Αφηρημένο

Στόχος

Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να εξετάσει τις επιπτώσεις της απόπτωσης-προώθηση και τους μηχανισμούς της αιματοπορφυρίνης μονομεθυλ αιθέρα (HMME) -sonodynamic θεραπεία (SDT) για ενδομητρίου καρκινικά κύτταρα

in vitro

Η

Μέθοδοι

δείγματα ενδομητρίου καρκινικά κύτταρα χωρίστηκαν σε τέσσερις ομάδες:. 1) χωρίς θεραπεία ομάδα ελέγχου, 2) ομάδα HMME, 3) καθαρή ομάδα υπερήχων, και 4) HMME σε συνδυασμό με υπερήχους, δηλαδή την ομάδα SDT. μέθοδος CCK-8 χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί η ανασταλτική δράση της SDT επί του πολλαπλασιασμού του ενδομήτριου καρκινικών κυττάρων. Οπτικό μικροσκόπιο και πεδίο μικροσκοπία ηλεκτρονίων μετάδοσης εκπομπών χρησιμοποιήθηκαν για να χαρακτηριστούν οι αλλαγές μορφολογία των καρκινικών κυττάρων που επάγεται από τις κατεργασίες. ρυθμός απόπτωση, αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) και το δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης (ΜΜΡ) εξετάστηκαν με κυτταρόμετρο ροής. Η ένταση φθορισμού μετρήθηκε με συνεστιακή μικροσκοπία σάρωσης λέιζερ χρησιμοποιήθηκε για να διερευνήσει τη μεταβολή του ενδοκυτταρικού ιόντος ασβεστίου (Ca

2+) συγκέντρωση. πρωτεΐνες που σχετίζονται με απόπτωση εμπλέκεται σε αμφότερες τις ενδογενείς και εξωγενείς σηματοδοτήσεις απόπτωση αναλύθηκε με κηλίδα western.

Αποτελέσματα

SDT μπορεί να διεγείρει αποτελεσματικά την απόπτωση των καρκινικών κυττάρων του ενδομητρίου. Σε σύγκριση με υπερήχους η οποία είναι γνωστή ως μια αποτελεσματική μέθοδος κατά του όγκου, SDT οδηγεί σε σημαντική βελτίωση σε σχέση με την καταστολή της κυτταρικής βιωσιμότητας και της επαγωγής της απόπτωσης, σε συνδυασμό με πιο αξιοσημείωτη τροποποιήσεις για τη μορφολογία και υποδομή σε αμφότερες υπερήχων ευαίσθητων και ανθεκτικών ενδομητρίου καρκινικά κύτταρα. Περαιτέρω μελέτες αποκαλύπτουν ότι SDT προωθεί την παραγωγή ROS, προκαλεί απώλεια της ΜΜΡ και αυξάνει την ενδοκυτταρική Ca

2+ συγκέντρωση πιο αποτελεσματικά από ό, τι HMME ή υπερηχογράφημα μόνο. ομάδες SDT δείχνουν επίσης μια μάλλον υψηλή έκφραση της απόπτωσης που προάγουν πρωτεΐνες, συμπεριλαμβανομένων των Bax, Fas και Fas-L, και σημαντική χαμηλή έκφραση πρωτεϊνών απόπτωσης αναστολή συμπεριλαμβανομένων Bcl-2 και Σουρβιβίνης. Εν τω μεταξύ, οι δύο διασπάται caspse-3 και κασπάσης-8 βελτιώνονται δραματικά σε ομάδες SDT. Πολλαπλές οδούς έχει προταθεί στη διαδικασία, περιλαμβανομένης της εγγενούς ενεργοποίησης από υπερβολική ROS και υπερφορτωμένα Ca

2+, φίμωση γονίδιο survivin, και την εξωγενή οδό προκαλούνται από τον υποδοχέα θανάτου.

Συμπέρασμα

Δεδομένου σημαντική αποτελεσματικότητα του σε δύο ευαίσθητα και ανθεκτικά υπερήχους κύτταρα, SDT μπορεί ως εκ τούτου να είναι μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτική μέθοδο για τη θεραπεία του ενδομητρίου καρκίνων

Παράθεση:. Sun H, Ge W, Gao Χ, Wang S, Jiang S, Hu Y, et al. (2015) Η απόπτωση-Προώθηση Επιδράσεις Αιματοπορφυρινης Μονο Αιθέρας-Sonodynamic Therapy (HMME-SDT) για τον καρκίνο του ενδομητρίου. PLoS ONE 10 (9): e0137980. doi: 10.1371 /journal.pone.0137980

Συντάκτης: Eric Asselin, Πανεπιστήμιο του Κεμπέκ στο Trois-Rivieres, Καναδάς

Ελήφθη: 29 του Δεκέμβρη του 2014? Αποδεκτές: 29 Ιούλη του 2015? Δημοσιεύθηκε: 14 Σεπτεμβρίου 2015

Copyright: © 2015 Sun et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Grant Νο 30872650)? Πρόγραμμα για New Century εξαιρετικά ταλέντα στο Πανεπιστήμιο της Κίνας (Grant Νο NCET-09-0131)? MY αναγνωρίζει οικονομική στήριξη από το πρόγραμμα προσλήψεων της Global Νέοι ειδικοί, η Κίνα

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του ενδομητρίου είναι μία από κοινού γυναικολογικών κακοηθειών, παραδοσιακά αντιμετωπίζεται με χειρουργική επέμβαση και συμπληρώνεται με χημειοθεραπεία και ακτινοθεραπεία, η οποία δυστυχώς έχουν μάλλον χαμηλή ευαισθησία σε πρώιμο ή μεταστατικού σταδίου του καρκίνου του ενδομητρίου, συνοδεύουν συνήθως με σημαντικές παρενέργειες [1-2]. Μέχρι στιγμής, εξακολουθεί να είναι ένα ανοιχτό ζήτημα πόσο νωρίς μπορεί να αντιμετωπιστεί ο καρκίνος του ενδομητρίου, διατηρώντας παράλληλα τη γονιμότητα. Και δεν υπάρχει καμία αναφορά στη βιβλιογραφία σχετικά με τη διατήρηση των οργάνων για τους ασθενείς σε ένα ενδιάμεσο ή προχωρημένο στάδιο. Προφανώς, μια αποτελεσματική προσέγγιση με χαμηλή τοξικότητα είναι υψίστης σημασίας.

Το κίνητρο της απόπτωσης προτιμάται στη θεραπεία του καρκίνου [3]. Έχει αποδειχθεί ότι το υπερηχογράφημα μπορεί να προκαλέσει απόπτωση μιας μεγάλης ποικιλίας κυττάρων, όπως κυττάρων μυελοειδούς λευχαιμίας, λεμφοκύτταρα και κύτταρα σαρκώματος [4-6]. Ωστόσο, η καθυστερημένη επίδραση δολοφονία [7] μαζί με την αναποτελεσματική αποτελεσματικότητα σε καρκινικά κύτταρα υπερηχογράφημα ανθεκτικά μπορεί να περιορίσει σε μεγάλο βαθμό τις εφαρμογές κλινική του. Πρόσφατα, ως συνδυασμός των υπερήχων και ηχοευαισθητοποιητές, sonodynamic θεραπεία (SDT) έχει γίνει μια συναρπαστική μη επεμβατική μέθοδος κατά του όγκου με υψηλή απόδοση και υψηλή εκλεκτικότητα στα κύτταρα του όγκου και χωρίς προφανή επιρροή επί γειτονικών κανονικών ιστών [8-10]. Μεταξύ ποικίλων χημικών παραγόντων που εφαρμόζονται σε SDT, αιματοπορφυρίνη μονομεθυλ αιθέρας (HMME) είναι ιδιαίτερα δημοφιλές ως sonosensitizer λόγω βέλτιστη οπτικές ιδιότητες τους και την ικανοποιητική προτιμησιακή κατακράτηση σε ιστό [11]. Το πιο σημαντικό, HMME έχει πολύ υψηλότερη πρόσληψη ποσοστό από τον όγκο των φυσιολογικών ιστών [10], και αυτή η υψηλή επιλεκτικότητα εξασφαλίζεται η ενέργεια υπερήχου να επικεντρωθεί ειδικά στα καρκινικά κύτταρα.

Η εφαρμογή του ΚΟΤ για γυναικολογικών κακοηθειών είναι γρήγορα αναδυόμενες. Αν και μια προηγούμενη μελέτη

in vitro

απέδειξε ότι μεθυλενίου μπλε μεσολάβηση SDT μπορεί να αυξήσει σημαντικά τα αντιδραστικά είδη οξυγόνου στα κύτταρα του καρκίνου των ωοθηκών και, συνεπώς, να προκαλέσουν απόπτωση [12], τα αποτελέσματα SDT για τον καρκίνο του ενδομητρίου παραμένουν ανεξερεύνητες μέχρι τώρα.

σε αυτή τη μελέτη, η επιρροή της HMME-SDT και στις δύο υπερηχογράφημα ευαίσθητα και ανθεκτικά ενδομητρίου καρκινικά κύτταρα έχει διερευνηθεί

in vitro

. Τα αποτελέσματα και οι μηχανισμοί της απόπτωσης προώθηση συζητηθεί υπό το φως των διαθέσιμων πληροφοριών.

Υλικά και Μέθοδοι

2.1. Cell Culture

Ανθρώπινο ενδομητρίου αδενοκαρκινώματος κυτταρικές σειρές Ishikawa και HEC-1-α αγοράστηκαν από τη Σαγκάη Bogoo Βιοτεχνολογίας. Co., Ltd. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI1640 (Hyclone, Θέρμο) διάλυμα που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου (Hyclone, Thermo) και επωάσθηκαν σε μία κορεσμένη επωαστή υγρασίας (HF240, Heal Force) στους 37 ° C με 5% CO

2. Τα πειράματα διεξήχθησαν όταν τα κύτταρα έφθασαν την λογαριθμική φάση ανάπτυξης.

2.2. Κυττάρων ποσοστό επιβίωσης

Κύτταρα σε λογαριθμική φάση ανάπτυξης τοποθετήθηκαν σε 0,25% θρυψίνη για την πέψη και φυγοκέντρηση και παρασκευάζονται σε ένα μονό κυτταρικό εναιώρημα με συγκέντρωση 1 × 10

5 /ml. Τα κύτταρα στη συνέχεια εμβολιάστηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων. Υπήρχαν τέσσερις ομάδες δείγμα ως ακολούθως: 1) Ομάδα άνευ αγωγής ελέγχου (έλεγχος), 2) ομάδα HMME (HMME), 3) καθαρού ομάδα υπερήχων (υπερηχογράφημα), και 4) υπέρηχος ομάδα συνδυασμένης HMME (SDT). Για την ομάδα SDT, HMME προστέθηκε μία ώρα πριν την παρέμβαση υπερήχων, η οποία ήταν 1,0 W /cm

2 σε 1 MHz για 60 s για Ishikawa και 2,0 W /cm

2 σε 1 MHz αντιμετωπίζεται 240 s για HEC- 1-α. Και η τελική συγκέντρωση της HMME ήταν 15 μg /ml για Ishikawa και 50 μg /ml για HEC-1-α. Ένα υγρό σφουγγάρι τοποθετήθηκε ανάμεσα στο κάτω μέρος της πλάκας καλλιέργειας και τον ανιχνευτή υπερήχων για να αποτρέψει πολλαπλές αντανακλάσεις των υπερήχων. Μετά την ακτινοβόληση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε πέψη και συλλέχθηκαν αμέσως, στη συνέχεια μεταφέρονται σε πλάκες 96-φρεατίων μετά τη ρύθμιση της συγκέντρωσης, με 100 μΐ σε κάθε φρεάτιο. Δύο ώρες αργότερα, 10 μΐ κυττάρων Μετρώντας Kit-8 αντιδραστήριο (CCK-8, Dojindo) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο. Μετά από μία ώρα επιπλέον πολιτισμού, απορρόφηση στα 490 nm μετρήθηκε με τη χρήση ενός αυτόματου οργάνου ένζυμο σήμα (Multiskan MK3, Θέρμο) [13].

2.3. Προετοιμασία για Χαρακτηρισμός του Κυττάρου Μορφολογία και Υποδομή

Η μορφολογία και προσκολλημένα ανάπτυξη των κυττάρων παρατηρήθηκαν 6h μετά τις τέσσερις διαφορετικές αγωγές με τη χρήση ενός ανάστροφου μικροσκοπίου (Olympus CKX4). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε πέψη σε 0.25% θρυψίνη για 90s, πλύθηκαν με αλατούχο φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα, στη συνέχεια, φυγοκεντρείται στα 2000 r /min για 5 λεπτά. Αφαίρεση του υπερκειμένου, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν μεταξύ 2,5% γλουταραλδεΰδη και 1% οσμικό οξύ, αφυδατώθηκαν με αιθανόλη και ακετόνη, ενσωματωμένα σε Epon812 εποξική ρητίνη, και κόβεται από III εξαιρετικά λεπτές τεμαχιστή. Τα δείγματα στη συνέχεια διπλό βαμμένα με οξικό ουρανύλιο και κιτρικό μόλυβδο, και στη συνέχεια, που χαρακτηρίζεται από τη χρήση ενός εκπομπής πεδίου μικροσκοπία μετάδοσης ηλεκτρονίου (ΤΕΜ, JEM-2010, JEOL).

2.4. Η απόπτωση Ανάλυση

6 ώρες μετά τις θεραπείες, τα κύτταρα από τις τέσσερις ομάδες που αναφέρονται παραπάνω συλλέχθηκαν και μετρήθηκαν, κατόπιν κονσέρβες αποφεύγοντας φως για 15 λεπτά μετά από προσθήκη 10 μΙ ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) -σημασμένου Αηηβχίην (20 μg /ml) για 1 × 10

6 κύτταρα. Στη συνέχεια, προστέθηκαν 5 μΐ ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ) (50 μg /ml). Μετά την αντίδραση για 5 λεπτά, 400 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος δέσμευσης ήταν μικτή. Τα δείγματα εξετάστηκαν με κυτταρόμετρο ροής (BD FACSCanto) αμέσως.

2.5. Δραστικών μορφών οξυγόνου (ROS) και δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης (ΜΜΡ)

Μετά την υπερηχητική ακτινοβολία, τα κύτταρα επωάστηκαν για 2 ώρες. 2’7′-διχλωροφθορεσκεϊνης διοξεικό (DCFH-DA, Beyotime) και Rhodamine123 (Sigma) με τελική συγκέντρωση 10 μmol /L και 200 ​​nmol /L προστέθηκαν σε κάθε δείγμα για τη δοκιμή ROS και ΜΜΡ. Σε αμφότερες τις περιπτώσεις, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C με 5% CO

2 αποφεύγοντας φως για 30 λεπτά. Η ένταση φθορισμού μετρήθηκε στη συνέχεια με ένα κυτταρόμετρο ροής σε διέγερση και μήκος κύματος εκπομπής 480 nm και 520 nm για τη δοκιμή ROS, και 490 nm και 530 nm για τη δοκιμή ΜΜΡ, αντίστοιχα.

2.6. Προσδιορισμός του ενδοκυτταρικού ασβεστίου (Ca) συγκέντρωση ιόντων

ενδομητρίου καρκινικά κύτταρα ελέγχου και ομάδα SDT πλύθηκαν τρεις φορές με φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα, φορτωμένο με Fluo-3 /AM (Bio-Rad) με τελική συγκέντρωση 10 μmol /L στους 37 ° C για 45 λεπτά, και στη συνέχεια μεταφέρθηκε σε ένα ειδικό μικρό αυλάκι. Η ένταση φθορισμού ελέγχθηκε από ένα συνεστιακό λέιζερ σάρωσης μικροσκόπιο (Meridian, Insight-PlusIQ) με διέγερση λέιζερ αργού των 488 nm. Η ελεύθερη Ca

2+ συγκέντρωση στα κύτταρα διαβαθμίστηκε με την εξίσωση: [

Ca

2 +] =

K

δ

[ ,,,0],(

F

–

F

min) /(

F

max –

F

)], όπου

K

δ

είναι 400 nMol,

F

είναι η μετρούμενη σχετική αξία φθορισμού,

F

max

είναι η μέγιστη τιμή φθορισμού μετά την προσθήκη 10 mmol /L 4-Br-Α23187 υψηλής υγρό Ca (10 mmol /LK

2CaEGTA, 10 mmol /L K-σφουγγαρίστρες και 100 mmol /L ΚΟΙ, Bio-Rad Company),

F

min

είναι η ελάχιστη τιμή φθορισμού μετά την προσθήκη 10 mmol /L 4-Br-Α23187 Ca-free λύση [14]. Αυτή είναι μια σχετικά απλή και χαμηλού κόστους μέθοδος που εφαρμόζεται συνήθως για ενδοκυτταρική Ca

2+ συγκέντρωση.

2.7. Έκφρασης των αποπτωτικών πρωτεϊνών που έχουν σχέση

Η απόπτωση που σχετίζονται με πρωτεΐνες αναλύθηκαν 24 ώρες μετά από κάθε θεραπεία με κηλίδα western. Εν συντομία, τα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από διαφορετικές επεξεργασίες. Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με την γέλη SDS-PAGE και μετά μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF, οι οποίες κατ ‘αρχάς δεσμεύτηκαν με 5% αποβουτυρωμένο γάλα και στη συνέχεια επωάστηκαν με ειδικά αντισώματα, όπως αναφέρεται στα σχήματα στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Οι συζευγμένη με υπεροξειδάση χρόνου δευτερεύοντος προστέθηκαν μετά. Η έκφραση των πρωτεϊνών έγινε ορατή από το σύστημα ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (ECL) (Thermo Scientific Pierce).

2.8. Στατιστική Ανάλυση

Όλα τα πειράματα επαναλαμβάνονται τρεις φορές ανεξάρτητα στα διάφορα κύτταρα. Το SPSS έκδοση 13.0 για Windows (SPSS Inc., Chicago, Illinois) χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των δεδομένων. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τετράγωνο απόκλιση (SD). Η ημερομηνία αναλύθηκε χρησιμοποιώντας μη ζευγαρωμένο t-test. P & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

3.1.. Επίδραση της SDT σε ποσοστό επιβίωσης των Κύτταρα καρκίνου του ενδομητρίου

Για να αξιολογηθεί η επίδραση της SDT στη βιωσιμότητα των κυττάρων, μια δοκιμασία CKK-8 εφαρμόστηκε σε Ishikawa και HEC-1-α κύτταρα σε διαφορετικές θεραπείες, όπως αναφέρεται στο σχήμα 1. Το ποσοστό επιβίωσης μειώνεται με απλή θεραπεία είτε HMME ή υπερηχογράφημα τόσο Ishikawa και HEC-1-α κύτταρα (σχήμα 1). Είναι ενδιαφέρον, βιωσιμότητα κυττάρου των κυττάρων Ishikawa μειώνεται στο 33,99 ± 4,06% με 1 MHz υπερήχων (1.0 W /cm

2) για 60 s? ενώ κανένας προφανής παρατηρείται αναστολή της ανάπτυξης στο HEC-1-α κυττάρων κάτω από τις ίδιες συνθήκες (Ανατρέξτε στο S1 Α σχήμα). Επιπλέον, έχει βρεθεί ότι η κυτταρική βιωσιμότητα του HEC-1-α κυττάρων διατηρείται όχι μικρότερη από 81,39 ± 4,83% κατά την κατεργασία, ακόμη και με ισχυρότερη υπερήχων (2,0 W /cm

2) για παράταση της διάρκειας από 60 s έως 240 s (S1B σχήμα). Αυτό δείχνει άμεσα την ευαισθησία του Ishikawa και αντοχή του HEC-1-α κατά την κατεργασία με υπερήχους. Είναι σημαντικό ότι, όπως φαίνεται στο σχήμα 1, αν και υπέρηχος αναστέλλει κυτταρική βιωσιμότητα του ενδομητρίου καρκινικών κυττάρων σε διαφορετικούς επεκταθεί, της συνέργειας των υπερήχων με HMME μπορεί σταθερά και ουσιαστικά να διεγείρουν ένα μεγάλο βαθμό ενισχυμένη θανάτωση αποτελεσματικότητα, δηλαδή 165% και 115%, όπως αυτό των υπερήχων μόνη της σε HEC-1-α και κύτταρα Ishikawa, αντίστοιχα.

δοκιμασία CCK-8 χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση των κυττάρων βιωσιμότητες τον έλεγχο, HMME, υπερήχων και ομάδες SDT σε Ishikawa (α) και HEC-1-α (b ) κύτταρα. HMME ή υπέρηχος δείχνει μια προφανή ανασταλτική επίδραση στην επιβίωση των κυττάρων. SDT αναστέλλει την κυτταρική βιωσιμότητα πιο αποτελεσματικά από ό, τι είτε εφάπαξ αγωγή. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση ± SD (η = 3), ** Ρ & lt? 0.01.

Η

3.2. Επίδραση του ΚΟΤ για τη μορφολογία και Υποδομή των Κύτταρα καρκίνου του ενδομητρίου

Επίσκεψη από τις εικόνες στην Εικόνα 2, για τις ομάδες ελέγχου και HMME, τα περισσότερα κύτταρα αναπτύσσονται προσκολλημένα και ομοιόμορφα σε μια δομή «ανοίγοντας πέτρα», δείχνει σαφή περίγραμμα, καλή διαφάνεια και τη ζωτικότητα? ενώ τα κύτταρα του υπερήχου και της ομάδας SDT είναι ανεπαρκώς διαφανείς, δεν στερεώνεται σταθερά ή ακόμα και αναστολή, και η μορφολογία των κυττάρων μέρος γίνεται κυκλική.

Η μορφολογία και η προσκολλημένη ανάπτυξη του Ishikawa (α) και HEC-1-α (β) κύτταρα παρατηρήθηκαν 6h μετά τις τέσσερις διαφορετικές αγωγές με τη χρήση ενός ανεστραμμένου οπτικού μικροσκοπίου (Olympus CKX4). Οι ομάδες ελέγχου δείχνουν προσκολλημένα κύτταρα που αναπτύχθηκαν με σαφή περίγραμμα και καλή διαφάνεια? υπερηχογράφημα και η ομάδα SDT δείχνουν ελάχιστα διαφανή κύτταρα, τα οποία δεν είναι σταθερά προσκολλημένο ή ακόμα και αναστολή. Η μεγέθυνση όλων των εικόνων είναι 40 φορές, γραμμή κλίμακας = 100 μm.

Η

Περισσότερες λεπτομέρειες μπορούν να διερευνηθούν από τις εικόνες TEM στο σχήμα 3. Έχει βρεθεί ότι τα κύτταρα της ομάδας ελέγχου και HMME κατέχουν ανέπαφη κυττάρων και πυρηνικών μεμβρανών, σαφείς δομές οργανίδιο και πλήρη μιτοχονδριακό δομές χωρίς εμφανή τροποποίηση. Όσον αφορά την ομάδα υπερήχων, η χρωματίνης πυρήνα του κυττάρου είναι προφανώς περιτυλιγμένα ή πάγωσε και περιθωριοποιημένων? τα μιτοχόνδρια γίνει πρησμένο, παραμορφωμένα και κενοτοπικής, και το λυσόσωμα αυξάνεται, πράγμα που είναι όλες οι ενδείξεις προς την κυτταρική απόπτωση. Για την ομάδα SDT, τυπικά φαινόμενα της απόπτωσης μπορεί ήδη να παρατηρηθεί από τα κύτταρα, όπου οι πυρήνες είναι υπό προφανές πύκνωση σε μια ετερογενή δομή μπλοκ, παρουσιάζοντας μικρή αποπτωτικά σώματα, διευρυμένη περιπυρηνικού κενά και τα πυρηνικά τους πόρους, επεκτάθηκε συσκευής Golgi και στο ενδοπλασματικό δίκτυο υπό αποκοκκίωση, καθώς και θολή ή εξαφανίστηκαν μιτοχονδριακό ακρολοφίες. Μερικά κύτταρα δείχνουν ακόμη συσσωρευμένη κόκκος του γλυκογόνου στο κυτταρόπλασμα τους με μειωμένο όγκο των κυττάρων.

Η υποδομή των τεσσάρων κυττάρων ομάδα χαρακτηρίζεται από την ηλεκτρονική μικροσκοπία μετάδοσης (ΤΕΜ, JEM-2010, JEOL). (Α) τον έλεγχο και (β) ομάδα HMME, δείχνοντας ανέπαφη κυτταρική μεμβράνη και την πυρηνική μεμβράνη, σαφή δομή οργανίδιο και ολοκληρωμένη δομή των μιτοχονδρίων, χωρίς προφανή τροποποίηση? (Γ) την ομάδα υπερήχων, που δείχνουν τάση προς την κυτταρική απόπτωση, συμπεριλαμβανομένων περιτυλιγμένα ή πάγωσε και περιθωριοποιημένων πυρήνα χρωματίνης των κυττάρων, παραμορφωμένα και κενοτοπικής μιτοχόνδρια και αυξημένη λυσόσωμα? (D) ομάδα SDT, δείχνοντας τυπικά φαινόμενα της απόπτωσης, όπου οι πυρήνες είναι υπό προφανείς πύκνωση σε μια ετερογενή δομή μπλοκ, με μικρές αποπτωτικά σώματα, διευρυμένη περιπυρηνική χάσμα και πυρηνικού πόρου, επεκτάθηκε συσκευή Golgi και στο ενδοπλασματικό δίκτυο υπό αποκοκκοποίηση, καθώς και θολές ή εξαφανίστηκαν μιτοχονδριακή ακρολοφίες. Η κλίμακα μπαρ σε όλες τις εικόνες είναι 2 μm.

Η

3.3. Επίδραση του ΚΟΤ για ROS Γενιάς και MMP Μείωση

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4, το αποπτωτικό ποσοστό του ΚΟΤ, υπερήχων, HMME και η ομάδα ελέγχου είναι 96,66 ± 0,45%, 91,21 ± 3,44%, 4,75 ± 1,10% και 0,42 ± 0,35%, αντίστοιχα, σε κύτταρα Ishikawa και 67,54 ± 12,65%, 18,88 ± 3,73%, 43,50 ± 5,02% και 3,09 ± 1,37%, αντίστοιχα, σε HEC-1-α κύτταρα. Η επαγόμενη απόπτωση συσχετίζεται αντίστροφα με τη βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίζεται με CCK-8 δοκιμασία στις τέσσερις διαφορετικές ομάδες (S1 Σχήμα και το Σχήμα 4), γεγονός που υποδηλώνει ότι η απόπτωση είναι ένας από κύριους μηχανισμούς που αποδίδουν στη χαμηλή βιωσιμότητα κυττάρου κατά θεραπείες. Τα ποσοστά της απόπτωσης σε ομάδες SDT είναι σημαντικά αυξημένη σε σύγκριση με είτε HMME ή θεραπεία με υπερήχους μόνη της σε δύο κύτταρα Ishikawa (ρ & lt? 0,05, Σχήμα 4Β) και HEC-1-α κυττάρων (ρ & lt? 0,01, Σχήμα 4D). Παρ ‘όλα αυτά, SDT προωθεί κυρίως πρώιμη απόπτωση σε κύτταρα Ishikawa (Σχήμα 4Α), ενώ αργότερα απόπτωση σε HEC-1-μια περίπτωση (Εικόνα 4C).

Τα επίπεδα απόπτωσης είναι πολύ υψηλότερα σε ομάδες SDT από τον έλεγχο, HMME ή ομάδες υπερήχων σε Ishikawa (α και β) και HEC-1-α (γ και δ) κύτταρα. προφίλ Εκπρόσωπος FACS έδειξαν στο a και c. Ιστογράμματα παρούσα μέση τιμή ± SD τριών ανεξάρτητων πειραμάτων (β και δ, * P & lt? 0,05? ** P & lt?. 0.01)

Η

Η ενδοκυτταρική ROS είναι σημαντικοί μεσολαβητές της απόπτωσης [15]. Για να καταλάβουμε αν επάγεται SDT απόπτωση οφείλεται στην παραγωγή ROS, τα επίπεδα ROS οπτικοποιήθηκε με DCF-Α, ένας ανιχνευτής που φθορίζει όταν οξειδωθεί. Έχει βρεθεί ότι μεταξύ τέσσερις διαφορετικές ομάδες, SDT μπορεί να αυξήσει πιο σημαντικά τα επίπεδα ROS και στις δύο Ishikawa και HEC-1-α κυττάρων (ρ & lt? 0,01, Σχήμα 5). Σε σύγκριση με υπερήχους, ο ρυθμός δημιουργίας ROS ομάδων SDT είναι αυξημένη έως και 1,48-φορές σε κύτταρα Ishikawa (ρ & lt? 0,01) και 4,7-φορές σε HEC-1-α κυττάρων (ρ & lt? 0,01), αντίστοιχα

επίπεδα ROS σημαντικά ενισχυμένη σε ομάδες SDT, σε σύγκριση με τον έλεγχο, HMME, και ομάδες υπερήχων σε Ishikawa (α και β) και HEC-1-α (γ και δ) κύτταρα. προφίλ Εκπρόσωπος FACS έδειξαν στο a και c. Ιστογράμματα παρούσα μέση τιμή ± SD τριών ανεξάρτητων πειραμάτων (β και δ, ** P & lt?. 0.01)

Η

Ενισχυμένη ROS μπορεί να προκαλέσει αλλαγές των ΜΜΡ, η οποία προάγει περαιτέρω την απόπτωση εξέλιξη [16]. Το δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης έτσι μετράται από κύτταρα επεξεργασμένα με ροδαμίνη. Όπως φαίνεται στο σχήμα 6, μια ελαφρά μείωση του ΜΜΡ παρατηρείται σε HMME και υπερήχων ομάδες για τόσο Ishikawa και HEC-1-α κύτταρα. Είναι σημαντικό ότι, η απώλεια της ΜΜΡ γίνεται πολύ πιο εμφανής στην ομάδα SDT σύγκριση με τις ομάδες μονο-θεραπεία σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές που εμπλέκονται. (Ρ & lt? 0,01)

Ishikawa (α και β) και HEC-1-Α (C και D) υποβλήθηκαν σε τέσσερις διαφορετικές επεξεργασίες: έλεγχος, HMME, υπερήχων και SDT. Απώλεια της ΜΜΡ ήταν περισσότερο εμφανής στην ομάδα SDT από τις άλλες ομάδες. προφίλ Εκπρόσωπος FACS έδειξαν στο a και c. Ιστογράμματα παρούσα μέση τιμή ± SD τριών ανεξάρτητων πειραμάτων (β και δ, ** P & lt? 0.01.)

Η

3.4. Επίδραση του ΚΟΤ για ενδοκυτταρικού Ca Ion Συγκέντρωση

Όπως αναφέρεται στο σχήμα 7 και στον Πίνακα 1, η συγκέντρωση των ιόντων Ca σε Ishikawa κύτταρα του ενδομητρίου για τον έλεγχο, HMME, υπερηχογράφημα και η ομάδα SDT είναι 92.533 nmol, 204.539 nmol, 2991.485 nmol και 3455.750 nmol αντίστοιχα. Προφανώς, η ενδοκυτταρική Ca

2+ συγκέντρωση με κατεργασία με υπερήχους μπορεί να αυξηθεί σε 32,3 φορές σε σύγκριση με εκείνη της ομάδας ελέγχου, και SDT μπορεί να προκαλέσει μια περαιτέρω αύξηση της συγκέντρωσης σε περίπου 37,3 φορές.

φθορισμού ένταση του καρκίνου του ενδομητρίου Ishikawa κύτταρα 1 ώρα μετά τις θεραπείες υποβλήθηκε σε συνεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης με λέιζερ (Meridian, Insight-PlusIQ) με διέγερση λέιζερ αργού των 488 nm. (Α) Ο έλεγχος και (β) ομάδα SDT, δείχνοντας την ενδοκυτταρική συγκέντρωση ιόντων ασβεστίου σε SDT είναι πολύ υψηλότερη από ότι στην ομάδα ελέγχου.

Η

3.5. Επίδραση της SDT στην έκφραση των αποπτωτικών πρωτεϊνών που σχετίζονται με

Για να κατανοήσουμε τους μοριακούς μηχανισμούς της SDT-επαγόμενης απόπτωσης, η ενεργοποίηση της κασπάσης-3 και κασπάσης-8 εντοπίστηκε για πρώτη φορά από κηλίδωση Western μετά από διάφορες θεραπείες. Όπως φαίνεται στο σχήμα 8, και οι δύο διασπασμένη κασπάση-3 και κασπάση-8 ενισχύονται σημαντικά σε ομάδες SDT, υποδηλώνοντας οι δύο casapses ενεργοποιούνται κατά τη θεραπεία. Επιπλέον, η αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη survivin και Bcl-2 μειώθηκαν και το προ-αποπτωτικό Bax αυξάνεται με SDT. Επιπλέον, δείκτες οδού του υποδοχέα θανάτου, όπως Fas και Fas-L, ενισχύονται επίσης με SDT (Σχήμα 8). Αυτά τα δεδομένα μαζί πρότειναν ότι και οι δύο ενδογενών και εξωγενών οδών έχουν εμπλακεί σε SDT-επαγόμενη απόπτωση

Ishikawa (α) και HEC-1-α (β) υποβλήθηκαν σε τέσσερις διαφορετικές επεξεργασίες:. Έλεγχος, HMME, υπερηχογράφημα και SDT. Η απόπτωση που σχετίζονται δείκτες ανιχνεύθηκαν με κηλίδωση Western με ειδικά αντισώματα όπως υποδεικνύεται. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ένα στοιχείο ελέγχου φόρτωσης.

Η

Συζήτηση

Αν και υπερήχων έχει θεωρηθεί ως μια αποτελεσματική θεραπεία για καρκίνους, μη ικανοποιητική σκοτώνοντας αποτελέσματα έχουν προταθεί από HEC-1-α κύτταρα σε αυτή τη μελέτη και επίσης από προηγούμενες εργασίες [7]. Σημαντικά, SDT δρα όχι μόνο αποτελεσματικά σε υπερήχους ευαίσθητα κύτταρα Ishikawa, καθώς επίσης και τα υπερηχογραφήματα ανθεκτικά HEC-1-α κύτταρα, υποδεικνύοντας ότι SDT μπορεί να έχει εφαρμογές σε ευρύτερο φάσμα των καρκινικών κυττάρων. Η συνεργική δράση προ-απόπτωσης με το συνδυασμό της HMME και υπερήχων στην ενδομητρίου καρκίνων μπορεί να αποδοθεί σε δύο παράγοντες, δηλαδή την υψηλή απόδοση της HMME ως sonosensitizer και το αποτέλεσμα θανάτωσης των υπερήχων.

SDT έχει κανονικά δύο θανάτωση τρόπων επί κυττάρων όγκου, δηλαδή νέκρωση και απόπτωση [17]. Το κυρίαρχο αποπτωτικών-όπως η αλλαγή της μορφολογίας των κυττάρων και υποδομή φαίνεται στο ανεστραμμένο μικροσκόπιο και οι εικόνες ΤΕΜ επισημαίνει ότι η απόπτωση είναι ο κύριος τρόπος θανάτου των καρκινικών κυττάρων του ενδομητρίου στην παρούσα περίπτωση. Με βάση τα πειραματικά αποτελέσματα μας, οι πιθανοί μηχανισμοί SDT στην απόπτωση των καρκινικών κυττάρων του ενδομητρίου που προτείνονται ως εξής:

(1) Απώλεια της ΜΜΡ από την παραγωγή ROS και Bcl-2 οικογένεια εναλλαγή μπορεί να είναι ένα από SDT απόπτωση μονοπάτια.

η

είναι αποκάλυψε ότι ROS στα κύτταρα αντιμετωπίζονται από SDT είναι η πιο υπερβολική μεταξύ όλων των δειγμάτων. Υπό κανονικές συνθήκες, τα ίδια τα κύτταρα μπορεί να διαγράψει συνεχώς μικρά μόρια που παράγονται κατά την αερόβια αναπνοή, συμπεριλαμβανομένων μονήρες οξυγόνο [18,19]. Ωστόσο, σε μια ισορροπημένη κατάσταση, ενδοκυτταρική ROS μπορεί να συσσωρευτεί, ζημιές μιτοχονδριακής μεμβράνης και να μειώσει το δυναμικό της μεμβράνης [20-22]. Αυτό είναι συνεπές με τα πειραματικά αποτελέσματα, όπου το πιο σημαντικό ρυθμό παραγωγής ROS και ο ρυθμός μείωσης ΜΜΡ παρατηρήθηκαν ταυτόχρονα σε ομάδες SDT. Επιπλέον, το δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης υποβάλλεται επίσης σε ρύθμιση Bcl-2 μελών της οικογένειας. Σε αυτή τη μελέτη, Bcl-2 μέλος της οικογένειας Bax αυξάνεται και Bcl-2 μειώνεται σε ομάδες SDT. Η αυξημένη Bax μπορεί έτσι να σχηματίζουν Βαχ /Bax ομοδιμερή ή ανταγωνίζεται αντι-απόπτωση αποτέλεσμα Bcl-2 μέσω σχηματισμού Bax /Bcl-2 ετεροδιμερών στην εξωτερική μεμβράνη των μιτοχονδρίων [23]. Τέτοιες αλλαγές μπορούν στη συνέχεια να αυξήσει τη διαπερατότητα της μεμβράνης, έτσι ώστε η απόπτωση προάγουν παράγοντες, όπως το κυτόχρωμα c, θα απελευθερώσει από μιτοχόνδρια στο κυτοσόλιο, όπου ενεργοποιούν καταρράκτες κασπάσης και τελικά να οδηγήσει σε απόπτωση των καρκινικών κυττάρων του ενδομητρίου. Ως εκ τούτου, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η υπερβολική ROS και οι αλλαγές των μελών οικογένειας Bcl-2 σε SDT μπορεί να ενεργοποιήσει την ενδογενή οδό απόπτωση επηρεάζοντας μιτοχόνδρια μεμβράνης δυναμικά.

(2) Υπερφόρτωση ιόντα Ca στα κύτταρα μπορεί να είναι ένας άλλος σημαντικός παράγοντας για την εγγενή το κύτταρο απόπτωσης σε SDT.

η

η υπερφόρτωση των ιόντων Ca περιλαμβάνει διάφορες διαδικασίες απόπτωση, ιδίως τα ανάντη ρύθμιση αυτών. Τα ιόντα Ca αποθηκεύονται κανονικά στο ενδοπλασματικό δίκτυο. Το ενδοπλασμικό δίκτυο στρες που οφείλεται στην υπερβολική ROS [14] μπορεί να αυξήσει Ca

2+ χωρητικότητα αποθήκευσης των κυττάρων καθώς και την ταχύτητα απελευθέρωσης Ca

2+ στα κύτταρα. Όπως αποδεικνύεται από τα παρόντα αποτελέσματα συνεστιακό μικροσκόπιο, Ca

υπερφόρτωση 2+ στα κύτταρα είναι μάλλον σοβαρή για την ομάδα SDT. Δεδομένου ότι η απελευθέρωση του κυτοχρώματος c έχει μια θετική ανατροφοδότηση σχετικά με το Ca

2 + συγκέντρωση [24-26], η Ca

υπερφόρτωση 2+ στο SDT μπορεί να είναι ένα άλλο διεγερτικό για τη μεγάλη απελευθέρωση του κυτοχρώματος c, η οποία στη συνέχεια ενεργοποιεί κασπάσης-3 και επάγουν την κυτταρική απόπτωση, όπως αναφέρεται ανωτέρω.

(3) SDT μπορεί να φιμώσουν αποτελεσματικά επιζών γονίδιο.

η

Πρόσφατα, έχει αποδειχθεί ότι το ποσοστό έκφραση survivin σε καρκίνο του ενδομητρίου ιστός είναι (100%) υψηλότερη από ότι στην πλέον υπερπλασία του ενδομητρίου (73%) [27], υποδηλώνοντας ότι η survivin μπορεί να σχετίζεται στενά με κακοήθη μετασχηματισμό του ενδομητρίου. Το πιο σημαντικό, νωρίτερα το έργο έχει επισημάνει ότι η survivin πρωτεΐνη επιβίωσης μπορεί να αναστέλλει έντονα την απόπτωση που διεγείρεται από διάφορους παράγοντες [28]. Σίγαση survivin μπορεί επομένως να σπάσει την προστασία και ευνοούν την απόπτωση των καρκινικών κυττάρων. Στην εργασία αυτή, SDT έχει αποδειχθεί ότι είναι ένας αποτελεσματικός τρόπος για την καταστολή του γονιδίου αυτού, που οδηγεί σε ένα εξαιρετικά εξασθενημένο έκφραση survivin και αποτελεσματικότερη ενεργοποίηση της κασπάσης-8 και κασπάσης-3 σε σύγκριση με τις τρεις άλλες ομάδες.

(4) εξωγενή οδό μπορεί να βοηθήσει τις εγγενείς παράγοντες για την απόπτωση σε SDT.

Η

Η παρουσία του Fas /Fas-L είναι ένα σημάδι του θανάτου μεσολάβηση υποδοχέα εξωγενή οδό της απόπτωσης όπου κασπάσης-8 πράξεις ως σημαντικό κασπάσης έναρξη και κασπάσης-3 είναι το εκτελεστικό κασπάσης. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι οι πρωτεΐνες του υποδοχέα θανάτου Fas /Fas-L αυξήθηκε σημαντικά στις ομάδες SDT και τόσο κασπάσης-8 και κασπάσης-3 ενεργοποιούνται με την ίδια θεραπευτική αγωγή, η οποία δείχνει άμεσα την ενεργοποίηση της εξωγενούς αποπτωτικών οδών σε απόκριση σε SDT.

εν περιλήψει, SDT μπορεί να αναστέλλει σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του ενδομητρίου, πολύ πιο αποτελεσματική από HMME ή υπερηχογράφημα μόνο στις δύο ευαίσθητων και ανθεκτικών υπερήχους κύτταρα. Η απόπτωση που προκαλείται από HMME-SDT περιλαμβάνει πολλαπλές οδούς, συμπεριλαμβανομένων ενδογενή οδό αποπτωτικών ενεργοποιείται από την παραγωγή ROS, μείωση ΜΜΡ και Ca

υπερφόρτωση 2+, αποτελεσματική σιωπή του γονιδίου survivin, μαζί με Fas /Fas-L-μεσολάβηση εξωγενή οδό της απόπτωσης. Λαμβάνοντας υπόψη την αξιοσημείωτη αποτελεσματικότητα και στα δύο ευαίσθητα και ανθεκτικά υπερήχους κύτταρα, HMME-SDT μπορεί, επομένως, έχουν ανοίξει ένα νέο δρόμο αποκατάστασης για ασθενείς που δεν μπορούν να επιβιώσουν από τη χειρουργική επέμβαση, ακτινοθεραπεία ή χημειοθεραπεία, και οι οποίοι απαιτούν τη διατήρηση οργάνων, ακόμη και αναπαραγωγικές λειτουργίες.

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 Εικ. Ultrasound ευαισθησία του ενδομητρίου καρκινικών κυττάρων αναλύθηκε με CKK-8 προσδιορισμούς.

(Α) Ishikawa και HEC-1-α κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με υπέρηχο (1 MHz) στην ένταση του 1.0 W /cm

2 για 60 s και στη συνέχεια υποβάλλεται σε μια δοκιμασία CKK-8. Ishikawa είναι πιο ευαίσθητα σε κατεργασία με υπερήχους από HEC-1-α. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση ± SD (η = 3), ** Ρ & lt? 0.01. ανθεκτικά (β) Ultrasound HEC-1-α κύτταρα κατεργάστηκαν με υπερήχους σε αυξημένη ένταση 2,0 W /cm

2 για 0 ​​s, 60 s, 120 s, και 240 s, αντίστοιχα. Μια μικρή και χρονο-εξαρτώμενη αναστολή κυτταρικής βιωσιμότητας παρατηρείται με τις θεραπείες. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD (n = 3)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0137980.s001

(ΔΕΘ)