Αφηρημένο

πρότεινε Συσσωρευμένα δεδομένα ότι η λειτουργική έκφραση της Toll-όπως υποδοχείς (TLRs ) σε κύτταρα όγκου που εμπλέκονται στην πρόοδο του όγκου. προηγούμενη μελέτη μας έδειξε ότι TLR9 σηματοδότησης θα μπορούσε να ενισχύσει την εξέλιξη του όγκου των ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα in vitro και in vivo. Δείξαμε επίσης ότι το miR-574-5p ήταν η ως επί το πλείστον ρυθμίζονται miRNA σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα υπό TLR9 σηματοδότησης από ανάλυση της σειράς miRNA. Εδώ χαρακτηριζόμενη τον πιθανό ρόλο των miRNA-574-5p σε ενισχυμένη εξέλιξης του όγκου που προκαλείται από TLR9 σηματοδότησης στον ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα. Επιβεβαιώσαμε ότι TLR9 σηματοδότηση αυξημένα αποτελεσματικά την έκφραση του miR-574-5p σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Συγκεκριμένα, βρήκαμε ότι η ρύθμιση προς τα κάτω των miRNA-574-5p χρήση αναστολέα miR-574-5p in vitro ή miR-574-5p σφουγγάρι in vivo καταργηθεί σημαντικά την ενισχυμένη εξέλιξης του όγκου που προκαλείται από TLR9 σηματοδότησης. Περαιτέρω μελέτες έδειξαν ότι το miR-574-5p ήταν ένας σημαντικός παίκτης που συνδέεται με αυξημένη την εξέλιξη του όγκου των ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα. Αξίζει να σημειωθεί ότι, εντοπίσαμε το σημείο ελέγχου καταστολέα 1 (Ches1) ως κυρίαρχο άμεσο στόχο για miRNA-574-5p για την απόκτηση του TLR9 σηματοδότησης ενισχυμένη εξέλιξης του όγκου. Εμείς αποκάλυψε ότι η υπερ-έκφραση του Ches1 ανέστειλε σημαντικά την έναρξη του κυτταρικού κύκλου των ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα. Τέλος, αποκάλυψε ότι η έκφραση του miR-574-5p συσχετίστηκε θετικά με TLR9 και αντίστροφα συσχετίζεται με Ches1 σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα. Τα ευρήματά μας όχι μόνο διευκόλυνε την περαιτέρω κατανόηση της λογομαχία μεταξύ των miRNAs και TLRs στη βιολογία του όγκου, αλλά παρείχε επίσης νέες πιθανές υποψήφιες για τη θεραπεία του καρκίνου του

Παράθεση:. Li Q, Λι Χ, Guo Ζ, Xu F, Xia J, Liu Ζ, et al. (2012) microRNA-574-5p ήταν καθοριστική για TLR9 Σηματοδοσίας Βελτιωμένη εξέλιξη του όγκου μέσω ρύθμισης προς τα κάτω Checkpoint Καταστολή 1 στα Ανθρώπινα καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 7 (11): e48278. doi: 10.1371 /journal.pone.0048278

Συντάκτης: Dean G. Τανγκ, το Πανεπιστήμιο του Τέξας ΜΌ Anderson Κέντρο Καρκίνου, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 17 Ιουλίου του 2012? Αποδεκτές: 21 Σεπτέμβρη, 2012? Δημοσιεύθηκε: 2 Νοεμβρίου, 2012

Copyright: © 2012 Li et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από Ταμείο του Τμήματος Επιστήμης και Τεχνολογίας της Pudong Νέο Χώρο (PKJ2011-Υ33), Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (81.071.744), Shanghai Pudong Νέο Χώρο Ακαδημαϊκό Leader στο Σύστημα Υγείας (PWRd2010-01), πρόγραμμα βασικής έρευνας που υποστηρίζονται από το Σαγκάη Επιτροπή Επιστήμης και Τεχνολογίας (11JC1410900), και Qianjiang ταλέντο του έργου του Τμήματος Επιστήμης και Τεχνολογίας της επαρχίας Zhejiang (2010R10080). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η ανακάλυψη μιας σειράς έμφυτο ανοσοποιητικό-ειδικούς υποδοχείς που ενεργοποιούνται από μοριακά μοτίβα παθογόνο που σχετίζεται με οδήγησε σε μια νέα κατανόηση της έμφυτης μηχανισμών ανοσίας. Μεταξύ των έμφυτη υποδοχείς ανοσο-ειδική, η καλύτερα χαρακτηρισμένη είναι οι ΤοΙΙ υποδοχέων (TLRs), τα οποία αναγνωρίζουν μια ποικιλία μοριακών μοντέλων παθογόνο που σχετίζεται, εκφράζονται κυρίως στα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος και παίζουν σημαντικό ρόλο στην έμφυτη και προσαρμοστική ανοσία [ ,,,0],1] – [3]. Είναι ενδιαφέρον, ένα αυξανόμενο σώμα της βιβλιογραφίας έδειξε ότι λειτουργική TLRs επίσης εκφράζεται ευρέως σε μια ποικιλία καρκινικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων του μαστού, του εγκεφάλου, του στομάχου και του καρκίνου του πνεύμονα κύτταρα [4]. Συσσωρευμένα στοιχεία έδειξαν ότι TLRs αγωνιστής θα μπορούσε να προωθήσει την εισβολή και να ενισχύσει την μεταστατικό δυναμικό των καρκινικών κυττάρων, υποδεικνύοντας ότι η ενεργοποίηση των TLRs σηματοδότηση σε κύτταρα όγκου που εμπλέκονται στην εξέλιξη του όγκου [5] – [8]. προηγούμενη μελέτη μας έδειξε ότι τα CpG ολιγοδεοξυνουκλεοτίδια (CpG ODNs), η οποία ήταν υπό έρευνα σαν πρόσθετο στη θεραπεία έναντι λοιμώξεων και καρκίνων, θα μπορούσε να ενεργοποιήσει αποτελεσματικά το μονοπάτι σηματοδότησης TLR9 σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα και έτσι προώθησε την πρόοδον των όγκων τόσο in vitro όσο και in vivo [ ,,,0],3], [4], [9] – [11]. Δείξαμε επίσης ότι πάνω ρύθμιση εξαρτώμενης από κυκλίνη κινάσης 2 (CDK2) ήταν κρίσιμη για TLR9 σηματοδότηση να διεγείρει τον πολλαπλασιασμό και κυτταρικό κύκλο είσοδος των ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα [4]. Ωστόσο, οι ακριβείς μηχανισμοί για το πώς TLR9 σηματοδότησης είχε εμπλακεί στην εξέλιξη των όγκων του καρκίνου του πνεύμονα ανθρώπου ήταν ακόμα πολύ λιγότερο σαφής.

Τα microRNAs (miRNAs) έχουν αναδειχθεί ως μια σημαντική κατηγορία των ρυθμιστών της γονιδιακής έκφρασης, μετα-μεταγραφικά ρύθμιση του γονιδίου έκφραση μέσω ζευγαρώματος βάσης σε μερικώς συμπληρωματικές θέσεις για την πρόληψη της συσσώρευσης πρωτεϊνών από την καταστολή μετάφραση ή με την πρόκληση της υποβάθμισης του mRNA, που συνδέεται με τις περισσότερες βιολογικές λειτουργίες, όπως η βιολογία του όγκου [12], [13]. Συσσωρευμένα δεδομένα υποδηλώνουν ότι miRNAs ήταν αποτελεσματικά και τα νέα βιοδεικτών για τη διάγνωση του καρκίνου του πνεύμονα, την πρόβλεψη και τη θεραπεία [14], [15]. Εν τω μεταξύ, miRNAs επίσης ενοχοποιηθεί για τη ρύθμιση των βιολογικών επιδράσεων των TLRs σηματοδότησης [16] – [18]. Προκειμένου να διερευνηθεί ο πιθανός ρόλος των miRNAs στην αυξημένη προόδου των όγκων των ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα μετά από TLR9 αγωνιστή διέγερση, εκτελέσαμε miRNA δοκιμασία μικροσυστοιχίας για την ανίχνευση το προφίλ έκφρασης του miRNA σε 95d κύτταρα με ή χωρίς επεξεργασία του CpG ODNs, και βρήκαν ότι CpG ODNs διέγερση εναλλάσσονται το προφίλ έκφρασης των miRNAs στην 95δ κύτταρα και τη διαφορά σε εκφράσεις της 23ης miRNAs μεταξύ της ομάδας αντιμετωπίζονται CpG ODNs και χωρίς θεραπεία ομάδα ήταν τουλάχιστον δύο φορές, μεταξύ των οποίων miRNA-574-5p ήταν η ως επί το πλείστον ρυθμίζονται miRNA σε CpG ODNs διεγερμένα 95d κύτταρα σε σύγκριση με εκείνη την ομάδα άνευ αγωγής [19]. Ωστόσο, η πιθανή επίδραση των miRNA-574-5p σχετικά με την ενίσχυση της προόδου του όγκου που προκαλείται από TLR9 σηματοδότησης παραμένει να διευκρινιστεί.

Για να αντιμετωπιστεί αυτό το ζήτημα, εδώ χαρακτηρίζεται το αποτέλεσμα των miRNA-574-5p που ήταν up-ρυθμίζονται από TLR9 σηματοδότηση σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Βρήκαμε ότι miRNA-574-5p ήταν καθοριστική για TLR9 σηματοδότηση για την ενίσχυση της εξέλιξης του όγκου των ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα. Περαιτέρω μελέτες έδειξαν ότι οδοφράγματος του καταστολέα 1 (Ches1) ήταν ένα κυρίαρχο άμεσο στόχο για miRNA-574-5p να προσδώσει η TLR9 σηματοδότησης ενισχυμένη εξέλιξης του όγκου. Αυτά τα ευρήματα επεκταθεί προηγούμενες μελέτες και παρέχεται μία νέα αντίληψη της κατανόησης των miRNAs στην λειτουργική έκφραση του TLR9 σε καρκινικά κύτταρα.

Η

(Α) 95d κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 μg /ml CpG ODNs ή τον έλεγχο CpG ODNs για τον προκαθορισμένο χρόνο και ανιχνεύονται για τον πολλαπλασιασμό τους. (Β) Ομάδες οκτώ γυμνά ποντίκια προκλήθηκαν με 2 × 10

6 του 95d κυττάρων. Πέντε ημέρες αργότερα, ο όγκος που φέρει ποντικοί εγχύθηκαν in situ με 100 μα CpG ODNs σε διαστήματα 7 ημερών. Η ομάδα ελέγχου έλαβε ίση δόση του ελέγχου CpG ODNs ή ίσο όγκο του μέσου. Το μέγεθος του όγκου προσδιορίστηκε. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει το μέσο (± SD) από οκτώ γυμνοί ποντικοί σε κάθε ομάδα. (Γ) 95d κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με την υποδεικνυόμενη δόση CpG ODNs επί 72 ώρες και στη συνέχεια προσδιορίστηκαν για έκφραση των miR-574-5p. (D) 95d κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 μg /ml ODNs CpG για τον υποδεικνυόμενο χρόνο και προσδιορίστηκαν για έκφραση των miR-574-5p. (Ε) 95d κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 μg /ml CpG ODNs με την παρουσία της ενδεικνυόμενης δόσης χλωροκίνης για 72 ώρες και στη συνέχεια προσδιορίστηκαν για έκφραση των miR-574-5p. (F) 95d κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 μg /ml CpG ODNs με την παρουσία της ενδεικνυόμενης δόσης ανασταλτικό πεπτίδιο MyD88 (Pepinh-MyD88) ή το πεπτίδιο ελέγχου (Pepinh-Control) για 72 ώρες και στη συνέχεια προσδιορίστηκαν για έκφραση των miR -574-5p. Οι ράβδοι σφάλματος υποδεικνύεται τυπική απόκλιση των μετρήσεων εις τριπλούν από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Όλοι οι ασθενείς σε αυτή τη μελέτη είχαν δώσει τη γραπτή συγκατάθεση, και η ανθρώπινη μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Πανεπιστημίου Tongji (αριθμός άδειας: 20.090.128). Όλα τα πειράματα σε ζώα πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τον Οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των Ιατρικών Εργαστηρίων Ζώα και με την ηθική έγκριση της Σαγκάης Εργαστήριο Ιατρικής Φροντίδας Ζώων και Επιτροπής χρήσης, καθώς και την Επιτροπή Ηθικής του Πανεπιστημίου Tongji (αριθμός άδειας: 20.110.016).

(Α) 95d κύτταρα επιμολύνθηκαν με αναστολέα miR-574-5p για 48 ώρες και στη συνέχεια προσδιορίστηκαν για έκφραση των miR-574-5p. (Β) 95d κύτταρα επιμολύνθηκαν με αναστολέα miR-574-5p ή τον έλεγχο αντίστοιχα, και στη συνέχεια διεγέρθηκαν με 10 μg /ml CpG ODNs για τον υποδεικνυόμενο χρόνο. Οι ράβδοι σφάλματος υποδεικνύεται τυπική απόκλιση των τριπλών μετρήσεων σχηματίζουν τρία ανεξάρτητα πειράματα. (C) Ενισχυμένη δραστηριότητα του miR-574-5p-ρυθμιζόμενη δημοσιογράφος είχε επιτευχθεί με τη μόλυνση των κυττάρων 95d με το miR-574-5p σφουγγάρι. Ομάδες οκτώ γυμνών ποντικών (D και Ε) προκλήθηκαν με 2 × 10

6 του 95d κύτταρα τα οποία επιμολύνθηκαν σταθερώς με miR-574-5p φορέα σφουγγάρι ή τον φορέα ελέγχου. Πέντε ημέρες αργότερα, ο όγκος που φέρει ποντικοί εγχύθηκαν in situ με 100 μα CpG ODNs σε διαστήματα 7 ημερών. Το μέγεθος του όγκου και ο χρόνος επιβίωσης των ποντικών που φέρουν όγκο προσδιορίστηκαν. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει το μέσο (± SD) από οκτώ γυμνοί ποντικοί σε κάθε ομάδα. * P & lt?. 0.05

Η

Ασθενείς

Από τον Ιούνιο του 2009 έως τον Μάρτιο του 2012, συλλέξαμε δείγματα όγκων από ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα στην Ανατολική Νοσοκομείο, Σαγκάη της Κίνας. Η ομάδα μελέτης (n = 23) περιελάμβανε χημειοθεραπεία και ακτινοθεραπεία απλοϊκούς ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα. Αναθεώρηση των εκθέσεων παθολογίας επιβεβαίωσε την διάγνωση. Άτομα με αυτοάνοσες νόσους (π.χ. ρευματοειδής αρθρίτιδα, συστηματικός ερυθηματώδης λύκος), χρόνιες λοιμώξεις (π.χ. μόλυνση του ιού της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας, φυματίωση), συμμετοχή του μυελού των οστών, αντιπηκτικές και αντιθρομβωτικές φαρμάκου χρησιμοποιώντας, ή εκείνοι που είχαν λάβει ανοσοκατασταλτική θεραπεία εξαιρέθηκαν. Πληροφορίες αναφορικά με την κλινική παθολογικά χαρακτηριστικά των ασθενών ήταν συνοψίζονται στον Πίνακα 1.

(Α) 95d κύτταρα επιμολύνθηκαν με miR-574-5p μιμείται ή τον έλεγχο αντίστοιχα, και στη συνέχεια προσδιορίστηκαν για πολλαπλασιασμό τους κατά τον προκαθορισμένο χρόνο. (Β) 95d κύτταρα επιμολύνθηκαν με αναστολέα miR-574-5p ή τον έλεγχο αντίστοιχα, και στη συνέχεια προσδιορίστηκαν για πολλαπλασιασμό τους κατά τον προκαθορισμένο χρόνο. Οι ράβδοι σφάλματος υποδεικνύεται τυπική απόκλιση των τριπλών μετρήσεων σχηματίζουν τρία ανεξάρτητα πειράματα. (C-F) Ομάδες οκτώ γυμνά ποντίκια προκλήθηκαν με 2 × 10

6 του 95d κύτταρα τα οποία επιμολύνθηκαν σταθερώς με miR-574-5p φορέα έκφρασης ή miR-574-5p φορέα σφουγγάρι αντίστοιχα, και στη συνέχεια προσδιορίστηκαν για τους εξέλιξης του όγκου σε γυμνά ποντίκια κατά τον προκαθορισμένο χρόνο. Ο χρόνος επιβίωσης των ποντικών που φέρουν όγκο προσδιορίστηκε επίσης. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει το μέσο (± SD) από οκτώ γυμνοί ποντικοί σε κάθε ομάδα.

Η

Ποντίκια

Θηλυκά BALB /c γυμνά ποντίκια μεταξύ 6 και 8 εβδομάδων αγοράστηκαν από το κέντρο Πειραματικής Ζώα του Πανεπιστημίου Tongji. Όλοι οι ποντικοί στεγάσθηκαν σε άνευ παθογόνου αποικία ποντικού σε ίδρυμα μας.

(Α) 95d κύτταρα επιμολύνθηκαν με αναστολέα miR-574-5p για 48 ώρες και στη συνέχεια προσδιορίστηκαν για έκφραση τους των υποδεικνυόμενων γονιδίων χρησιμοποιώντας πραγματικό time PCR. (Β) 95d κύτταρα επιμολύνθηκαν με αναστολέα miR-574-5p για 48 ώρες και στη συνέχεια προσδιορίστηκαν για έκφραση τους Ches1 χρησιμοποιώντας κηλίδα western. Η σχετική ένταση του επιπέδου πρωτεΐνης Ches1 από τρία ανεξάρτητα πειράματα δείχθηκε. (Γ) 95d κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με miR-574-5p μιμείται και ένα λουσιφεράσης ανταποκριτή που περιέχει ‘UTR ή μεταλλαγμένης Ches1 3’ η ευρεία τύπος Ches1 3 UTR. (D) 95d κύτταρα trasnfected με φορέα έκφρασης Ches1 για 48 ώρες και στη συνέχεια προσδιορίστηκαν για έκφραση τους επίπεδο πρωτείνης Ches1. (Ε) 95d κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με miR-574-5p μιμείται και φορέα έκφρασης Ches1, και στη συνέχεια προσδιορίστηκαν για πολλαπλασιασμό τους. (F) Ομάδες οκτώ γυμνά ποντίκια προκλήθηκαν με 2 × 10

6 του 95d κύτταρα τα οποία επιμολύνθηκαν σταθερώς με miR-574-5p φορέα έκφρασης συν φορέας έκφρασης Ches1 ή τον έλεγχό του, και στη συνέχεια προσδιορίστηκαν για την εξέλιξη του όγκου τους κατά τη προκαθορισμένο χρόνο. (G) 95d κύτταρα επιμολύνθηκαν με φορέα έκφρασης Ches1, και στη συνέχεια διεγέρθηκαν με 10 μg /ml ODNs CpG για τον υποδεικνυόμενο χρόνο. (H) Ομάδες οκτώ γυμνά ποντίκια προκλήθηκαν με 2 × 10

6 του 95d κύτταρα τα οποία διαμολύνθηκαν σταθερά με φορέα έκφρασης Ches1 ή τον φορέα ελέγχου. Πέντε ημέρες αργότερα, ο όγκος που φέρει ποντικοί εγχύθηκαν in situ με 100 μα CpG ODNs σε διαστήματα 7 ημερών. Το μέγεθος του όγκου προσδιορίστηκε κατά τον προκαθορισμένο χρόνο. Κάθε μπάρα αντιπροσωπεύει το μέσο (± SD) από οκτώ άτριχων ποντικών σε κάθε ομάδα.

Η

Αντιδραστήρια και Κυτταρική Γραμμή

CpG ODN2216, τον έλεγχο CpG ODN, χλωροκίνη και το ανασταλτικό πεπτίδιο κατά MyD88 αγοράστηκαν από InvivoGen. MiR-574-5p μιμείται και ο αναστολέας miR-574-5p αγοράστηκαν από Ribobio (Guangzhou, Κίνα). κιτ ανίχνευσης απόπτωσης V-FITC Annexin αγοράστηκε από eBioscience. του κυτταρικού κύκλου κιτ προσδιορισμού φάση αγοράστηκε από την Cayman. Το κιτ nucleofector αγοράστηκε από Amaxa. Η ανθρώπινη κυτταρική σειρά καρκίνου του πνεύμονα 95d κύτταρα ελήφθησαν από την ATCC και διατηρήθηκαν στους 37 ° C υπό 5% CO

2 σε πλήρες RPMI 1640 (GIBCO) που περιέχει 10% θερμοαπενεργοποιημένο εμβρυϊκό βόειο ορό συμπληρωμένο με 2 mM γλουταμίνη, 100 IU /ml πενικιλλίνη και /ml θειική στρεπτομυκίνη 100 mg.

(Α) 95d κύτταρα επιμολύνθηκαν με φορέα έκφρασης Ches1 και προσδιορίστηκαν για πολλαπλασιασμό τους κατά τον προκαθορισμένο χρόνο. (Β) Ομάδες οκτώ γυμνά ποντίκια προκλήθηκαν με 2 × 10

6 του 95d κύτταρα τα οποία διαμολύνθηκαν σταθερά με φορέα έκφρασης Ches1 ή τον φορέα ελέγχου. Το μέγεθος του όγκου προσδιορίστηκε κατά τον προκαθορισμένο χρόνο. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει το μέσο (± SD) από οκτώ γυμνοί ποντικοί σε κάθε ομάδα. (Γ και Δ) 95d κύτταρα τα οποία διαμολύνθηκαν σταθερά με φορέα έκφρασης Ches1 πρώτα συγχρονίζονται στη φάση G0 αντικαθιστώντας το μέσο καλλιέργειας με μέσο ελεύθερο ορού για 24 ώρες, και ανιχνεύεται για απόπτωση τους χρησιμοποιώντας αννεξίνη V χρώσης και του κυτταρικού κύκλου με τη χρήση του κυτταρικού κύκλου κιτ προσδιορισμού φάση με κυτταρομετρία ροής. (Ε) 95d κύτταρα επιμολύνθηκαν με φορέα έκφρασης Ches1 και προσδιορίστηκαν για το επίπεδο της πρωτεΐνης CDK2 48 ώρες αργότερα. Οι ράβδοι σφάλματος υποδεικνύεται τυπική απόκλιση των τριπλών μετρήσεων από τρία ανεξάρτητα πειράματα * ρ & lt?.. 0.05

Η

ΜΤΤ Δοκιμασία

95δ κύτταρα σπάρθηκαν σε 3 χ 10

3 κύτταρα κάθε φρεάτιο και επωάζονται παρουσία ή απουσία του CpG ODN (10 μg /ml) σε πλάκες 96-φρεατίων για 72 ώρες. Εκτίμηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων μετρήθηκε με τη χρησιμοποίηση εμπορικώς ΜΤΤ κιτ κυτταρικού πολλαπλασιασμού (Cayman) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

(Α) Σχετική TLR9, miR-574-5p και έκφραση Ches1 προσδιορίστηκαν με πραγματικού χρόνου PCR σε 23 NSCLC δείγματα καρκίνου του πνεύμονα. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει τη σχετική αναλογία αυτών των γονιδίων σε καρκινικό ιστό έναντι παρακείμενο πνευμονικό ιστό. Οι ράβδοι σφάλματος υποδεικνύεται τυπική απόκλιση των τριπλών μετρήσεων σχηματίζουν τρία ανεξάρτητα πειράματα. (Β-D) Η συσχέτιση αναλύσεις μεταξύ της έκφρασης TLR9 και miR-574-5p, miR-574 και Ches1, καθώς και TLR9 και Ches1, διεξήχθησαν. Κάθε τελεία εκπροσωπούνται τα αποτελέσματα από έναν ασθενή.

Η

Real-time PCR

Η ποσοτική Real-time RT-PCR διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20]. Όλες οι εκκινητές και ανιχνευτές ελήφθησαν από την Applied Biosystems. Ολικό RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ. cDNA συνετέθη με το κιτ αντιδραστηρίου PrimeScript RT (Takara). Ποσοτική RT-PCR (qRT-PCR) αναλύσεις διεξήχθησαν για την ανίχνευση της έκφρασης mRNA χρησιμοποιώντας SYBR Πρόμιγμα Εχ Taq (Takara) και β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος. TaqMan μικρο-RNA δοκιμασίες (Applied Biosystems) χρησιμοποιήθηκαν για ποσοτικούς τα επίπεδα έκφρασης του ώριμου miR-574-5p, και U6 μικρού πυρηνικού RNA χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος.

Western Blotting

τα κύτταρα λύθηκαν με αντιδραστήριο εκχύλισης M-ανά πρωτεΐνη (Pierce) συμπληρωμένο με ένα κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης. Κυτταροπλασματικά και πυρηνικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας NE-PER Πυρηνικής και κυτταροπλασματικά Εκχύλιση Αντιδραστήρια (Pierce). Μετά από φυγοκέντρηση στα 13.000 g κάτω των 4 ° C για 15 λεπτά, τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν, και η συγκέντρωση πρωτεΐνης των εκχυλισμάτων μετρήθηκε με BCA Protein Assay (Pierce) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Είκοσι μικρογραμμάρια της πρωτεΐνης φορτώθηκαν σε 10% πήγματα SDS-πολυακρυλαμιδίου και μεταφέρθηκαν για 90 λεπτά στα 100 V επί μεμβρανών πολυβινυλιδενο φθορίδιο χρησιμοποιώντας ένα υγρό σύστημα μεταφοράς. Οι μεμβράνες πλύθηκαν σε 5% αποβουτυρωμένο γάλα σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό συν 0,05% Tween 20 (PBST) για 2 ώρες, προκειμένου να εμποδίσει μη ειδικές θέσεις δέσμευσης πρωτεΐνης επί της μεμβράνης. Ανοσοκηλίδωση διεξήχθη χρησιμοποιώντας μονοκλωνικά αντισώματα σε Ches1 και CDK2 (Sigma και Cell Signaling Technology) σε αραίωση 1:1000 σε άπαχο γάλα ρυθμιστικό Τρις. Η μεμβράνη στη συνέχεια πλύθηκε σε PBST, ανιχνεύθηκαν με ένα δευτερεύον αντίσωμα αντι-κουνελιού συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας (Amersham Life Sciences) σε αραίωση 1:5000, αναπτύχθηκε με τη χρήση ενός ECL Western Blotting Kit (Pierce), και εκτέθηκαν σε ακτίνες Χ φιλμ (Kodak)

Κατασκευή πλασμιδίου

Ρετροϊών μεσολάβηση υπερέκφραση ή η αναστολή της miR-miR-574-5p παρήχθη με βάση φορέα ρΜΧ (Invitrogen) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21]. – [ ,,,0],23]. Εν συντομία, το miR-574-5p φορέας έκφρασης κατασκευάστηκε με σύνδεση EcoRI /XhoI αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) με θραύσματα ρΜΧ-puro ρετροϊικό φορέα. Ρετροϊική miR-574-5p φορέα «σφουγγάρι» κατασκευάστηκε με απολίνωση των δύο αντίγραφα του miR-574-5p συμπληρωματικά ολιγονουκλεοτίδια και του φορέα ρΜΧ-puro. Αλληλουχία που κωδικοποιεί μεταλλαγμένη miR-574-5p κλωνοποιήθηκε στον ίδιο φορέα και να χρησιμοποιηθεί ως φορέας ελέγχου. Ιός που παράγεται και κύτταρα-στόχους μολύνθηκαν σύμφωνα με το εγχειρίδιο του χρήστη. Δημιουργία Ches1 πλήρους μήκους πλασμίδιο πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24].

Luciferase Reporter και μεταλλαξογένεση Δοκιμασία

Ο ρεπόρτερ λουσιφεράσης και προσδιορισμός μεταλλαξογένεσης διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20]. MiR-574-5p μιμείται ή ελέγχου της συν-επιμολύνθηκε σε κύτταρα 95d με ένα μόνο πλασμίδιο έκθεσης (pMIR-Έκθεση πλασμίδιο? Ambion) που περιέχει είτε την άγριου τύπου ή μεταλλαγμένη 3 ‘UTR του Ches1 που δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας QuickChange τοπο-κατευθυνόμενης Mutagenesis Kit (Stratagene). Μετά από 48 ώρες επιμόλυνσης, πυγολαμπίδας και δραστηριότητες λουσιφεράσης Renilla μετρήθηκαν με τη χρήση του συστήματος διπλής λουσιφεράσης δοκιμασία ανταποκριτή (Promega).

Αξιολόγηση της ανάπτυξης όγκου in vivo

Αξιολόγηση της ανάπτυξης του όγκου πραγματοποιήθηκε όπως που περιγράφηκε προηγουμένως με ελάσσονες τροποποιήσεις [3]. Εν συντομία, BALB /c ηυ /ηυ ποντίκια (ηλικίας 6-8 εβδομάδων) εγχύθηκαν υποδορίως με 0.2 ml ενός εναιωρήματος μεμονωμένων κυττάρων που περιέχει 2 × 10

6 καρκινικά κύτταρα και να διατηρούνται σε ντουλάπια στρωτής ροής κάτω από ειδικές συνθήκες άνευ παθογόνων . Οι όγκοι μετρήθηκαν κάθε 5 ημέρες μετά την πρόκληση όγκου χρησιμοποιώντας παχύμετρο. Οι όγκοι των όγκων προκύπτει από τον πολλαπλασιασμό του μετρούμενο μήκος από το πλάτος μετράται από την υπολογισμένη μέση τιμή αυτών των μετρούμενων τιμών και παρουσιάστηκαν ως μέση τιμή ± SEM.

Στατιστικές Αναλύσεις

στατιστικές αναλύσεις των δεδομένων ήταν πραγματοποιείται με τη βοήθεια των προγραμμάτων ανάλυσης στο λογισμικό SPSS12.0. Στατιστική αξιολόγηση διεξήχθη χρησιμοποιώντας αμφίδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA, ρ & lt? 0,05). Χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα PRISM 4.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA)

Αποτελέσματα

TLR9 σηματοδοσίας Up-ρυθμίζεται η έκφραση του miR-574-5p σε ανθρώπινο πνεύμονα καρκινικά κύτταρα

Εμείς επιβεβαίωσε για πρώτη φορά την αυξημένη εξέλιξης του όγκου του ανθρώπινου καρκίνου του πνεύμονα που προκαλείται από TLR9 σηματοδότησης, και διαπίστωσε ότι η θεραπεία CpG ODNs των 95δ κύτταρα σημαντικά ενισχυμένο πολλαπλασιασμό τους in vitro και την εξέλιξη του όγκου in vivo (Σχήμα 1Α και Β, ρ & lt? 0,05). Για να διαλευκανθεί ο πιθανός ρόλος του miR-574-5p στα αποτελέσματα του TLR9 σηματοδότησης στην εξέλιξη των ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα, εμείς επικυρωμένη προηγούμενη πλατφόρμα μικροσυστοιχιών μας και αξιολόγησε την έκφραση του miR-574-5p σε 95d κύτταρα με ή χωρίς CpG ODNs επεξεργασία σε πραγματικό χρόνο ανάλυση PCR. Εμείς αποκάλυψε ότι η έκφραση του miR-574-5p πράγματι σημαντικά αυξημένα σε 95d κυττάρων μετά κατεργασία CpG ODNs σε μια δόση και το χρόνο εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 1 C και D, ρ & lt? 0,05). Για την περαιτέρω επιβεβαίωση ότι ήταν TLR9 /MyD88 σηματοδότησης που παρέχει το up-ρυθμισμένη έκφραση του miR-574-5p, η TLR9 αναστολέας της σηματοδότησης χλωροκίνη και ανασταλτικό πεπτίδιο MyD88 εφαρμόστηκαν για να εμποδίσει σηματοδοτικό μονοπάτι τους. Βρήκαμε ότι τόσο χλωροκίνη και ανασταλτικό πεπτίδιο MyD88 μπορούσε να καταργήσει σημαντικά την αυξημένη έκφραση του miR-574-5p επάγεται από CpG ODNs σε 95d κύτταρα σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο (Εικόνα 1 Ε και F, ρ & lt? 0,05). Τα ευρήματά μας κατέδειξαν έντονα ότι TLR9 σηματοδότησης αποτελεσματικά αυξημένα την έκφραση του miR-574-5p σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα.

κάτω ρύθμιση του MiR-574-5p ακύρωσε την Enhanced εξέλιξης του όγκου Induced από TLR9 Σηματοδοσίας σε ανθρώπινο πνεύμονα καρκίνος

Για να διευκρινιστεί ο πιθανός ρόλος του miR-574-5p στην ενισχυμένη προόδου των όγκων του ανθρώπινου καρκίνου του πνεύμονα που προκαλείται από TLR9 σηματοδότηση, 95d κύτταρα επιμολύνθηκαν με miR-574-5p αναστολέα και στη συνέχεια διεγέρθηκαν με CpG ODN. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, βρήκαμε ότι η επιμόλυνση με αναστολέα miR-574-5p μείωσε αποτελεσματικά την έκφρασή τους σε κύτταρα 95d (ρ & lt? 0,05). Αξίζει να σημειωθεί ότι, δείξαμε ότι η επιμόλυνση με αναστολέα miR-574-5p ανέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων που επάγεται 95d με CpG ODNs (Σχήμα 2Β, ρ & lt? 0,5). Για την περαιτέρω επιβεβαίωση αυτού του φαινομένου in vivo, miR-574-5p σφουγγάρι κατασκευάστηκε για να ρυθμίζουν προς τα κάτω την έκφραση του miR-574-5p. Το επίπεδο της λειτουργικής knockdown του miR-574-5p προσδιορίστηκε με μία δοκιμασία ρεπόρτερ, στην οποία η προβλεπόμενη θέση miR-574-5p δεσμευτικών εισήχθη στον 3 ‘UTR ενός ανταποκριτή λουσιφεράσης. Βρήκαμε ότι η επιμόλυνση 95d κυττάρων με το miR-574-5p σφουγγάρι προκάλεσε σημαντική αύξηση στην δραστικότητα της λουσιφεράσης σε σχέση με το σφουγγάρι ελέγχου (Σχήμα 2C, ρ & lt? 0,05), υποδηλώνοντας ότι η αποτελεσματική αναστολή της miR-574-5p δραστικότητα επιτεύχθηκε. Έτσι, ομάδες γυμνών ποντικών προσβλήθηκαν με 95d κύτταρα τα οποία εκφράζονται σταθερά miR-574-5p σφουγγάρι, και στη συνέχεια διεγείρονται με CpG ODN. Αξίζει να σημειωθεί, δείξαμε ότι κάτω ρύθμιση των miR-574-5p σε 95d κύτταρα ανέστειλε σημαντικά ενισχυμένη εξέλιξη τους που προκαλείται από TLR9 σηματοδότησης in vivo (Σχήμα 2D, ρ & lt? 0,05). Σταθερά, βρήκαμε ότι τα κάτω ρύθμιση του miR-574-5p επίσης παρέτεινε σημαντικά τον χρόνο επιβίωσης του γυμνά ποντίκια με όγκους (Σχήμα 2Ε,

ρ

& lt? 0,05). Συνδυάζοντας αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι το miR-574-5p ανατεθεί η επίδραση της TLR9 σηματοδότησης για την εξέλιξη του όγκου των ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα.

MiR-574-5p Προώθησε την εξέλιξη του όγκου των ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα

για να χαρακτηριστεί ο μηχανισμός αποτελεί τη βάση τον κεντρικό ρόλο του miR-574-5p σε ενισχυμένη προόδου των όγκων που προκαλούνται από TLR9 σηματοδότηση, αξιολογήσαμε περαιτέρω το άμεσο αποτέλεσμα του miR-574-5p επί της ανάπτυξης 95d κυττάρων in vitro και in vivo. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, βρήκαμε ότι η υπερ-έκφραση του miR-574-5p σε 95d κυττάρων οδήγησε σε αυξημένες πολλαπλασιασμό τους in vitro (ρ & lt? 0,05). Σταθερά, μειωμένη έκφραση του miR-574-5p σε 95d κύτταρα εξασθενημένη τον πολλαπλασιασμό τους in vitro (Σχήμα 3Β, ρ & lt? 0,05). Για την περαιτέρω επιβεβαίωση αυτών των αποτελεσμάτων in vivo, γυμνά ποντίκια προκλήθηκαν με 95d κύτταρα τα οποία επιμολύνθηκαν σταθερώς με miR-574-5p φορέα έκφρασης ή miR-574-5p φορέα σφουγγάρι αντίστοιχα. Βρήκαμε ότι υπερ-εκφράζεται miR-574-5p ενίσχυσε σημαντικά την εξέλιξη του όγκου των 95d κυττάρων in vivo, συνοδεύεται από μειωμένο χρόνο επιβίωσης των ποντικών που φέρουν όγκο (Σχήμα 3C και D, ρ & lt? 0,05). Σταθερά, ρύθμιση προς τα κάτω του miR-574-5p σε 95d κύτταρα κατάργησε την ανάπτυξή τους in vivo και παρέτεινε το χρόνο επιβίωσης των ποντικών που φέρουν όγκο (Σχήμα 3Ε και F, ρ & lt? 0,05). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το miR-574-5p ήταν ένας σημαντικός παράγοντας που συνδέεται με αυξημένη την εξέλιξη του όγκου του καρκίνου του πνεύμονα ανθρώπου.

Ches1 ήταν ένα άμεσο στόχο για miR-574-5p να προωθήσει την εξέλιξη του όγκου των Ανθρωπίνων Καρκίνο του Πνεύμονα

για την περαιτέρω κατανόηση της επίδρασης του miR-574-5p για τη ρύθμιση της εξέλιξης του όγκου των ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα, είχαμε προβλέψει τους στόχους του miR-574-5p από προγράμματα πρόβλεψης συμπεριλαμβανομένων TargetScan και Miranda, και επιλέγονται 10 πιθανός στόχος, συμπεριλαμβανομένων CALCOCO1, RFX4, CD96, CHEX1, FOXI2, DGKG, ZNF589, ZDHHC14, CCDC88C, CLVS1 για ανάλυση PCR πραγματικού χρόνου. Βρήκαμε ότι η έκφραση του Ches1 παρουσίασαν εντυπωσιακά ανύψωση σε 95d κύτταρα επιμολυσμένα με αναστολέα miR-574-5p (Σχήμα 4Α, ρ & lt? 0,05). Για να επιβεβαιωθεί αυτό το αποτέλεσμα, πραγματοποιήσαμε Western Blot για την ανίχνευση της έκφρασης του Ches1 σε 95d κύτταρα επιμολυσμένα με αναστολέα miR-574-5p. Βρήκαμε ότι το επίπεδο της πρωτεΐνης Ches1 αυξήθηκε σημαντικά από την επιμόλυνση με αναστολέα miR-574-5p σε 95d κύτταρα (Σχήμα 4Β, ρ & lt? 0,05). Στη συνέχεια πραγματοποιείται μια λουσιφεράσης δοκιμασία ρεπόρτερ για να επικυρώσει τη δυνατότητα ρυθμιστικών σχέση. Ένα σημαντικά αρνητική επίδραση στην δραστικότητα λουσιφεράσης παρατηρήθηκε στο 3 ‘UTR του Ches1 παρουσία miR-574-5p, όπως καταστολή εξαφανίστηκε όταν η προβλεπόμενη θέση στόχο στην 3’ UTR του Ches1 μεταλλάχθηκε (Σχήμα 4C, ρ & lt? 0,05 ). Για την περαιτέρω ανίχνευση της δυνητικό ρόλο της Ches1 σε TLR9 σηματοδότησης αυξημένη ανάπτυξη του 95d κυττάρων, 95d κύτταρα επιμολύνθηκαν με φορέα έκφρασης Ches1 και στη συνέχεια διεγέρθηκαν με CpG ODN. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4D, βρήκαμε ότι μορφομετατροπή με φορέα έκφρασης Ches1 αυξήθηκε σημαντικά την έκφρασή τους σε κύτταρα 95d (ρ & lt? 0,05). Συγκεκριμένα, βρήκαμε ότι η επιμόλυνση του miR-574-5p μιμείται απέτυχε να ενισχύσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων τα οποία 95d συν-επιμολύνθηκαν με το φορέα έκφρασης Ches1 (Σχήμα 4Ε, ρ & lt? 0,05). Δείξαμε επίσης ότι μορφομετατροπή με φορέα έκφρασης Ches1 κατήργησε αποτελεσματικά τον όγκο αποτέλεσμα προαγωγής του miR-574-5p in vivo (Σχήμα 4F, ρ & lt? 0,05). Επιπλέον, αποκάλυψε ότι πάνω ρύθμιση του Ches1 ανέστειλε αποτελεσματικά το TLR9 σηματοδότησης ενισχυμένο πολλαπλασιασμό των 95d κυττάρων (Σχήμα 4G, ρ & lt? 0,05). Σταθερά, βρήκαμε ότι η υπερ-έκφραση του Ches1 σε 95d κύτταρα εξασθενημένη αποτελεσματικά ενισχυμένη εξέλιξης του όγκου τους που προκαλείται από TLR9 σηματοδότησης σε γυμνά ποντίκια (Εικόνα 4Η, ρ & lt? 0,05). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι Ches1 ήταν ένας καλόπιστος στόχος του miR-574-5p στη ρύθμιση TLR9 σηματοδότησης ενισχυμένη εξέλιξης του όγκου του ανθρώπινου καρκίνου του πνεύμονα.

Η υπερέκφραση του Ches1 Αναστολή κυτταρικού κύκλου Έναρξη των ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα

για να διευκρινιστεί ο πιθανός ρόλος του Ches1 στην εξέλιξη του όγκου των ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα, 95d κύτταρα σταθερώς επιμολυσμένα με φορέα έκφρασης Ches1 ανιχνεύθηκαν για τον πολλαπλασιασμό τους in vitro και την εξέλιξη σε γυμνούς ποντικούς ίη νίνο. Δείξαμε ότι η υπερ-έκφραση του Ches1 ανέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων 95d (Σχήμα 5Α, ρ & lt? 0,05). Σταθερά, βρήκαμε ότι η εξέλιξη του όγκου των 95d κύτταρα επιμολυσμένα με φορέα έκφρασης Ches1 ήταν δραματικά βελτιώνεται από την ομάδα ελέγχου (Σχήμα 5Β, σελ & lt? 0,05). Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι Ches1 ήταν ένας ανασταλτικός παράγοντας στην ανάπτυξη των ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα. Για τον περαιτέρω χαρακτηρισμό του υποκείμενου μηχανισμού, αναλύσαμε την πιθανή επίδραση του Ches1 στον κύκλο και την απόπτωση των κυττάρων των ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα. 95d κύτταρα σταθερά επιμολυσμένα με φορέα έκφρασης Ches1 ή τον φορέα ελέγχου πρώτα συγχρονίζονται στη φάση G0 αντικαθιστώντας το μέσο καλλιέργειας με μέσο άνευ ορού, και στη συνέχεια συνεχώς καλλιεργήθηκαν και συλλέχθηκαν μετά από 24 ώρες. Βρήκαμε ότι το ποσοστό απόπτωσης των 95d κύτταρα επιμολυσμένα με φορέα έκφρασης Ches1 ήταν χαμηλή και γενικά συγκρίσιμη με την ομάδα ελέγχου (Σχήμα 5C). Αντίθετα, το ποσοστό των 95d κύτταρα επιμολυσμένα με τον φορέα Ches1 expresson στο Go στάδιο /G1 ήταν σημαντικά υψηλότερη από εκείνες στην ομάδα ελέγχου (Σχήμα 5D, ρ & lt? 0,05). Εκτός αυτού, έχουμε αποκάλυψε επίσης τη μείωση της έκφρασης CDK2 σε 95d κυττάρων μετά από επιμόλυνση με Ches1 φορέα έκφρασης (Σχήμα 5Ε, ρ & lt? 0,05), η οποία θα μπορούσε εν μέρει να εξηγήσει τα αποτελέσματά μας και ήταν σύμφωνο με προηγούμενη μελέτη μας αποδεικνύουν ότι πάνω ρύθμιση της CDK2 ήταν κρίσιμη για TLR9 σηματοδότηση για να διεγείρει τον πολλαπλασιασμό και κυτταρικού κύκλου είσοδο των ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα [4].

Η έκφραση του miR-574-5p συσχετίσθηκε θετικά με TLR9 και αντίστροφα συσχετίζεται με Ches1 στην Κλινική καρκίνο του πνεύμονα ασθενείς

για να διερευνήσουν περαιτέρω το δυναμικό ρόλο του miR-574-5p στην επίδραση της TLR9 σηματοδότησης σε ασθενείς με ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα, που εντοπίστηκε η σχέση μεταξύ της έκφρασης του miR-574-5p και TLR9 σε ασθενείς κλινική NSCLC. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6Α, τα επίπεδα έκφρασης TLR9 και miR-574-5p ήταν υψηλότερα σε καρκινικό ιστό πνεύμονα σε σύγκριση με γειτονικό ιστό του όγκου από κλινικά δείγματα καρκίνου του πνεύμονα (ρ & lt? 0,05). Σε αντίθεση, η έκφραση του Ches1 ήταν σημαντικά χαμηλότερη στους ιστούς του όγκου σε σύγκριση με γειτονικούς ιστούς (Σχήμα 6Α, ρ & lt? 0,05). Είναι σημαντικό ότι, βρήκαμε ότι το επίπεδο έκφρασης της miR-574-5p συσχετίστηκε θετικά με την έκφραση του TLR9 σε κλινικές ιστούς όγκου (Σχήμα 6Β, ρ & lt? 0,05). Επιπλέον, αποκάλυψε ότι η έκφραση του miR-574-5p ήταν αντιστρόφως συσχετίζεται με το επίπεδο έκφρασης του Ches1 στους ιστούς του όγκου (Σχήμα 6C, ρ & lt? 0,05). Επιπλέον, η έκφραση του TLR9 επίσης αντίστροφα συσχετίζεται με το επίπεδο έκφρασης του Ches1 στους ιστούς του όγκου (Σχήμα 6D, ρ & lt? 0,05). Τα ευρήματα αυτά ήταν σύμφωνα με τις παραπάνω στοιχεία μας, η οποία κατέδειξε ότι Ches1 ήταν ένας στόχος κυριαρχούν για miR-574-5p για να προσδώσουν την ενισχυμένη εξέλιξης του όγκου που προκαλείται από TLR9 σηματοδότησης στον ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα.

Συζήτηση

τα τελευταία χρόνια, συσσωρεύοντας δεδομένα πρότειναν ότι TLRs ήταν λειτουργικά εκφράζεται σε καρκινικά κύτταρα και συμμετέχουν εις την πρόοδον των όγκων [4] – [8]. Έχουμε προηγουμένως αποδείξει ότι TLR9 σηματοδότησης θα μπορούσε να ενισχύσει την εξέλιξη του όγκου των ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα in vitro και in vivo [3], [4], [9] – [11]. Εδώ επεκτείναμε προηγούμενη μελέτη μας, αποδεικνύοντας ότι πάνω ρύθμιση του miR-574-5p συνεισέφερε την ενισχυμένη προόδου του όγκου που επάγεται από TLR9 σηματοδότηση σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Τα ευρήματά μας πρότεινε ότι το miR-574-5p ήταν ένας σημαντικός παίκτης στην TLR9 σηματοδότηση και τη βιολογία του όγκου.

Στην παρούσα μελέτη, διαπιστώσαμε ότι TLR9 σηματοδότησης σημαντικά αυξημένα την έκφραση του miR-574-5p στην 95δ κύτταρα, τα οποία ήταν σύμφωνο με προηγούμενη μελέτη μας [19]. Για την αντιμετώπιση του δυνητικού ρόλου του miR-574-5p σε TLR9 σηματοδότηση ενισχυμένη εξέλιξη των ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα, αξιολογήσαμε την επίδραση της προς τα κάτω ρύθμιση miR-574-5p επί TLR9 σηματοδότησης ενισχυμένη εξέλιξης της 95d κυττάρων και ανακάλυψαν ότι κάτω ρύθμιση του miR-574-5p θα μπορούσε προφανώς να μειώσει την πρόοδο της 95d κυττάρων in vitro και in vivo. Τα δεδομένα μας πρότειναν ότι εγγενείς miR-574-5p μπορούσε να συμβάλει στην πρόοδο της ανθρώπινης κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα. Πράγματι, οι διαδοχικές μελέτη μας έδειξε ότι miR-574-5p θα μπορούσε να προωθήσει την εξέλιξη ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων πνεύμονα, υποδεικνύοντας ότι παρατεταμένη έκφραση του miR-574-5p ήταν καθοριστική για την εξέλιξη των ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα.