Αφηρημένο

δεακετυλάσης αναστολείς της ιστόνης μη-μικροκυτταρικού καρκίνου (HDACi) υπόσχονται θεραπευτικοί παράγοντες που χρησιμοποιούνται σήμερα σε συνδυασμό με χημειοθεραπευτικούς παράγοντες σε κλινικές δοκιμές για τη θεραπεία του καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων των μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC). Ωστόσο, οι μηχανισμοί που διέπουν τις δραστηριότητες κατά του όγκου τους παραμένουν ασαφείς. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι η αναστολή της HDAC6 προκαλεί βλάβη στο DNA και ευαισθητοποιεί τα μετασχηματισμένα κύτταρα σε παράγοντες κατά του όγκου όπως ετοποσίδη και δοξορουβικίνη. Εδώ, δείξαμε ότι η εξάντληση των HDAC6 σε δύο κυτταρικές σειρές NSCLC, Η292 και Α549, ευαισθητοποιημένα κύτταρα στη σισπλατίνη, ένα από τα πρώτης γραμμής χημειοθεραπευτικών παραγόντων χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία NSCLC. Προτείναμε ότι η εξάντληση των HDAC6 αυξημένη σισπλατίνη επαγόμενη κυτταροτοξικότητα οφειλόταν στην αύξηση της απόπτωσης μέσω ενεργοποίησης ATR /Chk1 οδό. Επιπλέον, δείξαμε ότι τα επίπεδα της πρωτεΐνης HDAC6 σχετίστηκαν θετικά με σισπλατίνη IC

50 σε 15 κυτταρικές σειρές NSCLC. Τέλος, η εξάντληση των HDAC6 σε ξενομοσχεύματα Η292 καθίσταται μειωμένο βάρος του όγκου και του όγκου και παρουσίασαν αυξημένη βασική απόπτωση σε σύγκριση με τους ελέγχους σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού. Εν ολίγοις, τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι HDAC6 συνδέεται θετικά με την αντίσταση στην σισπλατίνη σε NSCLC και αποκαλύπτουν HDAC6 ως πιθανό νέο θεραπευτικό στόχο για πυρίμαχα πλατίνα NSCLC

Παράθεση:. Wang L, Xiang S, Williams KA, Dong Η, Bai W, Λευκωσία SV, et al. (2012) Η εξάντληση των HDAC6 Ενισχύει την επαγόμενη από cisplatin βλάβες στο DNA και απόπτωση σε μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα. PLoS ONE 7 (9): e44265. doi: 10.1371 /journal.pone.0044265

Επιμέλεια: Γκύντερ Schneider, Τεχνικό Πανεπιστήμιο του Μονάχου, Γερμανία

Ελήφθη: 4 Μαΐου του 2012? Αποδεκτές: 31 Ιούλη του 2012? Δημοσιεύθηκε: 5 του Σεπτεμβρίου του 2012

Copyright: © Wang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε εν μέρει από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας στο πλαίσιο Βραβείο Αριθμός R01CA164147, New Investigator Grant (09KN-17) από τη Φλώριδα James και η Εσθήρ βασιλιάς Βιοϊατρικής Πρόγραμμα, το πιλοτικό επιχορήγηση Marsha Ίδρυμα Rivkin, καρκίνο των ωοθηκών Ταμείο Έρευνας (oCRF ), η επιχορήγηση εξέλιξη της σταδιοδρομίας από την H. Lee Moffitt Κέντρο Καρκίνου του πνεύμονα Καρκίνος SPORE να XZ και USF Μεταπτυχιακός Φοιτητής επιτυχία Διαφορετικότητα υποτροφία για να KAW. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή καρκίνο

πνεύμονα παραμένει η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο για τους άνδρες και τις γυναίκες στις Ηνωμένες Πολιτείες, διεκδικώντας περισσότερες ζωές κάθε χρόνο από τα επόμενα τρία αιτίες θανάτου από καρκίνο (καρκίνους του μαστού, του παχέος εντέρου και του προστάτη), σε συνδυασμό [1 ]. NSCLC αντιπροσωπεύει περισσότερο από το 80% όλων των καρκίνων του πνεύμονα. Τα ποσοστά επιβίωσης για τους ασθενείς με NSCLC παραμένουν εξαιρετικά χαμηλά, με μόνο το 16% των ασθενών ζωή πέντε χρόνια μετά τη διάγνωση του καρκίνου του πνεύμονα. Αν και αυτή η φτωχή πρόγνωση εξηγείται εν μέρει από το μεγάλο αριθμό των ασθενών που παρουσιάζουν με προχωρημένη νόσο, ακόμη και οι ασθενείς που προσδιορίζονται με εμπειρία σε πρώιμα στάδια υψηλά ποσοστά υποτροπής, παρά επαρκή χειρουργική εκτομή [2].

Αρκετές μεγάλες τυχαιοποιημένες μελέτες έδειξαν μέτριες βελτιώσεις σε μακροπρόθεσμη επιβίωση με ανοσοενισχυτικό σισπλατίνη χημειοθεραπεία με βάση [3] – [6]. Με βάση αυτές τις μελέτες, επικουρική χημειοθεραπεία έχει γίνει το πρότυπο της περίθαλψης για τους ασθενείς με σταδίου ΙΙ και ΙΙΙ NSCLC. Δεδομένου ότι ένας σχετικά μικρός πληθυσμός φαίνεται να ωφεληθούν από τη χημειοθεραπεία, πολλοί ασθενείς που υποβάλλονται σε θεραπεία τοξικών χωρίς κλινικό όφελος. Μια καλύτερη κατανόηση των μηχανισμών αντοχής σε πλατίνα χημειοθεραπεία με βάση απαιτείται και οι στρατηγικές που απαιτούνται για την αναγνώριση ασθενών απίθανο να ωφεληθούν από τη θεραπεία. Νέες μέθοδοι για την υπέρβαση αντίστασης πλατίνας μπορεί να στοχεύει σε αυτούς τους πληθυσμούς.

HDACs, μια κατηγορία ενζύμων που αφαιρούν ακετυλομάδες από ε-Ν-ακετυλο αμινοξύ λυσίνη σε ιστονών ή άλλων μη-ιστόνης πρωτεΐνες, παίζουν σημαντικούς ρόλους στην ανάπτυξη των κυττάρων, την απόπτωση, βλάβη του DNA, κ.λπ. Τα HDACs θηλαστικού χωρίζονται σε τέσσερις κατηγορίες: κατηγορία Ι (HDACs 1, 2, 3, και 8), κατηγορίας II (HDACs 4, 5, 6, 7, 9, και 10 ), κατηγορίας III (SIRTs 1, 2, 3, 4, 5, 6, και 7), και κλάσης IV (HDAC11) [7], [8]. HDACs κατηγορίας Ι εντοπίζεται κυρίως στον πυρήνα και βρίσκονται σε κατασταλτικά σύμπλοκα όπως Sin3, NuRD, CoREST, PRC2, Ν-ΟοΚ, και συμπλέγματα SMRT, η οποία deacetylate ιστόνες και άλλες πυρηνικές πρωτεΐνες. Οι HDACs Τάξης II χωρίζονται περαιτέρω σε ΙΙα και ΙΙβ υποκατηγορίες και αυτά τα μέλη εμφανίζουν ιστο-ειδική έκφραση. τα μέλη της κατηγορίας ΙΙΙ είναι Sir2 σχετίζονται NAD

+ – εξαρτώμενη απακετυλάσες. HDAC11 είναι το μόνο μέλος της οικογένειας κλάσης IV λόγω της χαμηλής ομοιότητα ακολουθίας του στην κατηγορία Ι και την κατηγορία των μελών II.

HDAC6 ανήκει στην κατηγορία ΙΙβ HDACs. Είναι κλωνοποιήθηκε ως ένα ομόλογο θηλαστικού του hda1 ζυμομύκητα από ποντικού και ανθρώπου, αντίστοιχα [9], [10]. Μοναδικά, HDAC6 περιέχει δύο λειτουργικά πεδία tandem δεακετυλάσης, που ονομάζονται DAC1 και DAC2, ή DD1 και DD2, καθώς και έναν τομέα ZNF-UBP το οποίο είναι ένα που περιέχει δάκτυλο ψευδαργύρου περιοχή που είναι ομόλογη με τη μη καταλυτική περιοχή πολλών ειδικών-ουβικιτίνης πρωτεασών (ΦΠΚΥ) [11]. HDAC6 ZNF-UBP τομέα είναι σε θέση να δεσμεύει μονο-, ή πολυ-ουβικιτίνης, καθώς ουβικουιτινωμένης πρωτεΐνες [11] – [13]. Τα υποστρώματα του HDAC6 περιλαμβάνουν κυτοσολικές πρωτεΐνες όπως α-τουμπουλίνης, hsp90, cortactin, κλπ [14] – [16]. HDAC6 ενεργεί επίσης σε ουβικιτίνη εξαρτώμενη autophagy επιτρέποντας την επεξεργασία ή την αποικοδόμηση των συσσωματωμάτων της πρωτεΐνης [17]. Επιπλέον, HDAC6 εμπλέκεται σε misfolded κύτταρο στρες που προκαλείται πρωτεΐνη [18]. HDAC6 θεωρείται πλέον ως κύριος ρυθμιστής της κυτταρικής απόκρισης με κυτταροτοξικά επιθέσεις [19]. Μια πρόσφατη έκθεση έδειξε ότι HDAC6 εμπλέκεται σε παράγοντες που προκαλούν βλάβη στο DNA που προκαλούνται γονοτοξικό στρες [20]. Ωστόσο, οι υποκείμενοι μηχανισμοί δεν είναι καθόλου σαφείς.

HDACs οι εκφράσεις μεταβληθεί σε πολλές μορφές καρκίνου. Για παράδειγμα, η υπερέκφραση του HDAC1, HDAC2, HDAC3, και HDAC6 έχει παρατηρηθεί σε κόλον, του μαστού, του προστάτη, του τραχήλου της μήτρας και γαστρικών καρκίνων [21] – [28]. Η αναστολή HDAC ένζυμα από τους αναστολείς HDAC έχει αναδειχθεί ως μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση για τη θεραπεία των καρκίνων [29] – [31]. HDAC αναστολείς μεταβάλλουν την κατάσταση ακετυλίωση της χρωματίνης και άλλες πρωτεΐνες μη-ιστόνης, έχοντας σαν αποτέλεσμα μεταβολές στη γονιδιακή έκφραση, επαγωγή της απόπτωσης, διακοπής της ανάπτυξης, και τερματικό κύτταρο διαφοροποίηση [31]. Ειδικότερα, οι αναστολείς HDAC υπόσχεται ανοσοενισχυτικό φάρμακα που χρησιμοποιούνται σε συνδυασμό με βάση την πλατίνα χημειοθεραπεία σε αρκετές καρκίνους συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του πνεύμονα [32].

Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε ότι HDAC6 προσδίδει αντίσταση σισπλατίνη σε κυτταρικές σειρές NSCLC. Εξόντωση HDAC6 ή αναστολή της δραστικότητας HDAC6 με HDAC6-ειδικός αναστολέας tubastatin Α σε NSCLC κυτταρικές γραμμές Α549 και Η292 ευαισθητοποιημένα των κυττάρων σε θεραπεία σισπλατίνη. Επιπλέον, μια θετική και σημαντική συσχέτιση μεταξύ του επιπέδου της πρωτεΐνης HDAC6 και IC

50 σισπλατίνη βρέθηκε σε 15 κυτταρικές γραμμές NSCLC. Επιπλέον, Η292 ξενομοσχεύματα με εξάντληση HDAC6 εμφανίζεται μικρότερο βάρος του όγκου και του όγκου, καθώς και η αυξημένη βασική απόπτωση σε σύγκριση με ξενομοσχεύματα έλεγχο. Συνολικά, τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι η ανάπτυξη των κλινικών σχετικών αναστολέων HDAC6-επιλεκτική θα είναι επωφελής για να χρησιμοποιηθεί σε συνδυασμό με θεραπεία με βάση την πλατίνα σε NSCLC.

Υλικά και Μέθοδοι

Χημικά και Αντιδραστήρια

Ένα διάλυμα 10 mM απόθεμα vorinostat (Σέλεκ χημικά) παρασκευάστηκε σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) και αραιώνεται ως απαιτείται συγκεντρώσεις στο μέσο καλλιέργειας κυττάρων. Tubastatin Α αγοράστηκε από BioVision. Ένα αποθεματικό διάλυμα 15 mM του tubastatin Α παρασκευάστηκε σε DMSO. Η σισπλατίνη και πακλιταξέλη αγοράστηκαν από την Sigma. Η σισπλατίνη παρασκευάστηκε ως ένα διάλυμα 50 mM στοκ σε διμεθυλοφορμαμίδιο (DMF) και paclitaxel ως διάλυμα αποθέματος 10 mM σε DMSO. Αντισώματα έναντι της φωσφορυλίωσης της ιστόνης H2AX (γH2AX) (20E3), φωσφορυλιωμένη ATR (Ser428) (# 2853), φωσφορυλιωμένη Chk1 (Ser296) (# 2349), φωσφορυλιωμένη p53 (Ser15) (16G8), Anti-ATR (# 2790), αντι-κασπάσης 3 (8G10), PARP-1 (# 9524S), και α-τουμπουλίνης (1Η10) αγοράστηκαν από την Cell Signaling Technology, ενώ αντι-ακετυλιωμένης τουμπουλίνης και αντι-β-ακτίνης ήταν από την Sigma. Anti-Chk1 (2G1D5), αντι-p53 (DO-1) και αντι-HDAC6 (H-300) αντισώματα αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology.

Γραμμές κυττάρων και την παραγωγή αγωνίζομαι και HDAC6 Νοκ ντάουν Η292 κυττάρων γραμμές

κυτταρικές σειρές NSCLC ADLC, Α549, EPLC, H23, Η292, Η358, Η441, Η460, Η522, H661, H820, H1650, H1975, H2122, H2172 και λήφθηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC ). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI 1640 με πενικιλίνη (100 U /ml), στρεπτομυκίνη (100 μg /ml) και 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS) και επωάστηκαν στους 37 ° C με 5% CO

2. Α549 knockdown HDAC6 (Α549-HD6KD) και ελέγχου (Α549-Sup) σταθερές κυτταρικές σειρές ευγενώς από το Δρ Tso-Pang Yao όπως περιγράφεται από Kawaguchi et al. [18]. Η292 σκαρφάλωμα και HDAC6 knockdown σταθερές κυτταρικές σειρές κλωνικά επιλεγεί από 0,5 μg /ml πουρομυκίνη. Κατ ‘αρχάς, Η292 κύτταρα παροδικά επιμολυσμένα με pRS φορέα ελέγχου ή φορέα shRNA έναντι HDAC6 (αναγνωρίζουν αλληλουχία 5-AGGTCTACTGTGGTCGTTACATCAATGGC-3’, ID σωλήνα: TI349960, ΟηΟεηε) (Cat # TR20003.). Είκοσι τέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα διαιρέθηκαν για να αναπαραγάγει πλάκες 1:20 σε μέσο ΚΡΜΙ1640 που περιείχε 0,5 μg /ml πουρομυκίνη. Πουρομυκίνη αναπληρώνονται κάθε 2 ημέρες για να διατηρηθεί επαρκές επίπεδο πίεσης επιλογής. Οι καλά απομονωμένες απλοί κλώνοι μεταφέρθηκαν σε τρυβλία 24 φρεατίων. Η knockdown επίδραση πιστοποιήθηκε με ανάλυση Western Blotting χρησιμοποιώντας αντισώματα αντι-HDAC6.

ΜΤΤ Δοκιμασίες

Η κυτταρική ανάπτυξη και η βιωσιμότητα αξιολογήθηκε με δοκιμασία ΜΤΤ. Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε εξάδα σε πλάκες επίπεδου πυθμένα φρεατίων 96 σε πυκνότητα 5 χ 10

3 κύτταρα /φρεάτιο. Τα φάρμακα προστέθηκαν στις αναφερόμενες συγκεντρώσεις 24 ώρες μετά την σπορά, ενώ όχημα προστέθηκε ως έλεγχος. Κατά τις υποδεικνυόμενες ημέρες, τα κύτταρα επωάστηκαν με 3- (4, 5-dimethylthiszol-x-υλ) -2, βρωμιούχο 5-diphenytetrazolium (ΜΤΤ) διάλυμα (Sigma) για 4 ώρες, στη συνέχεια συμπληρώνεται με 100 μΐ DMSO και αναταράσσεται για 15 λεπτά. Η απορρόφηση των καλλιεργειών σισπλατίνη εκτεθειμένων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο πολλαπλών φρεατίων στα 550 nm με μία αναφορά 630 nm. Τα αποτελέσματα παρουσιάστηκαν σαν ποσοστό απορρόφησης σε σχέση με καλλιέργειες ελέγχου του οχήματος.

Κύκλου Κυττάρου Ανάλυση

Η292 κύτταρα συλλέχθηκαν και απαλά επαναιωρήθηκαν σε εναιώρημα απλού κυττάρου σε κυττάρων ενεργοποιημένων με φθορισμό (FACS) ρυθμιστικό (PBS που περιέχει 2% FBS). Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS δύο φορές και σταθεροποιήθηκαν σε ψυχρή 70% όλη τη νύκτα αιθανόλη. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές με ψυχρό PBS και πάλι, επαναιωρήθηκαν σε 50 μΐ PBS συν 3.3 μΙ διαλύματος RNase Α (30 μg /ml) και επωάστηκαν για 30 λεπτά στους 4 ° C. Το εναιώρημα προστέθηκε με 450 μλ FACS ρυθμιστικό διάλυμα και 25 μΐ ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ, 1 mg /ml) που ακολουθείται από επώαση στους 4 ° C για 30 λεπτά. Τα κύτταρα στη συνέχεια αναλύθηκαν με FACS μηχανή αμέσως. Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με το λογισμικό FlowJo v8.3.3.

Ανάλυση ανοσοαποτύπωσης

ολόκληρου κυττάρου εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν με προσθήκη ρυθμιστικού RIPA (25 mM Tris-HCl ρΗ 7,6, 150 mM NaCl, 1% ΝΡ -40, 1% δεοξυχολικό νάτριο, 0.1% SDS, και αναστολέα πρωτεάσης κοκτέιλ). Η συγκέντρωση πρωτεΐνης όλων των δειγμάτων προσδιορίστηκε με αντιδραστήριο Bradford (Bio-Rad). Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν σε 8% ή 12% γέλες SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Οι μεμβράνες ανιχνεύθηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα και υπεροξειδάση (HRP) συζευγμένου δευτερεύοντα αντισώματα (GE Healthcare). Τέλος, οι κηλίδες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ανίχνευση χημοφωτισμού Kit (Pierce).

Comet Δοκιμασίες

Μετά την αγωγή σισπλατίνη, τα κύτταρα ελέγχου Η292-PRS ή HD6-KD ακτινοβολήθηκαν με 10 Gy γάμμα ακτινοβολίας προς εισαγάγει τυχαία μονής αλυσίδας. Βασικά, τα περισσότερα σταυροδεσμοί εισήγαγε σισπλατίνη, οι λιγότερες μονής αλυσίδας θα πρέπει να ανιχνεύεται σε ακτινοβολημένα κύτταρα. Οι κομήτη αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση ενός κιτ Δοκιμασία Comet OxiSelect ™ (Cell Biolabs, Inc.) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

ανοσοφθορισμού μικροσκοπία

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλάκες θαλάμου (Επιμελητήριο Slide System σχετικών εργαστηριακών TekII) πλύθηκαν με PBS και μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Η μονιμοποίηση διεκόπη με PBS που περιέχει 1% γλυκίνη. Τα κύτταρα διαπερατά χρησιμοποιώντας 1% γλυκίνη /0,5% Triton διάλυμα Χ-100 σε θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά. Μετά τον αποκλεισμό με 5% αλβουμίνη βόειου ορού (BSA) για 1 ώρα, τα κύτταρα επωάστηκαν σε PBS που περιέχει 0.2% Triton Χ-100, 1% BSA, και το αντίσωμα αντι-γH2AX (20E3) όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν με PBST (PBS που περιέχει 0.1% Tween) που ακολουθείται από επώαση με δευτερογενές αντίσωμα (σε PBS που περιέχει 1% BSA) για 45 λεπτά. Τέλος, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS που περιέχει 0.1% Tween και στη συνέχεια μόνο PBS. Τα πλακίδια ξηραίνονται και τοποθετείται με Vectashield® μέσο που περιέχει DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Συναρμολογήσεως

Αποικίας Δοκιμασία Σχηματισμού

Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε τριπλούν (1000 κύτταρα ανά 60 mm Tissue Culture πιάτο) και επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 37 ° C επιτρέποντας στα κύτταρα να προσκολληθούν στα πιάτα. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με έκδοχο ελέγχου ή σισπλατίνης για 8 ημέρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS, μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη για 15 λεπτά, και χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες (0.5% κρυσταλλικό ιώδες, 1% παραφορμαλδεΰδη και 20% μεθανόλη σε PBS) για 30 λεπτά. Οι αποικίες σε κάθε πλάκα μετρήθηκαν και η επιβίωση των κυττάρων μετά την σισπλατίνη θεραπεία εκφράστηκε ως ποσοστό του αριθμού των αποικιών που επιβιώνουν στις πλάκες ελέγχου.

Ανάπτυξη Όγκου

Όλες οι διαδικασίες με τα ποντίκια διεξήχθησαν κάτω από ένα πρωτόκολλο με τίτλο: ο ρόλος της HDAC6 σε Platinum Αντίσταση των μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα, που εγκρίθηκε από την Επιτροπή Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και Χρήση (IACUC) στον Τομέα της Έρευνας Ακεραιότητας και Συμμόρφωσης στο Πανεπιστήμιο της Νότιας Φλόριντα στις 19/10/2011 (πρωτόκολλο # R4064). Η 5- έως 6-εβδομάδων θηλυκούς αθυμικούς γυμνούς ποντικούς (Νυ /Νυ ποντικοί) που ζυγίζουν περίπου 20 γρ αγοράστηκαν από το National Cancer Institute (NCI). κύτταρα ελέγχου Η292-pRS (5 × 10

6 κύτταρα /100 μΙ σε RPMI 1640 συν 50% matrigel) εγχύθηκαν υποδορίως στην αριστερή πλευρά και την ίδια ποσότητα κυττάρων Η292-HD6KD εγχύθηκαν στο δεξί πλευρό. Οι όγκοι αφέθηκαν να αναπτυχθούν για έξι εβδομάδες. Τα μεγέθη των όγκων καταγράφηκαν κάθε εβδομάδα. Ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον τύπο V = (L χ W

2) × 0,5 (V = όγκος L = μήκος, W = πλάτος) [33]. Μέσο βάρος όγκου υπολογίστηκε επίσης μετά τη συγκομιδή τους όγκους.

ανοσοϊστοχημική χρώση

έλεγχος Η292 και HDAC6 knockdown ξενομοσχεύματα συλλέχθηκαν και σταθεροποιήθηκαν σε φορμαλίνη, κατόπιν δε εμβαπτίστηκαν σε παραφίνη και τεμαχίστηκαν. Ιστού μικροσυστοιχιών 12 ξενομοσχευμάτων του Η292-PRS και ζεύγη Η292-HD6KD παρασκευάζονται με Moffitt πυρήνα ιστολογία εγκατάσταση χρησιμοποιώντας Beecher Μέσο ιστού arrayer. Διαφάνειες βάφτηκαν χρησιμοποιώντας ένα Ventana Discovery ΧΤ αυτοματοποιημένο σύστημα (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή με ιδιόκτητο αντιδραστήρια. Εν συντομία, πλάκες αποπαραφινοποιήθηκαν στο αυτοματοποιημένο σύστημα με διάλυμα EZ Prep (Ventana). μέθοδος ανάκτησης αντιγόνου θερμότητας που προκαλείται χρησιμοποιήθηκε στο τηλέφωνο Ρύθμιση 1 (Ventana). Το πρωτογενές αντίσωμα κουνελιού που αντιδρά στην διασπασμένη κασπάση 3, (# 9661, Cell Signaling, Danvers, ΜΑ) ή Κί67 (# M3060, Άνοιξη Bioscience) χρησιμοποιήθηκε σε συγκέντρωση 1:400 ή 1:100 σε αραιωτικό αντισώματος Dako (Carpenteria, CA) και επωάζονται για 60 λεπτά. Το δευτερεύον αντίσωμα αντι-κουνελιού Ventana χρησιμοποιήθηκε για 16 λεπτά. Το σύστημα ανίχνευσης που χρησιμοποιήθηκε ήταν το κιτ Ventana OmniMap, και διαφάνειες στη συνέχεια με αιματοξυλίνη. Διαφάνειες ήταν τότε αφυδατωμένα και καλύφθηκαν σύμφωνα με τη συνήθη εργαστηριακό πρωτόκολλο.

μικροσυστοιχίες ιστών (TMA) διαφάνεια βάφονται κατά διασπασμένης κασπάσης 3 έχει υποστεί ψηφιακή σαρώνονται με τη χρήση της Aperio ™ (Vista, CA) ScanScope XT με 200x /0.75 NA αντικειμενικό φακό με ρυθμό 4 λεπτά ανά διαφάνεια μέσω Basler τρι-γραμμική συστοιχία. Η ανάλυση εικόνας πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ενός v9.0 ® αλγόριθμος βελτιστοποιηθεί Aperio PositivePixelCount με τις ακόλουθες βελτιστοποιημένη κατώφλια [HueValue = 0.1? HueWidth = 0.5? IWP (Υψηλή) = 220? IWP (Χαμηλή) /IP (Υψηλή) = 175? Ip (Χαμηλή) /Isp (Υψηλή) = 100? ISP (Χαμηλή) = 0? INP (Υψηλή) = -1] για το τμήμα θετική pixels διαφόρων εντάσεων. Το ποσοστό θετικότητας έχει ποσοτικοποιηθεί από τον αριθμό των κυττάρων που εμφανίζουν θετική χρώση ως ποσοστό του συνολικού αριθμού των κυττάρων του όγκου. Η ένταση χρώσης κατώφλι όπως parametertized πάνω σε αρνητικό (0), χαμηλή (1+), μέτρια (2+) και ισχυρό θετικό (3+) με μέση πυκνότητα λεκέ (0-255 δυναμικό εύρος) για κάθε πυρήνα TMA. Ο αλγόριθμος εκπαίδευσης που αναπτύχθηκε ήταν η ποιότητα ελέγχεται από έναν εν ενεργεία παθολόγος.

Στατιστική Ανάλυση

Όλες οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν σε τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέση τιμή ± SEM, και οι στατιστικές συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση μονόδρομης ANOVA που ακολουθείται από δοκιμή Dunnet. Ένα

σ

-τιμή & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. συντελεστής Spearman και

σ

-τιμή για τη συσχέτιση μεταξύ του επιπέδου HDAC6 και σισπλατίνη IC

50 υπολογίστηκαν από το λογισμικό της SAS.

Αποτελέσματα

HDAC6 συνδέεται με σισπλατίνη επαγόμενη κυτταροτοξικότητα σε NSCLC γραμμές κυττάρων

Για να χαρακτηρίσουμε το ρόλο του HDAC6 στην σισπλατίνη αντίσταση, ιδρύθηκαν δύο ζεύγη HDAC6 νοκ ντάουν κυτταρικές σειρές από Η292 και Α549 (Εικόνα 1Α και 1Δ). Κυτταροτοξικότητα της σισπλατίνης στον έλεγχο και ζεύγη HDAC6 νοκ ντάουν (Η292-PRS και Η292-HD6KD? Α549-Sup και Α549-HD6KD) μετρήθηκαν με προσδιορισμούς ΜΤΤ. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1 Β και 1 Ε, Α549 και Η292 κύτταρα εξαντλούνται από HDAC6 επέδειξε αυξημένη κυτταροτοξικότητα μετά από θεραπεία σισπλατίνης για 3 ημέρες, σε σύγκριση με αυτές των κυττάρων ελέγχου. Για να προσδιοριστεί η μακροπρόθεσμη επίδραση των HDAC6 knockdown στην επιβίωση των κυττάρων, πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς σχηματισμού αποικίας. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1 G και 1 Η, εξάντληση των HDAC6 μειώθηκαν σημαντικά τον αριθμό των αποικιών σε σχηματισμού Η292 κύτταρα κατά τη θεραπεία cisplatin. Είναι ενδιαφέρον, knockdown του HDAC6 δεν ενισχύει paclitaxel επαγόμενη κυτταροτοξικότητα σε Α549 και Η292 κύτταρα, υποδηλώνοντας ότι η αυξημένη ευαισθησία σε σισπλατίνη με εξάντληση της HDAC6 ήταν ειδική φαρμάκου (Σχήμα 1 C και 1 F). Να εξετάσει αν η εξάντληση των HDAC6 μπορεί εκ νέου να ευαισθητοποιήσει κύτταρα ανθεκτικά σισπλατίνη, κυτταρική σειρά C13, μια ανθεκτική σισπλατίνη κυτταρική σειρά καρκίνου των ωοθηκών προέρχεται από OV2008 [34], ήταν σταθερά επιμολυσμένα με τον έλεγχο ή HDAC6 shRNA για τη δημιουργία HDAC6 νοκ ντάουν κυτταρικές σειρές ελέγχου και διαχείρισης. Όπως φαίνεται στο Σχήμα S1, εξάντληση των HDAC6 σε κύτταρα C13 μείωσε δραματικά τη σισπλατίνη IC

50 σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. Προκειμένου να επεκτείνει τα ευρήματά μας, μετρήσαμε επίπεδο HDAC6 και σισπλατίνη IC

50 σε 15 κυτταρικές σειρές NSCLC. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 1Ι και S2, επίπεδο πρωτεΐνης HDAC6 συσχετίζεται θετικά με σισπλατίνη IC

50. Ο συντελεστής Spearman (0.64875) και

σ

-τιμή (0,0089) πρότεινε ότι αυτή η συσχέτιση ήταν στατιστικά σημαντική. Εμείς επόμενο ερώτημα αν η εξάντληση των HDAC6 σε μη μετασχηματισμένα κύτταρα θα μπορούσαν να ευαισθητοποιήσει κύτταρα σε σισπλατίνη. Όπως φαίνεται στο Σχήμα S3, σισπλατίνη IC

50 μειώθηκε σημαντικά σε HDAC6 knockout εμβρυϊκούς ινοβλάστες (ΠΜΑ) σε σύγκριση με ΠΜΑ άγριου τύπου. Συνολικά, τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι HDAC6 προσδίδει αντίσταση σισπλατίνη.

, Η292 κύτταρα επιμολύνθηκαν με σκαρφάλωμα shRNA ή shRNA έναντι HDAC6 να παράγουν Η292-PRS ή Η292-HD6KD σταθερός κλώνος, αντίστοιχα. έκφραση HDAC6 στον έλεγχο (Η292-PRS) ή HDAC6 νοκ ντάουν κύτταρα (Η292-HD6KD) ανιχνεύθηκε από αντι-HDAC6 κηλίδωση Western ανάλυση (άνω πάνελ). Αντι-β-ακτίνης στύπωση Western διεξήχθη για να εξασφαλιστεί η ίση φόρτωση πρωτεϊνών (κάτω πάνελ). Β, Knockdown της HDAC6 ευαισθητοποιημένων Η292 κύτταρα με σισπλατίνη θεραπεία. προσδιορισμοί ΜΤΤ πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση Η292-PRS ή κύτταρα Η292-HD6KD εκτέθηκαν σε έκδοχο ελέγχου (0 μΜ cisplatin) ή ενδεικνυόμενες συγκεντρώσεις σισπλατίνης για 3 ημέρες. C, εξόντωση HDAC6 δεν ευαισθητοποιήσει Η292 κύτταρα για τη θεραπεία πακλιταξέλη. προσδιορισμοί ΜΤΤ διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας κύτταρα επεξεργασμένα με έκδοχο ελέγχου (0 ηΜ paclitaxel) ή ενδεικνυόμενες συγκεντρώσεις πακλιταξέλης επί 3 ημέρες Η292-PRS ή Η292-HD6KD. D, HDAC6 ήταν αποτελεσματικά φτωχό σε κύτταρα Α549. έκφραση HDAC6 στον έλεγχο (Α549-Sup) ή HDAC6 νοκ ντάουν κύτταρα (Α549-HD6KD) ανιχνεύθηκε από αντι-HDAC6 κηλίδωση Western ανάλυση (άνω πάνελ). Η ανάλυση κηλιδώσεως Western αντι-β-ακτίνης Εκτελέστηκε επίσης να εξασφαλιστεί η ίση φόρτωση (κάτω πίνακας). Ε, εξόντωση HDAC6 ευαισθητοποιημένων Α549 κυττάρων σε θεραπεία σισπλατίνη. προσδιορισμοί ΜΤΤ διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας κύτταρα επεξεργασμένα με μάρτυρα φορέα ή ενδεικνυόμενες συγκεντρώσεις σισπλατίνης για 3 ημέρες Α549-Α549 Sup ή-HD6KD. F, εξόντωση HDAC6 δεν ευαισθητοποιήσει κύτταρα Α549 σε αγωγή με πακλιταξέλη. προσδιορισμοί ΜΤΤ διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας κύτταρα επεξεργασμένα με μάρτυρα φορέα ή ενδεικνυόμενες συγκεντρώσεις πακλιταξέλης επί 3 ημέρες Α549-Α549 Sup ή-HD6KD. G, δοκιμασίες σχηματισμού αποικίας πραγματοποιήθηκαν με Η292-PRS και Η292-HD6KD κυττάρων για 8 ημέρες με έκδοχο ελέγχου (0 μΜ cisplatin) ή ενδεικνυόμενες συγκεντρώσεις σισπλατίνης. Η, Τα ποσοτικά αποτελέσματα ελήφθησαν από τον υπολογισμό των αποικιών από Γ

Στήλες, σημαίνει από τρεις ή έξι αντίγραφα? μπαρ, SEM (*, Ρ & lt? 0,05? **, Ρ & lt? 0,01? ***, Ρ & lt? 0.001)

. Ι, τα επίπεδα HDAC6 θετικά συσχετίζονται με σισπλατίνη IC

50 σε ένα πάνελ κυτταρικών σειρών NSCLC. τα επίπεδα πρωτεΐνης HDAC6 ελήφθησαν με κηλίδωση Western αναλύσεις των 15 γραμμών NSCLC (ADLC, Α549, EPLC, H23, Η292, Η358, Η441, Η460, Η522, H661, H820, H1650, H1975, H2122 και H2172) και ποσοτικοποιούνται με Ποσότητα One λογισμικό. Η σισπλατίνη IC

50 υπολογίστηκε από προσδιορισμούς ΜΤΤ μετά τη θεραπεία αυτών των κυττάρων για 3 ημέρες. Η συσχέτιση μεταξύ του επιπέδου της πρωτεΐνης HDAC6 και σισπλατίνη IC

50 αναλύθηκε με το λογισμικό της SAS. Ένα οικόπεδο dot χρησιμοποιήθηκε για να τονίσει τη θετική συσχέτιση μεταξύ του επιπέδου HDAC6 και σισπλατίνη IC

50. συντελεστής Spearman ήταν 0,64875 και

σ

-τιμή ήταν 0,0089.

Η

Η εξάντληση των HDAC6 Αυξάνει Η σισπλατίνη απόπτωση

Για να προσδιορίσετε αν νοκ ντάουν της HDAC6 ενισχυμένη σισπλατίνη κυτταροτοξικότητα είναι οφείλεται σε κυτταρική απόπτωση, εξετάσαμε διάσπαση PARP1 σε Η292-pRS και ζεύγος Η292-HD6KD. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, που διασπάται PARP1 ανυψώθηκε σε κύτταρα Η292-HD6KD σε σύγκριση με εκείνη σε Η292-pRS κύτταρα μετά από 5 μΜ ή 10 μΜ θεραπεία cisplatin. Επιπλέον, όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Β, ο διασπασμένος μπάντα PARP1 εμφανίστηκαν νωρίτερα (ημέρα 1) σε κύτταρα Η292-HD6KD σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (ημέρα 2). Παρόμοια αποτελέσματα αποκτήθηκαν επίσης χρησιμοποιώντας HDAC6 άγριου τύπου και τα νοκ άουτ ΠΜΑ ζεύγος (Εικόνα S4) και Α549-Sup και ζεύγος Α549-HD6KD (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Για την επιβεβαίωση αποτελεσμάτων μας, κυτταρομετρία ροής ανάλυση χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση αποπτωτικών πληθυσμός σε κύτταρα που εκτίθενται σε σισπλατίνη. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Γ και 2Δ, ο πληθυσμός υπο-G1, το οποίο δείχνει αποπτωτικά κύτταρα [35], αυξήθηκε δραματικά σε κύτταρα Η292-HD6KD σύγκριση με Η292 PRS-κύτταρα που εκτέθηκαν σε 5 ή 10 μΜ cisplatin. Ως εκ τούτου, η εξάντληση του HDAC6 αυξημένη σισπλατίνη απόπτωση. Να εξετάσει αν η απόπτωση ήταν κασπάσης 3 εξαρτάται, ανιχνεύσαμε τα επίπεδα διασπαστεί κασπάσης 3 σε Η292-PRS ή κύτταρα Η292-HD6KD εκτίθενται σε σισπλατίνη. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Ε, τα επίπεδα της διασπασμένης κασπάσης 3 αυξήθηκαν σε κύτταρα HD6KD όταν εκτίθενται σε 1, 5 ή 10 μΜ σισπλατίνη, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. Συνολικά, τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι η εξάντληση των HDAC6 αυξάνει κασπάσης-εξαρτώμενη απόπτωση κατά την κατεργασία με σισπλατίνη σε κύτταρα NSCLC.

, Η292-PRS ή κύτταρα Η292-HD6KD υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με δεικνυόμενες συγκεντρώσεις σισπλατίνης για 24 ώρες. Anti-PARP1 και Δυτική αναλύσεις κηλίδωση αντι-β-ακτίνης πραγματοποιήθηκαν. Β, Η292-Η292 PRS και-HD6KD κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 μΜ cisplatin για τις υποδεικνυόμενες ημέρες. Anti-PARP1 και Δυτική αναλύσεις κηλίδωση αντι-β-ακτίνης πραγματοποιήθηκαν. C, πληθυσμός υπο-G1 προσδιορίστηκε σε Η292-PRS ή κύτταρα Η292-HD6KD αγωγή με φορέα (0 μΜ cisplatin) ή σισπλατίνη με ανάλυση FACS. CDDP αντιπροσωπεύει σισπλατίνη. D, ποσοτικοί παρουσίαση των ποσοστών sub-G1 φάση κύτταρα από C. Ε, Η292-PRS ή κύτταρα Η292-HD6KD υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ενδεικνυόμενη δοσολογία cisplatin, και αντι-διασπασμένη κασπάση 3 και αντι-β-ακτίνης Western αναλύσεις κηλίδωση ήταν εκτελείται.

η

Νοκ ντάουν της HDAC6 επιδεινώνει η σισπλατίνη που προκαλείται από βλάβη στο DNA

Για να διερευνήσει τις λειτουργίες του HDAC6 στην σισπλατίνη που προκαλείται από βλάβη στο DNA, Η292-pRS και Η292-HD6KD κύτταρα εξετάστηκαν από κομήτης δοκιμασία μόνο κύτταρο, ένα πρότυπο τεχνική για την αξιολόγηση της βλάβης του DNA. Μετά σισπλατίνη θεραπεία, και οι δύο κύτταρα εκτέθηκαν σε 10 Gy ιονίζουσας ακτινοβολίας να προκαλέσει τυχαία μόνο διαλείμματα σκέλος (που υποδεικνύεται από κομήτη ουρές). Η αποτελεσματικότητα της σισπλατίνης που προκαλείται από διασταυρούμενη σύνδεση φάνηκε από μείωση των κομήτη ουρές [36]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, άφησε δύο πάνελ, μετά παρατηρήθηκαν ακτινοβολία παρόμοια διακριτές κομήτες και στα δύο κύτταρα ελέγχου και HD6KD εκτίθενται σε έλεγχο του οχήματος. Ωστόσο, κατά την αγωγή σισπλατίνη, περισσότερο συντομευμένη ουρές παρατηρήθηκαν σε κύτταρα HD6KD σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Σχήμα 3Α, δεξιά δύο πίνακες), γεγονός που υποδηλώνει ότι η εξάντληση των HDAC6 ευαισθητοποιημένων Η292 κυττάρων σε σισπλατίνη που προκαλείται από βλάβη του DNA. Ποσοτική ανάλυση του κομήτη δοκιμασίας δείχνεται στο Σχήμα 3Β. Η σισπλατίνη μπορεί να τονώσει την φωσφορυλίωση Η2ΑΧ σε σερίνη 139 (γH2AX) των οποίων ο σχηματισμός εστιών μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανάλυση της βλάβης του DNA [37] – [39]. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιείται χρώση ανοσοφθορισμού για τον προσδιορισμό του σχηματισμού εστιών γH2AX. Μετά σισπλατίνη θεραπεία, πιο εστίες γH2AX ταυτοποιήθηκαν σε κύτταρα Η292-HD6KD σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Σχήμα 3C). Το εστίες στον πυρήνα κατηγοριοποιήθηκαν σε τρεις ομάδες: Εστίες & gt? 20, Εστίες = 1~20 και Εστίες = 0. Το ποσοστό των κυττάρων που εμπίπτουν στις ανωτέρω τρεις ομάδες είχαν προσδιοριστεί ποσοτικά. Όπως φαίνεται από το Σχήμα 3D, υψηλότερα ποσοστά της σισπλατίνης-κατεργασμένων κυττάρων HD6KD ανήκε στην Εστίες & gt? 20 ομάδα, σε σύγκριση με εκείνη των κυττάρων ελέγχου, γεγονός που υποδηλώνει ότι η εξάντληση των HDAC6 διεγείρεται σισπλατίνη που προκαλείται από βλάβη του DNA. Ομοίως, σε Α549-Sup και HD6KD ή C13-PRS και ζεύγη HD6KD, περισσότερο εστίες & gt? 20 ομάδα βρέθηκαν σε HDAC6 knockdown κυττάρων (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σταθερά, ανάλυση κηλίδος Western κατέδειξε ότι τα επίπεδα του γH2AX κατά 5 ή 10 μΜ θεραπείες σισπλατίνη ήταν υψηλότερα στα κύτταρα Η292-HD6KD σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου Η292-pRS (Σχήμα 3Ε). Επιπλέον, τα επίπεδα γH2AX ήταν υψηλότερα σε Η292 HDAC6 knockdown κυττάρων εκτέθηκαν σε 5 μΜ cisplatin για 1, 2 και 3 ημέρες σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Σχήμα 3F). Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν επίσης σε έλεγχο Α549 και Α549 HDAC6 νοκ ντάουν ζεύγος (Εικόνα S5). Είμαστε δίπλα χρησιμοποιούνται φαρμακολογικές αναστολείς όπως vorinostat (αναστολέας παν-HDAC) και tubastatin Α (αναστολέας HDAC6-επιλεκτική) για την επικύρωση ότι η καταστολή της δραστηριότητας HDAC6 αυξάνει σισπλατίνη που προκαλείται από βλάβη του DNA στα κύτταρα NSCLC. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 4Α και 4Β, συν-θεραπεία του vorinostat και σισπλατίνη αυξηθεί δραματικά τα επίπεδα της γH2AX σε Α549 ή Η292 κυττάρων σε σύγκριση με τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με σισπλατίνη ή vorinostat μόνο. Τα παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν επίσης σε Α549 και Η292 κύτταρα χρησιμοποιώντας tubastatin A για την αντικατάσταση vorinostat (Σχήμα 4C και 4D). Τόσο vorinostat και tubastain Α μπορεί να αυξήσει δραματικά τα επίπεδα των ακετυλιωμένων τουμπουλίνης, γεγονός που υποδηλώνει ότι η δραστηριότητα HDAC6 ήταν ουσιαστικά αναστέλλεται. Είναι ενδιαφέρον ότι, η απόπτωση ανιχνεύθηκε ως διασπασμένου PARP1 σε κύτταρα Η292 αγωγή με σισπλατίνη και vorinostat σε συνδυασμό ή σισπλατίνη και tubastatin Α σε συνδυασμό, αλλά όχι σε κύτταρα Α549 (Εικόνα 4). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι Η292 κύτταρα είναι πιο ευαίσθητα σε αυτά τα φάρμακα από ό, τι τα κύτταρα Α549. τα επίπεδα πρωτεΐνης HDAC6 δεν επηρεάστηκαν από φαρμακευτική αγωγή (Σχήμα 4). Μαζί, τα αποτελέσματα μας υποδηλώνουν ότι η αναστολή της δραστηριότητας HDAC6 ευαισθητοποιεί σισπλατίνη που προκαλείται από βλάβη του DNA.

Α, Η292-Η292 PRS ή-HD6KD κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με όχημα (0 μΜ cisplatin) ή σισπλατίνη για 24 ώρες, στη συνέχεια ακτινοβολούνται με 10 Gy ακτινοβολίας γάμμα για την εισαγωγή τυχαίων μονής αλυσίδας. Comet δοκιμασίες διεξήχθησαν όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. B, μη διασταυρωμένες DNA βαθμολογήθηκαν με υψηλής χωρητικότητας λογισμικού Πλευρές Σύστημα Ανάλυσης (HCSA) (Coats Associates, Inc.).

Στήλες, σημαίνει από 40 μεμονωμένα κύτταρα? μπαρ, SE (***, Ρ & lt? 0.001)

C, χρώση ανοσοφθορισμού των γH2AX εστιών σε Η292-PRS ή κύτταρα Η292-HD6KD αγωγή με όχημα (0 μΜ cisplatin) ή σισπλατίνη όπως υποδεικνύεται.. D, Ποσοτική εκπροσώπηση των γH2AX εστίες στην παραπάνω κύτταρα.

Στήλες, σημαίνει από 600 κύτταρα.

E, Η292-Η292 PRS και-HD6KD κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις σισπλατίνης για 24 ώρες, και αντι-γH2AX και αντι-β-ακτίνης Western αναλύσεις κηλίδωση ήταν τότε εκτελείται. F, Οι παραπάνω κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με όχημα ή 5 μΜ cisplatin για τις υποδεικνυόμενες ημέρες και αντι-γH2AX και αντι-β-ακτίνης Western αναλύσεις blotting πραγματοποιήθηκαν.

Η

, κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τον έλεγχο του οχήματος , σισπλατίνη μόνο, vorinostat μόνο, ή σισπλατίνη και vorinostat σε συνδυασμό για 24 ώρες, στη συνέχεια αντι-γH2AX, αντι-ακετυλιωμένης τουμπουλίνης, αντι-PARP1, αντι-HDAC6, και Western αναλύσεις κηλιδώσεως αντι-β-ακτίνης διεξήχθησαν. Β, Η292 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τον έλεγχο του οχήματος, σισπλατίνη μόνο, vorinostat μόνα ή σισπλατίνη και vorinostat σε συνδυασμό για 24 ώρες, στη συνέχεια αντι-γH2AX, αντι-ακετυλιωμένης τουμπουλίνης, αντι-PARP1, αντι-HDAC6, και αντι-β-ακτίνης Western κηλίδωση αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν. Το βέλος δείχνει την διασπασμένο μπάντα PARP1. C, τα κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τον έλεγχο του οχήματος, σισπλατίνη μόνο, tubastatin Α μόνη ή σισπλατίνη και tubastatin Α σε συνδυασμό για 24 ώρες, στη συνέχεια αντι-γH2AX, αντι-ακετυλιωμένης τουμπουλίνης, αντι-PARP1, αντι-HDAC6 και αντι-β-ακτίνης Western blotting αναλύσεις διεξήχθησαν. D, Η292 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τον έλεγχο του οχήματος, σισπλατίνη μόνο, tubastatin Α μόνη ή σισπλατίνη και tubastatin Α σε συνδυασμό για 24 ώρες, και αντι-γH2AX, αντι-ακετυλιωμένης τουμπουλίνης, αντι-PARP1, αντι-HDAC6 και αντι-β-ακτίνης Western blotting αναλύσεις διεξήχθησαν. Το βέλος δείχνει την διασπαστεί μπάντα PARP1.

Η

Νοκ ντάουν της HDAC6 Αυξάνει την φωσφορυλίωση του DNA Ζημιές Σηματοδοσίας Πρωτεΐνες Κατά Cisplatin Θεραπεία

Οι κυριότερες μοριακές αισθητήρες της βλάβης του DNA περιλαμβάνουν ΑΤΜ (αταξία τηλαγγειεκτασία μεταλλαγμένο) και ATR (αταξία τηλαγγειεκτασία και Rad3 σχετίζονται) [40], [41]. Σε απόκριση σε βλάβη του DNA, αυτές οι κινάσες θα προσλαμβάνει και να ενεργοποιούν άλλες πρωτεΐνες σηματοδότησης, όπως Chk1 και Chk2, προκαλώντας διακοπή του κυτταρικού κύκλου ή απόπτωση. Όλες αυτές οι κινάσες, ΑΤΜ, ATR, Chk1 και Chk2 μπορεί να φωσφορυλιώσει και να ενεργοποιήσει p53 που οδηγεί σε κύτταρα που υφίστανται απόπτωση μετά από βλάβη στο DNA. Για να προσδιορίσετε αν η μείωση HDAC6 θα μπορούσε να ενισχύσει βλάβες στο DNA σηματοδότησης μετά τη σισπλατίνη θεραπεία, οι βασικές πρωτεΐνες ελέγχθηκαν. Η292-PRS και Η292-HD6KD κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με όχημα (0 μΜ cisplatin) ή σισπλατίνη για 24 ώρες.