Αφηρημένο

απορυθμισμένη δραστηριότητα των μεταγραφικών παραγόντων (ΤΡ) της οικογένειας Σπ /KLF, όπως Sp1, Sp3 και SP4, και την επακόλουθη υπερέκφραση του Sp-ρυθμιζόμενα γονίδια συμβαίνουν συχνά σε ανθρώπινους καρκίνους. Αυτό παρέχει την λογική για την ανάπτυξη αναστολέων του ΤΡ Sp ως θεραπευτικές του καρκίνου. Μιθραμυκίνη Α (MTM-Α) είναι ένα φυσικό πολυκετιδίου που δεσμεύεται DNA αλληλουχίες πλούσιες σε GC, αναστέλλει δραστικότητα Sp ΤΡ και παρουσιάζει ισχυρή αντικαρκινική δραστικότητα σε πειραματικά συστήματα. Εντούτοις, η κλινική χρήση του ΜΤΜ-Α περιορίζεται από τη σοβαρή τοξικότητα της ένωσης. Εδώ, μελετήσαμε δύο αναλόγων MTM-Α, η οποία είχε παραχθεί με γενετική μηχανική της MTM-Α βιοσυνθετική οδό, και αξιολογήθηκαν δραστηριότητα τους σε ανθρώπινο καρκίνο του προστάτη σε καλλιέργειες κυττάρων και τα μοντέλα ποντικού. Οι ενώσεις, που ονομάστηκε MTM-SDK και MTM-SK, ήταν εξαιρετικά αποτελεσματικό

in vitro

παρεμπόδιση του πολλαπλασιασμού κυττάρων καρκίνου του προστάτη και μεταγραφή Sp ρυθμιζόμενα γονίδια αναστέλλοντας τη δέσμευση της Sp πρωτεϊνών στους υποκινητές του γονιδίου Όταν χορηγείται σε ποντίκια , και οι δύο ενώσεις ήταν καλά ανεκτή με μέγιστες ανεκτές δόσεις MTM-SDK και MTM-SK, αντίστοιχα, 4 και 32- φορές υψηλότερες από ό, τι MTM-A. Μετά από συστηματική χορήγηση, αμφότερες οι ενώσεις καθαρίστηκαν γρήγορα από την κυκλοφορία του αίματος, αλλά διατήρησε τα επίπεδα πλάσματος πολύ πάνω από τις δραστικές συγκεντρώσεις που απαιτούνται

in vitro

για αναστολή της δράσης της TF Sp και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Σταθερά, MTM-SDK και MTM-SK αναστέλλεται μεταγραφή Sp-γονιδίων που ρυθμίζονται σε ξενομοσχεύματα όγκου του προστάτη και παρουσίασαν ισχυρή αντικαρκινική δράση σε υποδόρια και μεταστατικό μοντέλα ξενομοσχεύματος όγκου χωρίς ή με ελάχιστη τοξικότητα. Στο σύνολό τους, τα στοιχεία αυτά δείχνουν ότι η MTM-SDK και MTM-SK διαθέτουν σημαντικά βελτιωμένη φαρμακολογικές και τοξικολογικές ιδιότητες σε σύγκριση με το MTM-Α και αποτελούν υποσχόμενα φάρμακα για τη θεραπεία του προχωρημένου καρκίνου του προστάτη

Παράθεση:. Malek Α, Núñez LE , του Magister M, L Brambilla, Γιόβιτς S, Carbone GM, et al. (2012) Διαμόρφωση της δραστηριότητας του Σπ μεταγραφή Παράγοντες από Μιθραμυκίνη Ανάλογα ως νέα στρατηγική για την θεραπεία του μεταστατικού καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 7 (4): e35130. doi: 10.1371 /journal.pone.0035130

Επιμέλεια: Λέων Τ.Ο. Lee, Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 7 Οκτ, 2011? Αποδεκτές: 13 Μάρ 2012? Δημοσιεύθηκε: 19 Απρίλη 2012

Copyright: © 2012 Malek et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Fondazione Ticinese per la Ricerca sul Cancro, ελβετικό Εθνικό Ίδρυμα Επιστημών και της Ελβετίας Καρκίνος Λιγκ με CVC και GMC. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Συν-συγγραφείς FM και LEN είναι εργαζόμενοι και FM είναι μέτοχος της EntreChem SL, η εταιρεία αδειούχος των ενώσεων που περιγράφονται στο χειρόγραφο. Όλοι οι άλλοι συγγραφείς πρέπει να δηλώνουν ότι δεν ανταγωνιστικών συμφερόντων exist.This δεν μεταβάλλει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

έναρξη και την εξέλιξη του όγκου είναι διαμεσολαβείται από πολλαπλές οδούς σηματοδότησης και τα θεραπευτικά οφέλη που επιτυγχάνονται με τη στόχευση ατομικές πορείες μπορεί να περιορίζεται [1]. Στόχευση τις περιοχές σύγκλισης των διαφορετικών ρυθμιστικών καταρράκτες μπορεί να αντιπροσωπεύει μια πιο ελπιδοφόρα στρατηγική για τη θεραπεία του καρκίνου. παράγοντες μεταγραφής (ΤΡ) είναι ιδιαίτερα ελκυστικές από αυτή την άποψη, δεδομένου ότι είναι κομβικά σημεία σε μονοπάτια σηματοδότησης και συχνά απορυθμισμένη στους ανθρώπινους καρκίνους [1], [2]. Η ανώμαλη έκφραση ή δραστηριότητα των μελών της οικογένειας Sp /KLF του ΤΡ, όπως Sp1, Sp3 και SP4, εμφανίζεται σε πολλούς ανθρώπινους καρκίνους [3] Sp TFs δεσμεύονται με στοιχεία DNA πλούσια σε GC (GC-box) σε προαγωγούς γονιδίου, αλληλεπιδρούν με συστατικά του βασικού μηχανισμού μεταγραφικής, συνεργάζονται με άλλα TFs και κατάντη επενεργητές πολλαπλών οδών σηματοδότησης [3]. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι Sp TFs έχουν σημαντικούς ρόλους στην παθογένεση ανθρώπινων καρκίνων και υπόσχονται θεραπευτικοί στόχοι [3], [4], [5],.

Μιθραμυκίνη Α (MTM-Α) είναι ένα φυσικό πολυκυκλικών αρωματικών πολυκετιδίων που παράγονται από διάφορους

Streptomyces

είδη [14]. MTM-Α συνδέεται κατά προτίμηση με πλούσιες σε GC αλληλουχίες στο DNA, μπλοκ ανταγωνιστικά τα στοιχεία σύνδεσης του Sp ΤΡ και άλλων πρωτεϊνών GC-πρόσδεση σε πλούσια σε GC σε υποκινητές γονιδίων και αναστέλλει τη μεταγραφή του Sp ρυθμισμένων γονιδίων [15], [16], [ ,,,0],17], [18], [19]. Αναστολή της Sp ρυθμιζόμενων γονιδίων είναι ο κύριος καθοριστικός παράγοντας της βιολογικής δραστικότητας του MTM-Α σε πειραματικά συστήματα [20], [21]. Η κλινική χρήση του MTM-A ωστόσο, είναι περιορισμένη λόγω της τοξικότητας της ένωσης [22]. Γενετικά μηχανική του MTM-Α βιοσυνθετικής οδού έδωσε την ευκαιρία για τη δημιουργία νέων αναλόγων της MTM-Α που μπορεί να έχουν βελτιωμένες φαρμακολογικές και τοξικολογικές ιδιότητες [23], [24], [25], [26]. Πρόσφατα, δύο ενώσεις, που ονομάζεται MTM-SDK και MTM-SK, ελήφθησαν χρησιμοποιώντας την προσέγγιση μεταβολική μηχανική [27], [28]. MTM-SDK και MTM-SK επέδειξαν μεγαλύτερη ικανότητα να δεσμεύουν σύνδεση με το DNA και την κυτταρική πρόσληψη σε σύγκριση με το MTM-Α SP1. Αυτό οδήγησε σε αυξημένη βιολογική δραστικότητα ως αναστολείς της Sp ρυθμιζόμενης γονιδιακής μεταγραφής και τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, τόσο in vitro όσο και in vivo [27], [29]. Έτσι, αυτά τα νέα ανάλογα MTM-Α μπορεί να είναι χρήσιμη για τη θεραπεία των καρκίνων με ανώμαλη δραστηριότητα του Σπ ΤΡ.

Στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε τη δράση των αναλόγων MTM-Α MTM-SDK και MTM-SK στη πειραματικά μοντέλα ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη. Ο καρκίνος του προστάτη είναι η πιο κοινή μορφή καρκίνου και η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στους άνδρες στις δυτικές χώρες [30]. Συμβατικά διαχείριση του καρκίνου του προστάτη περιλαμβάνει τη χειρουργική επέμβαση, ακτινοθεραπεία και στέρηση ανδρογόνου [31]. Παρά τη σταδιακή αύξηση στην επιβίωση και την ποιότητα ζωής απαλλαγμένο από ασθένειες, μεταστατική διάδοση εξακολουθεί να είναι η κύρια αιτία θανάτου για τους ασθενείς με καρκίνο του προστάτη [31]. Προχωρημένο καρκίνο του προστάτη είναι συχνά ανθεκτικά στην ορμονική θεραπεία και συστηματική χημειοθεραπεία έχει περιορισμένη αποτελεσματικότητα [31], [32]. Παρηγορητική θεραπεία παραμένει η κύρια επιλογή για πολλούς από αυτούς τους ασθενείς. Ως εκ τούτου, οι νέες θεραπευτικές προσεγγίσεις πρέπει να εφαρμοστούν για τη διαχείριση μεταστατικό καρκίνο του προστάτη. Η κατάσταση του Σπ TFs στον καρκίνο του προστάτη έχει ελάχιστα ερευνηθεί μέχρι σήμερα. Ωστόσο, βρήκαμε στοιχεία που να υποστηρίζουν ένα ρόλο για απορυθμισμένη δραστηριότητα της Sp ΤΡ σε έναρξη και την εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη. Πολλά γονίδια αναφερθεί ότι εμπλέκεται στην ογκογένεση του προστάτη ρυθμίζονται από Sp παραγόντων (βλέπε Μέθοδοι S1? Πίνακα S1, S2 και παραπομπές εκεί). Ενώσεις που παρεμβάλλονται Sp TFs από διαφορετικούς μηχανισμούς έχουν σχετική δραστηριότητα σε διάφορους καρκίνους, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη [7], [8], [9], [10], [11], [33], [34], [35] , [36], [37], [38]. Οι εκτιμήσεις αυτές, μαζί με βιοπληροφορικής αναλύσεις δημοσιευμένων συνόλων δεδομένων γονιδιακής έκφρασης, μας οδήγησε στο να υποθέσει ότι Sp TFs μπορούσε να είναι συναφείς στόχοι σε όγκους του προστάτη και ότι τα νέα ανάλογα MTM-Α με βελτιωμένες φαρμακολογικές ιδιότητες μπορεί να είναι χρήσιμες για τη θεραπεία αυτής της ασθένειας.

Υλικά και Μέθοδοι

Ενώσεις και κυτταρικές σειρές

ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη PC3, DU145, 22Rv1 και LNCaP κύτταρα διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 [39]. Φυσιολογικών ανθρώπινων ινοβλαστών διατηρήθηκαν σε DMEM [27]. MTM-Α, MTM-SK (ΕΚ-7072) και MTM-SDK (ΕΚ-7073) παρασκευάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [27]. Στοκ διαλύματα των ενώσεων (10 mM) παρασκευάστηκαν σε στείρο αλατούχο διάλυμα ή DMSO και αραιώνεται σε στείρο διάλυμα φυσιολογικού ορού αμέσως πριν από τη χρήση [29]. Για την έκφραση των γονιδίων και χρωματίνη ανοσοκαθίζηση κυττάρων (μάρκας) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 ηΜ του MTM-SDK και MTM-SK ή όχημα για 24 ώρες.

RNA και πρωτεΐνης ανάλυση

Ολικό RNA από καλλιεργημένα κύτταρα και ιστοί όγκου απομονώθηκε και αντίστροφη μεταγραφή όπως περιγράφεται [27], [29]. Ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR (qRT-PCR) εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας ΑΒΙ PRISM 7000HT Σύστημα Ανίχνευσης Αλληλουχίας και SYBRGreen PCR Master Mix (Applied Biosystems) όπως περιγράφεται [29]. Οι εκκινητές PCR φαίνονται στον Πίνακα S3.

GAPDH

και

B2M

χρησιμοποιήθηκαν ως εσωτερικοί έλεγχοι. δεδομένα Έκφραση εκφράστηκαν ως ποσοστό της γονιδιακής έκφρασης ελέγχου όπως περιγράφεται [29]. End σημείο RT-PCR πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως με τη χρήση του One-Step σύστημα SuperScript RT-PCR (Invitrogen) και το γονίδιο-ειδικών εκκινητών [27]. Κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν από τον έλεγχο και τα κύτταρα αγωγής με φάρμακο και πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν σε SDS-πολυακρυλαμιδίου πηκτές. Ανοσοκηλίδωση διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [27], [40].

χρωματίνης ανοσοκαταβύθιση (μάρκας)

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, διασυνδεδεμένη με φορμαλδεΰδη και επεξεργασία μετά από τροποποιημένο πρωτόκολλο κιτ ΕΖ-chip (Upstate Biotechnology), όπως περιγράφεται [41]. Χρωματίνης ανοσοκατακρημνίσθηκε με ένα αντίσωμα για Sp1 και φυσιολογική ποντικίσια IgG ως αρνητικός έλεγχος. DNA-πρωτεΐνης διασυνδέσεις αντιστράφηκαν και το DNA καθαρίστηκε από ολικό κυτταρολύματα (είσοδος) και ανοσοκαταβυθίστηκαν κλάσματα. qPCR διεξήχθη όπως αναφέρεται ανωτέρω. Οι εκκινητές για την ανάλυση πλινθίο του C-MYC και προαγωγός VEGF φαίνεται στον Πίνακα S3. Η ποσότητα του δεσμευμένου DNA υπολογίστηκε σε αναφορά σε μία πρότυπη καμπύλη και εκφράζονται ως ποσοστό του DNA εισόδου [41].

In vitro

αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης

Η βιωσιμότητα των κυττάρων ήταν προσδιορίζεται χρησιμοποιώντας τη χρωματομετρική δοκιμασία ΜΤΤ όπως περιγράφεται [27]. Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων και επωάστηκαν με όχημα ή ενώσεις για 24 και 72 ώρες. Κάθε αγωγή διεξήχθη εις τριπλούν και τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές.

Ζώα και μοντέλα ξενομοσχεύματος

Αθυμικοί αρσενικά γυμνά ποντίκια (Balb c ηυ /ηυ, ηλικίας 6-8 εβδομάδων) αγοράστηκαν από τα Harlan Laboratories. Τα ποντίκια διατηρήθηκαν κάτω από συνθήκες ελεύθερες παθογόνων με την τροφή και το νερό παρέχεται

κατά βούληση

και τη γενική υγεία τους κατάσταση παρακολουθείται καθημερινά. Όλα τα πρωτόκολλα που αφορούν πειραματόζωα διεξήχθησαν σύμφωνα με τις καθιερωμένες κατευθυντήριες γραμμές και σύμφωνα με την εθνική και διεθνή νομοθεσία και τις πολιτικές της. Οι πειραματικές διαδικασίες και πρωτόκολλα μελέτης έχουν ελεγχθεί και εγκριθεί από την Ελβετική καντονίου Κτηνιατρική Αρχή (έγκριση. 05/2011). Για τη δημιουργία υποδόρια ξενομοσχεύματα όγκου, κύτταρα PC3 (2 × 10

6 κύτταρα) εμβολιάστηκαν στο πλευρό των ποντικών. Για το μεταστατικό μοντέλο ξενομοσχεύματος, κύτταρα PC3 (0.6 × 10

6) εγχύθηκαν δύο φορές μέσα στη φλέβα της ουράς με ενδιάμεσο διάστημα 24 h μεταξύ των ενέσεων.

Τοξικότητα

Υγιείς CD-1 ποντίκια που παρέχονται από τη διευκόλυνση των ζώων του Πανεπιστημίου του Οβιέδο υποβλήθηκαν σε θεραπεία με εφάπαξ ή επαναλαμβανόμενες ενέσεις IV της MTM-SK, MTM-SDK και MTM-A. Κάθε ομάδα αποτελείτο από 4 ποντίκια. Για επαναλαμβανόμενες δόσεις, τα φάρμακα χορηγήθηκαν με ενδοφλέβια ενέσεις κάθε δύο ή τρεις ημέρες για ένα σύνολο 10 ενέσεων. Το σωματικό βάρος, οι θάνατοι, αλλαγές στη συμπεριφορά, την κινητικότητα, την κατανάλωση και τις συνήθειες κατανάλωσης οινοπνεύματος, καθώς και κάθε άλλο σημάδι της τοπικής ή συστηματικής τοξικότητας καταγράφονταν καθημερινά.

Φαρμακοκινητική

υγιή ποντίκια CD-1 ενέθηκαν IV με MTM-SK (18 mg /Kg) και MTM-SDK (2 mg /Kg). Το αίμα συλλέχθηκε σε πέντε χρονικά σημεία μεταξύ 5 και 120 λεπτά. Σε κάθε χρονικό σημείο αναλύθηκαν 3 ποντικούς ανά ομάδα. Τα δείγματα πλάσματος αραιώθηκαν με 4 όγκους ακετονιτριλίου, στροβιλίζεται και φυγοκεντρείται για την εξάλειψη κάθε αδιάλυτο ίζημα. Το υπερκείμενο στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε για να μετρηθεί MTM-SDK και MTM-SK με LC-MS. Τα επίπεδα πλάσματος εκτιμήθηκαν μετά από ενδοπεριτοναϊκή (ΙΡ) ένεση και IV του MTM-SK (18 mg /kg), επίσης με HPLC-UV.

ανάλυση

Η γονιδιακή έκφραση σε ξενομοσχεύματα όγκου

Για να αξιολογηθούν τα αποτελέσματα για μεταγραφή σε ιστούς όγκου, ποντικοί που φέρουν υποδόριους όγκους υποβλήθηκαν σε αγωγή με MTM-SDK (1,2 mg /kg) και MTM-SK (8 mg /kg) ή αλατούχο διάλυμα με IV ένεση. Τα ζώα θανατώθηκαν μετά από 1, 3 και 7 ημέρες από την ένεση. Όγκοι αμέσως συλλέχθηκαν και καταψύχθηκαν για απομόνωση RNA. qRT-PCR πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται παραπάνω. Σε κάθε χρονικό σημείο 4 ποντικών αναλύθηκαν σε κάθε πειραματική ομάδα και qRT-PCR πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν για κάθε δείγμα.

Η αντικαρκινική δράση

Ποντικοί που φέρουν υποδόριους όγκους υποβλήθηκαν σε αγωγή με ενώσεις ή όχημα. Κάθε πειραματική ομάδα αποτελείτο από 10 ποντίκια. Τα φάρμακα παρασκευάζονται σε στείρο αλατούχο διάλυμα και δίνεται από ΙΡ ενέσεις κάθε 3 ημέρες. Οι ποντικοί ελέγχου έλαβαν ένεση ΙΡ αποστειρωμένου αλατούχου διαλύματος. Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε με παχύμετρο δύο φορές την εβδομάδα. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο όρο ± SD των 10 ποντικών ανά ομάδα.

αντιμεταστατική δραστικότητα

Για να αξιολογηθεί η ικανότητα των ενώσεων να μπλοκάρουν την ανάπτυξη μεταστατικών όγκων, οι ποντικοί έλαβαν ενέσεις στην φλέβα της ουράς των καρκινικών κυττάρων για τη δημιουργία μετάσταση πνεύμονα. Στη συνέχεια, οι ποντικοί υποβλήθηκαν σε αγωγή με MTM-SDK (1,2 mg /kg), ΜΤΜ-SK (8 mg /kg) ή αποστειρωμένο αλατούχο διάλυμα δίδεται από ΙΡ ενέσεις κάθε 3 ημέρες ξεκινώντας δύο εβδομάδες μετά την ένεση στην ουραία φλέβα των καρκινικών κυττάρων. Δύο ομάδες ποντικών χωρίς θεραπεία (

η = 3 ανά ομάδα

) θυσιάστηκαν μετά από 1 και 2 εβδομάδες μετά την ένεση για να επιβεβαιώσει την εμφύτευση και την ανάπτυξη των μεταστατικών κυττάρων. Έλεγχος και ποντίκια που πήραν φάρμακο (

η = 3 ανά ομάδα

) στη συνέχεια θυσιάστηκαν μετά από 1 και 2 εβδομάδες από την έναρξη της θεραπείας. ιστούς των πνευμόνων συλλέχθηκαν για ανάλυση qPCR και ιστολογική εξέταση μετά την H & amp? χρώση Ε. πνευμονικών μεταστάσεων προσδιορίστηκαν ποσοτικά χρησιμοποιώντας μία προηγουμένως περιγραφείσα μέθοδο qPCR βάση [42]. Γονιδιωματικό ϋΝΑ που εξάγεται από κατεψυγμένους ιστούς των πνευμόνων ενισχύθηκε με σύνολα εκκινητών για τη μοναδική, διατηρημένη και συγκεκριμένα είδη περιοχές του γονιδιώματος ανθρώπου και ποντικού. PCR διεξήχθη με τη χρήση SYBRGreen qPCR Master Mix [42]. Το ποσοστό των ανθρώπινων κυττάρων σε ιστούς των πνευμόνων προσδιορίσθηκε εις τριπλούν ζεύγη αντιδράσεων για κάθε ζώο χρησιμοποιώντας πρότυπη καμπύλη μικτών δειγμάτων ανθρώπου /ποντικού όπως περιγράφεται [42]. Τα δεδομένα είναι μέσες ± SD 3 ποντικών ανά πειραματικό σημείο.

Στατιστική ανάλυση

Όλα τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD. Η IC50 υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας SigmaPlot. Οι διαφορές μεταξύ των πειραματικών ομάδων αναλύθηκαν για στατιστική σημασία χρησιμοποιώντας μη ζευγαρωμένο δύο-tailed t-test χρησιμοποιώντας GraphPad Prism 4.0 Λογισμικό. P values≤0.05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές.

Αποτελέσματα

MTM-SDK και MTM-SK αναστέλλουν την έκφραση του Σπ ρυθμιζόμενα γονίδια στα κύτταρα του καρκίνου του προστάτη

Ανάλυση της τρέχουσας βιβλιογραφίας έδειξαν ότι πολλά γονίδια υπερ-εκφράζονται σε πρωτογενή και μεταστατικό καρκίνο του προστάτη που ρυθμίζονται από Sp TFs και είναι δυνητικοί στόχοι των αναλόγων MTM-Α (βλέπε Methods S1, πίνακα S1, S2 και παραπομπές εκεί). Εφαρμόζοντας βιοπληροφορικής προσεγγίσεις σε διαθέσιμες στο κοινό σύνολα δεδομένων γονιδιακής έκφρασης βρήκαμε ότι τα γονίδια με προβλεπόμενες θέσεις δέσμευσης για Σπ TFs σε υποστηρικτές τους είχαν συχνά απελευθερωθεί σε όγκους του προστάτη, τόσο στα πρώιμα και προχωρημένα στάδια της νόσου, παρά την έλλειψη άμεσων αποδεικτικών στοιχείων της υπερ-έκφραση του TFs Sp σε αυτούς τους όγκους (Εικ. S1). Επιπλέον, διαπιστώσαμε ότι πολλά γονίδια κάτω-ρυθμίζονται από MTM-SDK σε μια ωοθηκική κυτταρική σειρά καρκίνου και υποθετική στόχους του Σπ TFs ήταν υπερεκπροσωπούνται μεταξύ των γονιδίων up-ρυθμίζεται στην πρωτοβάθμια και μεταστατικούς όγκους του προστάτη (Εικ. S1). Ως εκ τούτου, αξιολόγησε τον αντίκτυπο των νέων αναλόγων MTM-Α στη μεταγραφή του Σπ ρυθμιζόμενων γονιδίων σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Εμείς επιλεγμένα γονίδια που είναι γνωστό ότι υπερ-εκφράζεται σε όγκους του προστάτη και εμπλέκονται σε διάφορες πτυχές της ογκογένεσης του προστάτη, όπως τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την απόπτωση και την αγγειογένεση (Πίνακας S1). Κύτταρα προστάτη PC3 καρκίνου του υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 100 ηΜ MTM-SDK, MTM-SK ή όχημα για 24 ώρες και οι επιπτώσεις στην γονιδιακή έκφραση αξιολογήθηκαν από qRT-PCR. Αυτή η δόση επελέγη με βάση προηγούμενες εργασίες μας σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών [27]. Επιπλέον, διαπιστώσαμε ότι 24 ώρες θεραπείας σε δόσεις ≤100 nM ήταν ελάχιστα κυτταροτοξικά (≤30% της μείωσης της βιωσιμότητας των κυττάρων? Εικ. S2). Υπό αυτές τις συνθήκες, η θεραπεία με MTM-SDK μειωμένο επίπεδο του mRNA της

C-MYC

,

hTERT

,

VEGFA

,

C-SRC

,

CCDN1

,

CCNE1

,

ΧΙΑΡ

,

MCL1

και

BIRC5 από

≥75% (Εικ. 1Α). Όπως φαίνεται προηγουμένως στο ωοθηκών καρκινικά κύτταρα [27], MTM-SK ήταν ελαφρά λιγότερο αποτελεσματικό από MTM-SDK. Το επίπεδο του

C-MYC

,

hTERT

,

VEGFA

,

C-SRC

και

CCDN

1 mRNA μειώθηκε στην MTM-SK επεξεργασμένα κύτταρα κατά 50-75% σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου, ενώ η

ΧΙΑΡ

,

CCNE1

,

MCL1

και

BIRC5

ήταν ελάχιστα ή δεν επηρεάζονται.

κύτταρα PC3 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 ηΜ του MTM-SDK, MTM-SK ή φορέα (DMSO) για 24 ώρες. Α) Η γονιδιακή έκφραση μετρήθηκε με qRT-PCR. Δεδομένα κανονικοποιήθηκαν σε

Β2Μ

επίπεδο RNA και παρουσιάζονται ως ποσοστό της έκφρασης σε σύγκριση με κύτταρα υπό αγωγή με όχημα (έλεγχος). Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD από 3 ανεξάρτητα πειράματα. Β) Η σύνδεση του παράγοντα Sp1 στους υποστηρικτές του

C-MYC

και

VEGF

στον έλεγχο και τα κύτταρα που έλαβαν το φάρμακο προσδιορίστηκε από ChIP χρησιμοποιώντας ένα ειδικό αντίσωμα αντι-Sp1. DNA στην είσοδο και ανοσοκατακρημνίσθηκαν κλάσματα προσδιορίστηκε ποσοτικά με qPCR με εκκινητές που περιλαμβάνει την θέση σύνδεσης Sp στις υποκινητές γονιδίων. Τα δεδομένα (μέση τιμή ± SD) από 3 ανεξάρτητα πειράματα που εκφράζεται ως ποσοστό του DNA εισόδου σε immunoprecipated κλάσματα. *, P & lt? 0,01? ** P & lt? 0.001. C) Επίπεδο Sp1, Sp3 και Sp4 mRNA προσδιορίστηκε με RT-PCR σε κύτταρα PC3 επωάσθηκαν με 100 ηΜ του MTM-SDK, MTM-SK ή όχημα για 24 και 48 ώρες. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Δ) επίπεδο πρωτεΐνης Sp1, c-myc, ΧΙΑΡ, και η κυκλίνη D1 προσδιορίσθηκε με ανοσοστύπωση σε κύτταρα PC3 επωάσθηκαν με 100 ηΜ του MTM-SDK, MTM-SK ή όχημα για 24 και 48 ώρες.

Η

MTM-Α και τα ανάλογά της δεσμεύονται με στοιχεία DNA πλούσιο σε GC και αποτρέπουν δέσμευση του GC-συνδετικές πρωτεΐνες όπως οι TFs Sp για υποκινητές γονιδίων. Για να καθοριστεί εάν οι συνέπειες για την μεταγραφή οφείλονταν σε αναστολή της δέσμευσης Sp, μετρήθηκε η πρόσδεση του παράγοντα Sp1 στην

C-MYC

και

VEGFA

προαγωγό σε έλεγχο και των ναρκωτικών αντιμετωπίζεται κύτταρα με χρωματίνη ανοσοκατακρήμνιση . MTM-SDK και MTM-SK μείωσε σημαντικά τη σύνδεση του Sp1 στο

C-MYC

και

VEGFA

υποκινητή (Εικ. 1Β). MTM-SDK ήταν πιο αποτελεσματική από την MTM-SK, σε συμφωνία με τα δεδομένα γονιδιακής έκφρασης. Όπως Sp πρωτεΐνες μπορούν να ελέγχουν τις δικές τους μεταγραφή [3], θα αξιολογηθεί κατά πόσο MTM-SDK και MTM-SK επηρεάζονται έκφρασή τους. Sp1, Sp3 και Sp4 εκφράζονται σε κύτταρα PC3 και θεραπεία με τα ανάλογα MTM-Α μείωσε το επίπεδο του mRNA του SP1, Sp4 και σε μικρότερο βαθμό Sp3 (Εικ. 1 C). Και πάλι, MTM-SDK ήταν πιο αποτελεσματική MTM-SK. επιπέδων της πρωτεΐνης των στόχων Sp1 και Σπ, όπως c-myc, μειώθηκαν επίσης κατά την αγωγή με MTM-SDK- και MTM-SK, σε συμφωνία με τα δεδομένα του mRNA (Εικ. 1D).

MTM-SDK και MTM- SK αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του προστάτη

Αναστολή της Sp ΤΡ έχει αποδειχθεί ότι επηρεάζουν τον πολλαπλασιασμό και την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων. Εξετάσαμε τις αντιπολλαπλασιαστικές επιδράσεις των MTM-SDK και MTM-SK σε ένα πάνελ κυτταρικών γραμμών καρκίνου του προστάτη που αντιπροσωπεύουν εξαρτώμενων από ανδρογόνα (Αϋ) και ανεξάρτητα από ανδρογόνα (ΑΙ) όγκους του προστάτη. LNCaP κύτταρα είναι ανδρογόνων υποδοχέων (AR) θετικές και εξαρτώνται από την σηματοδότηση AR. 22Rv1 είναι AR θετικά αλλά AI. PC3 και DU145 είναι AR αρνητικά και AI. Η ανάπτυξη όλων των κυτταρικών γραμμών που εξετάστηκαν, ανεξάρτητα από κράτος AR τους, ήταν έντονα αναστέλλεται από τις δύο ενώσεις, με MTM-SDK είναι πιο αποτελεσματικό από το MTM-SK (Εικ. 2). Το IC είναι

50 τιμές που αναφέρονται στο σχήμα 2. Επιπλέον, η ανάπτυξη των κυττάρων του καρκίνου του προστάτη ανεστάλη κατά ≥50% σε ≤100 ηΜ των δύο φαρμάκων. Αξίζει να σημειωθεί ότι, τα φάρμακα δεν είχε καμία επίδραση σε αυτές τις δόσεις σε φυσιολογικά ανθρώπινα ινοβλάστες (Σχ. 2). Η βιωσιμότητα των φυσιολογικών ινοβλαστών επηρεάστηκε ελαφρά μόνο σε υψηλότερες δόσεις (~20-30% αναστολής στα 500 nm). Αυτή η διαφορά στην ευαισθησία μεταξύ φυσιολογικών και καρκινικών κυττάρων ήταν σύμφωνη με προηγούμενα δεδομένα μας δείχνουν ότι η κανονική ινοβλάστες ήταν πιο ανθεκτικά από ωοθηκών καρκινικά κύτταρα με την επαγωγή απόπτωσης όταν εκτίθενται σε MTM-SDK [27].

Ο καρκίνος του προστάτη κύτταρα (DU145, 22Rv1, PC3 και LNCaP) και πρωτογενείς καλλιέργειες φυσιολογικών ανθρώπινων ινοβλαστών (NHF) επωάστηκαν με τις ενώσεις επί 72 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με τη δοκιμασία ΜΤΤ χρωματομετρική. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD δειγμάτων εις τριπλούν από 3 ανεξάρτητα πειράματα. IC

50 για κάθε τύπο κυττάρου αναφέρονται στον κάτω πίνακα.

Η

Η τοξικότητα της MTM-SDK και MTM-SK

Η συστηματική τοξικότητα είναι ένας σημαντικός περιορισμός για την κλινική χρήση της MTM-A. Ως εκ τούτου, αξιολόγησε τις δόσεις στις οποίες MTM-SDK και MTM-SK μπορούσε να χορηγηθεί με ασφάλεια σε ποντικούς μετά από οξεία και χρόνια χορήγηση. Οι μέγιστες ανεκτές δόσεις (MTD) του MTM-SDK και MTM-SK μετά από μία μόνο ένεση IV ήταν 4 mg /kg και 32 mg /kg, αντίστοιχα (Πίνακας 1). Η MTD της MTM-SK για επαναλαμβανόμενη θεραπεία ήταν 8 και 18 mg /kg χρησιμοποιώντας το q2d × 10 και Q3d × 10 χρονοδιάγραμμα, αντίστοιχα. Η MTD της MTM-SDK ήταν 1,2 mg /kg και 1,8 mg /kg, αντίστοιχα, όταν δίνονται με την q2d × 10 και Q3d × 10 χρονοδιαγράμματος. Δοκιμάσαμε για σύγκριση MTM-Α και διαπίστωσε ότι οι MTDs ήταν 1 mg /kg και 0,5 mg /kg για την εφάπαξ και επαναλαμβανόμενη (q2d × 10) χορήγηση, αντίστοιχα. Περαιτέρω αύξηση της δόσης τόσο MTM-SK από την MTM-SDK και επαναλαμβανόμενη θεραπεία οδήγησε σε προοδευτική απώλεια του σωματικού βάρους και άλλα συμπτώματα της σοβαρής χρόνιας τοξικότητας, συμπεριλαμβανομένης της μειωμένης κινητικότητας, η επιπεφυκίτιδα και η περιφερική νευροπάθεια. Συμπερασματικά, θα μπορούσε να δοθεί εντυπωσιακά υψηλότερες δόσεις της MTM-SK από την MTM-SDK σε σύγκριση με το MTM-Α με ασφάλεια τόσο ως εφάπαξ και επαναλαμβανόμενες ενέσεις σε ποντίκια χωρίς σημεία τοξικότητας.

Η

Η φαρμακοκινητική της MTM-SDK και MTM-SK

τα επίπεδα στο αίμα της MTM-SK και MTM-SDK μετρήθηκαν μετά από εφάπαξ ενέσεις IV στη δόση των 18 και 2 mg /kg (Εικ. 3). Και οι δύο ενώσεις καθαρίστηκαν γρήγορα από την κυκλοφορία του αίματος με παρόμοια συνολική κινητική. Μετά από 5 επίπεδα λεπτά πλάσματος ήταν περίπου 20 και 0,7 μΜ για MTM-SK και MTM-SDK, αντίστοιχα. Μετά από 1 ώρα τα επίπεδα της MTM-SK και MTM-SDK ήταν περίπου 1 και 0,1 μΜ, αντίστοιχα. Συνεπώς, τα επίπεδα των δύο ενώσεων στο πλάσμα ήταν ίση ή μεγαλύτερη από την συγκέντρωση που απαιτείται

in vitro

για την αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων και την καταστολή των εξαρτώμενων Sp1 μεταγραφής. Στη συνέχεια, σε σύγκριση φαρμακοκινητική της MTM-SK μετά από εφάπαξ IV και ενέσεις IP. Εκτός από την αρχική κορυφή που παρατηρείται με την έγχυση IV, η κινητική εξής IV και ΙΡ χορήγηση ήταν αρκετά παρόμοια, φθάνοντας συγκρίσιμα επίπεδα φαρμάκου στο πλάσμα μέσα σε 15-30 λεπτά και διατηρώντας παρόμοια επίπεδα κατά τη διάρκεια 2 h της ανάλυσης (Σχ. S3 ).

Ποντίκια (n = 3 /ομάδα) έλαβε μόνο ένεση IV του MTM-SK (Α) ή MTM-SDK (Β) και τα επίπεδα στο πλάσμα προσδιορίστηκαν με LC-MS. Δόσεις MTM-SK και MTM-SDK ήταν 18 mg /kg και 2 mg /kg, αντίστοιχα.

Η

MTM-SDK και MTM-SK αναστέλλουν την γονιδιακή έκφραση σε ξενομοσχεύματα όγκου ανθρώπινου προστάτη

για να καθοριστεί εάν τα ανάλογα MTM-Α ήταν σε θέση να επηρεάσει τη δράση του Sp TFs in νίνο κατά την συστημική χορήγηση, τα ποντίκια που φέρουν ξενομοσχεύματα όγκου PC3 υποβλήθηκαν σε αγωγή με απλή ένεση IV του MTM-SDK (1,2 mg /kg), ΜΤΜ -SK (8 mg /kg) ή αλατούχο διάλυμα. Οι όγκοι αποκόπηκαν στις 1, 3 και 7 ημέρες μετά την ένεση και τα επίπεδα RNA επιλεγμένων γονιδίων που ρυθμίζονται Sp μετρήθηκαν με qRT-PCR. Έκφραση του

C-MYC

,

hTERT

,

VEGFA

,

C-SRC

,

CCDN1

,

CCNE1

,

ΧΙΑΡ

,

MCL1

και

BIRC5

μειώθηκε σημαντικά τόσο από MTM-SDK και MTM-SK στις 24 ώρες (Εικ. 4). Ωστόσο, υπήρχε μια διαφορά μεταξύ των δύο ενώσεων στην κινητική της ανάκαμψης από μεταγραφικής αναστολής. Η επίδραση της MTM-SDK διήρκεσε περισσότερο. Τα περισσότερα γονίδια ακόμη κατασταλεί από 30 έως 50% μετά από 3 ημέρες. Ακόμα και μετά από 7 ημέρες

VEGFA

,

C-SRC

και

ΧΙΑΡ

ήταν ακόμα σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται. Η επίδραση της MTM-SK αναστράφηκε ταχύτερα με τα περισσότερα γονίδια που επιστρέφουν στα επίπεδα ελέγχου εντός 3 ή 7 ημέρες. Έτσι, τα δύο φάρμακα ήταν αποτελεσματικά στη μείωση της μεταγραφή των γονιδίων Sp ρυθμιζόμενων όταν χορηγείται συστηματικά σε ποντικούς, επιβεβαιώνοντας την συσσώρευση των ενεργών συγκεντρώσεων του φαρμάκου στον ιστό του όγκου. Επιπλέον, η επίδραση της MTM-SDK ήταν πιο έντονη και επίμονη σε σύγκριση με το MTM-SK, σύμφωνα με το

in vitro

στοιχεία σχετικά με δεσμευτικές Sp1 και γονιδιακής έκφρασης.

Ποντίκια (n = 4 /ομάδα ) με υποδόριους όγκους υπέστησαν αγωγή με μία απλή IV ένεση του MTM-SDK, MTM-SK ή αποστειρωμένο αλατούχο διάλυμα. Δόσεις MTM-SK και MTM-SDK ήταν 8 mg /kg και 1,2 mg /kg, αντίστοιχα. Οι όγκοι συλλέχθηκαν 1, 3 και 7 ημέρες μετά την ένεση του φαρμάκου. Η γονιδιακή έκφραση αξιολογήθηκε με qRT-PCR. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD του επιπέδου μεταγραφής κανονικοποιημένη προς Β2Μ RNA και παρουσιάζονται ως ποσοστό της έκφρασης σε σύγκριση με τα ποντίκια ελέγχου που έλαβαν αποστειρωμένο αλατούχο διάλυμα. *, P & lt? 0,01? ** P & lt?. 0.001

Η

MTM-SDK και MTM-SK αναστέλλουν την ανάπτυξη των καρκινικών ξενομοσχευμάτων προστάτη

Εξετάστηκε η αντινεοπλασματική δραστικότητα του MTM-SDK και MTM-SK χρησιμοποιώντας υποδόρια ξενομοσχεύματα όγκου των καρκινικών κυττάρων PC3 προστάτη. κύτταρα PC3 είναι AI, ιδιαίτερα ογκογόνο και μεταστατικό. Έτσι, αυτά τα κύτταρα αντιπροσωπεύουν ένα καλό μοντέλο της προηγμένης ευνουχισμού ανθεκτικών καρκίνο του προστάτη. Ποντικοί που φέρουν ξενομοσχεύματα όγκου PC3 λαμβάνονται MTM-SDK (0.6, 1.2 και 1.8 mg /kg, Q3d × 10) και MTM-SK (4, 8 και 12 mg /kg,) κάθε 3 ημέρες με ενέσεις ΙΡ. Η χορήγηση ΙΡ επιλέχθηκε όπως είναι κοινώς χρησιμοποιείται για παρατεταμένες θεραπείες με αντικαρκινικές ενώσεις. Επιπλέον, IV και ΙΡ ενέσεις ήταν σχεδόν ισοδύναμες όσον αφορά τα επίπεδα στο πλάσμα και φαρμακοκινητική. Οι δόσεις και το χρονοδιάγραμμα χορήγησης επίσης με βάση τις φαρμακοδυναμικές και MTD δεδομένων που περιγράφονται παραπάνω. τερματίστηκε η θεραπεία ήταν όταν έπρεπε να θυσιαστούν λόγω της υπερβολικής επιβάρυνσης των όγκων ποντικών στις ομάδες ελέγχου. ποντίκια χορηγήθηκε φάρμακο παρακολουθήθηκαν για μια άλλη εβδομάδα μετά το τέλος της θεραπείας. Η θεραπεία με το MTM-SDK και MTM-SK μειωμένη ανάπτυξη του όγκου (Σχ. 5Α-Β). Η διαφορά μεταξύ επεξεργασμένων και μη επεξεργασμένων ποντικών ήταν πολύ στατιστικώς σημαντική σε όλες τις δόσεις που δοκιμάστηκαν. Μετά την διακοπή της θεραπείας, η ανάπτυξη των υποδόριων όγκων αργά επαναλαμβάνεται με ελαφρώς ταχύτερη κινητική στην περίπτωση των χαμηλότερων δόσεων MTM-SK. Αυτό είναι σε συμφωνία με φαρμακοδυναμικές δεδομένων, υποδεικνύοντας μια ταχύτερη ανάκαμψη της γονιδιακής έκφρασης μετά τη θεραπεία MTM-SK. Είναι ενδιαφέρον, ωστόσο, ελάχιστη επανανάπτυξη του όγκου παρατηρήθηκε σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με την υψηλότερη δόση του MTM-SK. Η θεραπεία με MTM-SDK και MTM-SK οδήγησε σε ελαφρά απώλεια σωματικού βάρους, η οποία συσχετίζεται με το επίπεδο δόσης αλλά όχι στατιστικά σημαντική (Σχ. 5C-D). Δεν σημεία οξείας τοξικότητας ή τοπικό ερεθισμό στη θέση της ένεσης παρατηρήθηκαν κατά τη διάρκεια της θεραπείας. Δύο ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με την υψηλότερη δόση του MTM-SDK (1,8 mg /kg) έδειξαν σημάδια τοξικότητας (π.χ., μειωμένη κινητικότητα, περιφερική νευροπάθεια) μετά από πολλαπλές ενέσεις. Αυτοί οι ποντικοί αποσύρθηκαν από τη θεραπεία και δεν συμπεριλήφθηκαν στην αξιολόγηση των αντικαρκινική δράση. Δεδομένου ότι η ίδια δόση χορηγήθηκε με ασφάλεια σε ποντίκια που φέρουν μη-όγκου, η τοξικότητα που παρατηρήθηκε σε αυτή τη δόση θα μπορούσε να οφείλεται στην παρουσία του όγκου ή διαφορές σε ποντίκια στέλεχος ή το φύλο.

Ποντίκια με υποδόριους όγκους υποβλήθηκαν σε θεραπεία με οι υποδεικνυόμενες δόσεις MTM-SDK, MTM-SK ή αποστειρωμένο αλατούχο διάλυμα (έλεγχος) δίνεται από ΙΡ ενέσεις δύο φορές την εβδομάδα για πέντε εβδομάδες (Q3d × 10). Ο όγκος του όγκου (Α) και το σωματικό βάρος (Β) μετρήθηκαν δύο φορές την εβδομάδα. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD του όγκου του όγκου σε κάθε ομάδα. Τα βέλη δείχνουν αρχή και το τέλος της θεραπείας. ** P & lt?. 0.001

Η

MTM-SDK και MTM-SK αναστέλλουν την ανάπτυξη του μεταστατικού καρκίνου του προστάτη

Δεν ήταν ενδιαφέρονται για τον προσδιορισμό εάν η θεραπεία με τα ανάλογα MTM-Α ήταν επίσης αποτελεσματικές σε μία μεταστατική μοντέλο καρκίνου του προστάτη. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήσαμε ένα πειραματικό μοντέλο μετάστασης πνεύμονα να μελετήσει τα αποτελέσματα της θεραπείας στις διαδίδονται ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα σε ανοσοανεπαρκείς ποντικούς. PC3 κύτταρα εγχύθηκαν στην ουραία φλέβα των ποντικών και η ανάπτυξη της μετάστασης πνεύμονα παρακολουθήθηκε με qPCR σε περίοδο 4 εβδομάδων [42]. Μία ομάδα ποντικών χωρίς θεραπεία ελέγχου θανατώθηκε μετά την πρώτη και τη δεύτερη εβδομάδα μετά την ένεση των κυττάρων του όγκου. Προς το παρόν, οι πνεύμονες περιείχαν 0,015 και 0,135% των ανθρώπινων κυττάρων, αντίστοιχα, επιβεβαιώνοντας την εμφύτευση και τον πολλαπλασιασμό των ενιεμένων ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων (Σχ. 6Α). Στη συνέχεια, οι ποντικοί έλαβαν κάθε 3 ημέρες ενέσεις IP του MTM-SDK (1,2 mg /kg), MTM-SK (8 mg /kg) ή φορέα. Ομάδες ελέγχου και ποντίκια υπό θεραπεία με φάρμακο θυσιάστηκαν δύο ημέρες μετά την δεύτερη και την τέταρτη ένεση και τους πνεύμονες τους εξετάστηκαν για την παρουσία της μετάστασης. Αυτή τη στιγμή, οι ποντικοί ελέγχου περιείχε 2,08% και 5,94%, αντίστοιχα, των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων σύμφωνα με την επέκταση του μεταστατικών εστιών στον πνεύμονα (Εικ. 6Α). Αντ ‘αυτού, τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με MTM-SDK είχε 0,14% και 0,09% και εκείνων που έλαβαν MTM-SK είχε 0,43% και 0,42% των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων μετά τη δεύτερη και την τέταρτη ένεση, αντίστοιχα. Έτσι, η αύξηση του διαδίδονται ανθρώπινα μεταστατικών κυττάρων ήταν σχεδόν πλήρως καταστέλλεται από τη θεραπεία. Τα δεδομένα qPCR επιβεβαιώθηκαν με ιστολογική εξέταση των τμημάτων του πνεύμονα που λαμβάνονται στο τέλος του πειράματος (Σχ. 6Β). Πολλαπλές μεταστατικά οζίδια ανιχνεύθηκαν στον πνεύμονα των ποντικών ελέγχου, ενώ δεν υπήρχαν μεταστάσεις ανιχνεύσιμο με μικροσκοπική εξέταση διαδοχικών τομών του πνεύμονες των ζώων που έλαβαν το φάρμακο.

Ποντίκια δόθηκαν PC3 με ένεση IV στη φλέβα της ουράς και, στη συνέχεια, αρχίζοντας 3 εβδομάδες αργότερα έλαβαν ενέσεις IP της MTM-SDK, MTM-SK ή αποστειρωμένο αλατούχο διάλυμα δύο φορές την εβδομάδα για δύο εβδομάδες. Οι δόσεις του MTM-SK και MTM-SDK ήταν 8 mg /kg και 1,2 mg /kg, αντίστοιχα. Α) αξιολόγηση qPCR της μετάστασης του πνεύμονα. Οι ποντικοί ελέγχου θυσιάστηκαν 1 και 2 εβδομάδες πριν τη θεραπεία και στη συνέχεια τον έλεγχο και τα ποντίκια που πήραν φάρμακο θυσιάστηκαν στο τέλος της πρώτης και της δεύτερης εβδομάδας της θεραπείας. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD του ποσοστού των ανθρώπινων κυττάρων σε σχέση με την συνολική κύτταρα ποντικού στον πνεύμονα (n = 3). Τα βέλη δείχνουν το χρόνο των ενέσεων ναρκωτικών. Β) Η μικροσκοπική αξιολόγηση της μετάστασης πνεύμονα. Lung ιστός συλλέχθηκε από τους ποντικούς ελέγχου και αγωγής με φάρμακο στο τέλος του πειράματος και χρωματίστηκαν με Η &? Ε για ιστολογική εξέταση. Αντιπροσωπευτικά τμήματα εμφανίζονται (× 20). ** P & lt?. 0.001

Η

Συζήτηση

Σπ παράγοντες της οικογένειας μεταγραφής ελέγχουν πολλές κυτταρικές διεργασίες απαραίτητες για την ανάπτυξη των ανθρώπινων όγκων [3]. έχουν διαφορετικές στρατηγικές έχουν διερευνηθεί τα τελευταία χρόνια να επηρεάσει τη δράση του Sp TFs συμπεριλαμβανομένων των φυσικών ενώσεων και μικρά παρεμβαλλόμενα RNA. παράγωγα Aureolic οξύ, όπως το MTM-Α, είναι αποτελεσματικοί αναστολείς του Sp TFs [15], [18], [19], [20]. Αυτές οι ενώσεις προσδένονται σε πλούσια σε GC του DNA και εμποδίζουν την αλληλεπίδραση του ΤΡ με πλούσια σε GC αλληλουχίες σε προαγωγούς γονιδίου. Επιπλέον, δεδομένου ότι Sp TFs ελέγχουν τις δικές τους μεταγραφή, MTM-Α μειώνει το επίπεδο των πρωτεϊνών SP, ενισχύοντας έτσι την επίδραση στην μεταγραφική δραστηριότητα [21], [34]. Διάφοροι παράγοντες μπορούν να επηρεάσουν τις φαρμακολογικές και τοξικολογικές ιδιότητες των aureolic αντιβιοτικά: συγγένεια για πλούσιες σε GC αλληλουχίες, σύνδεση /αποσύνδεση κινητική σε DNA, την ικανότητα να ανταγωνίζονται με πρωτεΐνες Sp για την πρόσδεση στο DNA και την κυτταρική πρόσληψη [17], [20], [ ,,,0],27], [43].