 10 ng /mL TRAIL για 48 ώρες. πληθυσμούς υπο-G1 αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Τα δεδομένα είναι τα μέσα ± SD 3 προσδιορισμών. ** P & lt?. 0.01

Η

Συζήτηση

Η μετφορμίνη, η «κλασική» φάρμακο για τον διαβήτη τύπου 2, έχει προσελκύσει πρόσφατα την προσοχή ως αντικαρκινικός παράγοντας [5-7]. Επιπλέον, τα δεδομένα μας δείχνουν νεωτεριστικές λειτουργίες της μετφορμίνης έναντι καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος.

Έχει αναφερθεί ότι επάγεται μετφορμίνη σύλληψη G1 φάσης με επαγωγή της έκφρασης p27 ως ένας από τους μηχανισμούς σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα [16]. Ομοίως, στα αποτελέσματά μας, η μετφορμίνη επαγόμενη σύλληψη G1 φάσης (Σχήμα 2Α), και επάνω ρυθμισμένη έκφραση της πρωτεΐνης ρ27 (Σχήμα 2Β) σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος PANC-1. Έχει αναφερθεί ότι τα κάτω ρύθμιση του miR-221 ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων του καρκίνου του παγκρέατος μέσω πάνω ρύθμιση του ΡΤΕΝ, ρ27, ρ57, και PUMA [38]. Μεταξύ αυτών των μορίων στόχων του miR-221, ρ27 είναι ένας αναστολέας CDK η οποία επάγει τη σύλληψη G1 φάσης σε καρκινικά κύτταρα [39]. Ως εκ τούτου, υποθέσαμε ότι η μετφορμίνη μπορεί να ρυθμίζουν προς τα κάτω την έκφραση miR-221, με αποτέλεσμα την επαγωγή του ρ27 με τη σύλληψη G1 φάσης σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι η μετφορμίνη κάτω ρυθμισμένη η έκφραση του miR-221 σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα (Σχήμα 2C). Επιπλέον, τόσο η σύλληψη G1 φάσης και η επαγωγή ρ27 από τη μετφορμίνη κατεστάλησαν με miR-221 μιμούνται σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα (Σχ 2D και 2Ε). Από τα αποτελέσματα, δείχνουμε για πρώτη φορά ότι η μετφορμίνη επαγόμενη σύλληψη G1-φάση τουλάχιστον μερικώς προκαλείται από επαγωγή ρ27 μέσω προς τα κάτω ρύθμιση του miR-221. Εν τω μεταξύ μετφορμίνης μειώθηκε εκφράσεις της κυκλίνης πρωτεΐνες D1 και CDK4 σε 10 mm ή περισσότερο (S5 σχήμα), σύμφωνα με προηγούμενες αναφορές [16, 40]. Ως εκ τούτου, η ρύθμιση προς τα κάτω της κυκλίνης D1 και εκφράσεις πρωτεΐνης CDK4 μπορεί να συνεισφέρει στην σύλληψη G1-φάση με μετφορμίνη σε χαμηλότερες δόσεις. Έχει αναφερθεί ότι miR-221, ένα από τα πιο γνωστά OncomiRs, ήταν επάνω ρυθμισμένη σε πολλαπλές κακοήθειες συμπεριλαμβανομένων του καρκίνου του παγκρέατος. [32] Ως εκ τούτου, miR-221 θεωρείται ότι είναι ένας ελκυστικός στόχος για την επιλεκτική θεραπεία κατά του καρκίνου [27-29]. Είναι ενδιαφέρον ότι, η προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι miR-221 ανυψώθηκε στους εσωτερικούς μαστικούς αρτηρίες των ασθενών με διαβήτη τύπου 2 και υπήρχε μια σημαντική αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ της από του στόματος δόση μετφορμίνης και το επίπεδο της miR-221 [33], αυξάνοντας την πιθανότητα ότι τα αποτελέσματά μας μπορεί να είναι φυσιολογική.

Από την άλλη πλευρά, οι προηγούμενες μελέτες ανέφεραν ότι miR-221 συνέβαλαν επίσης αντίσταση TRAIL σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα [28-31]. Ως εκ τούτου υποθέσαμε ότι η μετφορμίνη μπορεί να είναι σε θέση να βελτιώσει την ευαισθησία του TRAIL μέσω ρύθμισης προς τα κάτω του miR-221 σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Για να επιβεβαιωθεί αυτή η υπόθεση, εξετάσαμε πρώτα την επίδραση της μετφορμίνης στην ευαισθησία TRAIL σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος. Σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος PANC-1 (Σχ 3D), AsPC-1 κύτταρα (Σχήμα S4B) και κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2 (Σχήμα S4C), μετφορμίνη ενίσχυσε την ευαισθησία του TRAIL. Είμαστε δίπλα εξέτασε κατά πόσον miR-221 συμμετείχε στην αύξηση της ευαισθησίας TRAIL με μετφορμίνη. Στην παρούσα μελέτη, το miR-221 μιμητικό δεν καταστέλλουν την απόπτωση που επάγεται από τον συνδυασμό μετφορμίνης και ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος TRAIL PANC-1 (Σχήμα 5Β). Δεδομένου ότι η πιθανή αιτία της διαφοράς από τις προηγούμενες μελέτες [28-31], εμείς εικάζουν ότι το αντι-αποπτωτικό μονοπάτι από miR-221 μπορεί να μην υπάρχουν σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος που εξετάστηκαν. Ως εκ τούτου, προτείνεται ότι τα κάτω ρύθμιση του miR-221 από τη μετφορμίνη εμπλέκεται στην σύλληψη G1-φάση, αλλά όχι την απόπτωση αναφέρθηκε παραπάνω.

κατόπιν αναλύθηκε των μοριακών μηχανισμών ενίσχυσης TRAIL-ευαισθησία, και βρήκαν ότι μετφορμίνη προκάλεσε την έκφραση του DR5, ένα από τους υποδοχείς TRAIL (σχήμα 4? S6 σχήμα), και την έκφραση του Bim (Σχήμα 4Α). Δεν υπάρχουν αναφορές ότι η μετφορμίνη επάνω ρυθμισμένη την έκφραση της πρωτεΐνης σε Bim ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα. Bim έχει ένα προ-αποπτωτική λειτουργία στην κατάντη της οδού TRAIL-DR5. Το up-ρύθμιση του Bim αναφέρθηκε επίσης να είναι υπεύθυνη για την αύξηση της ευαισθησίας TRAIL [41]. Ως εκ τούτου, τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η DR5 και Bim πάνω ρύθμιση με μετφορμίνη μπορεί να συμβάλει στην ευαισθητοποίηση του TRAIL επαγόμενη απόπτωση.

Truong

et al

., έδειξαν ότι η μετφορμίνη up-ρυθμίζονται DR5 μέσω p53 εξαρτώμενη οδό [34]. Αντίθετα, τα παρόντα δεδομένα μας έχουν δείξει σαφώς ότι η μετφορμίνη πάνω ρυθμισμένα DR5 σε ρ53-μεταλλαγμένο παγκρεατικού καρκίνου PANC-1 (Σχήμα 4), AsPC-1 και τα κύτταρα ΜΙΑ 2 PaCa-(S6 Σχήμα), υποδεικνύοντας ότι η μετφορμίνη up-ρυθμίζει DR5 έκφραση σε ένα ρ53-ανεξάρτητο τρόπο. Επιπλέον, η απόπτωση που επάγεται από τον συνδυασμό μετφορμίνης και TRAIL ήταν σημαντικά μειωμένη από το DR5 /Fc χίμαιρα (Σχήμα 5Α), υποδεικνύοντας ότι η αυξημένη ευαισθησία TRAIL προκλήθηκε από μετφορμίνη ήταν τουλάχιστον μερικώς DR5 εξαρτάται. Είναι ενδιαφέρον, Ozawa

et al

. έδειξαν ότι τα επίπεδα έκφρασης της πρωτείνης DR5 σε παγκρεατικά καρκινικά δείγματα ήταν 5,1 φορές υψηλότερη (Ρ & lt? 0,01). από την κανονική παγκρεατικού ιστού [24]

Έχει αναφερθεί ότι η μετφορμίνη έχει διάφορες λειτουργίες [6, 7 , 10-16]. Πρόσφατα, κλινικές δοκιμές συνδυασμών με μετφορμίνη και διάφορους αντικαρκινικούς παράγοντες βρίσκονται σε εξέλιξη από την άποψη της επαναστόχευση φαρμάκων [8, 9]. Σε προηγούμενη μελέτη, Gritti

et al

. έδειξε ότι 40 mM μετφορμίνη δεν επηρεάζει τη βιωσιμότητα των ανθρώπινου ομφάλιου λώρου μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων, και περιγράφεται ότι η μετφορμίνη προκαλεί ειδικά αντικαρκινική δράση χωρίς να παρεμβαίνει με την κανονική βιωσιμότητα των κυττάρων [42]. Έχουμε αποδείξει εδώ ότι ο συνδυασμός μετφορμίνης και TRAIL είναι πολύ αποτελεσματικό έναντι ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος, αυξάνοντας την πιθανότητα μιας στρατηγικής συνδυασμού στη θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος.

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 Σχ. Η μετφορμίνη διεγείρει τη σύλληψη G1 φάση στα κύτταρα PANC-1.

(Α), (Β) ο αντιπρόσωπος ιστογράμματα του Σχήματος 2Α. (Α) δεν υπάρχει θεραπεία. (Β) 40 mM μετφορμίνη

doi:. 10.1371 /journal.pone.0125779.s001

(ΔΕΘ)

S2 Εικ. Η μετφορμίνη διεγείρει σύλληψη G1 φάσης σε κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2.

Κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2 υπέστησαν κατεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις μετφορμίνης για 24 ώρες. Το ποσοστό των κυττάρων σε κάθε φάση του κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής. Τα δεδομένα είναι τα μέσα ± SD 3 προσδιορισμών. * P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,01

doi: 10.1371 /journal.pone.0125779.s002

(ΔΕΘ)

S3 Εικ.. Η μετφορμίνη διεγείρει σύλληψη G1 φάσης σε κύτταρα PANC-1 έως τα κάτω ρύθμιση του miR-221.

Τα αντιπροσωπευτικά ιστογράμματα του Σχήματος 2D. (Α) Mock. (Β) 40 mM μετφορμίνης. (C) μιμούνται αρνητικό μάρτυρα. (D) μιμούνται αρνητικό μάρτυρα και 40 mM μετφορμίνη. (Ε) miR-221 μιμούνται. (F) miR-221 μιμούνται και 40 mM μετφορμίνη

doi:. 10.1371 /journal.pone.0125779.s003

(ΔΕΘ)

S4 Εικ. Η μετφορμίνη ευαισθητοποιεί AsPC-1 και ΜΙΑ PaCa-2 παγκρεατικού καρκίνου κύτταρα να TRAIL.

(Α) κύτταρα AsPC-1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με τις αναφερόμενες συγκεντρώσεις του TRAIL. Μετά από επώαση για 72 ώρες, τα βιώσιμα κύτταρα αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας μία μέτρηση κυττάρων Kit-8. (Β) κύτταρα AsPC-1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με την 10 ng /mL TRAIL ή /και 40 mM μετφορμίνης για 48 ώρες. κύτταρα (C) ΜΙΑ PaCa-2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 4 ng /mL TRAIL και /ή 40 mM μετφορμίνης για 24 ώρες. πληθυσμούς υπο-G1 αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Τα δεδομένα είναι τα μέσα ± SD 3 προσδιορισμών. * P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,01

doi: 10.1371 /journal.pone.0125779.s004

(ΔΕΘ)

S5 Σχ.. Μετφορμίνη ρυθμίζει προς τα κάτω τις εκφράσεις της κυκλίνης D1 και CDK4.

Κύτταρα PANC-1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις μετφορμίνης για 48 ώρες. Western blotting για κυκλίνη D1 και CDK4 διεξήχθη. β-ακτίνης είναι ένας έλεγχος φόρτωσης

doi:. 10.1371 /journal.pone.0125779.s005

(ΔΕΘ)

S6 Εικ. Μετφορμίνη up-ρυθμίζει πρωτεΐνες DR5 σε ρ53 μεταλλαγμένη παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα.

(Α) κύτταρα AsPC-1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις μετφορμίνης για 48 ώρες. κύτταρα (Β) ΜΙΑ PaCa-2 υπέστησαν κατεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις μετφορμίνης για 24 ώρες. Western blotting για DR5 διεξήχθη. β-ακτίνης είναι ένας έλεγχος φόρτωσης

doi:. 10.1371 /journal.pone.0125779.s006

(ΔΕΘ)