Αφηρημένο

έχουν εντοπιστεί στον καρκίνο του προστάτη (PCA), κυρίως με τη χρήση δοκιμασιών υποψήφιο γονίδιο που βασίζεται Πολλοί διαφορικά μεθυλιωμένα γονίδια. Πρόσφατα, έχουν πολλές παγκόσμιες προφίλ μεθυλίωσης του DNA έχουν αναφερθεί σε προστάτη, ωστόσο, κάθε ένα από αυτά έχει αδυναμίες όσον αφορά την ικανότητα να παρατηρεί παγκόσμια μεθυλίωση του DNA μεταβολές στη ΣΕΣΣ. Υποθέτουμε ότι εξακολουθεί να υπάρχει άγνωστος παρεκκλίνουσα μεθυλίωση του DNA σε PCa, τα οποία μπορούν να ταυτοποιηθούν χρησιμοποιώντας υψηλότερη ανάλυση μεθόδους προσδιορισμού. Χρησιμοποιήσαμε το νεοαποκτηθέντα Illumina HumanMethylation450 BeadChip στο προστάτη (

n

= 19) και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών (

n

= 4) και σε συνδυασμό αυτών με δεδομένα γονιδιακής έκφρασης για τον εντοπισμό νέων μεθυλίωσης του DNA που μπορεί να έχουν λειτουργικές συνέπειες στην ανάπτυξη και την εξέλιξη του προστάτη. Επιβεβαιώσαμε επίσης τα αποτελέσματα της μεθυλίωσης μας σε ένα ανεξάρτητο σύνολο δεδομένων. Δύο παρεκκλίνουσα γονίδια μεθυλίωση του DNA επικυρώθηκαν μεταξύ των επιπλέον 56 δείγματα προστάτη και 55 παρακείμενων φυσιολογικών ιστών. Ένα σύνολο 28.735 τοποθεσίες CpG έδειξε σημαντικές διαφορές στο DNA μεθυλίωση (FDR προσαρμοστεί

P

& lt? 0.05), που ορίζεται ως η διαφορά μέσης μεθυλίωσης τουλάχιστον 20% μεταξύ του προστάτη και φυσιολογικά δείγματα. Επιπλέον, ένα σύνολο 122 γονιδίων είχαν περισσότερες από μια διαφορικά μεθυλιωμένο CpG τοποθεσία στην περιοχή του υποκινητή και ένα πρότυπο έκφρασης γονιδίου που ήταν αντίστροφη προς την κατεύθυνση της μεταβολής στην μεθυλίωσης του DNA (π.χ. μειωμένη έκφραση με αυξημένη μεθυλίωση, και αντίστροφα). Παρεκκλίνουσα μεθυλίωση του DNA των δύο γονιδίων,

ΑΟΧ1

και

SPON2,

επιβεβαιώθηκαν μέσω όξινο θειικό αλληλουχίας, με τις περισσότερες από τις αντίστοιχες θέσεις CpG δείχνει σημαντικές διαφορές μεταξύ των δειγμάτων όγκων και φυσιολογικών ιστών. Η

ΑΟΧ1

περιοχή του υποκινητή έδειξε υπερμεθυλίωση στο 92,6% των 54 δειγμάτων που ελέγχθηκαν PCA σε αντίθεση με μόνο τρεις από τους 53 δοκιμαστεί φυσιολογικούς ιστούς. Αυτή η μελέτη χρησιμοποίησε ένα νέο BeadChip σε συνδυασμό με τα δεδομένα γονιδιακής έκφρασης σε προστάτη για τον εντοπισμό νέων διαφορικά μεθυλιωμένο CpG θέσεις που βρίσκονται μέσα στα γονίδια. Τα πρόσφατα εντοπίστηκαν διαφορικά μεθυλιωμένο γονίδια μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως βιοδείκτες για την PCA διάγνωση

Παράθεση:. Kim JW, Kim S-T, Turner AR, Νέοι Τ, Smith S, Liu W, et al. (2012) Προσδιορισμός της Νέας διαφορικά Methylated γονίδια που έχουν πιθανές λειτουργικές συνέπειες στον καρκίνο του προστάτη. PLoS ONE 7 (10): e48455. doi: 10.1371 /journal.pone.0048455

Επιμέλεια: Ludmila Prokunina-Olsson, Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 17 Ιουλίου 2012? Αποδεκτές: 26 Σεπτέμβρη 2012? Δημοσιεύθηκε: 31 Οκτώβρη, 2012

Copyright: © 2012 Kim et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας χορηγεί CA106523, CA95052, και CA105055 (σε JX)? CA135008 (σε WL και WBI)? CA133066 (σε WL και JWK) και το Υπουργείο Άμυνας PC051264 επιχορήγησης (έως JX). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

μεθυλίωση του DNA είναι ένας ομοιοπολικός προσθήκη μιας ομάδας μεθυλίου στον άνθρακα 5 θέση μιας βάσης κυτοσίνης και αυτό επιγενετικές αλλαγή βρίσκεται σχεδόν αποκλειστικά στα δινουκλεοτίδια κυτοσίνης γουανίνης (CpG) σε διαφοροποιημένα ανθρώπινα κύτταρα [1]. Οι θέσεις CpG βρίσκονται κυρίως σε επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες ή CpG νησίδες (CGI), οι οποίες είναι CpG πλούσιων περιοχών που μπορούν να βρεθούν σε όλο το ανθρώπινο γονιδίωμα. Σε φυσιολογικό ανθρώπινο εγκεφαλικό ιστό, λιγότερο από το 3% του CGIs βρίσκονται σε περιοχές προαγωγού βρέθηκαν να είναι μεθυλιωμένο, σε αντίθεση μέχρι 34% του CGI βρίσκονται σε διαγονιδιακών περιοχών μεθυλιώθηκαν [2]. Ωστόσο, CGI μεθυλίωση σε περιοχές προαγωγού είναι καλά τεκμηριωμένη σε πολλές μελέτες, λόγω σύνδεσης με γονιδιακής σίγησης [3] – [5]

Η ανώμαλη μεθυλίωση του DNA μεταξύ των δειγμάτων του καρκίνου και των φυσιολογικών ιστών έχει ευρέως παρατηρηθεί σε διάφορους καρκίνους συμπεριλαμβανομένου. προστάτη [6] – [9]. Περισσότεροι από 67 διαφορικά μεθυλιωμένα γονίδια εντοπίστηκαν σε PCa, κυρίως με βάση τις μεθόδους γονιδιακής-ειδική δοκιμασία [10]. Πρόσφατες εξελίξεις σε state-of-the-art τεχνικές, όπως η τεχνολογία των μικροσυστοιχιών και αλληλουχίας επόμενης γενιάς έχουν μπαίνει σε μια νέα εποχή της Γενετικής σε μελέτες μεθυλίωση του DNA [11] – [14]. Πολλαπλές μελέτες έχουν αναφέρει ανώμαλες μορφές του γονιδιώματος σε επίπεδο μεθυλίωσης του DNA σε δείγματα ιστού PCa, χρησιμοποιώντας Agilent CpG νησιού μικροσυστοιχίες, Illumina HumanMethylation27 (HM27) BeadChips ή μεθόδους αλληλούχισης επόμενης γενιάς [15] – [20]. Τέσσερα χαρτιά έχουν αναφέρει τα προφίλ της μεθυλίωσης DNA με τη χρήση του HM27 BeadChip [17] – [20]. Kobayashi et al. ανέφεραν περισσότερες από 8000 διαφορικά μεθυλιωμένες CpG θέσεις (DMCs) σε δείγματα προστάτη σε σύγκριση με παρακείμενες φυσιολογικούς ιστούς χρησιμοποιώντας έναν σχετικά μεγάλο αριθμό δειγμάτων [18]. Mahapatra et al. εντόπισαν και επιβεβαίωσαν πολλές παρεκκλίνοντα μεθυλιωμένα γονίδια τα οποία μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως διαγνωστικά ή προγνωστικά βιοδείκτες [20]. Αυτή η μέθοδος HM27 BeadChip παρέχει δεδομένα μεθυλίωσης του DNA σε ανάλυση μονού νουκλεοτιδίου σε περισσότερες από 27.000 τοποθεσίες CpG. Ωστόσο, αυτή η πλατφόρμα HM27 καλύπτει μόνο το 0,1% όλων των θέσεων CpG στο ανθρώπινο γονιδίωμα και όλων των τόπων δοκιμών CpG βρίσκονται σε περιοχές υποκινητή.

αλληλουχίας MethylPlex-επόμενης γενιάς (Μ-NGS) συνδυάζει την ενζυματική εμπλουτισμό των μεθυλιωμένων CpG νησίδες με μια τεχνική αλληλούχισης επόμενης γενιάς [16]. Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιήθηκε από τους Kim et al. για τον εντοπισμό 2481 ειδική για τον καρκίνο διαφορικά υπερμεθυλίωση περιοχών σε περιοχές υποκινητή με σύγκριση δειγμάτων PCa, δίπλα φυσιολογικούς ιστούς, και απαλλαγμένη από την ασθένεια ιστούς του προστάτη. Ωστόσο, κατά τη χρήση αυτής της μεθόδου, Kim et al. δεν ανέφερε κανένα αποτελέσματα για μεθυλιωμένος περιοχές της ΣΕΣΣ. Επιπλέον, το μέγεθος των διαφορικά υπερμεθυλίωση περιοχών που αναφέρθηκαν από τους Kim et al. ήταν σχετικά μεγάλο (3.000 ζεύγη βάσεων). Χρησιμοποιώντας αυτή τη μέθοδο, μπορεί να είναι δύσκολο να εντοπιστούν πυρήνα μεθυλιωμένα περιοχές που είναι κρίσιμες για τη ρύθμιση της έκφρασης γονιδίων? Ως εκ τούτου, ένα επιπλέον δοκιμασία απαιτείται για την ακριβή εκτίμηση της μεθυλίωσης του DNA σε μεμονωμένες θέσεις CpG [21]. Παρά τις αδυναμίες της κάθε τεχνικής, αυτές οι μελέτες μεθυλίωση του DNA του γονιδιώματος-ευρεία έχουν προσκομίσει αποδεικτικά στοιχεία ότι υπάρχουν πολλοί αγνώστων διαφορικά μεθυλιωμένων CpG θέσεις (ή οι περιφέρειες, ανάλογα με τις τεχνικές ανάλυσης), και αυτά αγνώστων DMC μπορεί να έχει σημαντική αξία ως νέο φάρμακο στόχους και διαγνωστικούς ή προγνωστικούς βιοδείκτες.

Illumina HumanMethylation450 (HM450) είναι μια νέα πλατφόρμα BeadChip, η οποία μπορεί να δοκιμάσει περισσότερα από 480.000 επιμέρους τόπους CpG στο ανθρώπινο γονιδίωμα [22], [23]. Η κάλυψη αυτή αντιστοιχεί σε περίπου 1,7% του συνόλου των CpG θέσεων στο ανθρώπινο γονιδίωμα, και αντιπροσωπεύει μια τεράστια αύξηση από τον προκάτοχό HM27 BeadChip (0,1% του συνόλου των CpG θέσεων). Η υψηλή συσχέτιση μεταξύ των δεδομένων HM450 και τα δεδομένα θειώδους αλληλουχίας ολόκληρου του γονιδιώματος δείχνει ότι η νέα αυτή BeadChip μπορεί να παρέχει αξιόπιστα στοιχεία μεθυλίωσης DNA για Γενετικής μελέτες προφίλ [23].

Θα διεξαχθεί μια πιλοτική μελέτη με αυτό το νέο HM450 BeadChip για την αξιολόγηση δείγματα προστάτη και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών. Ένα σύνολο γονιδίων που απορυθμισμένη από ανώμαλη μεθυλίωση του DNA σε PCa ταυτοποιήθηκε και στη συνέχεια συνδυάζονται με ανεξάρτητα δεδομένα γονιδιακής έκφρασης. Στη συνέχεια, επικεντρώθηκε σε δύο παρεκκλίνουσα γονίδια μεθυλίωση του DNA (

ΑΟΧ1

και

SPON2

), με αναλύσεις επιβεβαίωσης χρησιμοποιώντας επιπλέον του προστάτη και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών του προστάτη.

Υλικά και Μέθοδοι

μελέτη

Όλοι οι ιστοί δείγματα σε αυτή τη μελέτη ελήφθησαν από ασθενείς με καρκίνο του προστάτη που υποβάλλονται σε ριζική προστατεκτομή για την αντιμετώπιση της κλινικά εντοπισμένο νόσου στο Ινστιτούτο Karolinska, Σουηδία (

n

= 23) και το Johns Hopkins Hospital (JHH?

n

= 111). Όλα τα δείγματα προστάτη που χρησιμοποιείται για αυτή τη μελέτη συλλέχθηκαν μετά ελήφθησαν τα κατάλληλα εγκρίσεις ανθρώπινα υποκείμενα και γραπτή τεκμηρίωση της εν επιγνώσει συναίνεση παρασχέθηκε. Όλα τα πρωτόκολλα των μελετών εγκρίθηκαν από το Karolinska Institute ή το Johns Hopkins Hospital ή το Wake Forest University School of Medicine Διοικητικού κριτική Θεσμική. Θέμα δείγματα επιλέγονται με βάση την ικανότητα να αποκτήσουν γονιδιωματικό DNA επαρκή ποσότητα και καθαρότητα (& gt? 70% των καρκινικών κυττάρων για δείγματα καρκίνου, δεν υπάρχουν ανιχνεύσιμα καρκινικά κύτταρα για φυσιολογικά δείγματα) με macrodissection αντιστοιχισμένων γειτονικών μη-κακοήθη (εφεξής κανονική ) και του καρκίνου που περιέχουν περιοχές του ιστού του προστάτη όπως προσδιορίζεται με ιστολογική αξιολόγηση των αιματοξυλίνη και ηωσίνη χρωματισμένο κατεψυγμένες τομές ριζική προστατεκτομή δείγματα. Γονιδιωματικό DNA απομονώθηκε από καθαρισμένα κατεψυγμένοι ιστοί όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24].

μεθυλίωσης του DNA Δοκιμασία

Genome κλίμακα μεθυλίωσης DNA profiling εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας το BeadChip HM450 (Illumina, San Diego, CA) . Γενωμική DNA που τροποποιήθηκαν με χρήση του κιτ μεθυλίωση EZ-DNA (Zymo Έρευνας, Orange, CA) μετά από συστάσεις Illumina. Η δοκιμασία Illumina Infinium πραγματοποιήθηκε επίσης σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

δείγματα DNA τροποποιήθηκαν στο πλαίσιο της προετοιμασίας για αλληλούχιση όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25]. Bisulfite εκκινητές προσδιορισμού αλληλουχίας σχεδιάστηκαν από το λογισμικό Primer Express Methyl (Applied Biosystems, Foster City, CA) για την ενίσχυση όξινο θειώδες τροποποιημένο DNA (Πίνακας S1). Hot Start αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) (Qiagen, Valencia, CA) διεξήχθη χρησιμοποιώντας το ακόλουθο πρόγραμμα ποδηλασίας: 95 ° C για 15 λεπτά? 94 ° C για 30 δευτερόλεπτα, 56 ° C για 30 δευτερόλεπτα, και 72 ° C για 30 δευτερόλεπτα για 50 κύκλους? και ένα τελικό στάδιο στους 72 ° C για 10 λεπτά. Τα ενισχυμένα προϊόντα της PCR υποκλωνοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ κλωνοποίησης ΤΟΡΟ ΤΑ (Invitrogen, Carlsbad, CA). Μετά τον μετασχηματισμό του

Escherichia coli

, θα επιλέγονται τυχαία περίπου 10 με 20 ατομικές

Ε. coli

αποικίες για κάθε δείγμα αξιολογείται. Το DNA πλασμιδίου άμεσα ενισχύεται (κιτ ενίσχυσης Templiphi? GE Healthcare, Piscataway, NJ) και στη συνέχεια αλληλουχήθηκαν χρησιμοποιώντας κιτ αλληλουχίας κύκλου v1.1 BigDye Terminator (Applied Biosystems) με το εμπρόσθιο εκκινητήριο Μ13

Κάθε διθειώδες σετ εκκινητών προσδιορισμού αλληλουχίας. αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας σύνολα DNA ανασυσταθέντος ελέγχου που ήταν μείγματα σε διάφορες ποσότητες (0, 20, 50, 80 και 100% μεθυλίωσης) των δύο DNAs ελέγχου?

M.SssI

κατεργασμένα DNA όπως μεθυλιωμένο DNA (Millipore, Billerica, ΜΑ) και ολόκληρο το γονιδίωμα ενισχυμένο DNA ως μη μεθυλιωμένου DNA [26], [27].

Τα διθειώδες δεδομένα αλληλουχίας συγκρίθηκαν με την αλληλουχία αναφοράς γονιδιώματος UCSC, προκειμένου να εκτιμηθεί η κατάσταση μεθυλίωσης του κάθε τόπου CpG χρησιμοποιώντας λογισμικό BIQ Analyzer [28]. Οι κλώνοι με ένα ελάχιστο ποσοστό μετατροπής διθειώδους 95% περιελήφθησαν στις επόμενες αναλύσεις. Κάθε τοποθεσία CpG σε δεδομένα αλληλούχισης μας αριθμούνται από το 5 ‘προς 3’ κατεύθυνση. CpG θέσεις 2 και 34 στο

περιοχή του υποκινητή ΑΟΧ1

αποκλείστηκαν από την περαιτέρω ανάλυση, λόγω της συχνής λείπει μόνο νουκλεοτίδιο σε μεγάλες θυμίνη ομοπολυμερικής εκτείνεται γύρω από κάθε ένα από αυτά τα sites CpG.

Δημοσιεύθηκε μεθυλίωση και Έκφραση δεδομένα

δεδομένα μεθυλίωση Πρώτες DNA σε προστάτη χρησιμοποιώντας HM27 είχαν κατεβάσει από γονιδιακής έκφρασης Omnibus, ένα αποθετήριο δημόσιων δεδομένων [18]. Αυτά τα δεδομένα μεθυλίωση παρήχθησαν χρησιμοποιώντας 86 παρακείμενων φυσιολογικών ιστών του προστάτη και 92 στοιχειώδη δείγματα του προστάτη. δεδομένων γονιδιακής έκφρασης σε προστάτη, που βασίστηκε στην Affymetrix εξόνιο 1.0 ST Array είχαν κατεβάσει από την ιστοσελίδα πύλης δεδομένων (https://cbio.mskcc.org/cancergenomics/prostate/data/) [29]. Αυτά τα στοιχεία έκφρασης παράχθηκαν χρησιμοποιώντας 29 παρακείμενων φυσιολογικών ιστών, 131 στοιχειώδη δείγματα προστάτη και 19 μεταστατικό δείγματα του προστάτη. Ομαλοποιημένη ημερολόγιο

2 μεταμορφωθεί γονίδιο-επίπεδο (ολόκληρη μεταγραφή έντασης σήματος) δεδομένα χρησιμοποιήθηκαν για τη στατιστική ανάλυση.

Στατιστική Ανάλυση

Δεδομένα πρωτογενών HM450 ελήφθησαν με τη χρήση του λογισμικού GenomeStudio (Illumina) μετά τη σάρωση οι BeadChips. ρύθμιση του χρώματος ισορροπία, απλή κλιμάκωση εξομάλυνση, και χωρίς επίβλεψη ιεραρχική ανάλυση ομαδοποίησης διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το Bioconductor

lumi

πακέτο [30]. Η τιμή β (μεθυλίωση) υπολογίστηκε με βάση την προτεινόμενη εξίσωση από την Du et al. [31]. Η τιμή β είναι μια συνεχής μεταβλητή μεταξύ 0 και 1, με β αξίες πλησιάζει προς 1 (ή 0) υποδεικνύοντας πλήρη μεθυλίωση (ή καθόλου μεθυλίωση, αντίστοιχα) σε κάθε θέση CpG. CpG περιοχές που είχαν την ανίχνευση

P

τιμές μεγαλύτερες από 0.05, αποκλείστηκαν.

Σύνδεσης μεταξύ κάθε φαινοτύπου ή κλινικοπαθολογοανατομικών παραμέτρων και μεθυλίωσης του DNA σε κάθε θέση CpG εξετάστηκε ξεχωριστά μέσα στα δεδομένα HM450. Αυτές οι στατιστικές δοκιμασίες διεξήχθησαν με ένα γενικευμένο γραμμικό μοντέλο χρησιμοποιώντας PROC GENMOD στο λογισμικό SAS (SAS Institute Inc, Cary, NC) [32]. Η βήτα-κατανομή των τιμών β λογιστικοποιήθηκε με μια διωνυμική σύνδεσμο logit και κλίμακα μεταβλητή εκτιμάται με Pearson κατάλοιπα. Έχουμε καθορίζεται εάν κάθε επιμέρους ιστοσελίδα CpG ήταν στατιστικά σημαντική με βάση το ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη (FDR), προκειμένου να διορθωθούν τυχόν ψευδώς θετικά από πολλαπλές δοκιμές (α = 0.05). Μπορούμε επίσης να υπολογίζεται στη συνέχεια μια μέση μεθυλίωσης (αξία β) ενός site CpG σε κάθε ομάδα και επιλεγμένα CpG περιοχές που είχαν μεγαλύτερη ή ίση με 0,2 σημαίνει διαφορά μεθυλίωσης μεταξύ δύο ομάδες σύγκρισης [27], [33]. Ως εκ τούτου, ένα διαφορικά μεθυλιωμένη CpG (DMC) ορίστηκε ως τόπος CpG που είχε μια FDR προσαρμοστεί

P

αξία & lt? 0.05 από ένα γενικευμένο γραμμικό μοντέλο της δοκιμής και μια διαφορά μέση μεθυλίωσης μεταξύ δύο ομάδες σύγκρισης μεγαλύτερη ή ίση με το 0.2 (Σχήμα 1). Τα δεδομένα HM27 επίσης σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας την ίδια διαδικασία.

Η

Χρησιμοποιήσαμε το ακριβές τεστ του Fisher για τη δοκιμή των συσχετίσεων μεταξύ DMCs και γονιδιώματος τοποθεσίες σε όλη την γονιδίωμα. Η στατιστική δοκιμή για την έκφραση του γονιδίου έγινε με δοκιμή Wilcoxon Rank Sum στο λογισμικό SAS. Έχουμε καθορίζεται εάν κάθε επιμέρους γονίδιο ήταν στατιστικά σημαντική με βάση το FDR προσαρμοστεί

P

τιμή (α = 0.05).

Αποτελέσματα

Αναγνώριση των διαφορικά Methylated CpG τοποθεσίες σε προστάτη

διεξάγεται γονιδίωμα-ευρεία προφίλ μεθυλίωσης του DNA με τη χρήση της Illumina HM450 BeadChip. Αξιολογήσαμε τέσσερα δείγματα σε συνδυασμό όγκου και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών, καθώς και 15 επιπλέον δείγματα αταίριαστο όγκων που είχαν αρχικά συλλεχθεί από σουηδική άτομα (Πίνακας S2A). Μετά την κανονικοποίηση, όλα τα δείγματα 23 ιστού έδειξε πολύ παρόμοιες κατανομές έντασης του σήματος, ενώ χωρίς επίβλεψη ιεραρχική ομαδοποίηση σε ολόκληρο το σύνολο δεδομένων της μεθυλίωσης του DNA έδειξε ότι οι δύο κύριες ομάδες αποτελούνταν καθένα από ένα φαινότυπο? όγκου ή φυσιολογικά (Σχήμα S1). Αυτός ο σαφής διαχωρισμός μεταξύ του προστάτη και φυσιολογικά δείγματα έδειξε ένα διαφορετικό πρότυπο μεθυλίωσης του DNA μεταξύ δύο φαινοτύπους.

Για τον εντοπισμό ανώμαλης DMCs στον καρκίνο του προστάτη, πραγματοποιήσαμε στατιστική ανάλυση και περιόρισε την επιλογή των CpG θέσεων με βάση τις διαφορές μεθυλίωσης του DNA ( Φιγούρα 1). Συνολικά 28.735 sites CpG έδειξε στατιστική σημαντικότητα με FDR προσαρμοστεί

P

& lt? 0,05 και τουλάχιστον 0,2 μέση διαφορά μεθυλίωσης μεταξύ του προστάτη και φυσιολογικά δείγματα (Πίνακας S3). Αυτοί οι 28.735 DMCs περιλαμβάνονται 20.187 υπερμεθυλιωμένων περιοχές CpG (υπερ-DMCs) και 8548 μεθυλιωμένος CpG περιοχές (υπο-DMCs) σε όγκους σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς. Είναι ενδιαφέρον, 69,5% των υπερ-DMCs (14.038 sites CPG) βρίσκονταν στο CGI, ακτές CGI ή ράφια CGI, αλλά μόνο 37,0% των υπο-DMCs βρέθηκαν σε αυτές τις περιοχές (Fisher ακριβής δίπλευρη

p

& lt? 10

-44? Πίνακας 1Α). Επιπλέον, η κατανομή των προσδιορισμένων υπερ- και υπο-DMCs σε όγκους ήταν στατιστικά διαφορετικό μεταξύ των κατηγοριών γονιδίων περιοχής που παρέχονται από τον κατασκευαστή (Fisher ακριβής δίπλευρη

σ

= 2,0 × 10

-44? Πίνακα 1Β ) [23]. Hyper-DMCs ήταν πιο συχνά εντοπίζονται σε περιοχές εγγύς υποκινητή (συμπεριλαμβανομένης της θέσης έναρξης της μεταγραφής [TSS] 1500, TSS200, 5 ‘μη μεταφραζόμενη περιοχή [UTR] and1st εξώνιο) από υπο-DMCs, ωστόσο υπο-DMCs ήταν πιο συχνά σε μη-υποκινητή περιοχές (συμπεριλαμβανομένων σώμα γονιδίου και 3’UTR).

Η

Ένα σύνολο 19.570 DMCs βρίσκονται σε γονιδιακή περιοχές, αντιστοιχούσαν σε 7.031 μοναδικά γονίδια. Συνολικά 32 από τα 67 γονίδια που έχουν αναφερθεί στο παρελθόν στο PCA, ώστε να έχουν υπερμεθυλίωση προαγωγού εντοπίστηκαν στην λίστα μας (Πίνακας S4) [10]. Αυτός ο αριθμός υπερβαίνει τον αριθμό των κοινών γονιδίων από τη μέθοδο Μ-NGS (20 κοινά γονίδια), η οποία είναι κάπως εκπληκτικό επειδή M-NGS παρέχει καλύτερη πρακτική κάλυψη των γονιδιωματικών CpG (29,6%) θέσεις σε σχέση με το HM450 BeadChip (1,7%) [ ,,,0],16].

Είμαστε σε σύγκριση αποτελέσματά μας με τα δημοσιευμένα σύνολα δεδομένων. Μεταξύ 28.735 DMCs, συνολικά 1.175 ιστοσελίδες CpG ήταν παρόντες στις BeadChips HM27 που χρησιμοποιήθηκαν σε μια προηγούμενη μελέτη προστάτη [18]. Η στατιστική ανάλυση έδειξε ότι 1.157 (98,5%) από 1.175 θέσεις CpG έδειξε σημαντικά διαφορετικό μεθυλίωσης του DNA μεταξύ όγκου και φυσιολογικών δειγμάτων (FDR ρυθμίζεται

P

& lt? 0,05) και όλα αυτά τα 1157 CpG θέσεων έδειξε την ίδια κατεύθυνση του αλλαγή μεθυλίωση στα δύο σύνολα δεδομένων (928 υπερ-DMCs και 229 υπο-DMCs, Πίνακας S3).

DMC Σύλλογοι με την απορυθμισμένη γονιδιακή έκφραση σε προστάτη

Για να βρείτε παρεκκλίνουσα μεθυλίωση του DNA που μπορεί να προκαλέσουν γονιδιακή αλλαγή έκφρασης σε προστάτη, αναλύσαμε τα δεδομένα γονιδιακής έκφρασης μεταξύ λίστα των γονιδίων DMC. Για να αυξήσετε την πιθανότητα εντοπισμού πραγματικά θετικά, έχουμε δοκιμαστεί μόνο τα γονίδια που πληρούν τρία κριτήρια. Πρώτον, περισσότερα από ένα DMC εντοπίστηκαν σε περιοχές εγγύς υποκινητή (TSS1500, TSS200, 5’UTR και 1ο εξόνιο) ενός γονιδίου? δεύτερο, τουλάχιστον τα τρία τέταρτα αυτών των πολλαπλών DMCs σε μια περιοχή υποκινητή του γονιδίου είχαν την ίδια κατεύθυνση των αλλαγών μεθυλίωσης (υπερ ή υπομεθυλίωση στο PCA)? τρίτο, τουλάχιστον ένα DMC σε μία περιοχή του γονιδίου υποκινητή είχε τουλάχιστον 0.4 μέση διαφορά μεθυλίωσης μεταξύ του καρκίνου και της κανονικής φαινοτύπους. Με βάση αυτά τα κριτήρια, επιλέχθηκαν συνολικά 276 γονίδια από 9.643 DMCs που βρίσκονται σε περιοχές του γονιδίου υποκινητή εγγύς και διατίθενται 269 δεδομένα έκφρασης γονιδίων συμφωνημένα ελέγχθηκαν [29]. Ένα σύνολο 122 γονιδίων έδειξε σημαντικές διαφορές στην έκφραση γονιδίων μεταξύ όγκου και φυσιολογικών δειγμάτων (FDR ρυθμίζεται

P

& lt? 0,05 και αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ μεθυλίωσης του DNA και της αλλαγής έκφραση? Πίνακας 2 και Πίνακας S5). Αυτό το σετ περιλαμβάνονται επτά γνωστά γονίδια μεθυλίωση σε προστάτη, για παράδειγμα,

GSTP1, CAV1 και RaRb

. Συνολικά 65 από 122 γονιδίων επιβεβαιώνονται να έχουν διαφορική μεθυλίωση στα δεδομένα HM27 [18]. Αυτά τα 65 γονίδια επιβεβαιώθηκε στα δεδομένα HM27 έδειξε την ίδια κατεύθυνση των αλλαγών μεθυλίωση με δεδομένα HM450 μας. Επιπλέον, 55 από 122 γονιδίων έχει ταυτοποιηθεί ως cDMRs στα δεδομένα της μεθυλίωσης αλληλουχίας επόμενης γενιάς (Μ-NGS) [16].

Η

Επιβεβαίωση της ΑΟΧ1 Διοργανωτή υπερμεθυλίωση σε επιπλέον δείγματα προστάτη

Ανάμεσα στο σύνολο των 122 έκτροπα μεθυλιωμένων γονιδίων,

ΑΟΧ1

, το οποίο κωδικοποιεί οξειδάση αλδεΰδης 1 και βρίσκεται στο χρωμόσωμα 2q33.1, ήταν η πιο σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται γονιδίων σε δείγματα προστάτη, με βάση τα στοιχεία HM450 . Οι αλλαγές στη μεθυλίωση του DNA και γονιδιακή έκφραση του

ΑΟΧ1

μεταξύ ΠΑΠ και φυσιολογικών ιστών ήταν πολύ παρόμοια με

GSTP1

(Πίνακας 2). Συνολικά 13 από τις 19 δοκιμαστεί CpG θέσεων στο

ΑΟΧ1

γονίδιο ταυτοποιήθηκαν ως υπερ-DMCs (εύρος FDR προσαρμοστεί

P

: 7.4 × 10

-8~0.01 και φάσμα μέση διαφορά μεθυλίωσης: 0.20~0.52) και 11 από αυτά τα 13 DMCs βρίσκονταν σε περιοχές εγγύς υποκινητή (Πίνακας 2 και Σχήμα S2A)

Δύο θέσεις CpG στο

ΑΟΧ1

περιοχή του υποκινητή. επιβεβαιώθηκαν επίσης ως υπερ-DMCs στον ανεξάρτητο σύνολο δεδομένων HM27 (Πίνακας S3 και σχήμα S2A) [18]. Mahapatra et al. προσδιόρισε επίσης το γονίδιο αυτό ως διαφορικά μεθυλιωμένο γονίδιο χρησιμοποιώντας την ίδια πλατφόρμα HM27 [20]. Kim et al. εντόπισε διαφορικά μεθυλιωμένη περιοχή στο

ΑΟΧ1

που επικαλύπτεται με 13 sites υπερ-DMC μας χρησιμοποιώντας τη μέθοδο M-NGS σε δείγματα προστάτη [16]. Kim et al. Απέδωσε επίσης όξινο θειώδες αλληλουχίας του

ΑΟΧ1

υποκινητή σε δύο κυτταρικές σειρές του προστάτη, το οποίο επιβεβαιώθηκε απόδειξη της διαφορικής μεθυλίωσης στο

ΑΟΧ1

. Ωστόσο κατάστασης μεθυλίωσης σε δείγματα προστάτη ιστό με ανάλυση single-νουκλεοτίδιο δεν έχει πραγματοποιηθεί ακόμα.

Ως εκ τούτου, χρησιμοποιείται όξινο θειώδες αλληλουχίας για να επιβεβαιωθεί το εύρημα μας στο

ΑΟΧ1

γονιδίων μεταξύ των πρόσθετων προστάτη και φυσιολογικό προστάτη δείγματα ιστού (Πίνακας S2B). Εμείς ενισχύεται το

ΑΟΧ1

περιοχή προαγωγού, η οποία περιελάμβανε 5 υπέρ-DMCs και επικαλύπτονται με ένα νησί CpG, τότε η αλληλουχία μετά βακτηριακό μετασχηματισμό (Σχήμα S2A). Δεδομένα από μία σειρά ΟΝΑ ελέγχου έδειξε αξιόπιστα αποτελέσματα από αυτό το όξινο θειώδες ομάδα εκκινητών προσδιορισμού αλληλουχίας (Σχήμα S2B). Μεταξύ συνολικά 107 δείγματα ιστού από JHH συμπεριλαμβανομένων των 54 δειγμάτων του προστάτη και 53 φυσιολογικούς ιστούς (51 ζεύγη), παρατηρήσαμε το

ΑΟΧ1

γονίδιο υποκινητή να υπερμεθυλίωση σε μεγάλο βαθμό σε δείγματα προστάτη σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς σε όλα τα 34 δοκιμαστεί περιοχές CpG (μέση μεθυλίωση σε όλες τις 34 τοποθεσίες CpG: προστάτη

vs

κανονική = 0,73

vs

0.07, Σχήμα 2Α και S6..)? Αυτές οι διαφορές ήταν στατιστικά σημαντικές (FDR προσαρμοστεί

P

& lt? 8,8 × 10

-11). Εμείς καταγράφεται η μέση μεθυλίωση όλων των 34 CpG θέσεων σε κάθε δείγμα όγκου και τα συμφωνημένα κανονικά δείγματα (

n

= 51, Εικόνα S2C). Το οικόπεδο έδειξε ότι το σύνολο σχεδόν των δειγμάτων του όγκου είχαν μεγαλύτερη από την μέση τιμή μεθυλίωση του 0,3 στο

ΑΟΧ1

υποκινητή, ενώ ζεύγη παρακείμενο φυσιολογικό ιστό είχαν σχετικά χαμηλότερη μεθυλίωσης (λιγότερο από μέση τιμή μεθυλίωση 0.3). Μετά την εξέταση των στοιχείων αυτών, θέτουμε αυθαίρετα ένα επίπεδο αποκοπής των 0,3 για την ανάθεση

ΑΟΧ1

μεθυλίωση υποστηρικτής να διακρίνει όγκου από τον φυσιολογικό ιστό (Εικόνα 2Β). Η ευαισθησία της μεθυλίωσης του DNA στο

ΑΟΧ1

υποστηρικτής για την ανίχνευση του προστάτη ήταν 92,6% (50 από τις 54 δειγμάτων που ελέγχθηκαν PCA) και το 94,3% των θετικών αξία πρόβλεψης. Δεν μπορέσαμε να υπολογίσουμε ειδικότητα στον πληθυσμό αυτό αντιγραφής, επειδή τα δείγματα περιλαμβάνονται παρακείμενο φυσιολογικό ιστούς των ασθενών προστάτη. Ωστόσο, 50 από τους 53 (94,3%) από αυτά τα φυσιολογικά δείγματα έδειξαν αρνητικά αποτελέσματα του

ΑΟΧ1

μεθυλίωση του υποκινητή.

Α. Μέσος όρος μεθυλίωση των 34 δοκιμαστεί CpG θέσεων σε κάθε φαινότυπο. Οι μπάρες σφάλματος δείχνουν διαστήματα εμπιστοσύνης 95% για κάθε θέση CpG. Β Κατανομή του

ΑΟΧ1

μεθυλίωση προαγωγού σε κάθε φαινότυπο. Κάθε κύκλος ή τετράγωνο αντιπροσωπεύει το μέσο μεθυλίωσης των 34 δοκιμαστεί CpG θέσεων σε κάθε εξεταζόμενο δείγμα ιστού.

Η

Επιβεβαίωση της SPON2 Διοργανωτή υπομεθυλίωση σε επιπλέον δείγματα προστάτη

SPON2

, το οποίο κωδικοποιεί spondin 2 και βρίσκεται στο χρωμόσωμα 4p16.3, ήταν η δεύτερη πιο up-ρύθμιση του γονιδίου ανάμεσα στο σύνολο των 122 σημαντικά γονίδια είχαν διαφορετική έκφραση σε προστάτη, με βάση τα στοιχεία HM450. Συνολικά πέντε θέσεις CpG στο

SPON2

υποστηρικτής ταυτοποιήθηκαν ως υπο-DMCs (εύρος FDR προσαρμοστεί

P

: 2.1 × 10

-14~8.0 × 10

-8 και το εύρος των μέση διαφορά μεθυλίωσης: -0.20~-0,50) και τα πέντε αυτά DMCs επίσης βρίσκεται στην περιοχή LOC100130872 υποκινητή (Πίνακας 2)

επίσης, επιβεβαιώθηκε η μεθυλίωση του

SPON2

περιοχή προαγωγού, η οποία περιλαμβάνει πέντε υπο-DMCs και βρίσκεται σε ένα νησί ακτή CpG, χρησιμοποιώντας την ίδια μέθοδο με όξινο θειώδες προσδιορισμού αλληλουχίας που περιγράφεται παραπάνω (Σχήμα S3A). Δεδομένα από μία σειρά ΟΝΑ ελέγχου έδειξε αξιόπιστα αποτελέσματα από αυτό το όξινο θειώδες ομάδα εκκινητών προσδιορισμού αλληλουχίας (Σχήμα S3b). Ένα σύνολο 109 δειγμάτων ιστού JHH συμπεριλαμβανομένων των 54 δειγμάτων του προστάτη και 55 φυσιολογικούς ιστούς (54 ζεύγη) ελέγχθηκαν για

SPON2

μεθυλίωση του υποκινητή. Το αποτέλεσμα του θειώδους αλληλουχίας έδειξε υπομεθυλίωση του

SPON2

υποκινητή του γονιδίου σε δείγματα προστάτη σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς, και οι διαφορές αυτές ήταν στατιστικά σημαντικές σε 25 από τις 27 δοκιμαστεί περιοχές CpG (μέση διαφορά μεθυλίωσης μεταξύ των δειγμάτων του προστάτη και φυσιολογικούς ιστούς : -0,1 ~ -0,27, Σχήμα 3 και Πίνακας S7). Ωστόσο, οι τιμές μεθυλίωση σε αυτό το σύνολο των 25 χώρων CpG έδειξε μεγαλύτερη ποικιλία από ό, τι παρατηρήθηκε για το

ΑΟΧ1

υποκινητή (Εικόνα 2Α). Ένα σύνολο από 55 φυσιολογικούς ιστούς έδειξε μέση μεθυλίωσης του DNA μεταξύ 0,46 και 0,81 στις 25 CpG θέσεις, αλλά τα δείγματα προστάτη (

n

= 54) έδειξε μέσο μεθυλίωσης του DNA μεταξύ 0.30 και 0.63. Μεθυλίωσης του DNA του

SPON2

υποστηρικτής δεν έδειξαν καμία συσχέτιση με κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους όπως η ηλικία κατά τη στιγμή της χειρουργικής επέμβασης, το σκορ Gleason, και το στάδιο TNM σε δείγματα προστάτη και φυσιολογικούς ιστούς (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

κάθε κύκλος ή τετράγωνο αντιπροσωπεύει τη μέση μεθυλίωση των 27 δοκιμαστεί CpG θέσεων σε κάθε φαινότυπο. Οι μπάρες σφάλματος δείχνουν διαστήματα εμπιστοσύνης 95% για κάθε θέση CpG.

Η

DMCs συνδεδεμένες με Properties κλινικοπαθολογοανατομικές

Για την αναγνώριση CpG περιοχές που σχετίζονται με κλινικοπαθολογοανατομικές ιδιότητες, συγκρίναμε τα δεδομένα μεθυλίωσης των δειγμάτων προστάτη με Gleason σκοράρει ή την κατάσταση της βιοχημικής υποτροπής (BCR). Κατ ‘αρχάς, τα δείγματα προστάτη διαιρέθηκαν με σκορ Gleason (κάτω Gleason 6 και 3 + 4 εναντίον υψηλότερο Gleason 4 + 3, 9, 10). Ένα σύνολο 245 sites CpG ταυτοποιήθηκαν ως Gleason σκοράρει συνδεδεμένων DMCs (FDR προσαρμοστεί

P

& lt? 0.05), αλλά μόνο το 40 sites CpG έδειξε μεγαλύτερη από 0,2 σημαίνει διαφορά μεθυλίωσης μεταξύ υψηλότερων και χαμηλότερων Gleason προστάτη (Πίνακας S8) . δεδομένων γονιδιακής έκφρασης των 22 γονιδίων που είχαν Gleason σκορ συνδεδεμένων DMCs στη γονιδιακή περιοχές δοκιμάστηκαν για σύνδεση με σκορ Gleason σε δείγματα προστάτη. Μεταξύ αυτών των 22 δοκιμαστεί γονίδια, μόνο

PPARGC1A

έδειξαν σημαντικές διαφορές της γονιδιακής έκφρασης μεταξύ όγκους με χαμηλότερο Gleason έναντι υψηλότερο Gleason προστάτη (FDR προσαρμοστεί

P

= 0,022). Επιπλέον, η μεθυλίωση του

PPARGC1A

(cg12691631) ήταν αντιστρόφως ανάλογη με την έκφραση του γονιδίου (Σχήμα S4)

Συγκρίσεις μεταξύ BCR (βιοχημική υποτροπή?. Ορίζεται ως η ανίχνευση του συνολικού PSA μεγαλύτερες από 0,2 ng /ml μετά την επέμβαση) και οι ομάδες μη-BCR εντοπίστηκαν μόνο δύο θέσεις CpG ως DMC (cg11385353 στο

AGXT

και cg14218447 σε μια διαγονιδιακή περιοχή) χρησιμοποιώντας FDR προσαρμοστεί

P

& lt? 0,05 και μεγαλύτερο από 0,2 μέση διαφορά μεθυλίωσης μεταξύ των δύο ομάδων. Αυτές οι δύο θέσεις CpG έδειξε σημαντική διαφορά μετά από προσαρμογή για τις πληροφορίες θεραπείας. Ωστόσο, η γονιδιακή έκφραση του

AGXT

έδειξε καμία διαφορά μεταξύ BCR και μη BCR πρωτογενή προστάτη (δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Συζήτηση

Δοκιμάσαμε μεθυλίωσης του DNA σε περισσότερες από 480.000 CpG θέσεις χρησιμοποιώντας το HumanMethylation450 Beadchip στα δείγματα προστάτη και φυσιολογικούς ιστούς. Εντοπίσαμε με επιτυχία 28.735 διαφορικά μεθυλιωμένο CpG θέσεις στη ΣΕΣΣ. Πολλές από τις προσδιοριζόμενες DMCs ήταν ανεξάρτητες επαναλήψεις των προηγούμενων ευρημάτων της διαφορικής μεθυλίωσης του DNA σε προστάτη [16], [18]. Στην πρώτη, το 98,5% (1.157 από 1.175) κοινών τόπων CpG που ήταν παρόντες στη λίστα μας DMC και το HM27 BeadChip έδειξαν σημαντικές διαφορές μεθυλίωσης στο προηγούμενο σύνολο δεδομένων [18]. Στη δεύτερη, συνολικά 1.014 από 2.481 (40,9%) του καρκίνου ειδικά μετουσιωμένο περιοχές που ταυτοποιήθηκαν με τη μέθοδο του Μ-NGS στη ΣΕΣ, επικαλύπτονται με DMCs μας [16]. Κατά την εξέταση τις τεράστιες διαφορές στην πρακτική κάλυψη CpG αυτών των δύο μεθόδων (Μ-NGS

vs

. HM450:29.6%

vs

. 1,7%), το ποσοστό αντιστοιχίας του 40,9% μπορεί να είναι θεωρείται πολύ υψηλό.

Η κατανομή των DMCs στο HM450 έδειξε ένα παρόμοιο μοτίβο με την κατανομή των DMC σε καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρική γραμμή [22]. Sandoval et al. διαπίστωσε ότι οι περισσότεροι υπερμεθυλιωμένων CpG θέσεις βρίσκονταν στο CGI, CGI ακτή και περιοχές CGI ράφι, ενώ περισσότερο από το ήμισυ των υπερμεθυλιωμένων CpG θέσεων ήταν αταξινόμητους σε περιοχές εγγύς υποκινητή. Τα δεδομένα μας ήταν συνεπής με αυτή την παρατήρηση, δείχνουν ότι 69,5% των υπερ-DMCs βρίσκονταν στο CGI, CGI ακτή και περιοχές CGI ράφι, ενώ το 52,4% των υπερ-DMCs ήταν αταξινόμητους σε περιοχές εγγύς υποκινητή.

έχουν παρατηρήσει ότι συνολικά 6.907 ιστοσελίδες CpG προσδιορίστηκαν από την BeadChip HM450 τυχαίνει να βρίσκονται εντός πολυμορφισμού ενός νουκλεοτιδίου (SNP) τόπους. Ένα σύνολο 336 CpG τοποθεσίες μεταξύ των 28.735 DMCs που εντοπίστηκαν, επίσης, βρίσκεται στο SNP τόπους όπως υποδεικνύεται στον Πίνακα S3. Ως εκ τούτου, ιδιαίτερη προσοχή απαιτείται να ερμηνεύσουν τυχόν παρατηρούμενες συσχετίσεις με αυτά τα 336 DMCs.

Εμείς επιλέξαμε να περιορίσει την ανάλυσή μας στην περιοχή του εγγύς υποκινητή, επειδή αυτή η περιοχή είναι καλά χαρακτηρίζεται για τις επιπτώσεις της μεθυλίωσης του DNA για γονιδιακή αποσιώπηση. Η προσέγγιση αυτή μας επέτρεψε επίσης να αξιολογήσει τις ενώσεις με τις αλλαγές της γονιδιακής έκφρασης βασίζεται σε ένα ανεξάρτητο σύνολο δεδομένων προστάτη, με βάση την υπόθεση ότι η αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ μεθυλίωσης υποκινητή και την έκφραση του γονιδίου μπορεί να υποδεικνύει εύλογα ένα λειτουργικό αποτέλεσμα διαφορικά μεθυλιωμένα γονίδια που εντοπίστηκαν στην ΣΕΣΣ. Η προσέγγιση αυτή εντόπισε συνολικά 122 γονίδια των οποίων επτά γνωστά γονίδια μεθυλίωση του DNA σε ΣΕΣΣ. Ως θετική επιβεβαίωση της προσέγγισής μας,

GSTP1

, η οποία είναι η πιο εκτενώς μελετημένους υπερμεθυλιωμένο γονίδιο σε PCa βρέθηκε να υπερμεθυλίωση σε αυτή την ανάλυση (Πίνακας 2). Ένα σύνολο 7 από τις 15 θέσεις CpG στο HM450 BeadChip ταυτοποιήθηκαν ως υπερ-DMCs (εύρος μέση διαφορά μεθυλίωσης: 0,27 ~ 0,48) στο

GSTP1

γονίδιο (Πίνακας S3). Αγγελιαφόρο RNA του

GSTP1

γονίδιο έχει προηγουμένως αποδειχθεί ότι είναι σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται στην πρωτοβάθμια προστάτη, και μεταστατικούς όγκους δείχνουν πιο κάτω ρύθμιση [29].

Η οξειδάση αλδεΰδης 1 (

) γονίδιο ΑΟΧ1 εμπλέκεται σε διάφορες μεταβολικές οδούς, συμπεριλαμβανομένων του μεταβολισμού του φαρμάκου και την παραγωγή δραστικών ειδών οξυγόνου [34] – [36]. Μειωμένη έκφραση πρωτεΐνης ΑΟΧ1 σε χρόνια παγκρεατίτιδα και η απουσία έκφρασης πρωτεΐνης ΑΟΧ1 σε καρκίνο του παγκρέατος έχουν αναφερθεί [34]. Επιπλέον, η μειωμένη έκφραση πρωτεΐνης ΑΟΧ1 ανιχνεύθηκε σε ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα και αυτό απορρύθμιση της έκφρασης ΑΟΧ1 συνδέθηκε με το στάδιο του όγκου και τη μεταστατική κατάσταση [37]. Παρεκκλίνουσα DNA υπερμεθυλίωση της περιοχής του υποκινητή του

ΑΟΧ1

αναφέρθηκε πρόσφατα στον καρκίνο του παχέος εντέρου και του προστάτη [16], [18], [20], [38], [39]. Στο πλαίσιο αυτών των προτέρων δημοσιευμένα στοιχεία, τα στοιχεία μας υποστηρίζει περαιτέρω ένα ρόλο για την παρεκκλίνουσα μεθυλίωση του DNA στο

ΑΟΧ1

υποστηρικτής των όγκων του προστάτη, ενώ επίσης παρέχει την πιο ολοκληρωμένη κάλυψη των DMC σε αυτό το γονίδιο μέχρι σήμερα.

Οι παρατηρούμενες διαφορές της μεθυλίωσης του DNA στο

ΑΟΧ1

υποστηρικτής μεταξύ των δειγμάτων του προστάτη και των φυσιολογικών ιστών ήταν αξιοσημείωτη. Αυτή η περιοχή του υποκινητή έδειξε ένα πολύ σταθερό μοτίβο μεθυλίωσης σε 34 CpG περιοχές που εκτείνονται σε 400 ζεύγη βάσεων σε κάθε φαινότυπο. Αυτό το γονιδιωματικό τοποθεσία είναι επιδεκτική σε αξιολόγηση μέσω άλλες δοκιμασίες, όπως Pyrosequencing ή μεθυλίωση-ειδική PCR

Η πλειοψηφία των όγκων προστάτη (92,6%? Ευαισθησία). Παρατηρήθηκε ότι έχει θετικά μεθυλίωσης του DNA, με μια περικοπή μέση μεθυλίωσης -off 0,3 και 94,3% των φυσιολογικών ιστών δείχνει αρνητική μεθυλίωσης του DNA με το ίδιο cut-off. Αυτή η ευαισθησία του

ΑΟΧ1

μεθυλίωση ήταν παρόμοια με άλλα γνωστά μεθυλιωμένα γονίδια συμπεριλαμβανομένων

GSTP1

και

RaRb

που ελέγχθηκαν με τη χρήση μεθόδων Pyrosequencing [40]. Αυτή η υψηλή ευαισθησία του

ΑΟΧ1

μεθυλίωση προαγωγού και τεράστιες διαφορές της μεθυλίωσης του DNA μεταξύ των δειγμάτων ΠΑΠ και φυσιολογικούς ιστούς υποδηλώνουν την πιθανή χρησιμότητα αυτού του γονιδίου ως βιοδείκτη για την PCA διάγνωση.