Οι

Αφηρημένο

Το νικοτινικό υπομονάδες υποδοχέα της ακετυλοχολίνης (nAChR) που σχετίζονται με διάφορες πτυχές της συμπεριφοράς του καπνίσματος, καθώς και με διαταραχές που σχετίζονται με το κάπνισμα. Αρκετές από αυτές τις υπομονάδες έχουν βρεθεί να ρυθμίζεται προς τα πάνω σε καπνιστές ή εκφράζονται διαφορικά σε πνευμονικά κύτταρα όγκου. Οι μηχανισμοί πίσω από αυτές τις παρατηρήσεις δεν είναι γνωστές, αλλά θεωρείται ότι είναι κυρίως μετα-μεταγραφικό. Πολλές μετα-μεταγραφικούς μηχανισμούς ξεκίνησε από λειτουργικά σχετικές μοτίβα αλληλουχίας εντός αμετάφραστες περιοχές του γονιδίου, όπως ανάντη ανοικτά πλαίσια ανάγνωσης (uORFs). Πραγματοποιήσαμε μια συστηματική αναζήτηση σε όλους τους καπνιστές που σχετίζεται με νευρωνική nAChR υπομονάδων και εντόπισε λειτουργικά σχετικές uORFs στο

CHRNA4

και

CHRNA5

. Λουσιφεράσης πειράματα έδειξαν ότι αυτές οι uORFs είναι σε θέση να μειώσει σημαντικά την έκφραση της πρωτεΐνης. ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR μας (qPCR) τα αποτελέσματα υποδηλώνουν σαφώς ότι τα παρατηρούμενα αποτελέσματα προέρχονται από τη μετάφραση και όχι στο επίπεδο της μεταγραφής. Είναι ενδιαφέρον ότι η

CHRNA4

uORF ήταν μόνο λειτουργικά σχετικές όταν εκφράζεται σε βραχύτερο ισομορφή αυτού του γονιδίου. Ως εκ τούτου, τα στοιχεία που παρουσιάζονται στην παρούσα μελέτη δείχνει έντονα προς την κατεύθυνση σημαντικό ρόλο της uORFs εντός του 5’UTR του

CHRNA4

-isoform 1 και

CHRNA5

ως ρυθμιστές της μετάφρασης πρωτεϊνών. Επιπλέον, η κοινή uORF του

CHRNA4

-isoform 1 /ισομορφή 2 αποτελεί το πρώτο παράδειγμα μιας ακολουθίας μεταβλητής uORF

Παράθεση:. Eggert Μ, Aichinger Ε, Pfaffl MW, δίεΐηΐεϊη OK , PFOB Μ (2013) νικοτινικό υποδοχέα ακετυλχολίνης υπομονάδες α4 και α5 Συνεργαζόμενος με τη συμπεριφορά καπνίσματος και του καρκίνου του πνεύμονα ρυθμίζονται από Upstream Open Reading Frames. PLoS ONE 8 (7): e66157. doi: 10.1371 /journal.pone.0066157

Επιμέλεια: Huibert Δ Mansvelder, Neuroscience Campus Άμστερνταμ, το Πανεπιστήμιο VU, Ολλανδία

Ελήφθη: 12, Μαρτίου, 2013? Αποδεκτές: 2η Μαΐου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 2 Ιούλη, 2013

Copyright: © 2013 Eggert et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από την Deutsche Forschungsgemeinschaft [STE16511-2] και το Friedrich-Baur-Stiftung [No 57/12]. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

το κάπνισμα είναι γνωστό ως ένας σημαντικός παράγοντας κινδύνου για καρδιαγγειακή νόσο και το κάπνισμα σχετίζεται με κακοήθειες, όπως καρκίνο του πνεύμονα [1]. Ωστόσο, περίπου κάθε τρίτο των ενηλίκων σε όλο τον κόσμο καπνίζει και ο αριθμός αυξάνεται [2]. Ως εκ τούτου, δεν προκαλεί έκπληξη το ότι οι μεγάλες προσπάθειες που έχουν καταβληθεί για να αποκαλύψει τα αίτια της εξάρτησης από τη νικοτίνη, καθώς και για την ανάπτυξη νέων στρατηγικών για την πρόληψη και τη θεραπεία. Η νικοτίνη δρα ως ένας αγωνιστής της ακετυλοχολίνης που είναι σε θέση να δεσμεύονται σε νευρωνικούς νικοτινικούς υποδοχείς ακετυλοχολίνης (nAChR). Η nAChR σχηματίζουν ετερογενή και ομογενή διαύλους ιόντων πενταμερή με ποικίλο πρότυπο έκφρασης σε νευρωνικά και μη-νευρωνικών ιστών [3]. Κατά συνέπεια, πολλά από τα γονίδια που κωδικοποιούν για nAChR υπομονάδων είναι ύποπτοι για να διαδραματίσει καίριο ρόλο όσον αφορά την εξάρτηση από τη νικοτίνη. Αρκετά γονίδια υπομονάδα του nAChR έχουν ήδη συνδεθεί με το κάπνισμα και ασθένειες σχετίζονται με το κάπνισμα. Για παράδειγμα,

CHRNA7

, η κωδικοποιητική το α7 nAChR υπομονάδων γονίδιο δείχθηκε να καταστέλλει αεραγωγού βασικοκυτταρικό τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την ανάπλαση του επιθηλίου των πνευμόνων. Επιπλέον, η υπόθεση προέκυψε ότι απορυθμισμένη έκφραση α7 δημιουργεί προνεοπλασματικές μετασχηματισμούς [4], [5]. Γενετικές παραλλαγές εντός της περιοχής κωδικοποίησης, αλλά και στην περιοχή του προαγωγέα του

CHRNA4

σχετίζονται τόσο με υποκειμενικές αποκρίσεις στο κάπνισμα και τα αποτελέσματα διακοπή του καπνίσματος [6] – [10]. Ωστόσο, οι περισσότερες μελέτες που έχουν δημοσιευτεί σχετικά με το θέμα των χολινεργικών υποδοχέων και εξάρτηση από τη νικοτίνη /ασθένειες που συνδέονται με το κάπνισμα δείχνουν προς το σύμπλεγμα γονιδίων nAChR στο χρωμόσωμα 15. Οι πολυμορφισμοί εντός αυτής της περιοχής που αναφέρονται πιο σταθερά να σχετίζεται με την ποσότητα του καπνίσματος, εξάρτηση από τη νικοτίνη , καρκίνο του πνεύμονα και περιφερική αρτηριοπάθεια βρίσκονται είτε στο

CHRNA5

ή

CHRNA3

γονίδιο [11] – [16]. Επιπλέον, οι ενώσεις μεταξύ των

CHRNB3

πολυμορφισμούς και την αντιμετώπιση της χρήσης του καπνού πρώτη φορά περιγράφηκαν [17].

Οι μηχανισμοί με τους οποίους τα γονίδια nAChR που σχετίζονται με την εξάρτηση από τη νικοτίνη ρυθμίζονται δεν είναι γνωστά με λεπτομέρεια μέχρι στιγμής . Σε γενικές γραμμές, η έκφραση του γονιδίου μπορεί να τροποποιηθεί είτε πριν είτε μετα-μεταγραφικά. Οι τελευταίοι μηχανισμοί συχνά διαμεσολαβείται από μοτίβα ακολουθία cis-δράσης εντοπίζεται εντός των αμετάφραστες περιοχές (UTR) που υπάρχουν ανάντη και κατάντη των πιο κωδικοποίησης γονιδίου περιοχές ευκαρυωτικών. Αρκετές μοτίβα στο 5’UTR υπεύθυνη για μεταφραστική ρύθμιση έχουν ταυτοποιηθεί σε ευκαρυωτικά γονίδια όπως εσωτερικών θέσεων εισόδου ριβοσώματος, στοιχεία απόκρισης σιδήρου και ανάντη ανοικτά πλαίσια ανάγνωσης (uORFs). Τα τελευταία αυτά στοιχεία μπορούν να διαδραματίσουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης. Ένα αυξανόμενο σώμα της στοιχεία δείχνουν ότι uORFs είναι σε θέση να επηρεάσει τη μετάφραση πρωτεϊνών με διάφορους τρόπους. ριβοσώματα σάρωση μετάφραση ενός uORF μπορεί να μην είναι σε θέση να ξαναρχίσει περαιτέρω κατάντη της περιοχής κωδικοποίησης ATG, ή θα μπορούσε να καθυστερήσει στο uORF, μπλοκάροντας άλλα ριβοσώματα (ριβοσωμική οδόφραγμα). Εναλλακτικά, το κωδικόνιο λήξης της uORF θα μπορούσε να εκλάβει ως μετάλλαξη ανοησία, προκαλώντας ανοησίες μεσολάβηση φθορά. [18], [19]. Επιπλέον, η ίδια η πρωτεΐνη θα μπορούσε να uORF ρυθμίζουν τη μετάφραση, όπως υποδεικνύεται από τα πειράματα μεταλλαξογένεσης εισαγωγή παρερμηνεύσιμη μετάλλαξη εντός uORF αλληλουχιών [20]. Όλοι αυτοί οι μηχανισμοί είναι πιθανό να αυξήσει τη λειτουργική ποικιλομορφία των γονιδίων εντός των πληθυσμών. Η λειτουργική σημασία της uORFs τονίζεται περαιτέρω από το εύρημα ότι οι μεταλλάξεις στο εσωτερικό τους είναι σε θέση να προκαλέσουν ανθρώπινες ασθένειες όπως η κληρονομική θρομβοκυττάρωση ή Marie Unna απώλεια κληρονομικών μαλλιά [21], [22].

Στην παρούσα μελέτη πραγματοποιήθηκε μια συστηματική έρευνα για λειτουργικά σχετικές uORFs σε nAChR υπομονάδων που υπάρχουν υπόνοιες ότι εμπλέκονται σε εξάρτηση από τη νικοτίνη και ασθένειες σχετιζόμενες με το κάπνισμα. Τα πειράματά μας αποκάλυψαν ότι ορισμένες uORFs συμβάλλουν στην ρύθμιση της έκφρασης της πρωτεΐνης nAChR.

Υλικά και Μέθοδοι

Στο silico

ανάλυση των θεωρούμενων uORFs στο 5’UTR της α3, α4, α5, α7, και SS3 nAChR υπομονάδων

5’UTRs του

CHRNA3, CHRNA4

ισομορφή 1 και 2,

CHRNA5, CHRNA7

και

CHRNB3

(κωδικοποιούν για nAChR υπομονάδων α3, α4, α5, α7 και SS3) εξετάστηκαν για την έναρξη σε πλαίσιο και να σταματήσει κωδικόνια ανάντη της κύριας κωδικονίου έναρξης με την StarORF Finder (https://star.mit.edu/orf/runapp .html). SNPs επικυρωθεί από SNP άποψη γονίδιο της NCBI και βρίσκονται εντός της αλληλουχίας uORF ή τη δημιουργία /διαγραφή ενός uORF ελήφθησαν υπόψη για την έρευνα (Εικ. 1).

«UTRs νικοτίνης εξάρτηση σχετίζεται γονίδια υπομονάδα του nAChR με υποθετικό uORFs. Η θέση της BP για κάθε uORF (start /stop) απεικονίζεται ξεκινώντας από τον κεντρικό κωδικόνιο έναρξης στο 5′-κατεύθυνση.

CHRNA4

ισομορφή 1 και 2 ισομορφή διαφέρουν στην περιοχή κωδικοποίησης τους, με περαιτέρω προς τα κάτω έναρξης μετάφρασης για ισομορφή 2, που επιμηκύνεται 5’UTR του.

CHRNA4

ισομορφή 2 δεν είχε δημοσιευθεί μέχρι το 2012 και δεν έχει λειτουργικά αναλυθεί πριν. Πλατείες, uORFs? βέλη, SNPs

Η

πλασμίδιο κατασκευή

Firefly φορέα λουσιφεράσης pGL4.10 (AY738222.1) και λουσιφεράσης Renilla φορέα pGL4.74 (AY738230.1) αγοράστηκαν από την Promega (Mannheim, Γερμανία). Η αλληλουχία ΤΚ-Promoter αποκόπηκε από pGL4.74 με ΚρηΙ και XhoI (Fermentas, St. Leon-Rot, Γερμανία) μετά από τη δημιουργία μίας θέσης περιορισμού XhoI στη θέση bp 783 χρησιμοποιώντας geneart τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση σύστημα (Invitrogen, Καρλσρούη, Γερμανία ). Μετά ΚρηΙ και XhoI πέψη του pGL4.10, η αλληλουχία ΤΚ-Promoter συνδέθηκε μέσα στην θέση πολλαπλής κλωνοποίησης του pGL4.10 ανάντη της αλληλουχίας που κωδικοποιεί λουσιφεράση πυγολαμπίδας. Τα 5’UTR ένθετα του nAchR υπομονάδες α4 ισομορφή 1 και 2, α5 και SS3 συντέθηκαν (MWG Eurofins, Ebersberg, Germany) και κλωνοποιήθηκε σε pGL4.10 με XhoI και NcoI (Fermentas, St. Leon-Rot, Γερμανία) άμεσα μεταξύ της ΤΚ-υποκινητή και της αλληλουχίας κωδικοποίησης λουσιφεράσης πυγολαμπίδας. Μετά την κλωνοποίηση των ενθέσεων επιβεβαιώθηκε με αλληλούχιση. Για να δημιουργήσετε κατασκευάσματα που στερούνται ένα ορισμένο uORF, το ATG του uORF μεταλλάχθηκε σε TTG. Ομοίως, τα αλληλόμορφα του SNP στο uORFs ανταλλάχθηκαν με τοπο-κατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση. Για

CHRNA4

ισομορφή 1 (NM_000744.6), που φιλοξενούν ένα υποθετικό uORF, δύο κατασκευάσματα δημιουργήθηκαν: το ένα με το mRNA άγριου τύπου (

CHRNA4

-iso1-1) και μία με το μεταλλαγμένο uORF κωδικόνιο έναρξης (

CHRNA4

-iso1-2). Για μια επόμενη δοκιμή (βλέπε αποτελέσματα), δύο κατασκευάσματα δημιουργήθηκαν: ένα στο οποίο το κωδικόνιο λήξης της uORF μεταλλάχθηκε (TAG σε TAC), αλλά η πυγολαμπίδα κωδικόνιο έναρξης έμεινε ανέπαφο (

CHRNA4

-iso1- 3), και ένα λείπει τόσο το κωδικόνιο λήξης της uORF και το κωδικόνιο πυγολαμπίδα ξεκινήσει (ATG σε TTG) (

CHRNA4-

iso1-4).

για

CHRNA4

ισομορφή 2 (NM_001256573.1), που διαθέτουν πέντε υποθετικό uORFs, έξι κατασκευάσματα δημιουργήθηκαν: το ένα με το mRNA άγριου τύπου (

CHRNA4

-iso2-uORF1-5) και πέντε κατασκευάσματα στα οποία κάθε ένα από τα πέντε uORFs ήταν απενεργοποιημένο, αριθμούνται αντίστοιχα, αρχίζοντας με το πιο 5 ‘βρίσκεται uORF (

CHRNA4

-iso2-uORF1?

CHRNA4

-iso2-uORF2?

CHRNA4

-iso2 -uORF3?

CHRNA4

-iso2-uORF4?.

CHRNA4

-iso2-uORF5)

Για

CHRNA5

(NM_000745.3), που φιλοξενεί ένα υποθετική uORF περιέχουν ένα SNP, τέσσερα κατασκευάσματα δημιουργήθηκαν: ένα με την γουανίνη αλληλόμορφο και άθικτο /σβηστό uORF (

CHRNA5

-1?

CHRNA5

-2) και μία με την αδενίνη αλληλόμορφο και άθικτο /σβηστό uORF (

CHRNA5

-3?

CHRNA5

-4). Για μια επόμενη δοκιμή (βλέπε αποτελέσματα), δύο κατασκευάσματα δημιουργήθηκαν: ένα στο οποίο το κωδικόνιο λήξης της uORF μεταλλάχθηκε (TAG σε TAC), αλλά η πυγολαμπίδα κωδικόνιο έναρξης έμεινε ανέπαφο (

CHRNA5

-5) , και ένα λείπει τόσο το κωδικόνιο λήξης της uORF και το κωδικόνιο πυγολαμπίδα ξεκινήσει (ATG σε TTG) (

CHRNA

56).

για

CHRNB3

(NM_000749.3 ), που φιλοξενούν ένα υποθετικό uORF και SNP με το μείζον αλληλόμορφο αδενίνη δημιουργώντας ένα uORF κωδικόνιο έναρξης, χρησιμοποιήθηκαν τρία κατασκευάσματα: το ένα με ανέπαφη uORF κωδικόνιο έναρξης που παράγεται από την αδενίνη SNP αλληλόμορφο (

CHRNB3

-1)? ένα με την ελάσσονα SNP αλληλόμορφο γουανίνη διαγράφοντας το πρώτο uORF κωδικόνιο έναρξης (

CHRNB3

-2) οδηγώντας έτσι σε μία κολοβωμένη uORF και τρίτης κατασκεύασμα με το αλληλόμορφο γουανίνη SNP στην οποία έχει ενεργοποιηθεί το κωδικόνιο έναρξης του κόλουρου uORF off (

CHRNB3

-3). Μια επισκόπηση των δομών που χρησιμοποιούνται σε πειράματα μας φαίνεται στον Πίνακα 1.

Η

Κυτταρική καλλιέργεια

Τα ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρικά κύτταρα (ΗΕΚ) 293 αγοράστηκαν από την υπηρεσία Οι κυτταρικές σειρές (CLS, Eppelheim, Γερμανία). Η καλλιέργεια των κυττάρων έγινε σε φιάλες Τ75 σε μονοστιβάδα με DMEM (Sigma-Aldrich, Αμβούργο, Γερμανία) που περιέχει 4.5 g γλυκόζη, 10% FBS, 1% Ε-γλουταμίνη και 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (Invitrogen, Karlsruhe, Germany). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα στους 37 ° C και 5% CO

2.

ΗΕΚ 293 κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με το πλασμίδιο αναφοράς pGl4.10 + ΤΚ που περιέχει το 5’UTR του α4 ισομορφή 1 και 2, α5 και SS3, αντίστοιχα, και το πλασμίδιο ελέγχου pGL4.74 σε αναλογία 20:01 χρησιμοποιώντας TransIT ®-LT1 αντιδραστήριο επιμόλυνσης (MoBiTec, Göttingen, Germany) με 24 ώρες πριν από την μορφομετατροπή λουσιφεράσης δοκιμασίας και qPCR, αντίστοιχα .

λουσιφεράσης δοκιμασία

ΗΕΚ293 κύτταρα σπάρθηκαν 24 ώρες πριν από την επιμόλυνση με 3 × 10

5 κύτταρα σε πλάκες 24 φρεατίων (Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany). Οι δραστηριότητες της λουσιφεράσης πυγολαμπίδας και Renilla μετρήθηκαν με την Tristar LB941 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germany) με την Dual-Glow® σύστημα δοκιμασίας λουσιφεράσης (Promega, Mannheim, Germany) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η αναλογία πυγολαμπίδας δραστικότητας λουσιφεράσης και λουσιφεράσης Renilla προσδιορίστηκε και ομαλοποιήθηκε ως προς pGL4.10 + ΤΚ. Οι διάφορες 5’ΙΙΤΚ κατασκευάσματα εκφράζονται ως φορές μεταβολής σε pGL4.10 + ΤΚ.

Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν ανεξάρτητα τρεις φορές με δείγματα εις τριπλούν. Ένα δύο tailed t-test χρησιμοποιήθηκε για να συγκρίνει τις τιμές των δειγμάτων δοκιμής και των δειγμάτων ελέγχου. Ένα

σ

αξία των

σ

& lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Όλα τα δεδομένα εκφράζονται ως φορές μεταβολής και ως μέσος όρος ± SEM.

qPCR

ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR διεξήχθη δοκιμασία λουσιφεράσης αν έδειξαν σημαντικά αποτελέσματα. Η συν-επιμόλυνση με τα διάφορα κατασκευάσματα διεξήχθη όπως περιγράφεται παραπάνω. RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ Qiagen RNAeasy, συμπεριλαμβανομένης της θεραπείας με ϋΝάση 10 λεπτών, σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Qiagen, Hilden, Germany). Η σύνθεση του πρώτου κλώνου cDNA-διεξήχθη χρησιμοποιώντας 1 μα ολικού RNA από κάθε επιμόλυνση ως πρώτη ύλη (κιτ σύνθεσης iScript ™ cDNA, Bio-Rad, Munich, Germany). Real-time PCR πραγματοποιήθηκε στόχευσης λουσιφεράση της πυγολαμπίδας (στόχος) και λουσιφεράση της Renilla (έλεγχος) κωδικοποιητική αλληλουχία χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους εκκινητές πυγολαμπίδας-FWD 5′- TGCAACACCCCAACATCTTC-3 ‘και πυγολαμπίδας-rev 5′- CCTTTAGGCACCTCGTCCAC-3′? renilla-FWD 5’-AATGGCTCATATCGCCTCCT-3 ‘και renilla-rev 5′-CACGACACTCTCAGCATGGA-3’. αποτελεσματικότητα της ενίσχυσης και δοκιμή γραμμικότητας (συντελεστής συσχέτισης R

2) αξιολογήθηκαν για κάθε ζεύγος εκκινητών (Εικ. S1). Οι αντιδράσεις διεξήχθησαν σε όγκους 20 μΐ που περιέχουν 10 μΐ SsoFast

TM EvaGreen

® Supermix (Bio-Rad, Μόναχο, Γερμανία), 125 ηΜ του κάθε εκκινητή, 7 μλ βαθμού μοριακής βιολογίας νερού και 1 μΙ από καθένα εκμαγείο μετά τη σύνθεση cDNA. Ο θερμικός κύκλος συνίστατο από μετουσίωση (98 ° C για 5 s), ανόπτηση και επέκταση (60 ° C για Renilla? 62 ° C για πυγολαμπίδας για 5 s), πραγματοποιήθηκε σε 50 βήματα του κύκλου στο Mini Opticon CFD-3120 ανακυκλωτή (βιο- Rad, Μόναχο, Γερμανία). Ανάλυση καμπύλης τήξης κυμαίνεται από 65 ° C έως 95 ° C με διαστήματα 0,5 ° C. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές ανεξάρτητα με τριπλούν τεχνική δείγματα. Ένα δύο tailed t-test χρησιμοποιήθηκε για να συγκρίνει τις τιμές των δειγμάτων στόχου και των δειγμάτων ελέγχου. Ένα

σ

αξία των

σ

& lt?. 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

CHRNA3

και

CHRNA7

η

Στο silico

ανάλυση έδειξε ότι ούτε η 5’UTR του

CHRNA3

ισομορφή 1 (NM_000743.4) και ισομορφή 2 (NM_ 001.166.694,1), ούτε της

CHRNA7

ισομορφή 1 (NM_000746.5) και ισομορφή 2 (NM_001190455.2) περιέχουν υποθετικό uORFs (Εικ. 1). Ως εκ τούτου, αυτά τα δύο γονίδια υπότυπο δεν συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη.

CHRNA4

ισομορφή 1 5’ΙΙΤΚ φιλοξενεί ένα λειτουργικό uORF

Δύο διαφορετικές

CHRNA4

υπάρχουν παραλλαγές του mRNA. Το ισόμορφο 1 (NM_000744.6) παρουσιάζει ένα 5’UTR μήκος 231 nt ενώ ισόμορφου 2 (NM_001256573.1) χαρακτηρίζεται από μια μεγαλύτερη 5’UTR (690 nt) που οφείλονται στην κωδικοποίηση διαφορές περιοχή η οποία έχει ως αποτέλεσμα μια περαιτέρω κατάντη έναρξης μετάφρασης. Στην 5’UTR του

CHRNA4

ισομορφή 1 μία υποθετική uORF 60 μήκους nt θα μπορούσε να βρίσκεται

in silico

(Εικ. 1). κωδικόνιο έναρξης του περικλείεται από ένα επαρκές συναινετική αλληλουχία Kozak (λόγω της γουανίνης στη θέση -3). Τα κατασκευάσματα

CHRNA4

-iso1-1 και

CHRNA4

-iso1-2 ελέγχθηκαν με δοκιμασία λουσιφεράσης (Πίνακας 1 και S1). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η απενεργοποίηση του uORF σημαντικά αυξημένο

CHRNA4

-iso1-1 έκφραση της πρωτεΐνης κατά 4,8 φορές (

CHRNA4

-iso1-1 0,6 ± 0,09?

CHRNA4

– iso1-2 2,9 ± 0,43?

σ

= 0,013) (Εικόνα 2Α)

Α: λουσιφεράσης δοκιμασία του

CHRNA4

ισομορφή 1 5’ΙΙΤΚ οδήγησε σε σημαντική αύξηση.. στην έκφραση της πρωτεΐνης κατά την απενεργοποίηση της uORF. Φορές μεταβολής πυγολαμπίδας δραστηριότητα κανονικοποιήθηκε προς pGl4.10 + ΤΚ, απεικονίζεται για τις τρεις διαφορετικές κατασκευές? 1, pGl4.10 + TK? 2,

CHRNA4

-iso1-1? 3,

CHRNA4

-iso1-2. Β: Η uORF ATG του

CHRNA4

-iso1 είναι σε θέση να ξεκινήσει τη μετάφραση, με αποτέλεσμα ένα επίμηκες πρωτεΐνη πυγολαμπίδα. Διπλώστε την αλλαγή της πυγολαμπίδας δραστηριότητα ρυθμίζεται σύμφωνα με pGl4.10 + TK, παρουσιάζεται για τις πέντε διαφορετικές δομές? 1, pGl4.10 + TK? 2, pGl4.10? 3,

CHRNA4

-iso1-2? 4,

CHRNA4

-iso1-3? 5,

CHRNA4

-iso1-4. C: Σχετική qPCR για

CHRNA4-iso1

5’ΙΙΤΚ δεν έδειξαν σημαντικές διαφορές ποσού mRNA κατά τη σύγκριση άθικτο με διαγράφεται uORF. Φορές μεταβολής πυγολαμπίδας mRNA ρυθμίζεται σύμφωνα με pGl4.10 + ΤΚ, απεικονίζεται για τις τρεις διαφορετικές κατασκευές? 1, pGl4.10 + TK? 2,

CHRNA4

-iso1-1? 3,

CHRNA4

-iso1-2. Δ: Κανένα από τα πέντε uORFs του

CHRNA4

-iso2 5’ΙΙΤΚ έδειξε σημαντικά αποτελέσματα. Διπλώστε την αλλαγή της πυγολαμπίδας δραστηριότητα ρυθμίζεται σύμφωνα με pGl4.10 + TK, παρουσιάζεται για τις επτά διαφορετικές δομές? 1, pGl4.10 + TK? 2,

CHRNA4

-iso2-uORF1-5? 3,

CHRNA4

-iso2-uORF1? 4,

CHRNA4

-iso2-uORF2? 5,

CHRNA4

-iso2-uORF3? 6,

CHRNA4

-iso2-uORF4? 7,

CHRNA4

-iso2-uORF5. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν SEM ± 3 βιολογικής επαναλήψεις. Οι αστερίσκοι δείχνουν σημαντικές διαφορές (

σ

& lt? 0,05).

Η

Μερικές, αλλά όχι όλες οι uORFs μεταφραστεί σε πρωτεΐνη. Σε ένα επόμενο βήμα μας, ως εκ τούτου εξετάζεται αν το κωδικόνιο έναρξης ATG του

CHRNA4-

iso1-1 uORF είναι σε θέση να ξεκινήσει τη μετάφραση της πρωτεΐνης, η οποία θα ήταν απαραίτητη προϋπόθεση για τη μετάφραση του ίδιου του uORF. Ένα μεταφραστεί uORF με ένα μεταλλαγμένο κωδικόνιο λήξης, κλωνοποιημένο εντός πλαισίου με την πυγολαμπίδα ORF πρέπει να οδηγήσει στην σύνθεση ενός επιμήκους πυγολαμπίδα πρωτεΐνη. Οι δύο κατασκευές

CHRNA4-

iso1-3 και

CHRNA4-

iso1-4 συγκρίθηκαν με

CHRNA4

-iso1-2. Η uORF ορίστηκε σε πλαίσιο με την πυγολαμπίδα ORF και για τα 3 κατασκευάσματα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ούτε μια σημαντική διαφορά στην έκφραση της πρωτεΐνης μεταβάλλεται μεταξύ των

CHRNA4

-iso1-2 και

CHRNA4-

iso1-3 ούτε μεταξύ

CHRNA4

-iso1-2 και

CHRNA4-

iso1-4 (

CHRNA4

-iso1-2 1,47 ± 0,59?

CHRNA4

-iso1-3 0,94 ± 0,25?

σ

= 0.542 ?

CHRNA4

-iso1-2 1,47 ± 0,59?

CHRNA4

-iso1-4 0,83 ± 0,26?

σ

= 0.471). Σύγκριση των

CHRNA4

-iso1-4 με τον φορέα ελέγχου pGL4.10 αποκάλυψε μια αύξηση στην έκφραση της πρωτεΐνης που δεν φθάνουν σημασία (

CHRNA4

-iso1-4 0,83 ± 0,26? PGL4.10 0,03 ± 0,01?..

σ

= 0,067) (Εικόνα 2Β)

για να αναλύσουμε αν τα αποτελέσματα της ανάλυσης λουσιφεράσης οφείλονταν σε μεταγραφικό ή μεταφραστικό αποτέλεσμα, πραγματοποιήσαμε σχετική ποσοτική πραγματικού -Ώρα PCR (qPCR). Κατά τη σύγκριση της ποσότητας του mRNA των κυττάρων επιμολυσμένα με τις κατασκευές

CHRNA4

-iso1-1 και

CHRNA4

-iso1-2 δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές αλλαγές μεταξύ άθικτο και διαγράφονται uORF (

CHRNA4

-iso1-1 1,23 ± 0,29?

CHRNA4

-iso1-2 1,05 ± 0,22?..

σ

= 0,702) (Σχήμα 2C)

Το 5 ‘UTR του

CHRNA4

ισομορφής 2 περιέχει πέντε υποθετικό uORFs κυμαίνονται από 18 έως 60 nt σε μήκος (Εικ. 1). Το κατασκεύασμα με μόνο ανέπαφο uORFs συγκρίθηκε με κατασκευάσματα στα οποία κάθε μία από τις πέντε uORFs ήταν απενεργοποιημένο (Πίνακας 1 και S1). Τα αποτελέσματα δεν έδειξαν σημαντικές διαφορές σχετικά άθικτο έναντι σβηστό uORF. Αυτό ισχύει ιδιαίτερα για τα πιο 5 ‘uORF η οποία είναι παρούσα τόσο σε

CHRNA4

ισομορφών. Αυτό uORF φάνηκε να είναι λειτουργικός στο ισόμορφο με την μικρότερη 5’UTR (βλέπε παραπάνω), αλλά δεν προκάλεσε αλλαγές στην έκφραση της πρωτεΐνης όταν απενεργοποιείται στο ισόμορφο με το μακρύτερο 5’UTR (Σχ. 2D). (

CHRNA4

-iso2-uORF1-5 0,12 ± 0,02?

CHRNA4

-iso2-uORF1 0,13 ± 0,02?

σ

= 0,644?

CHRNA4

-iso2-uORF1-5 0,12 ± 0,02?

CHRNA4

-iso2-uORF2 0,14 ± 0,03?

σ

= 0.607?

CHRNA4

-iso2-uORF1-5 0,12 ± 0,02?

CHRNA4

-iso2-uORF3 0,14 ± 0,02?

σ

= 0,427?

CHRNA4

-iso2-uORF1-5 0,12 ± 0,02?

CHRNA4

-iso2-uORF4 0,15 ± 0,03?

σ

= 0,514?

CHRNA4

-iso2-uORF1-5 0,12 ± 0,02?

CHRNA4

-iso2-uORF5 0,12 ± 0,02 ?.

σ

= 0,926)

Κατά τη σύγκριση των δύο ισομορφών άγριου τύπου

CHRNA4

-iso1-1 και

CHRNA4

-iso2-uORF1-5, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η έκφραση της πρωτεΐνης του τελευταίου ένας ήταν σημαντικά μειωμένη (

CHRNA4

-iso1-1 0,6 ± 0,09?

CHRNA4

-iso2-uORF1-5 0,12 ± 0,02?

p

= 0,014).

CHRNA5

5’ΙΙΤΚ περιέχει μια μετα-μεταγραφικά λειτουργικά uORF

CHRNA5

5’UTR (NM_000745. 3) βρέθηκε να φιλοξενούν μία υποθετική uORF 30 μήκους nt (Εικ. 1). Μέσα σε αυτό το uORF την rs56182392 SNP με την προγονική γουανίνη αλληλόμορφο (συχνότητα αλληλόμορφο 99,4%) και τα σπάνια αλληλόμορφο αδενίνη αποτελέσματα σε μια ανταλλαγή αμινοξέος από αλανίνη σε θρεονίνη, όταν μεταφραστεί.

Για να αναλύσουμε το

CHRNA5

uORF και SNP του στο επίπεδο της πρωτεΐνης που εξετάσαμε κατασκευάσματα μας με λουσιφεράση δοκιμασίες (Πίνακας 1 και S1). Οι κατασκευές

CHRNA5

-2 και

CHRNA5

-4 οδήγησε σε αύξηση της πρωτεΐνης του 50%, αντιστοίχως 65%, σε σύγκριση με το

CHRNA5

-1, αντίστοιχα

CHRNA5

-3 (

CHRNA5

-1 0,76 ± 0,03?

CHRNA5

-2 1,15 ± 0,06?

σ

= 0,009?

CHRNA5

-3 0,63 ± 0,08?

CHRNA5

-4 1,04 ± 0,03?

σ

= 0,006). Κατά συνέπεια, σε αμφότερες τις περιπτώσεις, οι κατασκευές που δεν έχει την uORF παρήγαγαν σημαντικά περισσότερη πρωτεΐνη από τα αντίστοιχα κατασκευάσματα με ανέπαφη uORFs. Κατά τη σύγκριση των δύο αλληλόμορφα του rs56182392 (κατασκευές

CHRNA5

-1 και

CHRNA5

-3) οι ονομαστικές αλλαγές πρωτεΐνη δεν ήταν σημαντική (Εικ. 3Α).

‘UTR φιλοξενεί μια λειτουργική uORF?

CHRNB3

uORFs δεν εμπλέκονται στη μεταγραφική έλεγχο. Α: λουσιφεράσης δοκιμασία του

CHRNA5

5’ΙΙΤΚ οδήγησε σε σημαντική αύξηση στην έκφραση της πρωτεΐνης κατά την απενεργοποίηση της uORF. Διπλώστε την αλλαγή της πυγολαμπίδας δραστηριότητα ρυθμίζεται σύμφωνα με pGl4.10 + TK, παρουσιάζεται για τις πέντε διαφορετικές δομές? 1, pGl4.10 + TK? 2,

CHRNA5

-1? 3,

CHRNA5

-2? 4,

CHRNA5

-3? 5,

CHRNA5

-4. Β: Το uORF κωδικόνιο έναρξης του

CHRNA5

δεν κίνησε τη μετάφραση τόσο αποτελεσματικά όσο η πυγολαμπίδα κωδικόνιο έναρξης. Διπλώστε την αλλαγή της πυγολαμπίδας δραστηριότητα ρυθμίζεται σύμφωνα με pGl4.10 + TK, παρουσιάζεται για τις πέντε διαφορετικές δομές? 1, pGl4.10 + TK? 2, pGL4.10? 3,

CHRNA5

-2? 4,

CHRNA5

-5? 5,

CHRNA5

-6. C: Σχετική qPCR για

CHRNA5

5’ΙΙΤΚ δεν έδειξαν σημαντικές διαφορές ποσού mRNA κατά τη σύγκριση άθικτο με διαγράφεται uORF. Ωστόσο, σημαντικές διαφορές αξιολογήθηκαν για τη μεταγραφή των δύο SNP παραλλαγές αλληλόμορφο. Διπλώστε την αλλαγή της πυγολαμπίδας mRNA ρυθμίζεται σύμφωνα με pGl4.10 + TK, παρουσιάζεται για τις πέντε διαφορετικές δομές? 1, pGl4.10 + TK? 2,

CHRNA5

-1? 3,

CHRNA5

-2? 4,

CHRNA5

-3? 5,

CHRNA5

-4. D: λουσιφεράσης δοκιμασία του

CHRNB3

5’ΙΙΤΚ δεν έδειξε σημαντικά αποτελέσματα. Διπλώστε την αλλαγή της πυγολαμπίδας δραστηριότητα ρυθμίζεται σύμφωνα με pGl4.10 + TK, παρουσιάζεται για τις τέσσερις διαφορετικές δομές? 1, pGl4.10 + TK? 2,

CHRNB3

-1? 3,

CHRNB3

-2? 4,

CHRNB3

-3. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν SEM ± 3 βιολογικής επαναλήψεις. Οι αστερίσκοι δείχνουν σημαντικές διαφορές (

σ

& lt? 0,05).

Η

Και πάλι, για να αξιολογήσει εάν το κωδικόνιο έναρξης ATG του

CHRNA5

uORF είναι σε θέση να ξεκινήσει πρωτεΐνη μετάφραση, οι δύο κατασκευές

CHRNA5

-5 και

CHRNA5

-6 συγκρίθηκαν με

CHRNA5

-2. Η uORF ορίστηκε σε πλαίσιο με την πυγολαμπίδα ORF και για τα 3 κατασκευάσματα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι όσο η πυγολαμπίδα κωδικόνιο έναρξης ήταν άθικτο η πρωτεΐνη λουσιφεράσης εκφράζεται έντονα (

CHRNA5

-2 1,31 ± 0,30?

CHRNA5

-5 1,55 ± 0,46?

p

= 0.736). Ωστόσο, η έκφραση της πρωτεΐνης μειώθηκαν κατά περισσότερο από 90%, όταν μόνο το ATG της uORF ήταν παρούσα (

CHRNA5

-2 1,31 ± 0,30?

CHRNA5

-6 0,08 ± 0,01?

p

= 0,029). Σύγκριση των

CHRNA5

-6 με τον φορέα ελέγχου pGL4.10 δεν έδειξαν σημαντικές διαφορές (

CHRNA5

-6 0,08 ± 0,01? PGL4.10 0,03 ± 0,01?

p

= 0,069) (Εικ. 3Β).

στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε σχετική qPCR να αποκλείσει μία επίδραση στο επίπεδο RNA ως αιτία για τα ευρήματά μας. Κατά τη σύγκριση της ποσότητας του mRNA των κυττάρων επιμολυσμένων με τις αντίστοιχες δομές (

CHRNA5

-1?

CHRNA5

-2?

CHRNA5

-3?

CHRNA5

-4) από σχετική qPCR δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές αλλαγές μεταξύ άθικτο και διαγράφονται uORF (

CHRNA5

-1 0,98 ± 0,01?

CHRNA5

-2 0,97 ± 0,01?

p

= 0,369?

CHRNA5

-3 1,05 ± 0,01?

CHRNA5

-4 1,10 ± 0,05?

σ

= 0,459) (Σχήμα 3C).. Έτσι, η uORF δεν μετέβαλε ποσοτικά το επίπεδο του mRNA. Κατασκευάστε

CHRNA5

-3 περιέχει το σπάνιο αλληλόμορφο του rs56182392 απέδωσε σημαντικά πιο λουσιφεράσης πυγολαμπίδας μεταγραφές από

CHRNA5

-1 (

CHRNA5

-1 0,98 ± 0,01?

CHRNA5

-3 1,05 ± 0,01?

σ

= 0,011). Παρ ‘όλα αυτά, δεν υπάρχουν σημαντικές διαφορές μεταξύ των δύο αλληλόμορφα παρατηρήθηκαν σε επίπεδο πρωτεΐνης και επομένως είναι απίθανο ότι rs56182392 έχει σημαντικό αντίκτυπο στο

CHRNA5

λειτουργία.

CHRNB3

uORF κάνει δεν επηρεάζουν την έκφραση της πρωτεΐνης

Η 5’UTR της υπομονάδας (NM_000749.3) περιέχει ένα μοναδικό υποθετικό uORF. Είναι φιλοξενεί ένα SNP (rs4950 αδενίνη /γουανίνη) με το ελάχιστο αλληλόμορφο γουανίνη διαγράφοντας το πρώτο κωδικόνιο έναρξης ATG του υποτιθέμενου uORF, δημιουργώντας μια περικομμένη, υποθετικό uORF (Εικ. 1). Τα τρία κατασκευάσματα (

CHRNB3

-1?

CHRNB3

-2?

CHRNB3

-3) συγκρίθηκαν μεταξύ τους με δοκιμασία λουσιφεράσης (Πίνακας 1 και S1). Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των τριών διαφορετικές παραλλαγές (

CHRNB3

-1 0,83 ± 0,17?

CHRNB3

-2 0,75 ± 0,02?

σ

= 0.495?

CHRNB3

-1 0,83 ± 0,17?

CHRNB3

-3 0,92 ± 0,19?

σ

= 0.778?

CHRNB3

-2 0,75 ± 0,02?

CHRNB3

-3 0,92 ± 0,19?

σ

= 0.726). Έτσι, τα ευρήματά μας δείχνουν ότι ούτε η πλέον uORF ούτε η περικοπεί έκδοση uORF παίζουν ρόλο στη ρύθμιση της μετάφρασης πρωτεϊνών (Εικ. 3D).

Συζήτηση

Τα στοιχεία που παρουσιάζονται εδώ δείχνουν έντονα ότι uORFs εντός του 5’UTR του

CHRNA4

-iso1 και

CHRNA5

είναι σημαντικοί ρυθμιστές της μετάφρασης πρωτεϊνών. Επιπλέον, αναφέρει ότι οι δύο γνωστοί

CHRNA4

ισομορφές διαφέρουν σε σχέση με τις επιπτώσεις τους στο επίπεδο της γονιδιακής έκφρασης. Η επιρροή του

CHRNA4

-UTR στη γονιδιακή έκφραση ήταν επίσης προηγουμένως αναφερθεί από Briggs et al. Εξέφρασαν κουνάβι

CHRNA4

και

CHRNB2

μαζί με /ή χωρίς αντίστοιχη UTRs τους στα ωοκύτταρα. Είναι ενδιαφέρον, αποκλειστικά η υψηλής ευαισθησίας και κανένας τύπος υποδοχέα χαμηλής ευαισθησίας ανιχνεύθηκε όταν η UTR ήταν παρούσα. Ωστόσο, πιθανά ρυθμιστικά στοιχεία UTR δεν αναλύθηκαν λεπτομερώς σε αυτή τη μελέτη [23].

Σε σύγκριση με την μικρότερη ισομορφή, η παρουσία της μακράς 5’UTR του

CHRNA4

σημαντικά μειωμένη έκφραση λουσιφεράσης . Κανένας από τους πέντε uORFs παρόντες σε αυτήν την ισομορφή έδειξε οποιαδήποτε επίδραση επί της έκφρασης γονιδίου όταν νοκ άουτ μεμονωμένα. Αυτό καθιστά απίθανο ότι είναι υπεύθυνοι για τη μείωση των επιπέδων έκφρασης των γονιδίων που σχετίζονται με τον πλέον

CHRNA4

ισομορφή. Εμείς δεν μπορεί να αποκλείσει εντελώς την πιθανότητα ότι μια ταυτόχρονη νοκ-άουτ και των πέντε uORFs θα είχε επιπτώσεις στη γονιδιακή έκφραση, ωστόσο, η παρουσία άλλων κατασταλτικών ρυθμιστικών μοτίβα ακολουθία ή RNA αναδίπλωση γεγονότα που είτε αποσταθεροποιούν το mRNA ή να επιβραδύνει τη μετάφραση φαίνεται να είναι τουλάχιστον ως πιθανές εξηγήσεις.

είναι ενδιαφέρον ότι η uORF βρέθηκε να είναι λειτουργικός στο

CHRNA4

ισομορφή με την μικρότερη 5’UTR είναι επίσης παρούσα σε μακροπρόθεσμη 5’UTR-ισομορφή αλλά δεν φαίνεται ότι μειώνουν την έκφραση γονιδίου στο τελευταίο πλαίσιο αλληλουχία. Απ ‘όσο γνωρίζουμε αυτό παρουσιάζει την πρώτη παράδειγμα ενός uORF με ισομορφή-ειδική λειτουργική συνάφεια. Οι λόγοι πίσω από αυτή την παρατήρηση είναι μέχρι στιγμής άγνωστα. Πειράματα επιμήκυνσης μας δείχνουν ότι η ATG της βραχείας ισομορφής είναι σε θέση να ξεκινήσει τη μετάφραση της uORF. Ωστόσο, αυτή η επίδραση ήταν μάλλον μικρή και τα αποτελέσματα δεν ήταν σημαντική. Ως εκ τούτου, η μετάφραση της πρωτεΐνης uORF θα μπορούσε να συμβάλει, αλλά είναι απίθανο να είναι η κύρια αιτία για αυτή την παρατήρηση. Είναι επίσης πιθανό ότι η επαρκής συναινετική αλληλουχία Kozak [24] περιλαμβάνει το κωδικόνιο έναρξης uORF επιτρέπει επαρκή αναγνώριση ριβοσώματος. Ribosome απώλειας στήριξης έχει ως εκ τούτου να θεωρηθούν ως εναλλακτικό μηχανισμό για τις επιδράσεις που παρατηρήθηκαν σε επίπεδο πρωτεΐνης. Μπορεί να σκεφτεί μόνο γιατί η ίδια uORF φάνηκε να είναι μη λειτουργική, όταν αναλυθούν σε μακροπρόθεσμη 5’UTR-

CHRNA4

ισομορφή. Ένας πιθανός λόγος θα μπορούσε να είναι η παρουσία επιπλέον, μέχρι στιγμής άγνωστο ρυθμιστικές μοτίβα που υπάρχουν μόνο σε μακροπρόθεσμη 5’UTR-

CHRNA4

5’UTR και είναι σε θέση να αναστέλλουν τη λειτουργία uORF. Έχει ήδη δείξει ότι ο ρυθμιστικός ρόλος ορισμένων τουλάχιστον uORFs μπορεί να συνδέεται στενά με άλλες 5’ΙΙΤΚ μοτίβα ακολουθία [25]. Ωστόσο, η uORF που περιγράφονται στην παρούσα προηγούμενη έκθεση ήταν λειτουργική μόνο αν πρόσθετες ρυθμιστικές μοτίβα ήταν παρόντες. Η

CHRNA4

uORF συζητούνται εδώ θα απαιτήσει το αντίθετο μηχανισμό, δηλαδή η καταστολή από την ακολουθία μοτίβα άγνωστα.

Όσον αφορά την ενιαία uORF του

CHRNA5

, τα πειράματά μας έδειξαν καμία σαφή ένδειξη ότι ο uORF κωδικόνιο έναρξης είναι σε θέση να αρχίσει η μετάφραση του γονιδίου πυγολαμπίδας κλωνοποιούνται καθοδικά από αυτό. Η πιο πιθανή εξήγηση για την παρατήρηση αυτή θα ήταν η χαμηλή αντοχή αλληλουχία Kozak που περιβάλλει το uORF-ATG. Αυτό το αδύναμο μοτίβο ακολουθία είναι πιθανό να μειώσει την πιθανότητα ότι ριβοσώματα αναγνωρίζουν την uORF-ATG και να ξεκινήσει η μετάφραση σε αυτό το site. Ωστόσο, το γεγονός ότι δεν ήμασταν σε θέση να τηρήσει μια σημαντική διαφορά στα επίπεδα έκφρασης μεταξύ του φορέα ελέγχου και ένα μόρφωμα στο οποίο το uORF κωδικόνιο έναρξης υπηρέτησε ως την θέση έναρξης της μετάφρασης μόνο λειτουργία (

CHRNA5

-6) κάνει όχι απαραίτητα εμπλέκουν ότι η μετάφραση του uORF είναι εντελώς αποκλείεται ως ένα πιθανό μηχανισμό. Ωστόσο, με δεδομένη την εντυπωσιακή επίδραση στην έκφραση της πρωτεΐνης η uORF έδειξε με την παρουσία του δικού ανέπαφη στάση του κωδικόνιο είναι απίθανο ότι αυτή η ισχυρή επίδραση είχε ως αποτέλεσμα αποκλειστικά και μόνο από μια αδύναμη μετάφραση της πρωτεΐνης uORF. Αυτό υποδηλώνει ότι, σε αντίθεση με το

CHRNA4

uORF που περιγράφεται παραπάνω, η

CHRNA5

uORF δεν αποτελεί μέρος της ομάδας εξαρτώνται από την αλληλουχία uORFs που επιτυγχάνουν τα αποτελέσματά τους από κωδικοποιούν μικρές πρωτεΐνες που παίζουν ενεργό ρόλο στην μεταφραστικών μηχανισμών ελέγχου. Έτσι άλλοι μηχανισμοί πρέπει να ληφθούν υπόψη, συμπεριλαμβανομένης της απώλειας στήριξης των ριβοσωμάτων στο uORF ή διαρροή σάρωσης. Ο μηχανισμός καθυστερεί συμβαίνει όταν ριβοσώματα σταματήσει να κινείται κατά τη διάρκεια της uORF μετάφραση [26]. Ωστόσο, ένα κωδικόνιο έναρξης που δεν είναι σε θέση να επιτύχουν επαρκή μετάφραση είναι επίσης απίθανο να προκαλέσει σημαντικές ριβόσωμα στασιμότητα. Leaky σάρωση φαίνεται να είναι μια πιο λογική εξήγηση για τις παρατηρούμενες επιπτώσεις. Αυτός ο μηχανισμός παρουσιάζεται ιδιαίτερα αν το κωδικόνιο έναρξης της uORF περικλείεται από μια φτωχή αλληλουχία πλαισίου κωδικόνιο έναρξης, όπως παρουσιάζονται στην uORF του

CHRNA5

. Ως αποτέλεσμα, ορισμένοι ριβοσώματα αναγνωρίζουν το κωδικόνιο έναρξης του uORF και να ξεκινήσει, άλλοι το παρακάμψει και να ξεκινήσει κατά την επόμενη κωδικόνιο έναρξης.