Αφηρημένο

Η γνώση σχετικά με το ρόλο της caveolin-1 (Cav-1) πρωτεΐνη για την προσκόλληση ενδοθήλιο του καρκίνου κυττάρων είναι ασαφής. Η παρούσα μελέτη αποκάλυψε ότι Cav-1 παίζει ένα αρνητικό ρυθμιστικό ρόλο στην αλληλεπίδραση του καρκίνου-ενδοθήλιο. Η ενδογενής Cav-1 δείχθηκε να μειορυθμίζουν κατά τη διάρκεια της κυτταρικής αποκόλλησης και το επίπεδο μιας τέτοιας πρωτεΐνης αντιστρόφως σχετίζεται με τον όγκο ενδοθηλιακά πρόσφυσης. Επιπλέον, η έκτοπη υπερέκφραση της Cav-1 εξασθένησε την ικανότητα των καρκινικών κυττάρων να προσκολλώνται στο ενδοθήλιο ενώ shRNA μεσολάβηση Cav-1 knock-down εμφάνισε το αντίθετο αποτέλεσμα. Βρήκαμε ότι κύτταρο απόσπαση αυξημένη κυτταρική υπεροξειδίου του υδρογόνου και ρίζα υδροξυλίου παραγωγή και τέτοια δραστικά είδη οξυγόνου (ROS) ήταν υπεύθυνοι για την αυξανόμενη αλληλεπίδραση μεταξύ καρκινικών κυττάρων και των ενδοθηλιακών κυττάρων μέσω του αγγειακού ενδοθηλίου κυτταρικής προσκόλλησης μόριο-1 (VCAM-1). Σημαντικά, Cav-1 δείχθηκε να καταστέλλει το υπεροξείδιο του υδρογόνου και το σχηματισμό ρίζα υδροξυλίου με διατήρηση του επιπέδου των ενεργοποιημένων Akt που ήταν κρίσιμη για το ρόλο της Cav-1 σε εξασθένηση της κυτταρικής πρόσφυσης. Μαζί, η παρούσα μελέτη αποκάλυψε το νέο ρόλο της Cav-1 και υποκείμενο μηχανισμό για την προσκόλληση του όγκου που εξηγούν και επισημάνετε ένα σημαντικό ρόλο της Cav-1 για τον καρκίνο του πνεύμονα μετάσταση

Παράθεση:. Chanvorachote P, Chunhacha P ( 2013) Η caveolin-1 Ρυθμίζει ενδοθηλιακών των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα μέσω του Reactive Oxygen ανάλογα με το είδος μηχανισμού. PLoS ONE 8 (2): e57466. doi: 10.1371 /journal.pone.0057466

Επιμέλεια: Chih-Hsin Tang, η Κίνα Ιατρικού Πανεπιστημίου, Ταϊβάν

Ελήφθη: 18η Οκτωβρίου 2012? Αποδεκτές: 21 Ιαν 2013? Δημοσιεύθηκε: 27 Φεβρουαρίου, 2013

Copyright: © 2013 Chanvorachote, Chunhacha. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίζεται από επιχορηγήσεις από το Ταμείο Ταϊλάνδη Ερευνών (Π Chanvorachote) και μεταδιδακτορικός υπότροφος (Ratchadaphiseksompot Κληροδότημα, Πανεπιστήμιο Chulalongkorn). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Πρόσφατα, οι ρόλοι των caveolin-1 (Cav-1) στη ρύθμιση της εξέλιξης του καρκίνου και μετάσταση σε διάφορους τύπους καρκίνου έχουν αποκαλυφθεί [1] – [4] και ένα τέτοιο πρωτεΐνη έλαβε ίσως τη μεγαλύτερη προσοχή σε σχετίζονται με τον καρκίνο έρευνα. Αν και μερικές μελέτες πρότειναν ότι Cav-1 μπορεί να παίζει ρόλο στην αναστολή της εξέλιξης του καρκίνου σε ορισμένους καρκίνους [5], στον καρκίνο του πνεύμονα, Cav-1 ενισχύει την επιθετικότητα του καρκίνου, καθώς και μετάσταση [6]. Μαζί με το γεγονός ότι Cav-1 σε καρκίνο του πνεύμονα έχει δειχθεί ότι σχετίζονται με κακή πρόγνωση [2], και το μεγαλύτερο μέρος του σχετιζόμενου με καρκίνο θανάτου σε αυτόν τον καρκίνο δείχθηκε να συνδέσει με μετάσταση, είναι μεγάλου ενδιαφέροντος για τη διερεύνηση της ολόκληρο ρυθμιστικό ρόλο αυτής της πρωτεΐνης για μετάσταση καρκίνου [7]. Μετάσταση είναι μια διαδικασία πολλών σταδίων των καρκινικών κυττάρων εξαπλώνεται από αρχικές τους θέσεις στις μακρινές δευτερεύουσες θέσεις. Ξεκινώντας με το καρκινικό κύτταρο απόσπαση από πρωτογενή όγκο τους, τα κύτταρα εισβάλλουν αγγειακό τοίχωμα, ταξιδεύουν στο κυκλοφορικό σύστημα, και να συμμορφώνονται με το ενδοθήλιο για να σχηματίσουν τα δευτερογενείς όγκους. Αν και οι ρόλοι του Cav-1 επί συμπεριφορές κυττάρου καρκίνου του πνεύμονα έχουν εντατικά διερευνηθεί, ο ρόλος μιας τέτοιας πρωτεΐνης για προσκόλληση κυττάρου καρκίνου του πνεύμονα σε επιφάνεια ενδοθήλιο είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστη. Εμείς και άλλοι έχουν προτείνει τον σημαντικό ρόλο της Cav-1 σε απόδοση καρκινικά κύτταρα ανθεκτικά σε anoikis μετά κύτταρο απόσπαση [6], [8], [9], [10], ενισχύοντας εισβολή και τη μετανάστευση [11], και τη διευκόλυνση της ανάπτυξης σε αγκύρωση-ανεξάρτητο τρόπο [12]. Η ενδογενής επίπεδο Cav-1 δείχθηκε στις προηγούμενες μελέτες που πρέπει να ελέγχεται από τα αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS). Σε αποσπαστούν κατάσταση των κυττάρων, το υπεροξείδιο του υδρογόνου έδειξε να αυξηθεί το κυτταρικό επίπεδο της Cav-1 με αναστολή της αποικοδόμησης της [6]. Ενώ στα προσκολλημένα κύτταρα, ρίζα υδροξυλίου δείχθηκε να είναι ένας βασικός παράγοντας στην up-ρύθμιση Cav-1 έκφραση και αύξησε την κυτταρική μετανάστευση [11]. Αυτά τα ευρήματα υπογράμμισε το ρυθμιστικό ρόλο των ROS στις Cav-1 έκφρασης και συνοδεύουν τους ρόλους τους στη μετάσταση του καρκίνου.

Στη βιολογία, υπάρχουν αρνητικές ρυθμίσεις ανατροφοδότησης για την πρόληψη του υπερβολικού ερεθίσματα. Παρομοίως, πρωτεΐνη Cav-1 δείχθηκε να καταστέλλει το οξειδωτικό στρες που προκαλείται από τα ανοίγματα του υπεροξειδίου του υδρογόνου [13]. Ωστόσο, παραμένει άγνωστο αν Cav-1 ρυθμίζει το επίπεδο ROS σε μονοκατοικία κύτταρα και τέτοια ρύθμιση είναι κρίσιμης σημασίας για την κόλλα του καρκίνου του ακινήτου. Χρησιμοποιώντας φαρμακολογικές και γενετικές προσεγγίσεις, η παρούσα μελέτη έδειξε ότι Cav-1 παίζει σημαντικό ρόλο στην αναστολή της προσκόλλησης του καρκίνου-ενδοθηλίου που οφείλεται στην εξασθένηση του υπεροξειδίου του υδρογόνου και ρίζα υδροξυλίου γενεές μετά κύτταρο απόσπαση. Η παρούσα μελέτη διαπίστωσε επίσης ότι Cav-1 κατέστειλε τέτοιο σχηματισμό ROS μέσω Akt-εξαρτώμενη μηχανισμό. Μαζί με την παρατήρηση ότι Cav-1 μειώθηκαν κατά εξαρτώμενο από το χρόνο τρόπο μετά κύτταρο αποκόλληση, βρήκαμε ότι σε μεταγενέστερα χρονικά σημεία-, προσκόλληση καρκίνο ενδοθήλιο αύξησε σημαντικά την ταυτόχρονη εξάντληση της εν λόγω Cav-1. Έτσι, η μελέτη μας αποκάλυψε την ύπαρξη ενός νέου μηχανισμού προσκόλλησης των καρκινικών κυττάρων για Cav-1 που θα μπορούσε να αξιοποιηθεί σε μετάσταση και Drug Design.

Υλικά και Μέθοδοι

Κύτταρα και Αντιδραστήρια

μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα (NSCLC) -H460 και κύτταρα αγγειακού ενδοθηλίου Ανθρώπινα (HUV-EC-C) ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA). κύτταρα Η460 καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 ενώ τα κύτταρα HUV-EC-C καλλιεργήθηκαν σε μέσο Μ199. RPMI 1640 συμπληρώθηκε με ορό 5% εμβρυϊκό ορό (FBS), 2 mM L-γλουταμίνη και 100 μονάδες /ml πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη. Μ199 συμπληρώθηκε με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), 10 mM L-γλουταμίνη, και 100 μονάδες /ml πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη, 0.1 mg /ml ηπαρίνη, 0,05 mg /ml συμπλήρωμα ανάπτυξης ενδοθηλιακών κυττάρων (ECGS). Όλη η καλλιέργεια επωάστηκε σε 5% CO

2 περιβάλλοντος στους 37 ° C. 2 ‘, 7’-διχλωρο διοξεικό (DCFH

2-DA), διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO), μικροσπηλαίων κιτ απομόνωσης, Calcein ΑΜ, ηπαρίνη νατρίου ελήφθησαν από την Sigma Chemical, Inc. (St. Louis, ΜΟ)? Κουνέλι caveolin-1 αντίσωμα και συζευγμένο με υπεροξειδάση δεύτερο αντίσωμα από Abcam (Cambridge, ΜΑ)? Hydrophenyl φλουορεσκεΐνη (HPF), LY294002, Amplex Κόκκινο, Lipofectamine 2000 ήταν από Invitrogen (Carlsbad, CA)? Αντισώματος για την β-ακτίνη από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)? Αντισώματος για παν-Akt, p473-Akt, PTEN, EGFR, φωσφο-ΡΤΕΝ (Ser380 /Thr382 /383) ήταν από την Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, ΜΑ)? Συμπλήρωμα ανάπτυξης ενδοθηλιακών κυττάρων ήταν από Millipore Corporation (Billerica, ΜΑ)

πλασμίδιο και διαμόλυνση

Το πλασμίδιο έκφρασης Cav-1 pEX_Cav-1 και του φορέα ελέγχου.? pDS_XB-YFP αποκτήθηκαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA) και Cav-1 knockdown πλασμίδιο shRNA-Cav-1 και φορέα αναφοράς του? ελέγχου shRNA πλασμίδιο Α λήφθηκαν από Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Σταθερές επιμολύνσεις του Cav-1 πλασμίδιο έκφρασης ή Cav-1 knockdown πλασμιδίου παρήχθησαν με καλλιέργεια Η460 κύτταρα σε ένα πλακίδιο 6 φρεάτων μέχρι να φτάσει το 60% συρροή. 15 μΐ αντιδραστηρίου Lipofectamine και 2 μg Cav-1, και shRNA-Cav-1 πλασμίδιο που χρησιμοποιήθηκαν για την επιμόλυνση των κυττάρων εν απουσία ορού. Μετά από 12 ώρες το μέσο αντικαταστάθηκε με μέσο καλλιέργειας που περιέχει 5% ορό εμβρύου μόσχου. Περίπου 36 ώρες μετά την έναρξη της επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε πέψη με 0,03% θρυψίνη, και τα κυτταρικά εναιωρήματα επιστρώθηκαν επί 75 ml, φιάλες καλλιέργειας και καλλιεργήθηκαν για 24 έως 28 ημέρες με G418 ή πουρομυκίνη για την επιλογή των Hcav-1 και shCav- 1, αντίστοιχα. Οι σταθερές επιμολύνσεις συνενώθηκαν και η έκφραση της πρωτεΐνης Cav-1 στα επιμολυσμένα επιβεβαιώθηκε με κηλίδωση Western. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε αντιβιοτικό μέσο ελεύθερο RPMI 1640 για τουλάχιστον δύο διόδους πριν που χρησιμοποιούνται σε κάθε πείραμα.

ROS Detection

Τα ενδοκυτταρικά ROS προσδιορίστηκαν με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας DCFH

2-DA ως φθορίζοντα ανιχνευτή. Εν συντομία, τα κύτταρα επωάστηκαν με 10 μΜ DCFH-DA, HPF για 30 λεπτά στους 37 ° C, μετά την οποία πλένονται, επεξεργασία με θρυψίνη, επαναιωρήθηκαν σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό, και αμέσως αναλύθηκε για ένταση φθορισμού με κυτταρόμετρο ροής ΡΑΟδοαη (Beckton Dickinson, Rutherford, NJ) χρησιμοποιώντας ένα 488-nm διέγερση πορείας και ένα ζωνοπερατό φίλτρο 538-nm. Η διάμεση ένταση φθορισμού ποσοτικοποιήθηκε με λογισμικό CellQuest (Becton Dickinson) ανάλυση των καταγεγραμμένων ιστογράμματα.

H

2O

2 προσδιορίστηκε με Amplex Red αντιδραστήριο (Invitrogen). Εν συντομία, το μίγμα της αντίδρασης που περιέχει 50 μΜ Amplex Red αντιδραστήριο και 0,1 U /ml HRP σε φωσφορικό Krebs-Ringer (KRPG) προστέθηκε σε κάθε μικροπλάκα καλά. Στη συνέχεια, 20 μΐ 1,5 χ 10

4 Η460 κύτταρα αιωρούνται σε KRPG προστέθηκε στο μείγμα της αντίδρασης του. Μετά από 30 λεπτά επώασης, το σήμα φθορισμού που λαμβάνεται από τον αναγνώστη μικροπλάκας φθορισμού εξοπλισμένο για διέγερση στην περιοχή των 530-560 nm και ανίχνευση εκπομπής στα 590 nm παρακολουθήθηκε και μετρήθηκε πάνω από το 3 ώρες μετά την απόσπαση.

μονόφυλλο Δοκιμασία σύμφυσης κυττάρων

HUV-EC-C διεγέρθηκαν με 10 ng /ml IL-1

β

για 0-4 ώρες. κύτταρα Η460 (2.5 × 10

4 κύτταρα /ml) βάφτηκαν με 15 μΜ calcein ΑΜ (Sigma) για 45 λεπτά στους 37 ° C και 5% CO

2, τότε προστίθεται σε ένα ημι-συρρέουσα καλλιέργεια μονοστιβάδας του HUV-EC-C, επωάστηκαν για 20 λεπτά στους 37 ° C με περιστροφή σε 120 rpm, και πλύθηκαν εκτεταμένα για να αποκλείσει μη ειδική προσκόλληση των κυττάρων. Ο αριθμός των προσκολλημένων κυττάρων μετρήθηκε άμεσα κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [14]. Για τη μεσολάβηση αντισώματος μπλοκάρισμα κυτταρικής προσκόλλησης, η IL-1β διεγερμένων HUV-EC-C επωάστηκαν με αντίσωμα για VCAM-1, ICAM-1 και Ε-σελεκτίνης (σε τελική αραίωση του 1:400 για κάθε αντισώματα) για 3 στη συνέχεια προστέθηκαν ώρες στους 37 ° C σε επωαστή υγροποιημένου CO2, και Η460 κύτταρα.

ΜΙΚΡΟΣΠΗΛΑΙΑ απομόνωση

ΜΙΚΡΟΣΠΗΛΑΙΑ απομονώθηκαν από shCav-1, Η460 και κύτταρα 1 Hcav-χρησιμοποιώντας ένα μικροσπηλαίων απομόνωση κιτ (Sigma). ShCav-1, Η460 και κύτταρα Hcav-1 συλλέχθηκαν και λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης που περιέχει 1% Triton Χ-100. Τα προϊόντα λύσης φυγοκεντρήθηκαν στις 10,000

g

για 15 λεπτά. κλάσματα μεμβράνης Απορρυπαντικό ανθεκτικά απομονώθηκαν σε OptiPrep Density Gradient Medium (0, 20, 25, 30, και 35%). ΜΙΚΡΟΣΠΗΛΑΙΑ συνελέγησαν από κλάσματα caveolin-1-εμπλουτισμένο, η οποία έχει χρησιμοποιηθεί για τη διερεύνηση της Cav-1 και ΡΤΕΝ έκφρασης.

Western Blotting

Μετά ειδικές επεξεργασίες, τα κύτταρα επωάστηκαν σε ρυθμιστικό λύσης που περιέχει 20 mM Tris-HCl (ρΗ 7,5), 1% Triton Χ-100, 150 mM χλωριούχο νάτριο, 10% γλυκερόλη, 1 mM ορθοβαναδικό νάτριο, 50 mM φθοριούχο νάτριο, 100 mM φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο, και ένα κοκτέιλ αναστολέα εμπορική πρωτεάσης (Roche Molecular Biochemicals) επί 30 λεπτά επί πάγου. Τα κυτταρολύματα συλλέχθηκαν και προσδιορίστηκε ως προς την περιεκτικότητα πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Bradford (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Ίση ποσότητα πρωτεϊνών κάθε δείγματος (40 μg) μετουσιώθηκαν με θέρμανση στους 95 ° C για 5 λεπτά με ρυθμιστικό φόρτωσης Laemmli, και εν συνεχεία φορτώθηκαν σε ηλεκτροφόρηση 10% SDS-πολυακρυλαμιδίου. Μετά το διαχωρισμό, οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν επάνω σε 0,45 μm μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (Bio-Rad). Οι μεταφέρονται μεμβράνες αποκλείστηκαν για 1 ώρα σε 5% άπαχο ξηρό γάλα σε TBST (25 mM Tris-HCl (ρΗ 7.5), 125 mM NaCl, 0.05% Tween 20) και επωάστηκαν με τα κατάλληλα πρωτεύοντα αντισώματα στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Οι μεμβράνες πλύθηκαν δύο φορές με TBST για 10 λεπτά και επωάστηκαν με τον ισότυπο-ειδικά δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση αρμορακίας για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Τα ανοσοσυμπλέγματα εντοπίστηκαν με ενισχυμένη με υπόστρωμα χημειοφωταύγειας. (SuperSignal West Pico? Pierce) και ποσοτικά χρησιμοποιώντας το λογισμικό αναλυτής /Υ πυκνότητας (Bio-Rad)

Στατιστική Ανάλυση

Μέση δεδομένα από ανεξάρτητα πειράματα ομαλοποιήθηκαν να προκύψει από κύτταρα στον έλεγχο. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές. Μία στατιστική ανάλυση μεταξύ δύο ομάδων επιβεβαιώθηκε με δοκιμή t του Student, σε σύγκριση με πολλές ομάδες, πραγματοποιήθηκε μια ανάλυση της παραλλαγής (ANOVA) με post hoc εξέταση. Η δύναμη των σχέσεων, ο συντελεστής συσχέτισης (

r

), ανάμεσα σε κάθε επίπεδο της πρωτεΐνης μετά την απόσπαση προσδιορίστηκε με SPSS έκδοση 16 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Μια Ρ-τιμή μικρότερη του 0.05 θα μπορούσε να θεωρηθεί ως στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα

Η caveolin-1 Η εξάντληση μετά από απόσπαση των κυττάρων Βελτιώνει όγκων-ενδοθηλιακών κυττάρων Πρόσφυση

Cav-1 δείχθηκε να συνδέσει με μεταστατικό δυναμικό των καρκινικών κυττάρων του πνεύμονα [6], [12], ενώ το ρόλο του στην προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων είναι ακόμα ασαφής. Για τη μελέτη του ρόλου της πρωτεΐνης Cav-1 στην προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων, μπορούμε αποσπάται πρώτα τα καρκινικά κύτταρα για να μιμηθούν την πρώιμη βαθμίδα της μετάστασης, και αξιολογήθηκαν το προφίλ έκφρασης του Cav-1 μετά από απόσπαση των κυττάρων πάνω φορές. Τα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα Η460 καλλιεργήθηκαν σε πλάκες στερεώσεως ultralow αναλύθηκαν για έκφραση πρωτεΐνης Cav-1 με κηλίδωση Western σε υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία. Το Σχήμα 1Α δείχνει ότι μετά των κυττάρων αποκόλληση, Cav-1 μειώθηκε σταδιακά σε ένα χρονικό διάστημα που εξαρτάται από τη μόδα και η σημαντική μείωση ανιχνεύθηκε ήδη 6 ώρες μετά την κυτταρική προσκόλληση. Στη συνέχεια, τα αιωρούμενα κύτταρα κατά ταυτόχρονες χρονικά σημεία υποβλήθηκαν σε δοκιμασία κυτταρικής προσκόλλησης μονοστιβάδας, όπως περιγράφεται στο

Υλικά και Μέθοδοι

. Τα Σχήματα 1Α και Β δείχνουν ότι μετά των κυττάρων αποκόλληση, Cav-1 έκφραση σταδιακά μειώθηκε με την πάροδο του χρόνου η ταυτόχρονη με την αύξηση της πρόσφυσης των καρκινικών κυττάρων στα ενδοθηλιακά επιφάνειες, υποδηλώνοντας τον πιθανό ρόλο των Cav-1 στη ρύθμιση κόλλα καρκίνο. Εμείς υποστηρίζεται περαιτέρω μια τέτοια συσχέτιση, με την παραγωγή ενός διάγραμμα συσχέτισης μεταξύ Cav-1 έκφραση και η πρόσφυση των καρκινικών κυττάρων (Εικ. 1 C). Όχι μόνο έκανε η μείωση αυτών των πρωτεϊνών συσχετίζονται καλά με την ενισχυμένη ικανότητα των καρκινικών κυττάρων να προσκολλώνται στις επιφάνειες του ενδοθηλίου, αλλά η πλοκή αποκάλυψε επίσης μια υψηλή συσχέτιση του προφίλ με το συντελεστή συσχέτισης 0,922

Α.: κύτταρα

Η460 αιωρήθηκαν σε πλάκες πολυ-ΗΕΜΑ επικαλυμμένα για διάφορους χρόνους (0-12 h) και Cav-1 έκφραση αναλύθηκε με κηλίδωση Western. Στήλες είναι μέσοι όροι ± SD (

n =

5). *

P

& lt? 0,05 vs.

χρόνο 0. Β:

κύτταρα Μονοκατοικία Η460 υποβλήθηκαν σε μονοστρωματική καλλιέργεια της HUV-ΕΚ-C. Η αλληλεπίδραση των Η460 και κυττάρων HUV-EC-C εξετάσθηκε παρουσία IL-1

β

(10 ng /ml). Οι αντίθεσης φάσης μικροσκοπικές εικόνες των αντιπροσωπευτικών πειραμάτων παρουσιάζονται.

C:

ανάλυση συσχέτισης των κυτταρικό επίπεδο Cav-1 σε σχέση με την προσκόλληση Η460-HUV-ΕΚ-C (

n

= 5).

D: Cav

-1 υπερεκφράζεται Hcav-1 ή βραχείας φουρκέτας Cav-1-επιμολυσμένα κύτταρα shCav-1 κατασκευάστηκαν και αναλύθηκαν για Cav-1 έκφραση με κηλίδωση Western. Οι κηλίδες επανα-διερευνήθηκαν με αντίσωμα β-ακτίνης για να επιβεβαιωθεί ίση φόρτωση των δειγμάτων. Τα σήματα ανοσοστυπώματος ποσοτικοποιήθηκαν με πυκνομετρία, και μέση δεδομένα από ανεξάρτητα πειράματα κανονικοποιήθηκαν στα αποτελέσματα. Στήλες είναι μέσοι όροι ± SD (

n =

3), *

P

& lt? 0,05 έναντι Η460 κύτταρα.

Ε:

Hcav-1, τα κύτταρα Η460, και shCav-1 αποσπάστηκαν για 3 ώρες και προστίθεται σε μια κουλτούρα HUV-ΕΚ-C. Στήλες είναι μέσοι όροι ± SD (

n =

3), *

P

& lt?. 0,05 έναντι Η460 κύτταρα

Η

Για να επιβεβαιώσετε ότι Cav-1 μειώνει τον καρκίνο κύτταρο προσκόλληση σε ενδοθηλιακά κύτταρα, διερευνήσαμε την επίδραση διαφόρων έκτοπη επιπέδων έκφρασης Cav-1 σε κύτταρα Η460 προσκόλληση στο ενδοθήλιο. Ιδρύσαμε Cav-1 που υπερεκφράζουν (Hcav-1) κύτταρα, μικρή φουρκέτα (sh) μεσολάβηση Cav-1 νοκ ντάουν (shCav-1) κύτταρα με σταθερή επιμόλυνση. Οι κλώνοι μορφομετατροπέα αναλύθηκαν για Cav-1 έκφραση σε σύγκριση με τη γονική Η460 κύτταρα τους με κηλίδωση Western (Σχ. 1D). Είναι αξιοσημείωτο ότι ο έλεγχος επιμολυσμένα κύτταρα που παράγονται από τα πλασμίδια ελέγχου, pDS_XB-YFP και ελέγχου shRNA πλασμίδιο Α, αξιολογήθηκαν επίσης για Cav-1 έκφραση, ωστόσο? το επίπεδο της πρωτεΐνης ήταν συγκρίσιμη με εκείνη του Η460 κύτταρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Cav-1 υπερεκφράζεται, Cav-1 knockdown, και τα κύτταρα Η460 αποσπάστηκαν και υποβλήθηκαν σε ενδοθηλιακά δοκιμασία προσκόλλησης και τα καρκινικά κύτταρα προσκολλώνται στα ενδοθηλιακά κύτταρα HUV-EC-C παρατηρήθηκαν. Όπως ήταν αναμενόμενο, η ανάλυση των προσκόλλησης κυττάρου έδειξε ότι Cav-1 υπερεκφράζεται κύτταρα εμφάνισαν το χαμηλότερο ικανότητα να προσκολλώνται στα κύτταρα HUV-EC-C, ενώ τα κύτταρα shCav-1 είχε την υψηλότερη ικανότητα. Επίσης, ο φορέας επιμολυσμένα κύτταρα παρομοίως αξιολογήθηκαν για συγκολλητική ικανότητα και βρήκαμε καμία σημαντική μεταβολή σε σύγκριση με εκείνη των γονικών κυττάρων (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτό δείχνει ότι Cav-1 ρυθμίζει αρνητικά την πρόσφυση των καρκινικών κυττάρων στο αγγειακό ενδοθήλιο.

Η caveolin-1 Καταστέλλει υπεροξείδιο του υδρογόνου και ρίζα υδροξυλίου γενιά μετά κυττάρων Αποκόλληση

προηγούμενη μελέτη μας έχει δείξει ότι στην τηρούνται κατάσταση , Cav-1 λειτουργία στην εξασθένηση του οξειδωτικού στρες που προκαλείται από κατεργασία υπεροξειδίου του υδρογόνου [13]. Ως εκ τούτου, είναι πιθανό ότι Cav-1 πρωτεΐνη μπορεί να λειτουργεί για τη ρύθμιση της κατάστασης οξειδοαναγωγής των καρκινικών κυττάρων κατά τη διάρκεια της μετάστασης. Για να μελετηθεί η επίδραση της Cav-1 πρωτεΐνης που αποσπώνται επαγόμενη παραγωγή ROS, Cav-1 υπερεκφράζεται (Hcav-1), Cav-1 knock-down (shCav-1), και τον έλεγχο κύτταρα (Η460) αποκολλήθηκαν και επωάστηκαν σε προσκόλληση ανθεκτικών πλάκες μέχρι συγκεκριμένα χρονικά σημεία. Τα αιωρούμενα κύτταρα μετά αναλύθηκαν για ενδοκυτταρικά επίπεδα ROS με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας DCFH

2-DA ως φθορίζοντα ανιχνευτή. Το Σχήμα 2Α δείχνει ότι κύτταρο απόσπαση προκάλεσε μια αύξηση στην κυτταρική ROS σε ένα χρονο-εξαρτώμενο τρόπο ο οποίος ευθυγραμμίζεται με προηγούμενη αναφορά μας [6]. Η παρούσα μελέτη αποκάλυψε για πρώτη φορά ότι Cav-1 λειτούργησε στην εξασθένηση της αποκόλλησης επάγεται ROS στα κύτταρα αυτά. ShCav-1 κύτταρα που έχουν το χαμηλότερο έκφραση Cav-1 δείχθηκε ότι εμφανίζουν την υψηλότερη επαγωγή ROS και μια τέτοια επαγωγή μπορούσε να ανιχνευθεί ήδη 1 ώρα μετά την αποκόλληση (Εικ. 2Α), ενώ κυτταρικά ROS σε Cav-1 υπερεκφράζεται (Hcav- 1) κύτταρα δεν μεταβλήθηκε ως απάντηση στην κυτταρική αποκόλληση

Α:.

επίπεδο κυτταρικής ROS μονοκατοικιών Η460, shCav-1, και Hcav-1 κυττάρων προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας H

2DCF-DA ως ανιχνευτή φθορισμού. Στήλες είναι μέσοι όροι ± SD (

n =

3), *

P

& lt? 0,05 vs.

χρόνο 0. Β:

Η460, shCav-1, και Hcav- 1 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Mn (III) τετράκις (4-βενζοϊκό οξύ) χλωριούχο πορφυρίνη (MnTBAP, 50 μΜ), καταλάση (Cat, 7500 U /ml), μυρμηκικό νάτριο (NaF, 2.5 mM), ή δεφεροξαμίνη (DFO, 1 mM). Η ενδοκυτταρική επίπεδο ROS αυτών των κυττάρων προσδιορίστηκε με H

ανιχνευτή 2DCF-DA. Στήλες είναι μέσοι όροι ± SD (

n =

5), *

P

& lt? 0,05 έναντι επισυνάπτεται ελέγχου (

χρόνο 0

), και #

P

& lt? 0.05 έναντι μη επεξεργασμένου ελέγχου σε αντίστοιχο χρόνο.

C:

επίπεδο Το υπεροξείδιο του υδρογόνου των κυττάρων προσδιορίστηκε με αναγνώστη μικροπλάκας χρησιμοποιώντας Amplex Red. Στήλες είναι μέσοι όροι ± SD (

n =

3), *

P

& lt? 0,05 έναντι κύτταρα ελέγχου σε

χρόνο 0. D:

υδροξυλων ριζική επαγωγή προσδιορίστηκε από HPF. Στήλες είναι μέσοι όροι ± SD (

n =

3), *

P

& lt? 0,05 έναντι κύτταρα ελέγχου σε

χρόνο 0.

Η

Περαιτέρω, οι ειδικοί αναστολείς ROS χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση της ειδικής ROS που ήταν πάνω ρυθμισμένα σε αυτά τα κύτταρα. Cav-1 υπερεκφράζεται, Cav-1 χτυπήσει τα κάτω, και τα κύτταρα Η460 προκατεργάστηκαν με αναστολείς ειδικών ROS που ήταν MnTBAP (ένας αναστολέας ανιόντος υπεροξειδίου), καταλάση (ένας αναστολέας του υπεροξειδίου του υδρογόνου), δεφεροξαμίνη (α ρίζα υδροξυλίου αναστολέα), και μυρμηκικό νάτριο ( μια ρίζα υδροξυλίου καθαριστής), και τα επίπεδα ROS μετά την απόσπαση για 0-3 ώρες προσδιορίστηκαν. Το Σχήμα 2Β δείχνει ότι η θεραπεία με καταλάση, μυρμηκικό νάτριο, και η δεφεροξαμίνη μπορεί να μπλοκάρει την επαγωγή των ROS στα κύτταρα αυτά, γεγονός που υποδηλώνει ότι το υπεροξείδιο του υδρογόνου και ρίζα υδροξυλίου ήταν πρωταρχικός συγκεκριμένες ROS ρυθμισμένα προς τα πάνω μετά κυττάρου απόσπαση.

Η επίδραση του Cav-1 επί υπεροξειδίου του υδρογόνου και ρίζα υδροξυλίου που παράγεται από αυτά τα κύτταρα ήταν επόμενο αξιολογήθηκαν. Amplex κόκκινο, ένας ειδικός ανιχνευτής ανίχνευσης για το υπεροξείδιο του υδρογόνου, και HPF, ένας ειδικός ανιχνευτής ανίχνευσης για ρίζα υδροξυλίου, χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό των εν λόγω ειδικών ROS στα αποσπασμένων κυττάρων. Τα Σχήματα 2C και D υποδεικνύουν ότι κύτταρο απόσπαση αύξησε τα σήματα του υπεροξειδίου του υδρογόνου και ρίζα υδροξυλίου ειδικούς ανιχνευτές σε έναν χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. Είναι σημαντικό ότι, το σήμα του είτε υπεροξείδιο του υδρογόνου ή ρίζα υδροξυλίου ήταν μόλις ανιχνεύσιμη σε Cav-1 υπερεκφράζεται κύτταρα, ενώ τέτοια σήματα ROS είχαν ενισχύεται στα κύτταρα που εκφράζουν ένα χαμηλό επίπεδο Cav-1. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι Cav-1 εξασθενημένα υπεροξειδίου του υδρογόνου και ρίζα υδροξυλίου γενιές σε αιωρούμενα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα.

Υπεροξείδιο του υδρογόνου και ρίζα υδροξυλίου Ρυθμίζουν Προσκόλληση Cancer Cell με ενδοθηλιακά κύτταρα μέσω του VCAM-1 που εξαρτάται Μηχανισμός

ROS παρουσιάστηκαν σε πολλές μελέτες για να παίξει ένα ρόλο κλειδί στην ρύθμιση του καρκινικού κυττάρου συμπεριφορών [11]. Μαζί με την ανωτέρω διαπίστωση δείχνει ότι Cav-1 εξασθενημένα υπεροξειδίου του υδρογόνου και ρίζα υδροξυλίου σχηματισμούς κατά τη διάρκεια της κυτταρικής αποκόλλησης, ερευνήσαμε αν το υπεροξείδιο του υδρογόνου και ρίζα υδροξυλίου παίζουν ένα ρόλο στη ρύθμιση της προσκόλλησης των καρκινικών κυττάρων. Πνεύμονα καρκινικά κύτταρα επωάστηκαν με διάφορες γνωστές ειδικές ROS παράγοντες ρύθμισης, όπως περιγράφεται και τα κύτταρα υποβλήθηκαν στις αναλύσεις προσκόλλησης. Το Σχήμα 3Α δείχνει ότι η θεραπεία των κυττάρων με έναν αναστολέα υπεροξειδικής MnTBAP είχε μόνο μια ελάχιστη και ασήμαντο αποτέλεσμα επί προσκολλητική δραστικότητα των καρκινικών κυττάρων, ενώ η προσθήκη καταλάσης, μυρμηκικό δεφεροξαμίνη, και νάτριο ανέστειλε σημαντικά την πρόσφυση των κυττάρων Η460 στο ενδοθήλιο επιφάνεια. Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι το υπεροξείδιο του υδρογόνου και ρίζα υδροξυλίου, αλλά όχι ανιόντος υπεροξειδίου είναι τα ROS που ενισχύουν συγκολλητική ικανότητα αυτών των καρκινικών κυττάρων σε αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα

Α:.

Η460 κύτταρα αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ή προκατεργασμένο με Mn (III) τετράκις (4-βενζοϊκό οξύ) πορφυρίνη χλωριδίου (MnTBAP, 50 μΜ), καταλάση (Cat, 7500 U /ml), μυρμηκικό νάτριο (NaF, 2.5 mM), ή δεφεροξαμίνη (DFO, 1 mM) στη συνέχεια αποσπάται για 3 ώρες πριν από την δοκιμασία προσκόλλησης. Οι στήλες είναι μέσα ± SD (

n =

3), *

P

& lt? 0.05 έναντι μη επεξεργασμένου ελέγχου.

Β:

Η460 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 μΜ H

2O

2 ή 100 μΜ H

2O

2 και 50 μΜ FeSO

4 και υποβάλλεται στη HUV- EC-C επιφάνεια η οποία έχει αποκλειστεί από VCAM-1, ICAM-1, ή τα αντισώματα Ε-σελεκτίνη. Οι αντίθεσης φάσης μικροσκοπικές εικόνες των αντιπροσωπευτικών πειραμάτων παρουσιάζονται. Στήλες είναι μέσοι όροι ± SD (

n =

3), *

P

& lt?. 0,05 έναντι μη επεξεργασμένο έλεγχο

Η

Αποδείξεις έχουν προτείνει ότι ενδοθηλιακών κυττάρων μόρια προσκόλλησης (ECAMs) διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην αλληλεπίδραση κυττάρου καρκίνο ενδοθηλιακών [15]. Η ενεργοποίηση των ενδοθηλιακών κυττάρων από την IL-1

β

προκάλεσε την έκφραση του ECAMs δηλαδή VCAM-1, ICAM-1 και Ε-σελεκτίνης επί των επιφανειών των ενδοθηλιακών κυττάρων, και αυτές οι πρωτεΐνες διευκόλυνε την πρόσδεση των καρκινικών κυττάρων [15]. Για να επιβεβαιωθεί ο ρόλος του υπεροξειδίου του υδρογόνου και ρίζα υδροξυλίου επί αλληλεπίδραση καρκινικό κύτταρο-ενδοθηλιακού και να καθορίσουν τους επηρεάζονται μορίων προσκόλλησης, έχουμε μπλοκάρει τα ενδοθηλιακά επιφάνειες με ειδικά αντισώματα έναντι VCAM-1, ICAM-1 και Ε-σελεκτίνης, πριν από την προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων . Επίσης, τα καρκινικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με εξωγενές υπεροξείδιο υδρογόνου υπό την απουσία ή παρουσία θειικού σιδήρου για να επιβεβαιώσει τον ρόλο του υπεροξειδίου του υδρογόνου και ρίζα υδροξυλίου, αντίστοιχα.

Σχήμα 3Β δεικνύει ότι το υπεροξείδιο του υδρογόνου και ρίζα υδροξυλίου σημαντικά ενισχυμένη καρκίνο κυτταρική προσκόλληση σε ενδοθηλιακά κύτταρα, επιβεβαιώνοντας το ρόλο της αναφερόμενης ROS στην προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων. Είναι ενδιαφέρον ότι, μπλοκάροντας ενδοθήλιο με τα αντισώματα του VCAM-1 θα μπορούσε να καταργήσει την επίδραση του υπεροξειδίου του υδρογόνου και θειικού σιδήρου σχετικά με την συγκολλητική ιδιότητα αυτών των καρκινικών κυττάρων ενώ αντισώματα εναντίον ICAM-1 και Ε-σελεκτίνης δεν είχε σημαντικές επιδράσεις. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το υπεροξείδιο του υδρογόνου και ρίζα υδροξυλίου μπορεί, τουλάχιστον εν μέρει, να ρυθμίσουν την αλληλεπίδραση των καρκινικών κυττάρων στα ενδοθηλιακά επιφάνεια μέσω VCAM-1 που εξαρτάται από τον μηχανισμό. Επίσης, Cav-1 μπορεί να μειώσει τη συγκολλητική ιδιότητα των καρκινικών κυττάρων που οφείλεται στην εξασθένηση του υπεροξειδίου του υδρογόνου και ρίζα υδροξυλίου.

Cav-1 Καταστέλλει ROS γενιά μετά κυττάρων Αποκόλληση μέσω PI3K /AKT οδό

Έχοντας δείξει ότι εξασθενεί την ικανότητα του καρκίνου Cav-1 να τηρούν μια ενδοθήλιο με τη μείωση των κυτταρικών υπεροξείδιο του υδρογόνου και ρίζα υδροξυλίου up-κανονισμούς, και τα αποδεικτικά στοιχεία έδειξαν ότι Cav-1 ρυθμίζει διάφορες συμπεριφορές των κυττάρων κατά τη διάρκεια της κυτταρικής αποκόλλησης μέσω PI3K /Akt μονοπατιού [11]. Για την περαιτέρω επιβεβαίωση του ρόλου της Cav-1 για Ακί σηματοδότησης, παρακολουθήσαμε την Akt ενεργοποίησης από την άποψη της φωσφορυλιωμένη (σερίνη 473) Akt. Σε συμφωνία με την προηγούμενη διαπίστωση [16], βρήκαμε το αυξημένο επίπεδο της ενεργοποίησης της Akt σε κύτταρα Hcav-1 σε σύγκριση με εκείνη του Η460 και κυττάρων shCav-1 (Σχ. 4Α). Επίσης, βρήκαμε ότι κύτταρο απόσπαση μείωσε σημαντικά το επίπεδο του ενεργοποιημένου Akt σε όλα σχεδόν τα κύτταρα. Ενώ η φωσφορυλιωμένη (σερίνη 473) Akt σε shCav-1 κύτταρα βρέθηκε να επηρεάζονται περισσότερο από ένα τέτοιο κύτταρο αποκόλληση, το επίπεδο των ενεργοποιημένων Akt σε Hcav-1 ήταν μόλις μεταβληθεί (Σχ. 4Α).

Α:

Η460, shCav-1, και τα κύτταρα Hcav-1 αποκολλήθηκαν και εναιωρήθηκαν σε πολυ-ΗΕΜΑ-επικαλυμμένες πλάκες για 0-3 ώρες. p473-Ακί και παν-Akt επίπεδο σε αυτά τα κύτταρα προσδιορίστηκε με αντισώματα ειδικά προς Akt p473-και παν-Akt. Στήλες είναι μέσοι όροι ± SD (

n =

3), *

P

& lt? 0,05 έναντι Η460 κύτταρα σε

χρόνο 0

,

#P

& lt? 0,05 έναντι αντίστοιχης κύτταρα ελέγχου σε

χρόνο 0

.

Β:

λύμα Η460, shCav-1, και Hcav-1 κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για την έρευνα του ΡΤΕΝ, φωσφο-ΡΤΕΝ (Ser380 /Thr382 /383) έκφρασης. μικροσωματικό κλάσμα ΜΙΚΡΟΣΠΗΛΑΙΑ (Μ) παρασκευάστηκε όπως περιγράφεται στα υλικά και τις μεθόδους που χρησιμοποιούνται και για τη διερεύνηση του ΡΤΕΝ (Μ). EGFR χρησιμοποιήθηκε ως δείκτης για την μικροσπηλαίων κλάσμα. Οι στήλες είναι μέσα ± SD (η = 3), *

P

& lt? 0,05 vs. Η460 κύτταρα.

C:

Η460 κύτταρα αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ή προκατεργασμένο για 2 ώρες με 10 και 50 μΜ LY294002 τότε τα κύτταρα αποκολλήθηκαν για 3 ώρες και αναλύθηκαν για τα επίπεδα p473-Ακί και Akt. Οι στήλες είναι μέσα ± SD (

n =

3), *

P

& lt? 0.05 έναντι μη επεξεργασμένου ελέγχου.

D: κύτταρα

Η460 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με LY294002 και προσδιορίζεται για ROS, ρίζα υδροξυλίου, και την παραγωγή υπεροξειδίου του υδρογόνου από DCFH

2-DA, HPF, Amplex Red, αντίστοιχα. Στήλες είναι μέσοι όροι ± SD (

n =

4), *

P

& lt? 0,05 έναντι μη επεξεργασμένο έλεγχο σε

χρόνο 0

, #

P

& lt? 0.05 έναντι μη επεξεργασμένου ελέγχου σε

3 h. Ε:

ShCav-1 και Hcav-1 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με LY294002 και αναλύσεις για την κυτταρική ROS χρήση DCFH

2-DA. Στήλες είναι μέσοι όροι ± SD (

n =

3), *

P

& lt?. 0,05 έναντι μη επεξεργασμένο έλεγχο

Η

Από διαγράφονται φωσφατάση και tensin ομόλογο στο χρωμόσωμα δέκα (ΡΤΕΝ) είναι ένα σημαντικό αρνητικός ρυθμιστής του μονοπατιού ΡΙ3Κ /Akt σηματοδότησης, εκτελέσαμε επίσης το πείραμα για τη διαλεύκανση του ρόλου των Cav-1 επί ΡΤΕΝ. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι ΡΤΕΝ ήταν ρυθμισμένη στην κυτταροπλασματική τμήμα (C), αλλά κάτω-ρυθμίζονται στο κλάσμα μικροσπηλαίων μικροσωμικό (Μ) σε Cav-1 υπερεκφράζεται κύτταρα (Hcav-1) σε σύγκριση με εκείνα των κυττάρων Η460 (Σχ. 4Β ). Σε αντίθεση, Cav-1-γκρεμίσουμε τα κύτταρα παρουσίασαν οι αντίθετες προφίλ, γεγονός που υποδηλώνει ότι Cav-1 ρυθμίζεται η διαμερισματοποίηση του PTEN. Προκειμένου να αξιολογηθεί η δραστικότητα του ΡΤΕΝ, η ανάλυση στυπώματος Western των Ο-τερματικού φωσφορυλιωμένο ΡΤΕΝ σε Ser380, Thr382, Thr383 και που προωθούν τη σταθερότητα ΡΤΕΝ αλλά μειώνουν δραστηριότητες ΡΤΕΝ [17], εκτελέστηκε. Το Σχήμα 4Β δείχνει ότι ενεργοποιείται ΡΤΕΝ ήταν σημαντικά μειωμένη στα Hcav-1 κύτταρα με τις παρατηρήσεις ότι η φωσφορυλιωμένη ΡΤΕΝ (στο Ser380, Thr382, Thr383 και) αυξήθηκαν σημαντικά. Μαζί με το εύρημα υποδεικνύει ότι η φωσφορυλίωση μιας τέτοιας πρωτεΐνης σε κύτταρα ShCav-1 μειώθηκε, Cav-1 αποδείχθηκε στη μελέτη παρουσία που ρυθμίζεται αρνητικά ενεργοποιημένη κατάσταση του ΡΤΕΝ και τέτοια ρύθμιση μπορεί, τουλάχιστον εν μέρει, υπέστη το επίπεδο της φωσφορυλιωμένη Akt.

για να ελέγξετε αν η μεταβολή στη φωσφορυλιωμένη Akt επηρεάζει την κυτταρική οξειδωτικό στρες, έναν αναστολέα της PI3K LY294002 χρησιμοποιήθηκε για να καταστείλει Akt ενεργοποίηση. κύτταρα Η460 επωάστηκαν με αναστολέα ΡΙ3Κ LY294002 στις συγκεντρώσεις των 10 και 50 μΜ, και Akt και φωσφορυλιωμένο Akt-επίπεδα προσδιορίστηκαν με κηλίδωση Western (Εικ. 4C). LY294002 σε 10 και 50 μΜ ήταν σε θέση να μειώσει p473-Ακί (Εικ. 4C). Η επίδραση της LY294002 επί ROS που προκαλείται από κύτταρο απόσπαση παρακολουθείται με DCFH

2-DA, HPF και Amplex κόκκινο. Προφανώς, PI3K αναστολέα ήταν σε θέση να αυξήσει την κυτταρική οξειδωτικό στρες, όπως φαίνεται από τη σημαντική αύξηση του σήματος φθορισμού DCF. Επιπλέον, η συγκεκριμένη ROS, δηλαδή ρίζα υδροξυλίου και υπεροξειδίου του υδρογόνου, βρέθηκαν να αυξηθεί σημαντικά σε απόκριση προς τη θεραπεία του αναστολέα ΡΙ3Κ σε Η460 κύτταρα (Σχ. 4D).

Είναι ενδιαφέρον ότι η κατεργασία του LY294002 10 και 50 μΜ θα μπορούσε να αντιστρέψει την επίδρασή του Cav-1 στην καταστολή μείωση ROS στα κύτταρα Hcav-1. Το Σχήμα 4Ε δείχνει ότι σήμα ROS σε Hcav-1 κύτταρα κατεργασμένα με LY294002 ήταν αξιοσημείωτα αυξημένη, σε σύγκριση με εκείνη των μη κατεργασμένων κυττάρων Hcav-1. Αντίθετα, το επίπεδο ROS στα κύτταρα shCav-1 επηρεάστηκαν ελάχιστα από τη θεραπεία της LY294002. Λαμβανόμενα μαζί αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι Cav-1 ρυθμίζει το σχηματισμό ROS μετά κύτταρο απόσπαση από τη διατήρηση της ενεργοποίησης των ΡΙ3Κ /Akt μονοπάτι.

Συζήτηση

Μέχρι τώρα, ένας αριθμός σχετιζόμενων με τον καρκίνο πρωτεΐνες έχουν έχουν ταυτοποιηθεί και χρησιμοποιούνται για συγκεκριμένες εφαρμογές, συμπεριλαμβανομένων των βιολογικών δεικτών για την έγκαιρη ανίχνευση, πρόγνωση, και μοριακοί στόχοι για το σχεδιασμό αντικαρκινική [18]. Σύμφωνα με την ευρέως αποδεκτή υπόθεση ότι δεν είναι όλοι οι πρωτογενείς όγκους είναι σε θέση να προσκολληθούν στα ενδοθηλιακά επιφάνειες, αλλά ορισμένα καρκινικά κύτταρα διαθέτουν μια έμφυτη ή προσαρμοστική ικανότητα είναι σε θέση να προσκολλώνται στην επιφάνεια των αγγειακών ενδοθηλιακών κυττάρων και να σχηματίσουν μεταστάσεις [19]. Πολλές ρυθμιστικές πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν ως καταστολέα όγκων ή πρωτεϊνών προαγωγό όγκου? Ωστόσο, στην περίπτωση της Cav-1, και οι δύο λειτουργίες έχουν αναφερθεί. Cav-1 πρώτα περιγράφηκε ως μια πρωτεΐνη καταστολής όγκου δεδομένου ότι η προς τα κάτω ρύθμιση του Cav-1 βρέθηκε κατά τη διάρκεια της μετατροπής των κυττάρων [7]. Σε αντίθεση, Cav-1 έχει αποδειχτεί ότι ενισχύει την εξέλιξη του καρκίνου και αυξανόμενα στοιχεία έδειξε το ρόλο της ως υποκινητή καρκίνος [20]. Cav-1 δείχθηκε να λειτουργεί ως σημαντικός μεσολαβητής για πολλαπλές οδούς σηματοδότησης προ-επιβίωσης [21] – [23]. Επιπλέον, Cav-1 έκφραση έδειξε να αυξάνει σε διάφορους τύπους ανθρώπινων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του πνεύμονα, του μαστού, του προστάτη και καρκίνους του παγκρέατος, και αυτή η αυξητική ρύθμιση συσχετίστηκε με υψηλό βαθμό μετάσταση [20], [24] – [28]. Ακόμα κι αν Cav-1 έχει αποδειχτεί ότι ενισχύει τη μετάσταση του καρκίνου του πνεύμονα με την ενίσχυση της αντίστασης anoikis [9] και εισβολή και τη μετανάστευση [11], η παρούσα μελέτη παρέχει το ανασταλτικό αποτέλεσμα της Cav-1 στην προσκόλληση καρκίνο ενδοθήλιο το οποίο δεν έχει αποδειχθεί. <