Αφηρημένο

Matrix μεταλλοπρωτεϊνάσες (MMPs) διεγείρουν την εισβολή και μετάσταση όγκου, υποβαθμίζοντας την εξωκυττάρια μήτρα. Εδώ αποκαλύπτουν μια απροσδόκητη ρόλο για Mmp10 (στρομελυσίνη 2) στην συντήρηση και ογκογονικότητα του καρκίνου του πνεύμονα ποντικού βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με (CSC). Mmp10 εκφράζεται υψηλά σε ογκοσφαίρας καλλιέργειες εμπλουτισμένα σε ΚΕΠ και μεσολάβηση RNAi knockdown του

Mmp10

οδηγεί σε απώλεια της έκφρασης γονιδίου δείκτη βλαστικών κυττάρων και την αναστολή της ογκοσφαίρας ανάπτυξης, κλωνική επέκταση, και μετασχηματίστηκε ανάπτυξη

in vitro

. Είναι ενδιαφέρον, κλωνική επέκταση του

Mmp10

ανεπάρκεια ογκόσφαιρες μπορεί να αποκατασταθεί με προσθήκη εξωγενούς πρωτεΐνης Mmp10 στο μέσο καλλιέργειας, επιδεικνύοντας έναν άμεσο ρόλο για Mmp10 στον πολλαπλασιασμό αυτών των κυττάρων. Ογκόσφαιρες εμφανίζουν αυξημένη ογκογενή και μεταστατική δραστηριότητα όταν εγχέεται ορθοτοπικώς σε συγγενικά ποντίκια, ενώ Mmp10 ανεπάρκεια πολιτισμούς δείχνουν μια σοβαρή ατέλεια στην έναρξη του όγκου. Αντίθετα, ογκόσφαιρες εμφυτεύονται σε συγγενή μη διαγονιδιακά ή

Mmp10

– /- ποντίκια δεν δείχνουν σημαντική διαφορά στον όγκο έναρξης, ανάπτυξης ή μετάστασης, καταδεικνύοντας τη σημασία της

Mmp10

που παράγεται από τον καρκίνο κύτταρα και όχι το μικροπεριβάλλον του όγκου σε έναρξη και διατήρηση όγκου πνεύμονα. Η ανάλυση των δεδομένων γονιδιακής έκφρασης από ανθρώπινους καρκίνους αποκαλύπτει μια ισχυρή θετική συσχέτιση μεταξύ του όγκου έκφραση Mmp10 και μεταστατική συμπεριφορά σε πολλούς ανθρώπινους τύπους όγκων. Έτσι,

Mmp10

απαιτείται για τη διατήρηση της υψηλής ογκογόνων, καρκίνος-κίνησης, μεταστατικό στέλεχος που μοιάζει με πληθυσμό κυττάρων στον καρκίνο του πνεύμονα. Τα δεδομένα μας αποδεικνύουν για πρώτη φορά ότι

Mmp10

είναι ένα κρίσιμο καρκίνο του πνεύμονα γονίδιο βλαστικών κυττάρων και νέων θεραπευτικών στόχων για καρκίνο του πνεύμονα βλαστοκύτταρα

Παράθεση:. Justilien V, regala RP, Tseng IC, Walsh MP, Batra J, Radisky ES, et al. (2012) μεταλλοπρωτεϊνάσης-10 είναι απαραίτητη για τον καρκίνο του πνεύμονα Stem Συντήρηση κυττάρων, Tumor Έναρξη και μεταστατικό δυναμικό. PLoS ONE 7 (4): e35040. doi: 10.1371 /journal.pone.0035040

Συντάκτης: Dean G. Τανγκ, το Πανεπιστήμιο του Τέξας ΜΌ Anderson Κέντρο Καρκίνου, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 31η Ιανουαρίου του 2012? Αποδεκτές: 8, Μαρ 2012? Δημοσιεύθηκε: 24 Απρίλη 2012

Copyright: © 2012 Justilien et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας /Εθνικό Ίδρυμα Καρκίνου (R01 CA081436-13 και R21 CA151250-01), το V Ίδρυμα για την Έρευνα του Καρκίνου, και ο James και η Εσθήρ βασιλιάς Βιοϊατρικής Πρόγραμμα Έρευνας (1 KG-05-33971) να APF ? η Ruth A. Kirschstein Institute National Cancer μεταδιδακτορικής έρευνας (CA115160) να RPR? και ένα Εθνικό Ινστιτούτο Έρευνας Υγείας συμπλήρωμα για την Προώθηση της Διαφορετικότητας στην υγεία που σχετίζονται με Βραβείο Έρευνας από το National Cancer Institute (VJ). APF είναι η Monica Flynn Jacoby Καθηγητής Έρευνας για τον Καρκίνο, ένα κεφάλαιο χρηματοδότησης που παρέχει μερική υποστήριξη για το πρόγραμμα έρευνας του ερευνητή. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα (NSCLC) είναι η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στις Ηνωμένες Πολιτείες [1]. Έκβαση για ασθενείς με NSCLC παραμένει φτωχή, υπογραμμίζοντας την ανάγκη να προσδιοριστούν πιο αποτελεσματικό μέσο για την πρόληψη, τη διάγνωση και τη θεραπεία. Οι όγκοι περιέχουν υποπληθυσμών κυττάρων που εμφανίζουν χαρακτηριστικά στέλεχος που μοιάζει που οδηγούν παθογένεια [2], [3], [4]. Αυτά τα καρκινικά-έναρξη ή καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) εμφανίζουν αυτο-ανανέωση, δραστικότητα ογκογενή, κλωνική επέκταση ως «ογκόσφαιρες», την ικανότητα να υποστηρίξουν τη συντήρηση και τη μετάσταση των όγκων, και να διαφοροποιούνται σε παροδικά ενισχύει κύτταρα που περιλαμβάνουν το μεγαλύτερο μέρος του όγκου [2], [4], [5], [6]. ΚΕΠ μοιράζονται μοριακά χαρακτηριστικά με τα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων έκφραση της αφυδρογονάσης αλδεΰδης (ΑΙ_ϋΗ) [7], και βλαστικών δείκτες κυττάρων όπως CD133 [8], [9], Nanog [10], Oct4 [10], Sox2 [11] και Notch υποδοχέων [12]. Οι CSCs έχουν περιγραφεί σε πολλές μορφές καρκίνου στον άνθρωπο, συμπεριλαμβανομένων των καρκίνων του πνεύμονα [9], [13]. Ο κεντρικός ρόλος των ΚΕΠ στην ογκογένεση δεικνύει ότι αυτά τα κύτταρα θα πρέπει να στοχεύουν θεραπευτικώς για την επίτευξη αποτελεσματικής θεραπείας του καρκίνου.

MMPs έχουν ενοχοποιηθεί στον πολλαπλασιασμό όγκου πνεύμονα, εισβολή, και μετάσταση [14]. Η υποοικογένεια στρομελυσίνης [στρομελυσίνη 1 (ΜΜΡ3), 2 (Mmp10) και 3 (ΜΜΡ 11)] Συχνά υπερεκφράζεται σε NSCLC [15],. Είναι ενδιαφέρον, Mmp10 εκφράζεται έντονα σε NSCLC όγκους αλλά δεν σχετίζονται με όγκους στρωματικά κύτταρα, ενώ ΜΜΡ3 και ΜΜΡ 11 εκφράζονται κυρίως σε στρώμα [17],. Δείξαμε πρόσφατα ότι Mmp10 απαιτείται για μεταμορφώνεται ανάπτυξη και την εισβολή των ανθρώπινων κυττάρων NSCLC

in vitro

[19], επάγεται στο βρογχο-κυψελιδικά βλαστικά κύτταρα (BASCs) μεταμορφωθεί από ογκογόνο

Kras

[ ,,,0],20], και προωθεί

Kras

μεσολάβηση του πνεύμονα ογκογένεση in vivo [21].

Mmp10

ελλιπή ως ποντίκια εμφανίζουν ένα μπλοκ στο

Kras

-και σχηματισμό όγκων ουρεθάνη που προκαλείται, μια επίδραση που σχετίζεται με την αδυναμία των Mmp10 ανεπάρκεια BASCs να επεκτείνει και να υποστούν μετατροπή σε απάντηση ουρεθάνη ή

Kras

[21]. Έτσι, Mmp10 μεσολαβεί έναρξη του όγκου μέσω του ελέγχου του κυττάρου (BASC) επέκταση του όγκου-κίνηση.

Εδώ, θα αξιολογηθεί ο ρόλος της Mmp10 τη συντήρηση και την ογκογόνο δυναμικό του πλήρως μεταμορφωθεί ΚΕΠ πνεύμονα ποντικού. Πολιτισμών εμπλουτίζεται σε ΚΕΠ από τα κύτταρα αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα ποντικού εκφράζουν αυξημένα Mmp10, Nanog, ΑΙ_ϋΗ1, CD133, Notch3, Notch4, Hey1 και Hey2. Αυτές οι καλλιέργειες παρουσιάζουν αυξημένη ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη in vitro, και ενισχυμένη την έναρξη του όγκου, την ανάπτυξη και μεταστατική εξάπλωση ως ορθοτοπική όγκους σε συγγενή ποντίκια. Αυτές οι ιδιότητες στέλεχος-όπως απαιτούν έκφραση Mmp10 σε καρκινικά κύτταρα αλλά όχι σε σχετιζόμενο με τον όγκο στρώματος. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι Mmp10 είναι ένας ελκυστικός υποψήφιος για την ανάπτυξη της θεραπείας μηχανισμό που βασίζεται στόχο άκρως ογκογόνο ΚΕΠ πνεύμονα.

Αποτελέσματα

ογκόσφαιρες πνεύμονα ποντικού εκφράζουν αυξημένα Mmp10 και Mmp10 εξαρτώμενη από τις ιδιότητες των βλαστικών όπως

Mmp10

είναι ιδιαίτερα προκαλείται σε όγκο την έναρξη του πνεύμονα βρογχο-κυψελιδικά βλαστικά κύτταρα (BASCs) κατά την ενεργοποίηση των ογκογόνων

Kras

[20]. Επιπλέον,

Mmp10

ελλιπή ως ποντίκια εμφανίζουν μειωμένη

Kras

μεσολάβηση σχηματισμό όγκου πνεύμονα και η απώλεια του

Kras

μεσολάβηση επέκταση BASC in vitro και in vivo [21]. Για να διερευνηθεί άμεσα η σημασία της Mmp10 στον πνεύμονα CSC βιολογία, αναλύσαμε τα κύτταρα CMT167 ποντικού, μια εξαιρετικά ογκογόνων, μεταστατική κυτταρική σειρά που προέρχεται από μια αυθόρμητη φατνιακό αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα σε ένα C57BL /6 ποντίκι [22], [23]. της αλληλουχίας του DNA αποκάλυψε ότι τα κύτταρα CMT167 φιλοξενούν μια ενεργοποίησης

Kras

G12V

μετάλλαξη (Εικόνα 1Α), γεγονός που το καθιστά ιδανικό κυτταρικό μοντέλο για τη μελέτη Mmp10 στο μεταλλαγμένο

Kras

ΚΕΠ πνεύμονα. Σε αντίθεση με τα κύτταρα CMT167 αναπτύχθηκαν σε προσκολλημένα καλλιέργεια (Σχήμα 1Β, αριστερά), κύτταρα που αναπτύσσονται σε ορισμένο μέσο βλαστοκυττάρων σε πλάκες χαμηλής προσκόλλησης αυξάνεται καθώς ογκόσφαιρες (Σχήμα 1Β, μεσαίο) θυμίζει CSC καλλιέργειες από ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές πνεύμονα [13] . Αυτές ογκόσφαιρες επαναδιαφοροποιηθούν όταν επέστρεψε στην καλλιέργεια προσκολλημένη, εμφανίζουν μορφολογία συγκρίσιμη με γονικά κύτταρα (Εικόνα 1Β, δεξιά). CMT167 ογκοσφαίρας καλλιέργειες παρουσιάζουν ένα ~ 8-πλάσια αύξηση σε σχηματισμό αποικίας ανεξάρτητη από προσκόλληση σε σύγκριση με γονικά κύτταρα (Εικόνα 1 C), σύμφωνα με τις ενισχυμένες ογκογονικές ιδιότητες των ΚΕΠ [13]. σχηματισμός Ενισχυμένη αποικία είναι σε μεγάλο βαθμό χάνεται όταν αυτά τα κύτταρα αφήνονται να επαναδιαφοροποιηθούν επιστρέφοντας τους να προσκολλημένα καλλιέργειας (Σχήμα 1 C). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με τη χρήση ενός δεύτερου πνεύμονα ποντικού κυτταρική γραμμή αδενοκαρκινώματος, ο Lewis του πνεύμονα (LLC) (Σχήμα S1A και Β). κύτταρα LLC καλλιεργούνται ως ογκόσφαιρες στην βλαστικών κυττάρων καλλιέργειας εμφανίζουν αυξημένη σχηματισμού αποικιών αγκύρωση-ανεξάρτητη, αλλά χάνουν αυτές τις ιδιότητες, όταν επέστρεψε στην προσκολλημένη πολιτισμό. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι οι ογκοσφαίρας πολιτισμούς μας εμπλουτίζεται σε καρκινικά βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν.

κύτταρα Α) CMT167 φιλοξενούν μια ενεργοποίησης

Kras

G12V

μετάλλαξη. αλληλουχία DNA χρωματογράφημα του

Kras

αλληλόμορφο σε κύτταρα CMT167 αποκαλύπτει ένα κωδικόνιο 12 μετάλλαξη από γλυκίνη σε βαλίνη (

Kras

G12V

) (κόκκινο βέλος). Β) μικροφωτογραφίες αντίθεσης φάσεων γονικών προσκολλημένων κυττάρων CMT167 (

αριστερό πάνελ

), CMT167 ογκόσφαιρες σε καλλιέργεια βλαστικών κυττάρων (

μεσαίο πλαίσιο

) και επαναδιαφοροποιημένα ογκοσφαίρας κύτταρα μετά την επιστροφή σε προσκολλημένα πολιτισμό (

δεξιά

πίνακα). Γ) CMT167 ογκοσφαίρας καλλιέργειες εμφανίζουν ενισχυμένη αγκύρωση-ανεξάρτητη ανάπτυξη. Η μέση φορές η μετάβαση από τα γονικά κύτταρα CMT167 +/- SEM. n = 5, * ρ & lt? 0,00001? ** P & lt?. 0,00001

Η

Για να χαρακτηριστεί περαιτέρω ογκοσφαίρας πολιτισμών μας, τους αξιολογούνται για έκφραση καλά χαρακτηρισμένων γονιδίων βλαστικών κυττάρων που σχετίζονται με. QPCR αποκάλυψε ότι CMT167 ογκοσφαίρας καλλιέργειες εκφράζουν αυξημένα mRNA για πολλά γονίδια που σχετίζονται με τον φαινότυπο των βλαστικών κυττάρων [24], συμπεριλαμβανομένων Nanog, ΑΙ_ϋΗ1, CD133, Notch3, Notch4, Hey1 και Hey2 (Σχήμα 2Α). Εντυπωσιακά, αυτές οι καλλιέργειες εκφράζουν επίσης αυξημένα Mmp10 mRNA (Σχήμα 2Α), αλλά καμία αύξηση σε ΜΜΡ2, ΜΜΡ7, ΜΜΡ9, ΜΜΡ 11, ΜΜΡ 12 ή ΜΜΡ14, άλλα είδη Mmp συνήθως συνδέεται με τον καρκίνο του πνεύμονα (Σχήμα 2Α). Όπως ήταν αναμενόμενο, ογκοσφαίρας καλλιέργειες εμφανίζουν απώλεια δεικτών των βλαστικών κυττάρων και την έκφραση Mmp10 όταν αφήνεται να επαναδιαφοροποιηθούν σε προσκολλημένα καλλιέργειας (Σχήμα 2Β). Παρατηρήθηκε Ένα παρόμοιο μοτίβο έκφρασης δείκτη βλαστικών κυττάρων σε ογκοσφαίρας καλλιέργειες από κύτταρα LLC, συμπεριλαμβανομένου ενός δραματική αύξηση MMP10, υποδεικνύοντας ότι αυτές οι αλλαγές δεν είναι μοναδική για CMT167 ογκόσφαιρες (Σχήμα S1c). CMT167 ογκοσφαίρας καλλιέργειες εκκρίνουν αυξημένα πρωτεΐνη Mmp10 εντός του μέσου σε σχέση με τη γονική ή επαναδιαφοροποιημένα καλλιέργειες (Σχήμα 2C), αποδεικνύοντας τη λειτουργική σημασία των αυξημένη έκφραση Mmp10 σε αυτές τις καλλιέργειες. CD133 και Notch4 είναι δύο εξαιρετικά επιλεκτική δεικτών επιφανείας που εκφράζονται σε άλλα ΚΕΠ του πνεύμονα [9],. Ως εκ τούτου, εκτιμήσαμε την έκφραση αυτών των δεικτών σε CMT167 γονική, ογκοσφαίρας και επαναδιαφοροποιημένα ογκοσφαίρας καλλιέργειες με κυτταρομετρία ροής (Εικόνα 2D). Γονική καλλιέργειες κυττάρων περιέχει περίπου 8% CD133

+ /Notch4

+ κύτταρα. Σε αντίθεση, ογκοσφαίρας πολιτισμών περιέχει ~38% CD133

+ /Notch4

+ κύτταρα και επαναδιαφοροποιημένα πολιτισμών -6% CD133

+ /Notch4

+ κύτταρα. Αυτά τα αποτελέσματα είναι συνεπή με την επικράτηση της ΚΕΠ σε άλλες καρκίνο του πνεύμονα κυτταρικές γραμμές [9], υποδεικνύοντας ότι αυτές είναι εκλεκτικοί δείκτες για CSC-εμπλουτισμένων καλλιεργειών.

Α) έκφραση των δεικτών του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων σε CMT167 γονικών και ογκοσφαίρας πολιτισμούς. QPCR των γονιδίων του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων που σχετίζονται με? * P & lt? 0,05. Β) QPCR για δείκτες βλαστικών κυττάρων στο γονικό, ογκοσφαίρας και επαναδιαφοροποιημένα ογκοσφαίρας πολιτισμούς. Fold των γονικών κυττάρων +/- SEM, η = 3? * P & lt? 0,05. Γ) CMT167 ογκοσφαίρας καλλιέργειες εκκρίνουν αυξημένη πρωτεΐνη Mmp10. ELISA των υπερκειμένων καλλιέργειας από τη γονική, ογκοσφαίρας και επαναδιαφοροποιημένα CMT167 ογκοσφαίρας πολιτισμούς. Η μέση τιμή +/- SEM. n = 3, * ρ & lt? 1 × 10

-8 γονική ογκόσφαιρες έναντι? ** P & lt? 2 × 10

-8 ογκόσφαιρες εναντίον επαναδιαφοροποιημένα ογκόσφαιρες. Δ) Η κυτταρομετρία ροής των CMT167 γονικής, ογκοσφαίρας και επαναδιαφοροποιημένα ογκοσφαίρας πολιτισμούς για CD133 και Notch4.

Η

Από ογκόσφαιρες εκφράζουν αυξημένα Mmp10, είμαστε δίπλα αξιολογηθεί κατά πόσον Mmp10 είναι σημαντική για τη συντήρηση και την ανάπτυξή τους. Προσδιορίστηκαν τρεις RNAi φακοϊούς στόχευσης ποντίκι Mmp10 RNA που αναστέλλουν την έκφραση Mmp10 (Σχήμα S2A και Β). Κάθε knockdown ιός Mmp10 προκάλεσε μια ανάλογη αναστολή της ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη σε σύγκριση με τα μη στοχευόμενα κύτταρα-μάρτυρες (ΝΤ) RNAi (Σχήμα S2C). Η πιο αποτελεσματική κατασκεύασμα Mmp10 RNAi (3 #) χρησιμοποιήθηκε για να εκμαιεύσει αποτελεσματική knockdown του Mmp10 mRNA σε δύο γονικών και ογκοσφαίρας καλλιέργειες (Σχήμα 3Α). Mmp10 knockdown προκάλεσε μία αναστολή της ανάπτυξης μετασχηματισμένων (Σχήμα 3Β), και μια απώλεια σε έκφραση του Nanog, ΑΙ_ϋΗ1, Cd133, Notch3 και 4, Hey1 και 2, και Mmp10 (Σχήμα 3C). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν LLC ογκοσφαίρας καλλιέργειες στις οποίες MMP10 χτυπήθηκε κάτω από RNAi (Σχήμα S3A-C). Mmp10 RNAi ογκοσφαίρας καλλιέργειες παρουσίασαν επίσης μείωση CD133

+ /Notch4

+ κυττάρων σε σύγκριση με ΝΤ RNAi ογκοσφαίρας καλλιέργειες (Σχήμα 3D). Είναι ενδιαφέρον, Mmp10 knockdown προκάλεσε επίσης μία μείωση στην CD133

+ /Notch4

+ κύτταρα σε γονική καλλιέργειες (από ~ 11% σε περίπου 5%) (Σχήμα 3D), υποδεικνύοντας ότι Mmp10 είναι σημαντική για τη διατήρηση μιας CSC του πληθυσμού στο εσωτερικό της γονικής πολιτισμούς.

Α) QPCR δείχνει μεσολάβηση RNAi νοκ ντάουν της Mmp10 στη γονική CMT167 και ογκοσφαίρας πολιτισμούς. Σε σχέση με τα γονικά κύτταρα NT? Μέσος ± Τ.Α, n = 3. * ρ & lt?. 0.0002 και ** p = 0,01 έναντι NT γονικού ελέγχου. Β) Επίδραση των Mmp10 RNAi για την αγκύρωση-ανεξάρτητη ανάπτυξη των γονικών και CMT167 ογκοσφαίρας πολιτισμούς. Σε σχέση με τα γονικά κύτταρα NT +/- SEM, η = 5? * P & lt? 0,05 vs, NT? ** P & lt? 0,05 έναντι NT γονική. Γ) QPCR για δείκτες βλαστικών κυττάρων σε NT γονική, και NT και Mmp10 RNAi CMT167 ογκοσφαίρας κύτταρα. Fold ΝΤ γονικής +/- SEM, η = 3? * P & lt? 0,05. Δ) Η κυτταρομετρία ροής των ΝΤ και Mmp10 RNAi γονικών και ογκοσφαίρας κύτταρα για CD133 και Notch4.

Η

επόμενο καθοριστεί αν Mmp10 είναι σημαντική για την κλωνική επέκταση των ογκόσφαιρες, ένα καλά καθορισμένο χαρακτηριστικό του ΚΕΠ. Ενιαία ογκοσφαίρας κύτταρα Mmp10 RNAi- και ΝΤ RNAi απλώθηκαν σε ατομικά φρεάτια πλακών ιστοκαλλιέργειας χαμηλής προσκολλημένα και αφήνεται να διασταλεί κλωνικά. Σχεδόν όλα τα κύτταρα NT RNAi επεκταθεί σε μεγάλο ογκόσφαιρες διάρκεια μιας περιόδου 15 ημερών (Σχήμα 4Α, άνω), ενώ η πλειονότητα των κυττάρων Mmp10 RNAi παραμένουν ως απλά κύτταρα (Σχήμα 4Α, κάτω). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε LLC ογκοσφαίρας καλλιέργειες (Σχήμα S3D). Η μειωμένη κλωνική επέκταση CMT167 ογκόσφαιρες οφειλόταν σε γενετική απώλεια Mmp10 αφού προσθήκη ανασυνδυασμένου Mmp10 στο μέσο καλλιέργειας αποκατασταθεί κλωνική επέκταση των κυττάρων Mmp10 RNAi (Σχήμα 4Α, κάτω). Ποσοτικοποίηση επιβεβαίωσε ότι η ΝΤ RNAi ογκόσφαιρες αυξηθεί σημαντικά μεγαλύτερα από Mmp10 RNAi ογκόσφαιρες, και η προσθήκη του ανασυνδυασμένου Mmp10 αποκαθιστά την ανάπτυξη των κυττάρων Mmp10 RNAi σε αυτό συγκρίσιμο με κύτταρα NT RNAi ενώ έχουν καμία σημαντική επίδραση επί των κυττάρων NT RNAi (Σχήμα 4Β). Εξωγενείς Mmp10 οδήγησε επίσης σε εκ νέου έκφραση CD133 και Notch4 σε κύτταρα Mmp10 RNAi (Σχήμα 4C), και την εκ νέου έκφραση των δεικτών των βλαστικών κυττάρων (Nanog, ΑΙ_ϋΗ1, Cd133, Notch3, Notch4 και Hey2) (Σχήμα S4A). Η μειωμένη κλωνική ανάπτυξη του Mmp10 RNAi ογκόσφαιρες δεν οφείλεται σε απώλεια της βιωσιμότητας των κυττάρων, δεδομένου ότι αυτά τα κύτταρα πολλαπλασιάζονται σε ρυθμό διακριθεί από NT RNAi ογκόσφαιρες όταν τοποθετείται πίσω στη προσκολλημένα καλλιέργειας (Σχήμα S4B).

Α) Μικροφωτογραφίες του κλωνική επέκταση του ενιαίου ΝΤ και Mmp10 RNAi CMT167 ογκοσφαίρας κύτταρα παρουσία ή απουσία ή ανασυνδυασμένη Mmp10. διαμέτρου Β) αποικιών που προέρχονται από μεμονωμένα κύτταρα CMT167 NT και Mmp10 RNAi. Μέση τιμή +/- SEM? n = 10, * ρ & lt? 0,05 vs. ημέρα 1 κάθε θεραπεία? ** P & lt? 0,05 vs. ημέρα 15 NT RNAi χωρίς Mmp10. Γ) Η κυτταρομετρία ροής των ΝΤ και Mmp10 RNAi CMT167 ογκοσφαίρας πολιτισμών +/- Mmp10 για CD133 και Notch4.

Η

Mmp10-εξαρτώμενη δραστηριότητα ογκογενή ογκοσφαίρας πολιτισμούς έκθεμα

in vivo

Αξιολογήσαμε επόμενο τη δραστικότητα ογκογενή ογκοσφαίρας και γονικών καλλιεργειών από ορθοτοπική ένεση στο αριστερό λοβό του πνεύμονα συγγενών ποντικών. Τα αρχικά πειράματα προσδιορίστηκε ότι η ένεση των 100.000 γονική CMT167 /Luc κυττάρων που απαιτούνται για τη δημιουργία ορθοτοπική όγκους ενώ ένεση τόσο λίγα όσο 1.000 NT Luc κύτταρα RNAi CMT167 /από ογκοσφαίρας καλλιέργειες ρουτίνας έδωσε όγκους. Ένεση του 1000 ΝΤ luc ογκοσφαίρας κύτταρα RNAi CMT167 /οδήγησε σε μεγάλους όγκους ενώ εισαγωγή 1000 γονικών luc κύτταρα NT RNAi CMT167 /ή luc ογκοσφαίρας κύτταρα Mmp10 RNAi CMT167 /απέτυχαν να παράγουν μεγάλους όγκους όπως προσδιορίζεται με ζωντανή απεικόνιση βιοφωταύγειας (Σχήμα 5Α). Η παθολογική εξέταση των ιστών του πνεύμονα κατά το χρόνο της θυσίας απέδειξαν ότι take όγκου ήταν 100% για Luc ογκοσφαίρας κύτταρα NT RNAi CMT167 /(9/9) με μέσο μέγεθος όγκου των 3,63 +/-. 35 mm

2, αλλά μόνο 45% του όγκου λαμβάνουν τη γονική NT RNAi CMT167 /Luc κύτταρα (5/11) με μέσο μέγεθος όγκου των 0,42 +/-. 06 mm

2, και 27% του όγκου λάβει για Mmp10 RNAi CMT167 /Luc ογκοσφαίρας κύτταρα (3 /11) με ένα μέσο μέγεθος όγκου +/- 0.36. 09 mm

2. Αυτά τα στοιχεία επικυρώνουν in vivo μετρήσεις βιοφωταύγεια μας και να αποδείξει ότι Mmp10 διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στη δραστηριότητα και την ανάπτυξη του Luc ογκοσφαίρας κυττάρων CMT167 /όγκο έναρξη της έρευνας. Είναι ενδιαφέρον ότι, Mmp10 knockdown σε γονικά κύτταρα οδηγεί επίσης σε απώλεια σχηματισμού όγκων in vivo (Σχήμα S5A), υποδεικνύοντας ότι Mmp10 είναι σημαντική για την δραστικότητα ογκογενή ενός CSC-σαν κυτταρικό πληθυσμό παρόν σε καλλιέργειες γονικού κυττάρου. NT RNAi CMT167 /Luc ογκοσφαίρας πολιτισμούς δημιουργείται επίσης πολλές μεταστάσεις στα δεξιά λοβών του πνεύμονα ενώ οι καλλιέργειες /Luc κυττάρων RNAi CMT167 γονική NT παρουσίασαν πολύ λιγότερες μεταστάσεις και Mmp10 RNAi CMT167 /Luc ογκοσφαίρας πολιτισμούς ακόμα λιγότερες (Σχήμα S5B), προτείνοντας ένα ρόλο για Mmp10 στο μεταστατικό δυναμικό, μια ιδιότητα που αποδίδεται στο ΚΕΠ του πνεύμονα. Έτσι, Mmp10 είναι σημαντική για την ενισχυμένη ογκογόνο δυναμικό που παρατηρείται σε καλλιέργειες ογκοσφαίρας.

Α, ορθοτοπική ανάπτυξη του όγκου μετά την έγχυση των κυττάρων από 1000 NT προσκολλημένα, ΝΤ RNAi ογκοσφαίρας ή Mmp10 RNAi ογκοσφαίρας καλλιέργειες παρακολουθήθηκε με βιοφωταύγεια στο υποδεικνυόμενο χρονικά σημεία? * P & lt? 0,05 (

αριστερό πάνελ

). Εκπρόσωπος πλευρική θέα βιοφωταυγούς εικόνες των ποντικών που έφεραν πνεύμονα ορθοτοπική όγκους (

δεξί πάνελ

). λειτουργία Mmp10 σε CMT167 ογκοσφαίρας όγκων είναι κύτταρο αυτόνομη. Β) Εκπρόσωπος βιοφωταυγούς εικόνες του ΝΤ RNAi CMT167 ογκοσφαίρας ορθοτοπική όγκοι εμφυτεύονται σε NTG και

Mmp10

– /- ποντικών δεκτών. Ανάλυση της C) το μέγεθος του όγκου και D) μεταστάσεις σε NTG ή

Mmp10

– /- ποντίκια. C-D, η = 10, μέση τιμή +/- SEM.

Η

Ογκογονικότητα είναι ανεξάρτητη από Mmp10 στο μικροπεριβάλλον του όγκου

Τα αποτελέσματα της Mmp10 σε κύτταρα CMT167

in vitro

είναι κύτταρο αυτόνομα. Ωστόσο, δεν μπορούμε να αποκλείσουμε ένα ρόλο για Mmp10 παράγονται από σχετίζονται με όγκους επιθηλιακής, στρώματος και /ή κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος σε ορθοτοπική μελέτες όγκων μας. Για την αντιμετώπιση αυτού του ζητήματος, θα ένεση 1.000 κύτταρα από NT RNAi CMT167 /Luc ογκοσφαίρας πολιτισμούς είτε σε NTG ή

Mmp10

– /- ποντίκια. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στην ανάπτυξη του όγκου (Σχήμα 5Β), το μέγεθος του πρωτοπαθούς όγκου (Σχήμα 5C) ή μεταστάσεις (Εικόνα 5D) παρατηρήθηκαν σε NTG και

Mmp10

– /- ποντίκια παραλήπτη, υποδεικνύοντας ότι Mmp10 εκφράζεται από ογκόσφαιρες, αλλά όχι από Mmp10 παράγονται από άλλα κύτταρα που σχετίζονται με όγκους, είναι κρίσιμη για το σχηματισμό όγκων. Έχουμε προηγουμένως αποδείξει ότι Mmp10 εκφράζεται σε χαμηλά επίπεδα vanishingly στο επιθήλιο του πνεύμονα, αλλά είναι ιδιαίτερα επάγεται σε BASCs κατά την ενεργοποίηση των ογκογόνων

Kras

[20]. Έτσι, τα κύτταρα του όγκου είναι η κύρια πηγή Mmp10 στους πνεύμονες των ποντικών που φέρουν όγκο.

ογκοσφαίρας καλλιέργειες διαφοροποιηθούν σε κύτταρα όγκου χύμα μετά ορθοτοπική ένεση

ΚΕΠ αρχίσει και να διατηρήσει όγκων με τη διατήρηση CSC πληθυσμό και να διαφοροποιούνται σε παροδικά ενισχύει τα κύτταρα που αποτελούν το μεγαλύτερο μέρος του όγκου. Για να αξιολογηθεί η τύχη της ογκόσφαιρες CMT167 μετά τον σχηματισμό ορθοτροπική όγκου, απομονώσαμε καρκινικά κύτταρα από ορθοτοπική όγκους που προέρχονται από αυτές τις καλλιέργειες και αναλύθηκαν για τους CD133

+ /Notch4

+ κύτταρα (Σχήμα 6). Κατά τη στιγμή της ένεσης, οι ογκοσφαίρας καλλιέργειες έδειξαν σημαντικό εμπλουτισμό σε CD133

+ /Notch4

+ κύτταρα (~ 36%) (Σχήμα 6Α). Σε αντίθεση, τα καρκινικά κύτταρα που απομονώνονται από ορθοτοπική όγκους αποτελούνταν από ~ 11% CD133

+ /Notch4

+ κύτταρα, σύμφωνα με γονικά κύτταρα CMT167 (Σχήμα 6Β). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι ογκοσφαίρας καλλιέργειες διαδίδουν πληθυσμό CD133

+ /Notch4

+ βλαστικά κύτταρα που ομοιάζουν, και επίσης διαφοροποιούνται σε παροδικά ενισχύει κύτταρα όγκου in vivo. Εμείς διερευνηθεί επίσης η κατανομή των CMT167 ογκοσφαίρας κυττάρων σε ορθοτοπική όγκους με ανοσοϊστοχημεία για Mmp10 και Notch4 (Σχήμα 6C). Πρωτοπαθείς όγκους που προέρχονται από ογκόσφαιρες παρουσίασαν ελαφρώς αυξημένα χρώση Mmp10 με πιο σκούρα χρώση Mmp10 σε περιοχές όπου ο όγκος αλληλεπιδρά με τον περιβάλλοντα στρώμα. Tumor-σχετίζεται στρώμα και φυσιολογική χρώση πνεύμονα επιθήλιο αρνητικό για Mmp10, σύμφωνα με τη σπανιότητα της έκφρασης Mmp10 σε φυσιολογικό επιθήλιο πνεύμονα [20]. χρώση Notch4 παρουσίασαν ένα παρόμοιο μοτίβο, υποδεικνύοντας συν-έκφραση Mmp10 και Notch4 σε καρκινικά κύτταρα στη διαχωριστική επιφάνεια του όγκου και των γύρω στρώμα (Σχήμα 6C, άνω).

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής για έκφραση CD133 και Notch4 σε CMT167 ογκόσφαιρες πριν από την έγχυση ορθοτοπικά σε συγγενή ποντίκια (Α) και τα κύτταρα που απομονώνονται από CMT167 ορθοτοπική όγκους (Β). Γ) Mmp10 και Notch4 χρώση σε ένα δημοτικό CMT167 ογκοσφαίρας όγκου (

πάνω πάνελ

) και μεταστατική βλάβη (

κάτω πάνελ

).

Η

έκφραση Mmp10 συνδέεται με μετάσταση των καρκινικών κυττάρων του πνεύμονα

Πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι η ΚΕΠ διαμένουν σε προ-μεταστατικό κόγχες υπεύθυνη για μεταστατική εξάπλωση των όγκων. Με δεδομένη τη σύνδεση των βλαστική ικανότητα και μεταστατικό δυναμικό, εκτιμήσαμε την έκφραση Mmp10 και Notch4 σε μεταστατικές βλάβες από όγκους που προέρχονται από ογκόσφαιρες. Είναι ενδιαφέρον ότι, και τα δύο Mmp10 και χρώση Notch4 ήταν έντονη και ομοιόμορφη σε μεταστατικές αλλοιώσεις (Σχήμα 6C, κάτω), υποδεικνύοντας ότι αυτές οι αλλοιώσεις εμπλουτισμένα σε Mmp10-Notch4 διπλό θετικό ΚΕΠ. Μια παρόμοια συσχέτιση της έκφρασης Mmp10 με μεταστατικές βλάβες σε ανθρώπινους καρκίνους παρατηρήθηκε όταν αναλύσαμε δημοσίως διαθέσιμα σύνολα δεδομένων γονιδιακής έκφρασης των ανθρώπινων όγκων με τη χρήση του εργαλείου βιοπληροφορικής NextBio. Η ανάλυση αποκάλυψε μία ισχυρή θετική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης Mmp10 και μεταστατικό δυναμικό σε ανθρώπινο NSCLC, ορθοκολικό καρκίνο, μελάνωμα, καρκίνο του μαστού, καρκίνωμα νεφρικών κυττάρων και ο καρκίνος του προστάτη (Πίνακας 1). Έτσι, Mmp10 φαίνεται να παίζει ένα διαδεδομένο ρόλο στην ανθρώπινη κακοήθεια.

Η

Συζήτηση

Ένα μικρό υποπληθυσμό της αυτο-ανανέωσης βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με μπορεί να είναι υπεύθυνος για την έναρξη, τη συντήρηση, την εξέλιξη και μεταστατική εξάπλωση των όγκων. Ωστόσο, σχετικά λίγα είναι γνωστά σχετικά με τους μοριακούς μηχανισμούς που εμπλέκονται στην συντήρηση CSC. ΚΕΠ μπορεί να ξεφύγει συμβατική χημειοθεραπεία, λόγω των εγγενών αντίστασης στα φάρμακα τους και /ή σχετική αδράνεια, με αποτέλεσμα την υποτροπή της νόσου και την κακή έκβαση των ασθενών. Ως εκ τούτου, θεραπευτικές στρατηγικές που στοχεύουν στην εξάλειψη ΚΕΠ μπορεί να βελτιώσει την κλινική έκβαση των ασθενών με καρκίνο.

Αν και MMPs έχουν από καιρό εμπλακεί στην πρόοδο του όγκου και της μετάστασης, πρόσφατα έδειξαν ότι Mmp10 υπερεκφράζεται σε ανθρώπινο NSCLC και

Kras

-μεταμορφωμένων BASC κύτταρα πνεύμονα καρκίνο κίνηση [19], [20], και ότι Mmp10 απαιτείται για την ανάπτυξη και μετασχηματίζεται εισβολή των ανθρώπινων κυττάρων NSCLC em

in vitro

[19]. Επιπλέον, Mmp10

– /- ποντίκια παρουσιάζουν σημαντική μείωση στην urethane- και

Kras

επαγόμενη πνευμονική ογκογένεση οφείλεται σε ελάττωμα του Mmp10 ανεπάρκεια BASCs να επεκταθεί σε απάντηση ογκογόνο

Kras

[21]. Εδώ, αναφέρουμε το εκπληκτικό αποτέλεσμα ότι Mmp10 ευνοεί την έναρξη των πνευμόνων και μετάσταση όγκου μέσω της διατήρησης ενός CSC-σαν πληθυσμό κυττάρων όγκου του πνεύμονα.

ΚΕΠ ορίζονται από την ικανότητά τους να επεκτείνουν κλωνικά, διαφοροποιούνται σε κύτταρα όγκου χύμα , και να ξεκινήσει όγκων σε ζώα-δέκτες. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι Mmp10 υπερεκφράζεται σε CSC εμπλουτισμένο ογκοσφαίρας καλλιέργειες από κυτταρικές γραμμές αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα δύο ποντίκι και απαιτείται για ενισχυμένη μετασχηματίζονται ανάπτυξη και κλωνική επέκταση

in vitro

, και για την έναρξη του όγκου

in vivo

. Αναστολή της

Mmp10

έκφραση σε ογκόσφαιρες μειώνει σημαντικά την έκφραση των παραγόντων μεταγραφής κυττάρου σχετιζομένου βλαστικών και των δεικτών της κυτταρικής επιφάνειας, υποδεικνύοντας ότι Mmp10 είναι κρίσιμη για τη διατήρηση του πνεύμονα CSC ταυτότητας. έκφραση Mmp10 είναι επίσης αυξημένη σε ΚΕΠ απομονώθηκε από ανθρώπινο μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κυτταρικές γραμμές [27], υποδηλώνοντας ότι Mmp10 μπορεί επίσης να λειτουργεί στην διατήρηση αυτών των ΚΕΠ.

Ένα κλειδί για την αποτελεσματική στόχευση NSCLC ΚΕΠ θα είναι για την ακριβή προσδιορίσει αυτό υποπληθυσμό εντός των όγκων. BASCs είναι οι υποθετικές ογκογενή κύτταρα από τα οποία

Kras

όγκους επαγόμενη πνεύμονα ποντικού προέρχονται. BASCs έκθεμα επιφανειακή έκφραση του Sca1, Spc και Ccsp, ωστόσο μέχρι σήμερα, τα ανθρώπινα βλαστικά κύτταρα βρογχοκυψελιδικού που συν-εκφράζουν SP-C και CCSP δεν έχουν απομονωθεί, και Sca1 δεν εκφράζεται σε κύτταρα ανθρώπινου πνεύμονα [28]. Είναι ενδιαφέρον, CMT167 ογκοσφαίρας καλλιέργειες δεν είναι μόνο εμπλουτισμένο σε CCSP

+ /SPC

+ κύτταρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται), αλλά και σε CD133

+ /Notch4

+ κύτταρα, δύο δείκτες που εμπλέκονται στην ιατρική και ΚΕΠ ποντίκι από διάφορους τύπους όγκων, συμπεριλαμβανομένων των πνευμόνων [25], [29]. Η αναστολή της σηματοδότησης Notch δεσμεύει την ικανότητα του γλοιοβλαστώματος προερχόμενων νευροσφαιρίων CSC να διαδώσει όγκους και εξαντλεί CD133

+ βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν σε νευρόσφαιρες [29]. Ομοίως, Notch μπλοκ αναστολή του πολλαπλασιασμού και της δραστηριότητας του όγκου κίνηση του ανθρώπινου ΚΕΠ του πνεύμονα [25]. Παρατηρήσαμε σημαντική εμπλουτισμό της Notch4

+ /CD133

+ κυττάρων σε CMT167 ογκόσφαιρες με λίγες μόνο θετικά κύτταρα υποδηλώνοντας ότι η συν-έκφραση αυτών των μορίων που απαιτούνται για τη διατήρηση CMT167 ΚΕΠ. Έτσι, Notch4 και CD133 μπορεί να είναι χρήσιμοι δείκτες της ΚΕΠ του πνεύμονα μεταξύ των ειδών.

Τα στοιχεία μας παρέχουν άμεση απόδειξη ότι ο ρόλος του

Mmp10

στον πνεύμονα ΚΕΠ είναι κύτταρο αυτόνομη. ορθοτοπικό μοντέλο όγκου μας δείχνει χρώση Mmp10 σε καρκινικά κύτταρα αλλά όχι με όγκους που συνδέονται στρώμα ή μορφολογικά φυσιολογικό επιθήλιο πνεύμονα. Το πιο σημαντικό, δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στον αριθμό των όγκων, το μέγεθος ή μεταστατικές αλλοιώσεις που σχηματίζονται από ογκοσφαίρας κύτταρα εγχέονται ορθοτοπικά σε συγγενικά NTG ή Mmp10

– /- ποντίκια. Ετσι, ενώ πολλές MMPs που παράγονται από σχετιζόμενο με τον όγκο στρώματος παίζουν εξέχοντα ρόλο στις επεμβατικές και μεταστατικές ιδιότητες των κυττάρων του όγκου πνεύμονα, Mmp10 παράγεται κυρίως από τα κύτταρα του πνεύμονα όγκου για να υποστηρίξουν την αυτόνομη ανάπτυξη των ΚΕΠ. Τα δεδομένα μας συμφωνούν με πολυάριθμες αναφορές ότι Mmp10 εκφράζεται σε ανθρώπινα κύτταρα NSCLC και όχι γύρω φυσιολογική ή σχετίζονται με τον όγκο ιστούς των πνευμόνων [15], [17], [18]. Οι μελλοντικές μελέτες θα επικεντρωθεί στον προσδιορισμό των μοριακών μηχανισμών που συμβάλλουν στην Mmp10 μεσολάβηση πολλαπλασιασμού CSC.

κακή έκβαση σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα οφείλεται σε μεταστατική διάδοση και την αντίσταση των καρκινικών κυττάρων στη χημειοθεραπεία, δύο χαρακτηριστικά που αποδίδονται σε ΚΕΠ. Σε πρωτογενείς όγκους ογκοσφαίρας προερχόμενο παρατηρήσαμε αυξημένη χρώση Mmp10 και Notch4 στη διεπαφή μεταξύ του όγκου και του περιβάλλοντος ιστού, υποδηλώνοντας ένα ρόλο για Mmp10

+ /Notch4

+ κύτταρα σε εισβολή όγκου. Αυτά τα δεδομένα είναι σύμφωνα με προηγούμενες χρηματοδότηση μας που απαιτείται για Mmp10 εισβολή ανθρώπινων κυττάρων NSCLC

in vitro

[19], και την τρέχουσα εύρημα μας ότι Mmp10 συμβάλλει στην μεταστατική συμπεριφορά των CMT167 ογκοσφαίρας προερχόμενων όγκους. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα καρκινικά κύτταρα εντός μεταστατικών βλαβών ομοιόμορφα ρητή Mmp10 και Notch4 γεγονός που υποδηλώνει ότι προέρχονται από, και άκρως εμπλουτισμένο σε, ΚΕΠ. Mmp10 νοκ ντάουν οδηγεί σε σημαντική μείωση των μεταστατικών βλαβών που δείχνει τη σημασία της Mmp10 σε μεταστατική συμπεριφορά.

Ανάλυση της έκφρασης προφίλ δεδομένα σχετικά με NSCLC αποκάλυψε μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης Mmp10 και την εξέλιξη του όγκου, την τοπική εισβολής και μακρινή μετάσταση [30 ]. Παρατηρήσαμε παρόμοιες συσχετίσεις μεταξύ της έκφρασης Mmp10 και μεταστατική συμπεριφορά του ανθρώπινου ορθοκολικού καρκίνου, του μελανώματος, του μαστού, των νεφρών και των καρκίνων του προστάτη (Πίνακας 1). Έτσι, Mmp10 μπορεί να παίζει ένα διαδεδομένο ρόλο στη μεταστατική συμπεριφορά πολλών τύπων ανθρώπινων καρκίνων. Χρησιμοποιώντας μια προσέγγιση βιοπληροφορική, έχουμε πρόσφατα έδειξαν ότι η έκφραση Mmp10 σε ανθρώπινους όγκους συνδέεται με αμφότερα τα εμβρυϊκά υπογραφές γονίδιο βλαστικών κυττάρων και μεταστατικό δυναμικό [21]. Είναι ενδιαφέρον, ΚΕΠ φαίνεται να προωθήσει χημειοαντίσταση και μια πρόσφατη μελέτη αποκάλυψε ότι Mmp10 υπερεκφράζεται σε σισπλατίνη ανθεκτικό σε σύγκριση με τα ανθρώπινα κύτταρα σισπλατίνη ευαίσθητα ωοθηκών αδενοκαρκίνωμα [31]. Περαιτέρω μελέτες θα πρέπει να καθοριστεί εάν Mmp10 προάγει μετάσταση και χημειοαντίσταση σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα με τη διατήρηση ενός πολύ μεταστατικός, στη χημειοθεραπεία του καρκίνου πληθυσμός βλαστοκυττάρων, καθώς παρόντα δεδομένα μας σε κύτταρα αδενοκαρκινώματος πνεύμονα ποντικού θα προβλεφθούν.

Υλικά και Μέθοδοι

οι κυτταρικές σειρές, ένζυμα και λεντοϊού μεσολάβηση RNAi γονίδιο knockdown

κύτταρα

CMT167 και LLC εκφράζουν λουσιφεράση πυγολαμπίδας ήταν ένα δώρο από τον Dr. Raphael Nemenoff (Πανεπιστήμιο του Κολοράντο, Denver, CO) και ήταν χαρακτηριζόμενη προηγουμένως [32]. Εν συντομία, αυτά τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με pGL3 που περιέχει λουσιφεράση πυγολαμπίδας συστατικώς οδηγείται από έναν υποκινητή του SV40 και κύτταρα που εκφράζουν υψηλά λουσιφεράση επελέγησαν χρησιμοποιώντας αντίσταση σε νεομυκίνη [32]. Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη καταλυτική περιοχή proMmp10 εκφράστηκε σε Ε coli στέλεχος BL21 (DE3), που απομονώνονται από έγκλειστα σωμάτια, καθαρισμένο, αναδιπλώθηκε, και ενεργοποιημένα

in vitro

κατεργασία με 4-αμινοφαινυλυδραργυρικό οξικό, ουσιαστικά όπως περιγράφηκε προηγουμένως για ΜΜΡ3 [33]. Οι λεπτομέρειες της κατασκευής και μέθοδοι έχουν υποβληθεί για δημοσίευση αλλού [34]. Συγκεντρώσεις των ενεργοποιημένων Mmp10 προσδιορίστηκαν με απορρόφηση υν στα 280 nm, χρησιμοποιώντας ένα υπολογισμένο συντελεστή μοριακής απόσβεσης του 29.910 Μ

-1 εκατοστά

-1. Ειδική δραστικότητα του Mmp10 (43,75 U /μg? 1 U = 100 pmol /min στους 37 ° C) προσδιορίστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19]. 100 U /ml του Mmp10 προστέθηκε όπως υποδεικνύεται στις λεζάντες σχήμα.

Οι φορείς λεντοϊών που περιέχουν μικρή φουρκέτα RNAi έναντι Mmp10 ποντικού ελήφθησαν από την Sigma-Aldrich. Ένας φορέας λεντοϊού ελέγχου μη-στόχου που περιέχει ένα σύντομο κατασκεύασμα φουρκέτας RNA που δεν αναγνωρίζει κανένα ποντίκι ή ανθρώπινα γονίδια (ΝΤ) χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Τα κύτταρα μετάγονται με ανασυνδυασμένο φακοϊό και σταθερή μορφομετατροπείς επιλέγονται από πουρομυκίνη αντίσταση όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19]. Οι RNAi αλληλουχίες που παρέχονται στην Εικόνα S1 Α. Η αποτελεσματικότητα της Mmp10 knockdown εκτιμήθηκε με ποσοτική PCR (QPCR).

Εμπλουτισμός, κλωνική επέκταση και επαναδιαφοροποίηση ΚΕΠ πνεύμονα

ΚΕΠ εμπλουτίστηκαν από κύτταρα CMT167 και LLC με καλλιέργεια 10.000 κύτταρα /ml σε ορό -δωρεάν DMEM-F12 μέσο (Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA) που περιέχει 50 μg /ml ινσουλίνη (Sigma-Aldrich), 0.4% αλβουμίνη βόειου Κλάσμα V (Sigma-Aldrich), Ν-2 συμπλήρωμα Plus Media (R &? D Systems , Minneapolis, ΜΝ), Β-27 συμπλήρωμα (Gibco-Invitrogen), 20 μg /ml EGF (PeproTech) και 10 μg /ml bFGF (PeproTech) (μέσο CSC) σε εξαιρετικά χαμηλές φιάλες προσάρτησης (Corning, Corning, ΝΥ) να υποστηρίξει την ανάπτυξη μη διαφοροποιημένων ογκόσφαιρες. Ογκοσφαίρας καλλιέργειες επεκτάθηκαν με θρυψινοποίηση και μηχανική διάσπαση που ακολουθείται από επανα-επιμετάλλωση των αιωρημάτων απλού κυττάρου (10,000 κύτταρα /ml) σε φρέσκο ​​μέσο CSC. Ογκόσφαιρες συλλέχθηκαν για πειράματα μετά από 2 εβδομάδες σε μη προσκολλημένα καλλιέργεια. Στήλες, σημαίνει? Στήλες, σημαίνει? * P & lt? 0,05.