Αφηρημένο

Ένας αυξανόμενος αριθμός αναφορών έχουν δείξει ότι οι διαφορετικές microRNAs που εμπλέκονται στην ογκογένεση και την εξέλιξη του όγκου. Πραγματοποιήσαμε αυτή τη μελέτη για την ταυτοποίηση νέων miRNAs που μπορεί να εμπλέκεται στον καρκίνο του πνεύμονα και μελέτη για τις λειτουργίες τους. Ελέγξαμε την έκφραση των 450 miRNAs σε ιστούς όγκων του πνεύμονα και των παρακείμενων μη-καρκινικούς ιστούς. Βρήκαμε ότι miRNA-545 ήταν λιγότερο άφθονη σε καρκινικούς ιστούς πνεύμονα από ό, τι σε παρακείμενες μη-καρκινικούς ιστούς. περαιτέρω μελέτες μας έδειξαν ότι το miR-545 κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων

in vitro

και

in vivo

. Βρήκαμε επίσης ότι το miR-545 προκαλείται διακοπή του κυτταρικού κύκλου στη φάση Ο0 /Ο1 και επαγόμενη κυτταρική απόπτωση στα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα με τη στόχευση κυκλίνης D1 και CDK4 γονίδια. Τα αποτελέσματα της κυκλίνης D1 και CDK4 κάτω ρυθμισμένα με miR-545 ήταν παρόμοια με αυτά που προκαλούνται από siRNAs κυκλίνης D1 και CDK4, και η υπερέκφραση της κυκλίνης D1 και CDK4 μπορεί να καταργήσει το miR-545 που προκαλείται από την αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Συμπερασματικά, miR-545 κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων αναστέλλοντας την έκφραση της κυκλίνης D1 και CDK4. Τα ευρήματά μας παρέχουν νέες γνώσεις σχετικά με το ρόλο του miR-545 στην ανάπτυξη του καρκίνου του πνεύμονα και να αναφέρει την πιθανή εφαρμογή του miR-545 στη θεραπεία του καρκίνου

Παράθεση:. Du Β, Wang Ζ, Ζανγκ Χ, Feng S , Wang G, He J, et al. (2014) microRNA-545 καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων από Στόχευση κυκλίνης D1 και CDK4 σε κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα. PLoS ONE 9 (2): e88022. doi: 10.1371 /journal.pone.0088022

Επιμέλεια: Liang-Hu Qu, η Sun Yat-sen University, η Κίνα

Ελήφθη: 12 του Αυγ 2013? Δεκτές: 2, Γενάρη του 2014? Δημοσιεύθηκε: 5 Φεβρουαρίου, 2014

Copyright: © 2014 Du et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Αρ 30870535 και 90913017), του έργου Συνδυασμός της επαρχίας Γκουανγκντόνγκ και το Υπουργείο Παιδείας (Αρ 2009B090300080 και 2011B090400478), το Εισήγαγε καινοτόμο Ε & amp? D Πρόγραμμα ομάδας της επαρχίας Γκουανγκντόνγκ (Όχι . 201001Y0104789252) και το Πρόγραμμα της Κίνας (Αρ 2012AA022501 863). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν τα εξής ενδιαφέροντα: Shipeng Feng απασχολείται από Guangzhou RiboBioCo, Ltd. Δεν υπάρχουν διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Τα microRNAs (miRNAs) είναι μια κατηγορία των μικρών RNAs μη κωδικοποιητική που είναι περίπου 22 νουκλεοτίδια μήκος [1], [2], και μπορεί να καταστείλει miRNAs μεταγραφικούς γονιδιακή έκφραση μέσω δέσμευσης με τις 3′-αμετάφραστες περιοχές (3’UTRs) του mRNA, η οποία προκαλεί μεταγραφική αναστολή ή mRNA στόχο την υποβάθμιση [3].

κυκλίνης D1 και CDK4 εργαστούν μαζί στο ίδιο συγκρότημα να ρυθμίζουν την G1 του κυτταρικού κύκλου /S μετάβαση. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η κυκλίνη D1 και CDK4 είναι πιο άφθονα σε ιστούς όγκου πνεύμονα από ό, τι σε φυσιολογικούς ιστούς του πνεύμονα [4], [5]. Ένας αυξανόμενος όγκος στοιχείων στηρίζει έναν κεντρικό ρόλο για την κυκλίνη D1 και CDK4 στην προαγωγή του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων. Oliver et al. ανέφεραν κυκλίνης D1 ως «κεντρικό στοιχείο» κακοήθους μετασχηματισμού στον καρκίνο του πνεύμονα [6]. Κατά συνέπεια, φίμωση κυκλίνης D1 με αντιπληροφοριακά ολιγονουκλεοτίδια μπορούν να αναστείλουν τον πολλαπλασιασμό των μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων [7]. Αυτές οι μελέτες δείχνουν ότι η κυκλίνη D1 και CDK4 μπορεί να είναι σημαντικά γονίδια για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του καρκίνου του πνεύμονα. Οι

miRNAs εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων [8], η διαφοροποίηση [9], και την απόπτωση [10], και παρεκκλίνουσα έκφραση miRNA είναι που συνδέονται με το σχηματισμό του όγκου και της εξέλιξης [11] – [14]. Πολλές μελέτες έχουν δείξει ότι miRNAs μπορούν να λειτουργήσουν ως ογκογονίδια ή γονίδια καταστολής όγκων σε καρκίνο του πνεύμονα. Για παράδειγμα, το σύμπλεγμα miR-17-92 υπερεκφράζεται σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα και προάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε ένα καρκινικό κύτταρο πνεύμονα γραμμής [15]. Επιπλέον, αντιπαράλληλα ολιγονουκλεοτίδια συμπληρωματικά προς miR-17-5p και miR-20a, που είναι μέλη του συμπλέγματος miR-17-92, μπορεί να επάγει κυτταρική απόπτωση [16]. Ωστόσο, ας-7 miRNA λειτουργεί ως ογκοκατασταλτικό γονίδιο στον καρκίνο του πνεύμονα και είναι λιγότερο άφθονο σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα από ό, τι στα φυσιολογικά κύτταρα του πνεύμονα [17]. Η υπερέκφραση του ας-7 καταστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων σε πολλαπλές κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα και ξενομοσχεύματα σε ανοσοανεπαρκείς ποντικούς [18]. miR-34a είναι ένα άλλο σημαντικό ογκοκατασταλτικό miRNA. miR-34a υποεκφράζεται σε πρωτογενείς ιστούς όγκων μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) σε σύγκριση με συζευγμένες φυσιολογικούς ιστούς [19]. Επιπλέον miR-34a μπορούν να αναστείλουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων NSCLC [20]. miR-210 υπερεκφράζεται στα όψιμα στάδια του NSCLC και εμπλέκονται στην αλλοίωση της βιωσιμότητας των κυττάρων στο Α549 κυτταρική γραμμή αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα [21]. επίπεδο miR-23 είναι αυξημένη σε ορούς από ασθενείς με NSCLC σε σύγκριση με εκείνα από υγιή άτομα [22]. Αυτές οι αναφορές αποκαλύπτουν ότι οι διάφορες miRNAs εμπλέκονται στη ρύθμιση του καρκίνου του πνεύμονα.

Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να προσδιορίσει νέες miRNAs που σχετίζονται με τον καρκίνο των πνευμόνων και να διαφωτίσει τις λειτουργίες τους. Χρησιμοποιήσαμε ποσοτική πραγματικού χρόνου αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης δοκιμασίες (qRT-PCR) για να μελετήσει το προφίλ miRNA στον καρκίνο του πνεύμονα, και τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι miR-545 ήταν υποεκφράζεται σε ιστούς όγκου πνεύμονα σε σύγκριση με παρακείμενες μη-καρκινικούς ιστούς των πνευμόνων. Βρήκαμε ότι miR-545 καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων με άμεση στόχευση κυκλίνη D1 και CDK4 γονιδίων σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι το miR-545 λειτουργεί ως καταστολέας των όγκων στον καρκίνο του πνεύμονα.

Αποτελέσματα

miR-545 είναι μειωμένη σε Ανθρώπινο Καρκίνο του Πνεύμονα ιστοί

σύγκριση της έκφρασης 450 miRNAs μεταξύ ιστών καρκίνου του πνεύμονα και των παρακείμενων μη καρκινικούς ιστούς πνεύμονα από 15 ασθενείς, και βρήκαμε ότι 31 miRNAs ήταν υποεκφράζονται (Ρ & lt? 0,05, φορές μεταβολής & lt? 0,5) σε ιστούς καρκίνου του πνεύμονα σε σύγκριση με παρακείμενες μη-καρκινικούς ιστούς πνεύμονα (Εικ . S1, Πίνακας S1 και S2).

Για να επιβεβαιώσετε την έκφραση του miR-545, ελέγξαμε miR-545 έκφρασης σε άλλα 10 ασθενείς. Βρήκαμε ότι miR-545 επίπεδα σε ιστούς καρκίνου του πνεύμονα ήταν λιγότερο από το 50% των ατόμων σε παρακείμενες μη-καρκινικούς ιστούς του πνεύμονα σε 14 από τους 25 ασθενείς, ενώ τα επίπεδα miR-545 σε ιστούς καρκίνου του πνεύμονα ήταν περισσότερο από δύο φορές εκείνες στις παρακείμενες μη καρκινικούς ιστούς των πνευμόνων σε 2 από τους 25 ασθενείς (Εικ. 1Α). Η ανάλυση των πολλαπλών σειρών συγκρίσιμων καρκινικούς και παρακείμενους ιστούς μη-καρκινικές πνεύμονα έδειξε ότι miR-545 ήταν λιγότερο άφθονα σε ιστούς καρκίνου του πνεύμονα από ό, τι σε παρακείμενες μη-καρκινικούς ιστούς (Εικ. 1Β). Αυτό υποδηλώνει ότι miR-545 ήταν υποεκφράζεται σε όγκους του πνεύμονα και μπορεί να λειτουργήσει ως καταστολέας όγκου.

(α) Σχετική miR-545 έκφρασης σε 25 ζεύγη καρκινικούς ιστούς καρκίνου του πνεύμονα και των παρακείμενων μη-καρκινικούς ιστούς. (Β) Η έκφραση του miR-545 σε ιστούς καρκίνου του πνεύμονα σε σύγκριση με παρακείμενες μη-καρκινικούς ιστούς. 5S rRNA χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το 2

-ΔΔCt μέθοδο. *, P & lt?. 0.05 (τεστ Wilcoxon)

Η

miR-545 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό κυττάρων in vitro και in vivo

Για την αναγνώριση miRNAs που θα μπορούσαν να εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, χρησιμοποιήσαμε το CCK-8 κιτ για να μελετηθεί η βιωσιμότητα των κυττάρων Α549 επιμολύνονται με κάθε μία από τις 31 miRNAs. Βρήκαμε ότι τα κύτταρα Α549 επιμολύνονται με miR-545 είχε τη χαμηλότερη βιωσιμότητα των κυττάρων (Εικ. 2).

βιωσιμότητα κυττάρου Α549 μετρήθηκε με CCK-8 στις 72 ώρες μετά την επιμόλυνση με κάθε miRNA. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± S.D. από τρία ανεξάρτητα πειράματα. NC, δεν αποτελούν στόχο τον έλεγχο? *, P & lt? 0,05? ** P & lt?. 0.01 (t-test του Student)

Η

Για να επιβεβαιώσετε ότι το miR-545 μπορεί να καταστείλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, εκτελέσαμε τον προσδιορισμό κυτταρικής βιωσιμότητας με τρεις κυτταρικές σειρές. Α549 και Η460 κύτταρα επιμολυσμένα με miR-545 μιμείται έδειξε χαμηλότερη κυτταρική βιωσιμότητα από εκείνα που επιμολύνθηκαν με έναν έλεγχο χωρίς στόχου (σχήμα 3Α και 3Β.)? Ωστόσο, HFL1 ινοβλάστες πνεύμονα επιμολύνθηκαν με έναν αναστολέα miR-545 εμφάνισαν μια πιο αποτελεσματική πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε σύγκριση με εκείνους που μορφομετατρέπονται με έναν αναστολέα ελέγχου (Σχ. 3C).

Η επιμόλυνση με miR-545 μιμείται καταστέλλει τη βιωσιμότητα των (α ) κύτταρα Α549 και (β) Η460 κύτταρα. (Γ) Η επιμόλυνση με έναν αναστολέα miR-545 αυξάνει την βιωσιμότητα των κυττάρων HFL1. (Δ) Tumor εικόνες από το γυμνό μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού. (Ε) Ο όγκος και (στ) βάρη των όγκων σε ένα γυμνό μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως το μέσο ± S.D. από τρία ανεξάρτητα πειράματα. *, P & lt? 0,05? ** P & lt?. 0.01 (t-test του Student)

Η

Χρησιμοποιήσαμε επόμενο ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού όγκου για να δοκιμαστεί η επίδραση του miR-545 για την εξέλιξη του όγκου. Τα Α549 κύτταρα προ-αγωγή με miR-545 μιμείται ή όργανα ελέγχου δεν αποτελούν στόχο και στη συνέχεια με ένεση σε αθυμικά γυμνά ποντίκια. Ο όγκος του όγκου σε ποντίκια που έλαβαν κύτταρα προεπεξεργασμένα με miR-545 μιμείται ήταν σημαντικά (Ρ & lt? 0,05) μικρότερο από ότι σε ποντικούς που έλαβαν κύτταρα κατεργασμένα με έναν έλεγχο χωρίς στόχο. Αυτές οι διαφορές σε όγκο και βάρος παρατηρήθηκαν σε όγκους που συλλέχθηκαν από ποντίκια θυσιάζονται στις ημέρες 48 (Εικ. 3D, 3Ε, και 3F). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι miR-545 μπορεί να αναστείλει σημαντικά την ανάπτυξη καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων σε ένα γυμνό μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού.

miR-545 Προκαλεί κυτταρικού κύκλου σύλληψης στο G0 /G1 φάση

Μία δοκιμασία edu αποκάλυψαν ότι και οι δύο Α549 κύτταρα και Η460 επιμολυσμένα με miR-545 μιμείται ενσωματώνονται λιγότερο edu από εκείνα που επιμολύνθηκαν με έναν έλεγχο χωρίς στόχο (Σχ. 4Α-C). Σε αντίθεση, τα κύτταρα HFL1 επιμολυσμένα με τον αναστολέα miR-545 ενσωματώνεται περισσότερο edu από εκείνα που επιμολύνονται με τον αναστολέα ελέγχου (Εικ. 4D). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι miR-545 μπορεί να αναστέλλουν τη σύνθεση του DNA. Για να διερευνήσουν περαιτέρω το ρυθμιστικό μηχανισμό (ες) του miR-545, πραγματοποιήσαμε μια ανάλυση του κυτταρικού κύκλου. Ένα υψηλότερο ποσοστό των Α549 και Η460 επιμολυσμένα με miR-545 μιμείται ήταν στην φάση G0 /G1 σε σύγκριση με εκείνους που επιμολύνθηκαν με έναν έλεγχο χωρίς στόχο (Σχ. 4Ε και 4F). Αντίθετα, ένα μικρότερο ποσοστό των κυττάρων που HFL1 επιμολυνθεί με ένα miR-545 αναστολέας ήταν στην φάση G0 /G1 σε σύγκριση με εκείνους που μορφομετατρέπονται με έναν αναστολέα αντι-miRNA ελέγχου (Σχ. 4G). Αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι miR-545 συλλήψεις το κυτταρικό κύκλο στη φάση G0 /G1, αναστέλλοντας έτσι τη σύνθεση του DNA και τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Επιπλέον, βρήκαμε ότι miR-545 που επάγεται απόπτωση των κυττάρων και του θανάτου σε Α549 και Η460 κύτταρα (Σχ. 4Η και 4I).

(α) edu ενσωμάτωση σε κύτταρα Α549 που μετράται με συνεστιακή μικροσκόπηση λέιζερ. Η επιμόλυνση με miR-545 αναστέλλει τη σύνθεση του DNA σε (β) Α549 κύτταρα και (γ) κύτταρα Η460. (Δ) Η επιμόλυνση των κυττάρων με τον αναστολέα HFL1 miR-545 αυξάνει τη σύνθεση του DNA. Η επιμόλυνση με miR-545 αυξάνει το ποσοστό των κυττάρων στη φάση G0 /G1 σε (ε) τα κύτταρα Α549 και (στ) Η460 κύτταρα (ζ) Η επιμόλυνση των κυττάρων HFL1 με miR-545 μειώνει το ποσοστό των κυττάρων στη φάση Ο0 /Ο1 . miR-545 επάγει απόπτωση σε κύτταρα (h) Α549 και (θ) Η460. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση ± S.D. από τρία ανεξάρτητα πειράματα. NC, δεν αποτελούν στόχο τον έλεγχο miRNA? *, P & lt? 0,05? ** P & lt?. 0.01 (t-test του Student)

Η

miR-545 στοχεύει άμεσα κυκλίνης D1 και CDK4

Έχουμε χρησιμοποιήσει το λογισμικό Targetscan να προβλέψει τις πιθανές στόχους του miR-545 . Μεταξύ εκατοντάδες προβλέψει στόχους, επιλέξαμε CASP8AP2, DDX58, κυκλίνη D1, MAF, CDK4, και PRKCE ως πιθανούς στόχους του, επειδή μπορεί να εμπλέκεται στον κυτταρικό κύκλο ή απόπτωση. Εμείς κλωνοποιημένο τις 3’UTRs αυτών των γονιδίων στο πλασμίδιο pmirGlo και εξέτασε εάν miR-545 μπορεί να καταστείλει την έκφραση αυτών των γονιδίων με τη δοκιμασία λουσιφεράσης. Η δοκιμασία λουσιφεράσης έδειξε ότι miR-545 μιμείται ανέστειλε την δραστικότητα δύο κατασκευάσματα ανταποκριτή που περιείχε το 3’UTR είτε κυκλίνης D1 ή CDK4 (Εικ. 5Α). Επιπλέον, για να ελέγξετε αν κυκλίνης D1 και CDK4 είναι άμεσοι στόχοι του miR-545, θα μεταλλαχθεί την προβλεπόμενη θέση δέσμευσης του miR-545 στην 3’UTRs και των δύο γονιδίων. Βρήκαμε ότι miR-545 δεν ανέστειλε την δραστικότητα του ανταποκριτού κατασκευασμάτων που περιείχαν τα μεταλλαγμένα 3’UTRs (Εικ. 5Β).

(α) miR-545 ανέστειλε την δραστικότητα λουσιφεράσης που περιέχει την 3’UTR της η D1 κυκλίνης ή γονίδιο CDK4. πλασμίδια που περιέχουν pmirGlo άγριου τύπου (WT) 3’UTRs της CASP8AP2, DDX58, κυκλίνη D1, MAF, CDK4, ή γονίδιο PRKCE συν-επιμολύνθηκαν σε Α549 κύτταρα με τα miRNA ελέγχου ή miR-545. Η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Η ομαλοποιημένη σχέση της δραστηριότητας της λουσιφεράσης υπολογίστηκε ως (Rluc

miR-545 /Luc

miR-545) /(Rluc

NC /Luc

NC). (Β) miR-545 δεν ανέστειλε την δραστικότητα λουσιφεράσης κατασκευάσματα που περιέχουν το μεταλλαγμένο (Mut) 3’UTR της D1 κυκλίνης ή γονίδιο CDK4. (Γ) Η αφθονία της κυκλίνης D1 πρωτεϊνών και CDK4 αναλύθηκαν σε Α549, κύτταρα Η460, και HFL1 με κηλίδωση Western μετά την επιμόλυνση θεραπείες. (Δ) επίπεδα κυκλίνης D1 και πρωτεΐνες CDK4 ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± S.D. από τρία ανεξάρτητα πειράματα. *, P & lt? 0,05? ** P & lt? 0,01? ***, Ρ & lt? 0.001 (δοκιμασία t Student)

Η

Επίσης εξετάσαμε την έκφραση του ενδογενούς D1 κυκλίνης και γονίδια CDK4 τόσο στο mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης.. Βρήκαμε ότι miR-545 μείωσε το επίπεδο των CDK4 mRNA σε κύτταρα Α549, αλλά δεν επηρέασε το επίπεδο της κυκλίνης D1 mRNA (σχ. S2). Ωστόσο, παρατηρήθηκε ότι Α549 και Η460 κύτταρα επιμολυσμένα με miR-545 είχαν χαμηλότερα επίπεδα και των δύο πρωτεϊνών D1 και CDK4 κυκλίνης από εκείνα που επιμολύνθηκαν με έναν έλεγχο χωρίς στόχο (Σχ. 5C και 5D). Περαιτέρω, τα κύτταρα HFL1 επιμολυσμένα με αναστολέα miR-545 είχαν υψηλότερα επίπεδα και των δύο πρωτεϊνών D1 και CDK4 κυκλίνης από εκείνα επιμολυσμένα με αναστολείς NC (Σχ. 5C και 5D).

miR-545 Καταστέλλει Tumor Πολλαπλασιασμός με στόχευση Κυκλίνη D1 και CDK4

για να εξεταστεί αν miR-545 αναστέλλει την κυτταρική βιωσιμότητα με τη στόχευση κυκλίνη D1 και CDK4, χρησιμοποιήσαμε siRNAs να αναστέλλουν την έκφραση της κυκλίνης D1 και CDK4 γονίδια? Τα αποτελέσματα ήταν παρόμοια με εκείνα που περιγράφονται παραπάνω για miR-545. Για παράδειγμα, η χρήση των siRNAs να σιγήσει είτε D1 κυκλίνης CDK4 ή μείωσε την βιωσιμότητα των κυττάρων Α549 (Εικ. 6Α). Το siRNA μεσολάβηση καταστολή της κυκλίνης D1 και CDK4 γονιδίων που προκαλείται διακοπή του κυτταρικού κύκλου κατά την G0 /G1 φάση (Εικ. 6Β), ανέστειλε edu ενσωμάτωση (Εικ. 6C και 6D) και επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα Α549 (Σχ. 6Ε). Επιπλέον, η υπερέκφραση της κυκλίνης D1 και /ή γονίδια CDK4 μπορούσε να καταργήσει σημαντικά miR-545 που προκαλείται από την αναστολή της Α549 κυτταρικής ανάπτυξης (Εικ. 6F). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα αποκαλύπτουν ότι οι κυκλίνη D1 και CDK4 γονίδια είναι άμεσοι στόχοι του miR-545.

(α) miR-545 μιμείται και siRNAs βιωσιμότητα των κυττάρων αναστέλλεται Α549 στις 72 ώρες μετά την επιμόλυνση. (Β) Το κυτταρικό κύκλο συλλαμβάνεται σε G0 /G1 φάση μετά την επιμόλυνση των Α549 κυττάρων με miR-545 και siRNAs κυκλίνη D1 και στόχευση CDK4. miR-545 και siRNA επαγόμενη αναστολή της σύνθεσης του DNA όπως προσδιορίζεται με τη δοκιμασία ενσωμάτωσης edu χρησιμοποιώντας (γ) συνεστιακή μικροσκοπία laser και (δ) κυτταρομετρία ροής. (Ε) υποέκφραση της κυκλίνης D1 και CDK4 επάγει κυτταρική απόπτωση σε κύτταρα Α549. (Στ) Η υπερέκφραση της κυκλίνης D1 και CDK4 καταργεί την αναστολή που προκαλείται από miR-545. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± S.D. από τρία ανεξάρτητα πειράματα. *, P & lt? 0,05? ** P & lt? 0,01? *** P & lt? 0.001. t δοκιμή Student χρησιμοποιήθηκε για την (α) – (ε)? μονόδρομη ANOVA χρησιμοποιήθηκε για την (f).

Η

Συζήτηση

Η μελέτη μας δείχνει ότι miR-545 υποεκφράζεται σε καρκινικούς όγκους του πνεύμονα, και miR-545 έχει αναφερθεί ότι είναι υποεκφράζεται σε γαστρικό καρκίνωμα [23]. Επιπλέον, miR-545 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του πνεύμονα και

in vitro

και

in vivo

. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν miR-545 μπορεί να λειτουργήσει ως καταστολέας των όγκων στον καρκίνο του πνεύμονα.

Περαιτέρω έρευνα αποκαλύπτει ότι η κυκλίνη D1 και CDK4 γονίδια είναι άμεσοι στόχοι του miR-545. miR-545 αναστέλλει κυκλίνη D1 και την έκφραση του γονιδίου CDK4 αναγνωρίζοντας αλληλουχιών σε 3’UTRs τους. Επιπλέον, η υπερέκφραση της κυκλίνης D1 και CDK4 μπορεί να καταργήσει την αναστολή του πολλαπλασιασμού που προκαλείται από miR-545 μιμείται. Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι το miR-545 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων με απευθείας στόχευση κυκλίνης D1 και CDK4. Προηγούμενες μελέτες αναφέρουν ότι η έκφραση της κυκλίνης D1 και CDK4 σε ανθρώπινους ιστούς καρκίνου του πνεύμονα είναι σημαντικά υψηλότερη από ότι σε φυσιολογικούς ιστούς των πνευμόνων [7], [8]. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η υπερέκφραση της κυκλίνης D1 και CDK4 σε ιστούς καρκίνου του πνεύμονα μπορεί να προκύψει εν μέρει από την υποέκφραση του miR-545.

Εν κατακλείδι, τα miRNA profiling αποτελέσματα δείχνουν ότι miR-545 είναι μικρότερη αφθονία στον καρκίνο του ανθρώπινου πνεύμονα ιστούς από ότι σε γειτονικό μη καρκινικούς ιστούς των πνευμόνων. miR-545 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα με καταστολή της έκφρασης της κυκλίνης D1 και CDK4 γονίδια. Μια αυξημένη κατανόηση του miR-545 απορρύθμισης σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα συμβάλλει στην κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που ευθύνονται για τον καρκίνο του πνεύμονα. Επιπλέον, miR-545 θα μπορούσε να είναι ένας πιθανός στόχος για τον καρκίνο του πνεύμονα θεραπευτική αγωγή.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Έχουμε λάβει γραπτή συγκατάθεση από όλους τους ασθενείς, και όλα πρωτόκολλα εγκρίθηκαν από το Διοικητικό συμβούλιο Institutional Review του πρώτου Ενταγμένο Νοσοκομείο Guangzhou Medical College. Όλα τα ανθρώπινα υλικά που χρησιμοποιήθηκαν σύμφωνα με τις πολιτικές του Διοικητικού κριτική Θεσμική. Η πρόταση μελέτη σε ζώα εγκρίθηκε από την Επιτροπή Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και Χρήση Guangzhou Ινστιτούτο Βιοϊατρικής και Υγείας (IACUC 2012010). Όλες οι πειραματικές διαδικασίες που αφορούν τα ζώα εκτελέστηκαν σύμφωνα με τον Οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου και πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις θεσμικές ηθικές κατευθυντήριες γραμμές για τα πειράματα σε ζώα.

τηλέφωνα Γραμμές

Το ανθρώπινο πνεύμονα καρκινικές κυτταρικές γραμμές Α549 (ATCC) και ΝΟΙ-Η460 (Η460, ATCC) ελήφθησαν από Lab Dr. Duanqing Pei κατά τη Guangzhou Ινστιτούτα Βιοϊατρική και Υγεία και καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 (1640, GIBCO, ΝΥ, USA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS, Hyclone, UT, USA). Η κανονική πνεύμονα κυτταρική σειρά ινοβλαστών HFL1 αγοράστηκε από την Κινεζική Ακαδημία Επιστημών κυττάρων Τράπεζας Type Culture Collection (CBTCCCAS, Σαγκάη, Κίνα) και καλλιεργήθηκε σε μέσο F-12K (Jinuo, Hangzhou, Κίνα) συμπληρωμένο με 10% FBS. Όλα τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2 στους 37 ° C.

Δείγματα ιστού που ελήφθη από καρκίνο του πνεύμονα Ασθενείς

Τόσο καρκινικών και παρακείμενων δειγμάτων μη καρκινικά πνευμονικό ιστό ελήφθησαν από την Guangzhou Ινστιτούτο αναπνευστικών νοσημάτων, η οποία συνδέεται με την Πρώτη Ενταγμένο Νοσοκομείο Guangzhou Ιατρικό Πανεπιστήμιο (Guangzhou, Κίνα). Αφαιρεθεί χειρουργικά δείγματα αποθηκεύτηκαν σε υγρό άζωτο μέχρι τη χρήση. Τα σχετικά χαρακτηριστικά των υπό μελέτη θεμάτων που φαίνονται στον Πίνακα S3.

Η επιμόλυνση

Όλα τα siRNA, μιμείται miRNA, και αναστολείς miRNA αγοράστηκαν από Guangzhou RiboBio (RiboBio, Guangzhou, Κίνα) και μεταφέρθηκε σε κύτταρα χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Life Technologies, CA, USA), όπως συνιστάται από τον κατασκευαστή. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με μιμείται και αναστολείς miRNA σε συγκέντρωση 50 ηΜ. Οι αλληλουχίες των siRNAs έχουν ως εξής: SI-κυκλίνης D1 νόημα, 5′-UGG AAU AGC UUC UGG AAU UdTdT-3 ‘, αντινόημα, 3′-dTdAA CCU υΑυ CGA AGA CCU UAA-5′? si-CDK4 νόημα, 5’-CAG CCG ΑΑΑ CGA UCA ΑΓΓ AdTdT-3 ‘, αντίθετης φοράς, 3′-dTdTG Πανεπιστημίου Στερεάς Ελλάδας ΕΕΜ UUG CUA Ουυ CCU-5’.

κυτταρικού πολλαπλασιασμού Δοκιμασία

ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας Καταμέτρηση κυττάρων Kit 8 αντιδραστήριο (CCK-8, Dojindo, Kyushu, Ιαπωνία) ή αντιδραστήριο CellTiter-Glo (Promega, WI, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή

.

edu Δοκιμασία Κυτταρικού πολλαπλασιασμού

η ενσωμάτωση του αναλόγου θυμιδίνης 5-αιθυνυλ-2′-δεοξυουριδίνης (edu) στο DNA κατά την αντιγραφή του DNA μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη μέτρηση των κυττάρων που υποβάλλονται σε αντιγραφή του DNA. Το ποσοστό των κυττάρων που ενσωματώνουν Edu αξιολογήθηκε με τη χρήση της απεικόνισης κυττάρων-Light edu ανίχνευση κιτ σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (RiboBio, Guangzhou, Κίνα).

Κυτταρικού Κύκλου Δοκιμασία

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 72 ώρες μετά επιμόλυνση και σταθερή για όλη τη νύχτα σε 70% παγωμένης αιθανόλης. Μετά τη σταθεροποίηση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 500 ng /μl RNase Α για 30 λεπτά και στη συνέχεια βάφτηκαν με 50 ng /μΙ ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ) για 20 λεπτά. Τα κύτταρα ποσοτικά χρησιμοποιώντας φθορισμό ενεργοποιημένων κυττάρων (FACS, BD, NJ, USA), και τα δεδομένα αναλύθηκαν με λογισμικό FlowJo (Tree Star, OR, USA).

Δοκιμασία κυτταρικής απόπτωσης

ανάλυση κυτταρικής απόπτωσης διεξήχθη με το ΡΕ Annexin V Detection Kit apoptosis Ι (BD, NJ, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή, και τα κύτταρα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας FACS (BD, NJ, USA).

RNA Εκχύλιση και qRT-PCR

Ολικό RNA εξήχθη από τις κυτταρικές γραμμές και δείγματα ιστών χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen, Life Technologies, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Σύνθεση του cDNA χρησιμοποιώντας M-MLV ανάστροφης μεταγραφάσης (Promega, WI, USA) διεξήχθη όπως προτείνεται από τον κατασκευαστή, και τυχαίων εκκινητών (Takara, Shiga, Japan) χρησιμοποιήθηκαν για mRNA. Οι δοκιμασίες qRT-PCR διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το κιτ SYBR Green RealMasterMix (Tiangen, Beijing, Κίνα) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Αντίστροφη μεταγραφή και qRT-PCR για miRNA πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση των Αρδεννών-Loop miRNA qRT-PCR Primer Set (RiboBio, Guangzhou, Κίνα). Η ανάλυση των δεδομένων πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το 2

-ΔΔCt μέθοδο [24]. Οι ακόλουθοι εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση: κυκλίνη D1 προς τα εμπρός εκκινητή, 5′-CAA ATG GAG CTG CTC CTG GTG-3 ‘, αντίστροφος εκκινητής, 5′-CTT CGA TCT GCT CCT GGC AGG-3′? CDK4 πρόσθιο εκκινητή, 5’-TGC CAA TTG CAT CGT TCA CCG AG-3 ‘, αντίστροφος εκκινητής, 5′-TGC CCA ACT GGT CGG CTT CA-3′? ακτίνης προς τα εμπρός εκκινητή, 5’-CTC CAT ΚΔ GGC CTC GCT GT-3 ‘, αντίστροφος εκκινητής, 5′-GCT GTC ACC TTC ACC GTT CC-3′? και 5S rRNA πρόσθιο εκκινητή, 5’-ACG GCC ΑΤΑ CCA CCC TGA AC-3 ‘, αντίστροφος εκκινητής, 5′-GGC GGT CTC CCA TCC AAG TA-3’.

Κατασκευή πλασμιδίου

τα 3’UTRs κυκλίνης D1 και CDK4 γονίδια κλωνοποιήθηκαν στο πλασμίδιο pmirGlo (Promega, WI, USA) μεταξύ του

Xho

Ι και

Xba

θέσεις Ι χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους εκκινητές: κυκλίνη D1 άγριου τύπου 3’UTR πρόσθιο εκκινητή, 5′-ΑΤΑ TCT CGA GCA GGT GCT CCC CTG ACA GTC ΚΔ-3 ‘, ανάστροφο εκκινητή, 5′-ΤΑΑ TCT AGA TGG ΑΑΑ CAT GCC GGT TAC ATG TTG GT-3′? CDK4 άγριου τύπου 3’UTR πρόσθιο εκκινητή, 5’-ΑΤΑ TCT CGA GGC ΑΑΤ GGA ΟΤΟ GCT GCC ATG GAA-3 ‘, αντίστροφος εκκινητής, 5′-ΤΑΑ TCT AGA TTG ACA CAG ΑΟΤ CTT GCT CTG TTG CCC A-3’ .

Τα πλασμίδια που περιέχουν μεταλλαγμένα pmirGlo D1 κυκλίνης CDK4 ή 3’UTR κατασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας το ΚΩΔ-plus μεταλλαξογένεσης κιτ (Toyobo, Osaka, Japan) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

το ανοικτό αναγνωστικό έκφραση πλαίσιο φορείς pReceiver_M02_cyclin D1, pReceiver_M02_CDK4, και οι pReceiver_M02 φορέα ελέγχου αγοράστηκαν από την FulenGen Corporation (GeneCopoeia, MD, USA). Όλα εισαχθεί ή μεταλλαγμένες αλληλουχίες επιβεβαιώθηκαν με ανάλυση αλληλουχίας.

Dual-λουσιφεράσης Δοκιμασία

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων σε 1 ημέρα πριν από την επιμόλυνση. Οι μιμείται miRNA (50 ηΜ) και πλασμίδιο (5 ng /μL) συν-επιμολύνθηκαν σε κύτταρα Α549. Στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, μετρήθηκε δραστικότητα λουσιφεράσης χρησιμοποιώντας το Dual-Glo κιτ δοκιμασίας λουσιφεράσης (Promega, WI, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Western Blotting

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε SDS ρυθμιστικό (Beyotime, Σαγκάη, Κίνα) για την προετοιμασία της συνολικής πρωτεΐνης εκχυλισμάτων. Εν συντομία, ολικό εκχύλισμα πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση θειικού δωδεκυλ-πολυακρυλαμιδίου 12% γέλη και μεταφέρθηκαν πάνω σε μια μεμβράνη φθοριούχου πολυβινυλιδενίου μεταφορά Immobilon-Ρ (Millipore, ΜΑ, USA). Η μεμβράνη επωάστηκε σε θερμοκρασία δωματίου σε 5% αλβουμίνη βόειου ορού (BSA) που παρασκευάζεται με ρυθμιστικό ΤΒδ-Τ επί 2 ώρες. Η μεμβράνη επωάστηκε με πρωτογενές αντίσωμα αραιωμένο 1:1,000 με 1% BSA σε 4 ° C όλη τη νύκτα. Την επόμενη ημέρα, η μεμβράνη επωάστηκε με δευτερογενή υπεροξειδάση (HRP), συζευγμένης αντίσωμα αραιωμένο 1:5,000 με 1% BSA σε 4 ° C για 6 ώρες. Η μεμβράνη οπτικοποιήθηκε μετά από επώαση με υπόστρωμα HRP (BeyoECL συν A /B, Beyotime, Σαγκάη, Κίνα). Τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη ήταν αντι-κυκλίνης D1 (sc-8396, Santa Cruz, CA, USA), αντι-CDK4 (sc-260, Santa Cruz, CA, USA), αντι-β-ακτίνης (A2066, Sigma, MO, USA), συζευγμένο με HRP IgG αντι-ποντικού (SC-2005, Santa Cruz, CA, USA), και συζευγμένο με HRP IgG αντι-κουνελιού (SC-2004, Santa Cruz, CA, USA).

Tumor Ξενομοσχεύματα

στις 6 ώρες μετά την επιμόλυνση του miR-545 μιμείται ή να ελέγχουν miRNA, κύτταρα Α549 συλλέχθηκαν και αιωρήθηκαν σε ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο σε μια συγκέντρωση 1 × 10

6 κύτταρα /mL και εγχέεται εκατέρωθεν του πλευρού οπίσθιο τμήμα του ίδιου BALB /c αθυμικά γυμνά ποντίκια (ηλικίας 5-6 εβδομάδων) με 100 μι κυτταρικού εναιωρήματος. Η ανάπτυξη του όγκου μετρήθηκε κάθε 4 ημέρες. Ο όγκος του όγκου (V) παρακολουθήθηκε με μέτρηση του μήκους (L) και το πλάτος (W) του όγκου με καλίμπρες και υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον τύπο V = (L χ W

2) /2 [25].

Στατιστική Ανάλυση

Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση (SD). P & lt? 0,05 θεωρήθηκε σημαντική. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση SPSS 16.0 λογισμικού (Chicago, IL). t δοκιμή Student χρησιμοποιήθηκε για να αναλύσει τη σημασία μεταξύ των δύο ομάδων. Ανάλυση Διασποράς με έναν παράγοντα (ANOVA) χρησιμοποιήθηκε για να δοκιμαστεί η σημασία μεταξύ περισσότερων από δύο ομάδες. Η ανάλυση της έκφρασης miRNAs σε κλινικό δείγμα διεξήχθη χρησιμοποιώντας Wilcoxon τεστ.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Σχήμα S1. έκφραση

miRNA σε ιστούς καρκίνου του πνεύμονα και των παρακείμενων μη-καρκινικούς ιστούς. Οι εκφράσεις των miRNAs μετριέται με qRT-PCR. 5S rRNA χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Ο θερμικός χάρτης αντιπροσωπεύει την υπερέκφραση (κόκκινο) και υποέκφραση (πράσινο) των miRNAs. Λείπει δεδομένων αντιπροσωπεύεται με γκρι χρώμα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0088022.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

Κυκλίνη D1 CDK4 και mRNAs μετρήθηκαν με qRT-PCR. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± S.D. *, P & lt? 0,05? ** P & lt? 0,01? *** P & lt? 0.001 (δοκιμασία t του Student)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0088022.s002

(ΔΕΘ)

Πίνακα S1. .

Η έκφραση των miRNAs σε ιστούς του καρκίνου του πνεύμονα και μη-καρκινικούς ιστούς των πνευμόνων

doi: 10.1371 /journal.pone.0088022.s003

(DOC)

Πίνακας S2.

Σχετική έκφραση των 450 miRNAs

doi:. 10.1371 /journal.pone.0088022.s004

(XLS)

Πίνακα S3.

Τα χαρακτηριστικά των ασθενών με κλινική καρκίνο του πνεύμονα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0088022.s005

(DOC)

Ευχαριστίες

Είμαστε ευγνώμονες στον Δρ Πέι Duaquing για το δώρο των κυτταρικών σειρών Α549 και Η460.