Abstract

Πρόσφατες αναφορές έχουν προτείνει ότι πολλαπλούς παράγοντες όπως η γενετική υποδοχής, το περιβάλλον και τη διατροφή μπορεί να προωθήσει την εξέλιξη της υγιούς βλεννογόνου προς σποραδικά ορθοκολικό καρκίνωμα. Συσσωρευμένα στοιχεία που έχει επιπλέον σχετίζεται εντερικών βακτηρίων με την έναρξη και την εξέλιξη της νόσου. Προκειμένου να εξετάσει και να αναλύσει τη σύνθεση του εντέρου μικροχλωρίδας με την απουσία της σύγχυσης επιρροές, έχουμε δημιουργήσει ένα ζωικό μοντέλο της 1, 2-διμεθυλυδραζίνη (ΩΜΗ) επαγόμενη από καρκίνο του παχέος εντέρου. Χρησιμοποιώντας αυτό το μοντέλο, έχουμε πραγματοποιήσει Pyrosequencing της περιοχής V3 των γονιδίων 16S rRNA σε αυτή τη μελέτη για να προσδιοριστεί η ποικιλομορφία και το εύρος των εντερικών μικροβιακών ειδών. Τα ευρήματά μας δείχνουν ότι η μικροβιακή σύνθεση της εντερικής αυλού διαφέρει σημαντικά μεταξύ των ομάδων ελέγχου και των όγκων. Η αφθονία των Firmicutes ανυψώθηκε ενώ η πληθώρα των Bacteroidetes και σπειροχαίτες μειώθηκε στον αυλό των αρουραίων CRC. Fusobacteria δεν ανιχνεύθηκε σε κανένα από τα υγιή ποντίκια και δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στην παρατηρούμενη είδη Πρωτεοβακτηρίων κατά τη σύγκριση των βακτηριακών κοινοτήτων μεταξύ δύο ομάδων μας. Είναι ενδιαφέρον ότι η αφθονία των Πρωτεοβακτηρίων ήταν υψηλότερη στους αρουραίους CRC. Σε επίπεδο γένους,

Bacteroides

παρουσίασε μια σχετικά υψηλότερη αφθονία σε αρουραίους CRC σε σύγκριση με τους μάρτυρες (14,92% έναντι 9,22%,

σ

& lt? 0.001). Εν τω μεταξύ,

Prevotella

(55.22% έναντι 26,19%),

Lactobacillus

(3,71% έναντι 2,32%) και

Treponema

(3,04% έναντι 2,43%), βρέθηκαν να είναι σημαντικά πιο πλούσια σε υγιείς αρουραίους από τους αρουραίους CRC (

ρ

& lt? 0.001, αντίστοιχα). Μπορούμε επίσης να αποδείξει μια σημαντική μείωση των βακτηρίων βουτυρικού που παράγουν, όπως

Roseburia

και

Eubacterium

στο έντερο μικροχλωρίδα των αρουραίων CRC. Επιπλέον, μια σημαντική αύξηση στο

Desulfovibrio, Erysipelotrichaceae

και

Fusobacterium

παρατηρήθηκε επίσης στην ομάδα του όγκου. Μια μείωση στην προβιοτικό είδη, όπως

Ruminococcus

και

Lactobacillus

παρομοίως παρατηρήθηκε στην ομάδα όγκου. Συλλογικά, μπορούμε να συμπεράνουμε ότι υπάρχει μια σημαντική διαφορά στην εντερική βακτηριακή χλωρίδα μεταξύ υγιών αρουραίων και των αρουραίων CRC

Παράθεση:. Zhu Q, Jin Ζ, Wu W, Gao R, Guo Β, Gao Ζ, et al. (2014) Ανάλυση της εντερικό αυλό μικροχλωρίδας σε ένα ζωικό μοντέλο του καρκίνου του παχέος εντέρου. PLoS ONE 9 (3): e90849. doi: 10.1371 /journal.pone.0090849

Επιμέλεια: Τζωρτζίνα Λ Κρατήστε, Πανεπιστήμιο του Αμπερντίν, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 10 Δεκεμβρίου 2013? Αποδεκτές: 30, Ιανουαρίου, 2014? Δημοσιεύθηκε: 6 Μαρτίου 2014

Copyright: © 2014 Zhu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φύση Επιστημών της Κίνας (Νο 81230057). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Κάθε χρόνο, περίπου 1,2 εκατομμύρια άτομα έχουν διαγνωστεί με καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC) σε όλο τον κόσμο [1]. CRC είναι η τρίτη πιο κοινή μορφή καρκίνου στους άνδρες και η δεύτερη πιο συχνή στις γυναίκες με την πλειονότητα των περιπτώσεων που συμβαίνουν στον ανεπτυγμένο κόσμο. Μια πολύπλοκη κυτταρική κοινότητα υπάρχει μέσα σε έναν κακοήθη όγκο. Η κοινότητα αυτή αποτελείται από ογκογονικώς μετασχηματισμένων κυττάρων, μη νεοπλασματικά κύτταρα, όπως στρωματικά κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος και, και τα μικρόβια όπως βακτηρίδια και ιούς, σε ορισμένες περιπτώσεις [2]. Πολλοί τύποι καρκίνου που σχετίζονται με μολυσματικούς παράγοντες και αυτοί οι καρκίνοι τείνουν να συμβαίνουν σε βλεννογόνους ιστούς που έχουν έκθεση σε υψηλού επιπέδου σε μικρόβια. Μερικοί πιστεύουν ότι μέχρι το ένα πέμπτο όλων των καρκίνων προκαλούνται ή προωθούνται από μολυσματικούς παράγοντες [3]. Για παράδειγμα, ο καρκίνος του τραχήλου της μήτρας και γαστρικών καρκίνων μπορεί να προκληθεί από ιούς θηλώματος του ανθρώπου και το βακτήριο,

Helicobacter pylori

, αντίστοιχα [4].

αξιολογείται ότι ο συνολικός αριθμός των κυττάρων διαφορετικών ειδών βακτηρίων στο ανθρώπινο γαστρεντερικό σωλήνα είναι 10

14, η οποία είναι περισσότερο από 10 φορές τον αριθμό των ευκαρυωτικών κυττάρων ανθρώπινου [5] και ίσως και 10 φορές περισσότερο ιούς. Σε ένα υγιές έντερο, οι συνήθεις βακτηριακή χλωρίδα διατηρεί την ομοιοστασία με τον ξενιστή [6]. Ωστόσο, οι αλλαγές σε βακτηριακών πληθυσμών και των μεταβολικών προϊόντων τους έχουν συνδεθεί με διάφορες ασθένειες συμπεριλαμβανομένης της ελκώδους κολίτιδας, της νόσου του Crohn και CRC [7] – [9]. Και υπάρχουν αυξανόμενες αναφορές ότι η μικροχλωρίδα του εντέρου παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη της καρκινογένεσης του παχέος εντέρου [10]. Για παράδειγμα, σε μελέτες ζωικού μοντέλου, τα μεταλλαγμένα ποντίκια που είναι γενετικά επιρρεπείς στην CRC βρέθηκαν να αναπτύξει σημαντικά λιγότερους όγκους όταν διατηρείται σε ελεύθερα μικροβίων περιβάλλοντα [11]. Wei και οι συνεργάτες του καθόρισαν τις αλλαγές δομή του εντέρου μικροχλωρίδας των αρουραίων την ανάπτυξη προκαρκινικών βλαβών του βλεννογόνου που προκαλούνται από καρκινογόνο θεραπεία ΩΜΗ, και απέδειξε ότι η αφθονία του

Ruminococcus

-όπως και

Allobaculum

-όπως τα βακτήρια ήταν αυξήθηκε στα περιττώματα του DMH-αγωγή αρουραίους [12]. Moore και συνεργάτες ανέφεραν επίσης ότι 15 είδη βακτηρίων από ανθρώπινα περιττώματα χλωρίδα συσχετίστηκαν σε σημαντικό βαθμό με υψηλό κίνδυνο καρκίνου του παχέος εντέρου και 5 συσχετίστηκαν με χαμηλό κίνδυνο καρκίνου του παχέος εντέρου [13]. Επιπλέον, Bacteroides και Bifidobacterium ήταν πιο έντονα σχετίζεται με αυξημένο κίνδυνο στη μελέτη τους Καυκάσιους, Ιάπωνες, της Χαβάης και της Αφρικής ασθενείς. Αυτές οι μελέτες κατέδειξαν προκαταρκτικά ότι υπήρχε στενή σχέση μεταξύ της μικροχλωρίδα του εντέρου και την ανάπτυξη του CRC [13]. Ωστόσο, υπάρχουν σαφείς ενιαία βακτηριακά είδη προσδιορίστηκαν ως παράγοντες κινδύνου για CRC επειδή περίπου το 80% των ανθρώπινων βακτηρίων θεωρήθηκαν uncultivable [14]. Για να ξεπεραστεί αυτό το πρόβλημα και να διερευνήσουν τη μικροβιακή ποικιλότητα, οι ερευνητές έχουν στραφεί στον τομέα της μεταγονιδιωματικής [15]. Το 2011, υπήρχαν τέσσερις χάρτες υψηλής ανάλυσης που αναφέρεται στην ένωση ανάμεσα στην ανθρώπινη παχέος dysbiosis και CRC προέκυψαν διαδοχικά, τα οποία αναφέρθηκαν από τρεις ανεξάρτητες ομάδες [2], [8], [16], και διάφορα βακτηριακά είδη βρέθηκαν να είναι κατά προτίμηση κατοικούν είτε ιστούς όγκου ή τους περιβάλλοντες ιστούς μη-όγκου. Ο εμπλουτισμός του

Fusobacterium spp.

Στα δείγματα των όγκων ήταν εντυπωσιακά παρόμοια με αυτά τεκμηριώνονται microbiomes CRC. Ειδικότερα, μία απομόνωση από Fusobacteria (CC53), αποδείχθηκε ότι έχει διεισδυτικότητα σε καλλιεργημένα κολονικού αδενοκαρκινώματος-2 (2-Caco) κύτταρα [16]. Αυτές οι μελέτες ανέφεραν επίσης μια σχετική αφθονία των

Bacteroidaceae

,

Streptococcaceae

,

Fusobacteriaceae

,

Peptostreptococcaceae

,

Veillonellaceae

, και

Pasteurellaceae

σε καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με τις κανονικές εντερικό αυλό [17]. Περαιτέρω, προκειμένου να καθοριστεί ορθοκολικού καρκίνου που σχετίζονται με dysbiosis, Sobhani

κ.ά.

. διερευνηθεί το σκαμνί μικροχλωρίδα του κανονικού και του παχέος εντέρου ασθενείς που χρησιμοποιούν Pyrosequencing και επακόλουθη ανάλυση κύριο συστατικό (PCA) [18]. Και ανιχνεύεται μια αλλαγή σύνθεσης στο έντερο μικροχλωρίδα των ασθενών CRC. Ειδικότερα,

Bacteroides

και

Prevotella

είδη βρέθηκαν να είναι πιο άφθονο σε ασθενείς με καρκίνο από ό, τι στην ομάδα ελέγχου. Στο σύνολό τους, αυτές οι μελέτες έδειξαν ότι η μικροχλωρίδα του εντέρου μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη CRC

γενετική υποδοχής, το περιβάλλον και η διατροφή έχει μια δραματική επίδραση στη μικροχλωρίδα υποδοχής των ατόμων από διαφορετικές χώρες [19] -. [20 ]. Ως εκ τούτου, μπορούμε να παρατηρήσουμε ότι υπάρχει μεταβολή στη σύνθεση της μικροχλωρίδας του εντέρου που οδηγεί σε κλινικές συσχετίσεις μεταξύ βακτηριακή λοίμωξη και CRC. Σε αυτή τη μελέτη έχουμε δημιουργήσει ένα ζωικό μοντέλο του 1,2-διμεθυλυδραζίνη (DMH) επαγόμενη καρκίνο του παχέος εντέρου και εκτελείται Pyrosequencing γονιδίων 16S rRNA για τη σύγκριση της μικροχλωρίδας μέσα στον εντερικό αυλό των αρουραίων CRC και υγιείς μάρτυρες. Έχουμε επιπλέον εντοπιστεί βακτηριακή phylotypes που μπορούν να χρησιμεύσουν ως πιθανοί βιοδείκτες στην ανάπτυξη CRC.

Υλικά και Μέθοδοι

Ζώα και αντιδραστήρια

Τέσσερις-εβδομάδων αρσενικούς αρουραίους Wistar (180 -200 g) αγοράστηκαν από τη Σαγκάη σκούζουν Εργαστήριο ζώων Corporation (Σαγκάη, Κίνα) χρησιμοποιήθηκαν για αυτή τη μελέτη. Όλα τα ζώα στεγάστηκαν σε πλαστικά κλουβιά (με τέσσερα ή πέντε ποντίκια /κλουβί) υπό ελεγχόμενες συνθήκες υγρασίας (44 ± 5%), το φως (σκότους /12 ωρών φωτός) και της θερμοκρασίας (22 ± 2 ° C). 1, 2-διμεθυλυδραζίνη (DMH) αγοράστηκε από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ, USA). DMH παρασκευάστηκε φρέσκο ​​πριν από τη χρήση σε 1 mM EDTA-αλατούχου διαλύματος και το ρΗ ρυθμίστηκε σε 7,0 με χρήση αραιού ΝαΟΗ διάλυμα.

Πειραματικές Διαδικασίες

Σαράντα 4-εβδομάδων αρσενικούς αρουραίους Wistar χωρίστηκαν σε δύο ομάδες : μια ομάδα που επάγεται όγκων ϋΜΗ (TG, n = 30) και μία ομάδα μη-DMH επαγόμενη-όγκου (ομάδα ελέγχου, CG, n = 10). Τα ζώα εγκλιματίζονται στις δίαιτα τρωκτικών και νερό

κατά βούληση

για 1 εβδομάδα. Μετά την εγκλιματισμού, οι αρουραίοι από TG ήταν ενδοπεριτοναϊκά (i.p.) ένεση με DMH (40 mg /kg) μία φορά την εβδομάδα για 10 συνεχόμενες εβδομάδες. Τα υπόλοιπα 10 αρουραίοι εγχύθηκαν ενδοπεριτοναϊκώς με EDTA – κανονικό αλατόνερο ως έλεγχοι. Τα βάρη των ζώων καταγράφηκαν μία φορά την εβδομάδα καθ ‘όλη την πειραματική περίοδο. Ξεκινώντας από την 12η εβδομάδα του πρωτοκόλλου, τριών αρουραίων υποβλήθηκαν σε ευθανασία κάθε 2 εβδομάδες, προκειμένου να εξεταστεί ο σχηματισμός όγκων του παχέος εντέρου. Τα ζώα αναισθητοποιήθηκαν με κεταμίνη 100 mg /kg και Ξυλαζίνη 15 mg /kg σωματικού βάρους ε.π. υπό ασηπτικές συνθήκες. Το σύνολο του παχέος εντέρου αφαιρέθηκε χειρουργικά και ανοίχτηκαν κατά μήκος. Δείγματα κοπράνων συλλέχθηκαν και καταψύχθηκαν αμέσως σε υγρό άζωτο. Τα δείγματα κοπράνων αργότερα μεταφέρθηκαν σε -80 ° C μέχρι διεξήχθη εκχύλιση του DNA. Το κόλον φωτογραφήθηκε και ο συνολικός αριθμός των όγκων μετρήθηκε. Για ιστολογική εξέταση, οι όγκοι του κόλου ξεχωριστά αποκόπηκαν και σταθεροποιήθηκαν σε 10% ουδέτερη φορμαλίνη ρυθμισμένου με φωσφορικό.

Ιστολογική Εξέταση

για ιστολογική εξέταση, οι σταθερές ιστοί εγκλείστηκαν και χωρισμένο κατά διαστήματα 5 μm. Ο ιστός κηλιδώθηκε με πρότυπο αιματοξυλίνη και ηωσίνη για μικροσκοπική εξέταση φωτός. τομές ιστών εξετάστηκαν από δύο ανεξάρτητους παθολόγους με τυφλό τρόπο. Οποιαδήποτε διαφορά μεταξύ των δύο αυτών ερευνητές επιλύθηκε μέσω της επαναξιολόγησης από την τρίτη παθολόγος μέχρι να επιτευχθεί συναίνεση της κοινής γνώμης.

Το βακτηριακό DNA Extraction

Τα νουκλεϊκά οξέα που προέρχονται από κάθε δείγματα κοπράνων χρησιμοποιώντας μια μέθοδο τροποποιημένη από τις οδηγίες του κατασκευαστή για την QIAamp DNA σκαμνί Mini Kit (Qiagen, Hilden, Γερμανία). Η ποσότητα του DNA προσδιορίστηκε με Synergy 2 Multi-Λειτουργία Microplate Reader (BioTek, ΗΠΑ). Ακεραιότητα και το μέγεθος του DNA προσδιορίστηκε με 1% (v w /) ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. Όλα τα δείγματα του DNA φυλάχθηκαν στους -20 ° C μέχρι τη χρήση. Σωληνάρια που περιέχουν μόνο το σκαμνί Mini ελέγχους εξόρυξη κιτ QIAamp DNA συμπεριλήφθηκαν σε όλη τους τη λύση και PCR βήματα για να χρησιμεύσουν ως αρνητικοί μάρτυρες

PCR και 454 Pyrosequencing

Οι ακόλουθοι καθολική 16S ριβοσωμικού RNA εκκινητές:. ( 27F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ‘, 533R: 5′-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3’) αντιστοιχούν στις θέσεις V3 του γονιδίου 16S rRNA, με μία αλληλουχία barcode δείγμα και τους προσαρμογείς FLX Tianium χρησιμοποιήθηκαν για να ενισχύσουν την περιοχή V3 του καθενός δείγμα κοπράνων με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης. PCR διεξήχθη με πρότυπο 10 ng, 0.4 μΙ FastPfu πολυμεράσης (διαγονιδιακής Biotech, Κίνα), 4 μΐ 5 χ ρυθμιστικού FastPfu, 2 μΙ dNTPs (2,5 mM το καθένα, Takara Bio, Japan), 0,4 μΙ προς τα εμπρός εναρκτήρες (5 μΜ) και 0.4 μl αντίστροφοι εκκινητές (5 μΜ) σε έναν ΑΒΙ GeneAmp® 9700 κυκλοποιητή. Οι παράμετροι κυκλοποίησης ήταν ως εξής: 5 λεπτά μετουσίωσης στους 95 ° C που ακολουθείται από 25 κύκλους των 30 δευτερολέπτων στους 95 ° C (μετουσίωση), 30 δευτερόλεπτα για την συγκόλληση στους 55 ° C και 30 δευτερόλεπτα στους 72 ° C (επιμήκυνση), με μια τελική επέκταση στους 72 ° C για 5 λεπτά. Αντιδράσεις τριπλούν PCR πραγματοποιήθηκαν σε κάθε δείγμα. Τα ενισχυμένα προϊόντα από δείγματα κοπράνων ελέγχθηκε από ηλεκτροφόρηση γέλης χρησιμοποιώντας 5 μΙ του μίγματος αντίδρασης PCR σε ένα πήκτωμα αγαρόζης 2,0%. Τα προϊόντα PCR καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ εκχύλισης AxyPrepDNA Gel (Axygen, US) και ποσοτικά σε QuantiFluor ™ -Αγ Fluorometer (Promega, ΗΠΑ). Τα προϊόντα από διαφορετικά δείγματα αναμίχθηκαν σε ίσες αναλογίες για Pyrosequencing χρησιμοποιώντας την Roche GS FLX 454 Sequencer σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Όλα Pyrosequencing διαβάζει στη συνέχεια απομακρύνθηκαν εκκινητών, barcodes, και οι αλληλουχίες προσαρμογέα τους, και περαιτέρω διαλογή και διηθείται σύμφωνα με τα πρότυπα για τον έλεγχο της ποιότητας ως εξής: η εξάλειψη των αλληλουχιών που δεν ταιριάζουν απόλυτα το εγγύς εκκινητής PCR (πάνω από δύο αναντιστοιχίες στους εκκινητές), εκείνοι με μικρό μήκος αλληλουχίας (λιγότερο από 200 nt) ακολουθίες που περιέχονται μονονουκλεοτίδιο επαναλήψεις 6 nt, ακολουθίες με διφορούμενη χαρακτήρες ή ακολουθίες με ποιότητα ανάγνωσης σκοράρει & lt? 25. Τέλος, ένα σύνολο 197,911 αλληλουχιών υψηλής ποιότητας από είκοσι δείγματα που παράγονται, τα οποία αντιπροσώπευαν το 62,9% των έγκυρων ακολουθιών σύμφωνα με barcode- και αστάρι-ακολουθία φιλτραρίσματος.

βιοπληροφορική ανάλυση της αλληλουχίας δεδομένων

Οι αλληλουχίες ευθυγραμμίστηκαν χρησιμοποιώντας βάση δεδομένων SILVA (https://www.arb-silva.de/) και οριοθέτηση των επιχειρησιακών ταξινομικά μονάδων (Otus) διεξήχθη με Mothur κατά 97% αποκοπής σύμφωνα με την κατά ζεύγη αποστάσεις τους. Στη συνέχεια πραγματοποιήσαμε την ανάλυση της κάλυψης του Good, ποικιλομορφία εκτιμητές (Shannon και Simpson), πλούτο εκτιμητές (Chao1 και Ace), και καμπύλη αραίωσης με τη χρήση του πακέτου λογισμικού Mothur (https://www.mothur.org/wiki/Main_Page) σε το επίπεδο εμπιστοσύνης 80% [21]. Ο θερμικός χάρτης κατασκευάστηκε για το γένος των πληροφοριών με τη λειτουργία heatmap 2 στο πακέτο R vegan. Επιπλέον, Bray-Curtis ομοιότητες χρησιμοποιήθηκαν για να κατασκευαστεί ένα δενδρόγραμμα συμπλέγματος. Πραγματοποιήσαμε επίσης μη σταθμισμένης Unifrac ανάλυση απόσταση μετρήσεις χρησιμοποιώντας Otus από κάθε δείγμα, και πραγματοποίησε την ανάλυση κύριων συνιστωσών σε σχέση με την μήτρα της απόστασης. Μια μεταγονιδιωματική προσέγγιση βιοδεικτών ανακάλυψη που απασχολούνται με lefse [γραμμική διακριτική ανάλυση (LDA) σε συνδυασμό με τη μέτρηση του μεγέθους ισχύ], η οποία πραγματοποίησε μια μη παραμετρική δοκιμή αθροίσματος κατάταξης Wilcoxon που ακολουθείται από ανάλυση LDA χρήση λογισμικού online (https://huttenhower.sph.harvard.edu /Galaxy /) για να αξιολογήσει το μέγεθος της επίδρασης της κάθε διαφορικά άφθονη ταξινομικής βαθμίδας [22].

Στατιστική Ανάλυση

το

t-test

και Mann-Whitney test πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση SPSS έκδοση 19.0 για Windows.

Ηθική Δήλωση

το πειραματικό πρωτόκολλο αναθεωρήθηκε και εγκρίθηκε από την επιτροπή των ζώων Φροντίδα και Χρήση και στην επιτροπή δεοντολογίας του έκτου Λαϊκού Νοσοκομείου Συγγενείς στη Σαγκάη Πανεπιστήμιο Jiao Tong.

Data Access

Οι πληροφορίες ακολουθία 16S που δημιουργούνται σε αυτή τη μελέτη έχει υποβληθεί στην Διαβάστε Αρχείο NCBI ακολουθία με αριθμό πρόσβασης SRA098098.

Αποτελέσματα

ζώων μοντέλα και του όγκου Σχηματισμός

Σύμφωνα με το πειραματικό πρωτόκολλο (Εικόνα 1Α), έχουμε ευθανασία τρεις αρουραίους ΩΜΗ έλαβαν κάθε δύο εβδομάδες αρχίζει το 12ο εβδομάδα. Αδένωμα βρέθηκε για πρώτη φορά στην 12η εβδομάδα σε ένα από τα τρία ζώα υποβάλλονται σε ευθανασία. Η πλειοψηφία των αδενωμάτων, όμως, βρέθηκαν μεταξύ του 14ου και 18ου εβδομάδες (7/9). Δυστυχώς, δύο αρουραίοι ΩΜΗ αγωγή πέθανε στο 19ο εβδομάδα της απόφραξης του παχέος εντέρου και καχεξία. Στα δείγματα από την 20η εβδομάδα, διαπιστώσαμε ότι δύο αρουραίους κατέδειξε αδενοκαρκίνωμα (2/3) με περιστασιακά αδένωμα εντός του ιστού. Ως αποτέλεσμα, αποφασίσαμε να euthanize το υπόλοιπο των DMH-αγωγή αρουραίους καθώς και εκείνων που ανήκουν στην ομάδα ελέγχου στην 22η εβδομάδα, προκειμένου να κρατήσει τον κύκλο ζωής των αρουραίων σε αντιστοιχία. Κατά την νεκροψία βρήκαμε παθολογικά επιβεβαίωσε αδενοκαρκινώματος κόλου που προκαλείται με επιτυχία σε έντεκα αρουραίοι DMH-αγωγή (11/13) χωρίς ενδείξεις μετάστασης οργάνων. Τα υπόλοιπα δύο αρουραίοι εμφανίζεται κανένα σημάδι σχηματισμού όγκων. Ωστόσο, ένα από τα ζώα βρέθηκε να έχει μια ατελή απόφραξη του παχέος εντέρου, ως εκ τούτου μόνο δέκα DMH-αγωγή αρουραίοι περιλαμβάνονται στην τελική ομάδα μελέτης μας. Εν τω μεταξύ, όλοι οι αρουραίοι στην ομάδα ελέγχου επιβίωσαν στο 22ο εβδομάδα. Το μέσο σωματικό βάρος των δέκα επιλεγμένες αρουραίους ΩΜΗ αγωγή ήταν 343,5 ± 10,74 g και 359,3 ± 7,61 g στα ζώα ελέγχου χωρίς στατιστική σημαντικότητα (

σ

= 0,59). Οι λεπτομέρειες της ϋΜΗ-επαγόμενης όγκων συνοψίζονται στον Πίνακα 1 και δείχνεται στο Σχήμα 1Β-G.

(Α) Πειραματικές διαδικασίες. (Β) Κανονική παχέος εντέρου. (C) Adenoma (λευκό βέλος). (D) Adencarcinoma (κίτρινο βέλος). Η κηλίδα αίματος γύρω από τον όγκο προκλήθηκε από έλκος του όγκου αντί ανατομή μας. Αντιπροσωπευτικά μικροφωτογραφίες που δείχνουν την κανονική βλεννογόνο (Ε), αδένωμα (F) και το αδενοκαρκίνωμα (G) έχουν μεγεθυνθεί σε 40 × (αριστερά), και κάθε ένα από τα δεξιά μικρογραφία (400χ) τόνισε τη περιοχή από την αντίστοιχη πράσινο ορθογώνιο.

Χαρακτηριστικά του 454 Pyrosequencing

Συνολικά, 314.880 έγκυρες ακολουθίες ελήφθησαν από όλα τα 20 δείγματα, με μέσο όρο 15.744 αλληλουχίες ανά δείγμα. Οι προκύπτουσες αλληλουχίες υπέστησαν επεξεργασία χρησιμοποιώντας Seqcln (https://sourceforge.net/projects/seqclean/) και Mothor [23]. Μετά την απομάκρυνση κακής ποιότητας των εικόνων (& lt? Q25) και αλληλουχίες μικρότερη από 200 bp, με ομοπολυμερή περισσότερο από έξι νουκλεοτίδια, και περιέχει διφορούμενη κλήσεις βάσεως ή εσφαλμένη αλληλουχίες εκκινητή, συνολικά 197.911 αλληλουχιών υψηλής ποιότητας παρήχθησαν με μέσο μήκος από 481 bp ανά ακολουθία. Ακολουθίες ευθυγραμμίστηκαν με τη βάση δεδομένων Silva (SSU111 έκδοση: https://www.arb-silva.de/) χρησιμοποιώντας k-mer αναζήτηση (https://www.mothur.org/wiki/Align.seqs). Δυνητικά χιμαιρικές αλληλουχίες ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας UCHIME (https://drive5.com/uchime) και να απομακρυνθεί. Το υπόλοιπο διαβάζει είχαν προ-συγκεντρωμένα (https://www.mothur.org/wiki/Pre.cluster) και, στη συνέχεια, συγκεντρωμένα χρησιμοποιώντας μη διορθωμένη κατά ζεύγη αλγόριθμο. Τα λεπτομερή χαρακτηριστικά του κάθε δείγματος παρατίθενται στον πίνακα 2. Επιπλέον, Επιχειρησιακό ταξινομικές μονάδες ορίστηκαν ως ανταλλαγή & gt? χρησιμοποιώντας 97% ταυτότητα ακολουθίας πιο μακριά μέθοδο γείτονα (https://www.mothur.org/wiki/Cluster). Ο συνολικός αριθμός των Otus σε επίπεδο ομοιότητας 97% ήταν 41.923, με ένα μέσο όρο 2.096 Otus ανά δείγμα.

Η

Η μέση τιμή της κάλυψης Καλό για κάθε ομάδα ήταν πάνω από 80%, υποδεικνύοντας ότι η 16S rRNA αλληλουχίες που ταυτοποιούνται στις δύο ομάδες αντιπροσωπεύουν την πλειοψηφία των βακτηρίων που υπάρχουν στα δείγματα της μελέτης. Ενώ εμείς δεν παρατηρούμε το οροπέδιο της καμπύλης διάθλασης (Σχήμα S1 Α) με την τρέχουσα αλληλουχίας, οι εκτιμήσεις ποικιλομορφία Shannon όλων των δειγμάτων είχε ήδη φτάσει σταθερών αξιών σε αυτό το βάθος αλληλουχίας, γεγονός που υποδηλώνει ότι, αν και θα πρέπει να αναμένεται ταυτοποίηση νέων phylotypes από επιπλέον αλληλουχίας, το εύρος της διαφορετικότητας εντός των δειγμάτων είχε συλληφθεί (Εικόνα S1B, C, D). Στατιστικά σημαντικές διαφορές παρατηρήθηκαν στους δείκτες Shannon μεταξύ της ομάδας του όγκου και της ομάδας ελέγχου (5,92 ± 0,30 έναντι 6,17 ± 0,20,

σ

= 0,042, σχήμα S1E). Διαφορές αποδεικνύουν ότι οι υψηλότερες ποικιλομορφία θα μπορούσε να βρεθεί στα noncancerous εντερικό αυλό των αρουραίων από την ομάδα ελέγχου, η οποία επιβεβαιώνεται από το δείκτη ποικιλότητας του Simpson (0,024 ± 0,013 έναντι 0,013 ± 0,007,

σ

= 0.037, Εικόνα S1F). Οι εκτιμητές της κοινότητας πλούτο (Chao1 και Ace) και τα λεπτομερή χαρακτηριστικά του κάθε δείγματος φαίνεται στον Πίνακα S1.

Σύγκριση των Gut μικροχλωρίδας μεταξύ της Ομάδας Ελέγχου και του όγκου του Ομίλου

Η μικροχλωρίδα και συνθέσεις των δύο ομάδων αναλύθηκαν και συγκρίθηκαν μέσω της σχετικής αφθονίας των Otus με βάση το μη σταθμικό πίνακα αποστάσεων Unifrac για κάθε ομάδα. Μετέπειτα αποτελέσματα της PCA εκτίθενται ότι υπήρχε σημαντική διαφορά στη σύνθεση της κοινότητας βακτηριακή μεταξύ υγιών αρουραίων και των αρουραίων CRC χρησιμοποιώντας τα δύο πρώτα κύρια αποτελέσματα συστατικό των PC1 και PC2 (31.32% και το 20,4% της διακύμανσης εξηγείται, αντίστοιχα) (Σχήμα 2). Επιπλέον, lefse διεξήχθη για να ληφθεί η αναπαράσταση cladogram και τα κυρίαρχα βακτήρια της μικροχλωρίδας εντός των δύο ομάδων, η οποία απεικονίζεται στο Σχήμα 3Α. Δείξαμε επίσης τις μεγαλύτερες διαφορές στα είδη μεταξύ των δύο κοινοτήτων στο Σχήμα 3Β.

Peptostreptococcaceae

,

Erysipelotrichales

,

Coriobacteriaceae

και

Porphyromonadaceae

εμπλουτίστηκαν σε αρουραίους CRC, ενώ

Roseburia

και

Prevotella

εμπλουτίστηκαν σε υγιείς αρουραίους, όλα από τα οποία ήταν το κλειδί phylotypes εμπλέκονται στην διαχωρισμό των εντερικών μικροχλωρίδας σε CRC και υγιείς αρουραίους, σύμφωνα με την ανάλυση lefse.

Κάθε σύμβολο αντιπροσωπεύει δείγμα. Κόκκινοι κύκλοι αντιπροσωπεύουν υγιή ποντίκια? Μπλε κύκλοι αντιπροσωπεύουν αρουραίους CRC.

Η

(Α) Ταξινομική αναπαράσταση στατιστικά και βιολογικά σταθερές διαφορές μεταξύ των υγιών αρουραίων και των αρουραίων CRC. Οι διαφορές που αντιπροσωπεύεται από το χρώμα του πιο άφθονο κατηγορία (κόκκινη ενδεικτική ομάδα ελέγχου, το πράσινο ομάδα όγκων και κίτρινο μη σημαντική). Η διάμετρος της διαμέτρου του κάθε κύκλου είναι ανάλογη με την αφθονία της ταξινομικής ομάδας του. (Β) Ιστόγραμμα των βαθμολογιών LDA για διαφορικά άφθονη γένη. Cladogram ήταν υπολογίζονται lefse, και εμφανίζονται ανάλογα με το μέγεθος αποτέλεσμα.

Η

Συγκρίσεις Gut μικροχλωρίδας σε διάφορα επίπεδα μεταξύ υγιείς αρουραίους και αρουραίους CRC

Μελετήσαμε τις βακτηριακές κοινότητες στα κόπρανα από το εντερικό αυλό των αρουραίων, με ή χωρίς CRC. Η διαφορετική φύλα και γένη εκτιμήθηκαν με ταξινομική εκχώρηση όλων των ακολουθιών και το συνολικό μικροβιακή σύνθεση για κάθε ομάδα σε επίπεδο συνομοταξία δείχνεται στο Σχήμα 4Α, Β Σύμφωνα με τα αποτελέσματα ταξινομικές, αποδείξαμε ότι Bacteroidetes, αντιπροσωπεύοντας 79,26% και 63,95 % της μικροχλωρίδας του εντέρου σε υγιείς και CRC αρουραίους, αντίστοιχα, ήταν το πιο κυρίαρχο φύλο στη μελέτη μας. Και Firmicutes ήταν η δευτερεύουσα συνομοταξία με το ποσοστό του 15,14% και 29,55%, αντίστοιχα. Τέλος, σπειροχαίτες και Πρωτεοβακτηρίων αποτέλεσε το τρίτο πιο άφθονο φύλα, συμβάλλοντας 3,04% και 1,06% σε υγιή ποντίκια, και 2,44% και 2,95% σε αρουραίους CRC, αντίστοιχα. Η σύνθεση του εξουσιάζοντας φύλα παρουσιάζεται στον Πίνακα S2. Θεωρούμε ότι η μικροβιακή σύνθεση εμφανίζει υψηλή μεταβλητότητα μεταξύ των ατόμων (Σχήμα 4C). Firmicutes αντιπροσώπευαν το 3,39% -48,35% και Bacteroidetes 43,24% -95,79% μεταξύ όλων των μεμονωμένων ζώων (Πίνακας 3). Εκτός από το ότι, η αφθονία των Bacteroidetes και κυανοβακτηρίων ήταν υψηλότερες στο έντερο microbiota υγιών αρουραίων από ότι σε αρουραίους CRC, και η διαφορά έδειξε στατιστικώς σημαντική (

σ

= 0.044 και 0.003, αντίστοιχα) (Σχήμα S2A, B ). Ότι, Firmicutes και Ακτινοβακτηρίων ήταν σημαντικά λιγότερο άφθονες μικροχλωρίδας σε υγιείς αρουραίους (

σ

= 0.01 και 0.035, αντίστοιχα) (Σχήμα S2C, D). Από τα στοιχεία μας δεν Fusobacteria ανιχνεύθηκε σε οποιοδήποτε από τα υγιή ποντίκια (Σχήμα S2E) και δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στο Πρωτεοβακτηρίων (

σ

= 0,175) (Εικόνα S2F) κατά τη σύγκριση των βακτηριακών κοινοτήτων των δύο ομάδων, αν και η αφθονία της ήταν υψηλότερη στους αρουραίους CRC. Στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ της ομάδας του όγκου και της ομάδας ελέγχου σε επίπεδο οικογένειας πραγματοποιήθηκαν επίσης στη μελέτη μας. Διαφορά στη σχετική αφθονία των Bacteroidetes (11,6% έναντι 4,6%,

σ

= 0.0029), Rikenellaceae (3,71% έναντι 1,47%,

σ

= 0,0008), και Peptostreptococcaceae (9,18 % έναντι 1,61%,

σ

= 0.046) ήταν σημαντική μεταξύ των αρουραίων CRC και υγιή ποντίκια, ενώ υπήρχε ένα εξαιρετικά χαμηλότερο επίπεδο Prevotellaceae (31,91% έναντι 62,88%,

p =

0.0027) και κυανοβακτήρια (0,3% έναντι 0,82%,

σ

= 0,003) σε CRC αρουραίους σε σύγκριση με τα υγιή ποντίκια.

(Α) υγιή ποντίκια, (αρουραίοι Β) CRC. Ιστόγραμμα αντιπροσωπεύει τη σχετική αφθονία των βακτηριακών φύλα σε μικροχλωρίδα του κάθε δείγματος (C). «Άλλοι» αντιπροσωπεύει τις αταξινόμητη βακτήρια, Ακτινοβακτηρίων, κυανοβακτήρια, Deferribacteres, Elusimicrobia, Fusobacteria και Tenericutes.

Η

Σε επίπεδο γένους, μελετήθηκε η μικροβιακή σύνθεση του κάθε δείγματος (Σχήμα S3) και βρέθηκε να είναι σημαντικά διαφορετική μεταξύ των δύο ομάδων. Οι δέκα πιο άφθονα γένη στην ομάδα ελέγχου ήταν

Prevotella

,

Bacteroides

,

Lactobacillus

,

Treponema

,

Parabacteroides

,

Anaerovibrio

,

Ruminococcus

,

Roseburia

,

Oscillospira

και

Sutterella

. Ωστόσο,

Prevotella

,

Bacteroides

,

Allobaculum

,

Treponema

,

Lactobacillus

,

Blautia

,

Parabacteroides

,

Paenibacillus

,

Anaerovibrio

και

Paraprevotella

ήταν οι δέκα πιο άφθονα γένη στην ομάδα του όγκου, αντίστοιχα (Σχήμα S4). Είναι ενδιαφέρον ότι, αν και

Prevotella

ήταν το πιο άφθονο γένος και στις δύο ομάδες, η αφθονία του ήταν πολύ υψηλότερη σε υγιή ποντίκια. Στατιστικά,

Bacteroides

, με πάνω από 1% του συνόλου των βακτηριδίων στα κόπρανα, ήταν σχετικά άφθονη σε αρουραίους CRC. Από την ιδιαίτερη σημείωση, γένη

Bacteroides. fragilis

βρέθηκε κυρίως σε αρουραίους CRC. Εν τω μεταξύ,

Prevotella

,

Lactobacillus

και

Treponema

βρέθηκαν να είναι σημαντικά υψηλότερη σε υγιή ποντίκια από αρουραίους CRC (Σχήμα 5). Γένη

Desulfovibrio

,

Clostridium

,

Actinobacillus

,

Succinatimonas

,

Dorea

,

Phascolarctobacterium

,

Parabacteroides

,

Bilophila

,

Paraprevotella

,

Helicobacter

και

Paenibacillus

παρουσίασαν χαμηλή αφθονία? Ωστόσο, ήταν όλες στατιστικά εμπλουτισμένο σε κόπρανα του CRC αρουραίων σε σύγκριση με υγιείς αρουραίους. Επιπλέον, γένη

Roseburia, Eubacterium

και

Ruminococcus

εμπλουτίστηκαν στην ομάδα ελέγχου, και

Fusobacterium

ήταν απούσα από υγιή ποντίκια. Ο θερμικός χάρτης του επιπέδου βακτηριακού γένους έδειξαν επίσης το ίδιο φαινόμενο (Σχήμα S5). Πρόσθετες διαφορές μεταξύ των δύο ομάδων μπορούν να βρεθούν στον Πίνακα S3.

Το τεστ Mann-Whitney χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογήσει τη σημασία των συγκρίσεων μεταξύ υποδεικνύεται ομάδες.

Η

Συζήτηση

Η μικροβιακού πληθυσμού στο έντερο είναι ετερογενής και πολύπλοκη. Εργαστηριακά τρωκτικά έχουν συμβάλει στο να βοηθήσει τους ερευνητές να διαλευκάνουν τις πολύπλοκες αλληλεπιδράσεις που τα θηλαστικά, συμπεριλαμβανομένων των ανθρώπων, έχουν με μικροβιακή συσσιτώνες τους [24]. Έχουμε χρησιμοποιηθεί μια κοινή ζωικό μοντέλο της CRC σε αυτή τη μελέτη για τη διερεύνηση της φύσης της κοινότητας δομή μικροβιακών στο CRC σε σύγκριση με υγιή ζώα. Οι μελέτες που διεξήχθησαν σε ζωικά μοντέλα θα μπορούσαν ενδεχομένως να έχουν σημαντικές συνέπειες που σχετίζονται με την ανθρώπινη ασθένεια [25].

Στην παρούσα μελέτη, συγκρίναμε την βακτηριακή σύνθεση των εντερικό αυλό των αρουραίων μεταξύ υγιών ομάδα και ομάδα CRC χρησιμοποιώντας την πλατφόρμα του Roche 454 sequencer. Παρατηρήσαμε σημαντική διαφοροποίηση του εντέρου μικροχλωρίδας μεταξύ υγιών αρουραίων και των αρουραίων καρκινογόνο αγωγή που αναπτύχθηκε παχέος καρκινώματα. Δείξαμε μία σχετική υψηλότερη αφθονία Firmicutes, Πρωτεοβακτηρίων και Ακτινοβακτηρίων στον εντερικό αυλό των αρουραίων CRC, και περαιτέρω έδειξαν ότι Bacteroidetes ήταν λιγότερο άφθονα σε αυτήν την ομάδα. Το αποτέλεσμα αυτό είναι σύμφωνο με παρόμοια ευρήματα από τον Zhao

et al.

[26] από μελέτες σε ανθρώπους. Έχει αναφερθεί ότι οι φλεγμονώδεις ασθένειες του εντέρου, όπως η νόσος του Crohn και η ελκώδης κολίτιδα γνωστούς παράγοντες κινδύνου για καρκίνο του παχέος εντέρου, καθώς και μια σημαντική μείωση των Bacteroidetes συνομοταξία ανιχνεύθηκε σε αυτές τις δύο νόσους από τους ερευνητές [27] – [28]. Σε περαιτέρω μελέτη, οι μεταβολές μεταξύ των γενών της παρούσας συνομοταξία ανιχνεύθηκαν επίσης στη μελέτη μας. Ειδικά, η διαπίστωση ότι

Β. fragilis

αυξήθηκε στον εντερικό αυλό των αρουραίων CRC.

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι οι διάφορες

Bacteroides

στελέχη μπορούν να επηρεάσουν την υγεία του ξενιστή μέσω colitogenic ή προβιοτικό δυναμικό τους. Waidmann και οι συνεργάτες του είχε περιγράψει το απομονωμένο Β vulgates στέλεχος με πιθανές προβιοτικές propertites που ήταν σε θέση να βελτιώσει E. coli ανάπτυξης που προκαλείται από κολίτιδα από ένα ακόμα άγνωστο μηχανισμό στην ιντερλευκίνη-2-ανεπαρκή ποντίκια [29]. Ωστόσο, μια ανθρώπινη παχέος συμβιωτικών, εντεροτοξιγόνα

Β. fragilis

έχουν καταδειχθεί ότι ο αποικισμός του σε πολλαπλές εντερική νεοπλασία (Min) ποντικούς θα μπορούσε να οδηγήσει σε σημαντική αύξηση των κολονική πάχος, φλεγμονή και ορατή κολονική όγκους που συνοδεύονται από την ενεργοποίηση της STAT3 και τη διείσδυση του Τ

Η17 φλεγμονώδη κύτταρα [30]. Τα αποτελέσματα της έρευνας είναι σε συμφωνία με το εύρημα μας ότι

Β. fragilis

ήταν εν αφθονία σε αρουραίους CRC. Επιπλέον, Πρωτεοβακτηρίων έχουν επίσης αναφερθεί να αυξηθεί μικροχλωρίδας σε ζώα με πειραματικά προκαλούμενη κολίτιδα και οι ασθενείς που πάσχουν από ΙΒϋ [31]. Θα μπορούσε να είναι σχετικό με την άμεση αλληλεπίδραση μεταξύ Πρωτεοβακτηρίων και εντερικών κυττάρων μέσω βακτηριακά συστήματα έκκρισης, όπως το σύστημα τύπου ΙΙΙ έκκριση (T3SS) [32]. Επιπλέον, έχει αναφερθεί ότι Firmicutes πραγματοποιήθηκε τη δυνατότητα στην ενίσχυση της ενεργειακής συγκομιδή από τη διατροφή [33]. Η συνομοταξία Firmicutes περιέχει σχετικές γένη, συμπεριλαμβανομένων των

Ruminococcus

,

Clostridium

και οι παραγωγοί βουτυρικό

Eubacterium

,

Faecalibacterium

και

Roseburia

[34]. Το βουτυρικό είναι μια σημαντική πηγή ενέργειας για κολικά επιθηλιακά κύτταρα, συχνά προτιμάται έναντι του κυκλοφορικού γλυκόζη ή γλουταμίνη. Έως και 90% του βουτυρικού μεταβολίζεται από κολονοκύτταρα [35]. Εδώ μπορούμε να δείξουμε μειωμένη αφθονία

Roseburia

και

Eubacterium

στο έντερο μικροχλωρίδα των αρουραίων CRC. Σε δύο διατροφικές μελέτες παρέμβασης, η πυκνότητα του πληθυσμού των

Roseburia

και

Eubacterium

είχαν αποδειχθεί ότι έχουν μια ισχυρή συσχέτιση με κοπράνων συγκεντρώσεις βουτυρικού ως απάντηση στην τροποποιημένη προσφορά υδατάνθρακες [36], γεγονός που υποδηλώνει τη σημασία της

Roseburia

και

Eubacterium

στην παραγωγή βουτυρικού ίη νίνο. Sengupta

et al.

[37] έδειξε ότι μπορεί να υπάρχουν κάποιες ενδείξεις ότι η παράδοση του επαρκή ποσότητα βουτυρικού στον εντερικό βλεννογόνο μπορεί να προστατεύσει από νωρίς ογκογόνο γεγονότα. Ως εκ τούτου, η ανισορροπία δομή σε αυτό το έγγραφο παίζει σημαντικό ρόλο στη μείωση των βακτηριδίων που παράγουν βουτυρικό στο έντερο των αρουραίων CRC.

Εκτός αυτού, η ανισορροπία δομή εντός του εντέρου μικροχλωρίδας των αρουραίων CRC είναι σημαντικά σχετίζεται με την αύξηση σε πολλαπλές πιθανών παθογόνων παραγόντων και τη μείωση των προβιοτικών ειδών. Έχει αποδειχθεί ότι

Bacteroides

πληθυσμών και ειδικότερα εκείνες του

Β. fragilis

παράγουν ένα μεταλλοπρωτεάσης γνωστή ως fragilysin σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου, αλλά όχι στους μάρτυρες. Αυτή η έκθεση δείχνει ότι αυτό υποπληθυσμός θα μπορούσε να ευνοήσει την καρκινογένεση [38]. Επιπλέον, ο πυκνός

Desulfovibrio

μειώνει θειικό για να παράγει υδρόθειο (H

2S), το οποίο έχει αποδειχθεί ότι είναι σε θέση να παράγει βλάβη του DNA που μπορεί να είναι, εν μέρει, υπεύθυνη για την παραγωγή του γενωμική αστάθεια και οι αθροιστικές μεταλλάξεις παρατηρούνται σε καρκίνο του παχέος εντέρου [39] – [40].