Αφηρημένο

Ιστορικό

Κάθε χρόνο περίπου 74.000 γυναίκες πεθαίνουν από καρκίνο του ενδομητρίου, κυρίως λόγω επανεμφάνισης ή μεταστατική νόσο. Η παρουσία των λεμφοκυττάρων που διηθούν όγκο (TILs), καθώς και των υποδοχέων προγεστερόνης (PR) θετικότητα έχει συσχετιστεί με βελτιωμένη πρόγνωση. Αυτή η μελέτη περιγράφει δύο μηχανισμοί μέσω των οποίων η προγεστερόνη αναστέλλει μεταστατική εξάπλωση του καρκίνου του ενδομητρίου: διεγείροντας διήθηση Τ-κυττάρων και με αναστολή επιθηλιακών-to-μεσεγχυματικών κυττάρων μετάβαση (ΕΜΤ)

Μεθοδολογία και Principal Ευρήματα

τομές παραφίνης από ασθενείς με (n = 9) ή χωρίς (n = 9) προοδευτική καρκίνου του ενδομητρίου (υποτροπιάζουσα ή μεταστατική νόσο) αξιολογήθηκαν για την παρουσία του CD4 + (βοηθητικά), CD8 + (κυτταροτοξικά) και Foxp3 + (κανονιστική) Τ-λεμφοκύτταρα και της έκφρασης PR. Προοδευτική ασθένεια παρατηρήθηκε ότι σχετίζεται με σημαντική απώλεια TILs και απώλεια έκφρασης PR. Κατεψυγμένα δείγματα όγκου, που χρησιμοποιούνται για την ανάλυση της έκφρασης του γονιδιώματος-ευρεία, έδειξαν σημαντική ρύθμιση των οδών που εμπλέκονται στην immunesurveillance, EMT και μετάσταση. Για έναν αριθμό γονιδίων, όπως CXCL14, DKK1, DKK4, PEG10 και WIF1, ποσοτική RT-PCR για την επαλήθευση άνω ή προς τα κάτω ρύθμιση σε προοδευτική ασθένεια. Για να επιβεβαιωθεί ο ρόλος της προγεστερόνης στην ρύθμιση εισβολή, Ishikawa (ΙΚ) ενδομητρίου καρκινικές κυτταρικές γραμμές σταθερά επιμολυσμένα με PRA (IKPRA), PRB (IKPRB) και PRA + PRB (IKPRAB) καλλιεργήθηκαν σε παρουσία /απουσία προγεστερόνης (ΜΡΑ) και χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση του γονιδιώματος σε επίπεδο έκφρασης, Boyden- και δοκιμασίες μετανάστευσης επούλωση των πληγών, και IHC για τους γνωστούς δείκτες EMT. κυτταρικές σειρές IKPRB και IKPRAB έδειξαν MPA επαγόμενη αναστολή της μετανάστευσης και της απώλειας του μεσεγχυματικών βιμεντίνης δείκτη στο μεταναστευτικό μέτωπο της δοκιμασίας επούλωσης πληγών. Επιπλέον, η ανάλυση μονοπατιού των σημαντικά MPA ρυθμισμένων γονιδίων έδειξαν σημαντική προς τα κάτω ρύθμιση των σημαντικών οδών που εμπλέκονται στην EMT, immunesuppression και μετάσταση:. Όπως IL6-, ΤΟΡ-β και σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης

Συμπέρασμα

άθικτη σηματοδότησης προγεστερόνης σε μη-προοδευτική καρκίνο του ενδομητρίου φαίνεται να είναι ένας σημαντικός παράγοντας για την τόνωση immunosurveilance και την παρεμπόδιση της μετάβασης από επιθηλιακά σε μια πιο μεσεγχυματικά, πιο επεμβατικές φαινότυπο

Παράθεση:. van der Horst PH, Wang Υ , Vandenput Ι, Kühne LC, Ewing PC, van IJcken WFJ, et al. (2012) Η προγεστερόνη Αναστέλλει Τα επιθηλιακά-to-μεσεγχυματικά μετάβαση σε καρκίνο του ενδομητρίου. PLoS ONE 7 (1): e30840. doi: 10.1371 /journal.pone.0030840

Επιμέλεια: Irina Agoulnik, Διεθνές Πανεπιστήμιο της Φλόριντα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 23 Ιουνίου του 2011? Αποδεκτές: 22 του Δεκέμβρη 2011? Δημοσιεύθηκε: 25 Ιανουαρίου 2012

Copyright: © 2012 van der Horst et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το έργο της LJB και MvdZ υποστηρίζεται από μια επιχορήγηση από το ολλανδικό Αντικαρκινική Εταιρεία (EMCR 2008 – 4056). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή δεδομένων και αναλύσεις, η απόφαση για τη δημοσίευση ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν ανταγωνιστικά συμφέροντα υπάρχουν

Εισαγωγή

Κάθε χρόνο, σε ολόκληρο τον κόσμο, περισσότερες από 287.000 γυναίκες αναπτύσσουν καρκίνο του ενδομητρίου καθιστώντας το πιο κοινό γυναικολογικό καρκίνο στον κόσμο και η τέταρτη πιο κοινή γυναικεία κακοήθεια στις ανεπτυγμένες χώρες [1]. Συνήθως ο καρκίνος του ενδομητρίου ανιχνεύεται σε πρώιμο στάδιο και η χειρουργική επέμβαση είναι ο ακρογωνιαίος λίθος της θεραπείας. Όπου υπάρχει υποτροπιάζουσα ή μεταστατική νόσο, ωστόσο, η κατάσταση είναι διαφορετική. (Νεο) Adjuvant ακτινοβολία ή /και συστημική θεραπεία σε συνδυασμό με χειρουργική επέμβαση είναι συνήθως αναφέρεται και σε γενικές γραμμές, προοδευτική νόσος έχει κακή πρόγνωση αντιπροσωπεύοντας 74.000 θανάτους παγκοσμίως κάθε χρόνο [2], [3]. Προγνωστικοί παράγοντες για επαναλαμβανόμενες και μεταστατικό καρκίνο του ενδομητρίου περιλαμβάνουν χειρουργική στάδιο ΦΥΓΩ, ο βαθμός διαφοροποίησης, ιστοπαθολογικών υποτύπου και μυομήτριο και lymphovascular εισβολή [2], [4], [5], [6], [7].

σε διάφορους τύπους καρκίνου, η παρουσία των λεμφοκυττάρων που διηθούν όγκο (TILs) έχει συσχετιστεί με βελτιωμένη πρόγνωση, και μεγάλο μέρος της έρευνας έχει πραγματοποιηθεί για το θέμα αυτό [8], [9], [10], [11], [12] , [13], [14], [15]. Το σκεπτικό είναι ότι καλά διαφοροποιημένο καρκίνο του προκαλεί μία φλεγμονώδη απόκριση που είναι παρόμοια με μια οξεία βλάβη η οποία, μετά διαδοχική διείσδυση διαφορετικών κυτταρικών πληθυσμών δενδρικών, τελικά καταλήγει σε Τ-λεμφοκυττάρων διείσδυση [16]. Διείσδυση των TILs ως θετικός προγνωστικός παράγοντας περιγράφηκε για πρώτη φορά σε δερματικό μελάνωμα, όπου η παρουσία των TILs ήταν προβλεπτική για βελτιωμένη επιβίωση [8]. Γκαλών et al. το 2006, έδειξε ότι η διείσδυση των λεμφοκυττάρων του προσαρμοστικού ανοσοποιητικού συστήματος προς το κέντρο και επεμβατική περιθώριο του ορθοκολικού καρκίνου συσχετίστηκε θετικά με μειωμένη υποτροπή και βελτιωμένη επιβίωση [10]. Το 2009 Kilic et al., Έδειξαν ότι τα υψηλά επίπεδα του TILs εντός καρκίνο του πνεύμονα μη-μικρού κυττάρου σχετίζεται με μειωμένη υποτροπή και βελτιωμένη επιβίωση [12]. Στον καρκίνο των ωοθηκών, η παρουσία εντός του όγκου Τ-λεμφοκύτταρα επίσης συσχετίζεται θετικά με βελτιωμένη επιβίωση και καθυστερημένη υποτροπής της νόσου [15]. Επιπλέον, TILs στον καρκίνο των ωοθηκών ήταν επίσης σχετίζεται με αυξημένα επίπεδα της ΙΝΡ-γ, IL2 και χημειοκινών που δείχνει την ενεργοποίηση των Τ-κυττάρων και έλξη [15].

Η παρουσία TILs δεν έχει ερευνηθεί εκτενώς σε καρκίνο του ενδομητρίου . Στον καρκίνο του ενδομητρίου, διήθηση των κυτταροτοξικών (CD8 +) Τ-λεμφοκύτταρα στην περιοχή της βλάβης έχει περιγραφεί ως ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας και συσχετίζεται θετικά με τη νόσο ελεύθερο και η συνολική επιβίωση [17], [18]. Επιπλέον, μια υψηλή αναλογία κυτταροτοξικών λεμφοκυττάρων Τ /ρυθμιστικών Τ-λεμφοκυττάρων (CD8 /FoxP3) έχει περιγραφεί για να συσχετιστεί με βελτιωμένη επιβίωση τύπου Ι καρκίνο του ενδομητρίου [17].

Δίπλα στην εισροή των Τ -lymphocytes στην περιοχή του όγκου, η παρουσία των υποδοχέων προγεστερόνης (PR) περιγράφεται επίσης ως ένα σημαντικό πλεονέκτημα για την πρόγνωση και τη θεραπεία του καρκίνου του ενδομητρίου [19], [20], [21]. Σε καλά διαφοροποιημένο καρκίνο του ενδομητρίου έκφραση PR συνήθως διατηρείται και η θεραπεία με οξική μεδροξυπρογεστερόνη (ΜΡΑ), από εκείνους τους ασθενείς με καλά διαφοροποιημένο ασθένεια που επέλεξαν να διατηρήσουν τη γονιμότητα, είναι συνήθως επιτυχής [22], [23]. Απώλεια PR, ωστόσο, είναι ένας αρνητικός προγνωστικός παράγοντας και σχετίζεται με την προοδευτική ασθένεια στην οποία θεραπεία MPA είναι συνήθως μόνο προσωρινά επιτυχείς σε 15-20% των περιπτώσεων [24].

Πρόσφατα, η ομάδα μας έχει μελετηθεί η μηχανισμός μέσω του οποίου η προγεστερόνη μπορεί να επάγει διαφοροποίηση κατά την διάρκεια του κανονικού έμμηνου κύκλου και μπορεί να αναστείλει καλά διαφοροποιημένο ενδομήτριας ανάπτυξης καρκίνου. Παρατηρήθηκε ότι τα αποτελέσματα της θεραπείας προγεστερόνης σε επαγωγή της έκφρασης δύο σημαντικών αναστολέων της σηματοδότησης Wnt /β-κατενίνης: DKK1 και FOXO1 [25], [26]. Στον καρκίνο του ενδομητρίου, ενεργοποίηση της σηματοδότησης Wnt /β-κατενίνης παρατηρείται σε 30-40% των καλά διαφοροποιημένο ενδομητριοειδές καρκινώματα [27] και προκάλεσε την προγεστερόνη αναστολή της οδού σηματοδότησης Wnt υποτίθεται ότι είναι ένας σημαντικός μηχανισμός για τη μείωση της εξέλιξης του καρκίνου [25] .

στην παρούσα μελέτη στοχεύει να διερευνήσει το ρόλο της προγεστερόνης ως άμεσος αναστολέας των μεταναστευτικών ικανότητες του ενδομητρίου καρκινικά κύτταρα και ο ρόλος της Τ-λεμφοκυττάρων που σχετίζονται αναστολή της εξέλιξης της νόσου.

Υλικά και Μέθοδοι

υλικά ασθενής

ιστό καρκινώματος του ενδομητρίου Primary από γυναίκες με (n = 9) και χωρίς (η = 9) ένα γνωστό επεισόδιο υποτροπής ή μετάστασης, ελήφθη από τους ασθενείς που έλαβαν μεταξύ 1997 και το 2006 στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Gasthuisberg, Καθολικό Πανεπιστήμιο Leuven του Βελγίου. Από αυτό το σημείο, μη επαναλαμβανόμενες νόσος αναφέρεται ως μη-προοδευτική νόσο και υποτροπιάζουσα /μεταστατική νόσο ως προοδευτική ασθένεια. Ιστοπαθολογικές ταξινόμησης, στάσης και πληκτρολογώντας καθορίστηκαν σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές της ΠΟΥ και ΦΥΓΩ [28], [29] και όλων των όγκων αναθεωρήθηκαν από έναν παθολόγο με εμπειρία στην gynaecopathology (PCE). συμπεριλήφθηκαν ασθενείς με τύπου ενδομητριοειδές και καρκίνωμα του ενδομητρίου ΦΥΓΩ σταδίου Ι. εξαιρέθηκαν ασθενείς που λαμβάνουν θεραπεία με ακτινοθεραπεία ή χημειοθεραπεία πριν από τη χειρουργική επέμβαση, χρησιμοποιώντας ορμονικά στεροειδή ή με ένα δεύτερο κακοήθεια. Πλήρη κλινικό ιστορικό λήφθηκε από όλους τους ασθενείς και την παρακολούθηση αναθεωρήθηκε μέχρι σήμερα. Δείγματα καταψύχθηκαν ακαριαία σε υγρό άζωτο για RNA-απομόνωση ή μονιμοποιήθηκαν σε φορμαλίνη και εγκλείστηκαν σε παραφίνη για ανοσοϊστοχημεία (IHC). Για την ανάλυση μικροσυστοιχιών, από 4 μη-προοδευτική και 4 προοδευτική ασθενείς, snap χρησιμοποιήθηκαν κατεψυγμένα δείγματα όγκου. Αυτές επελέγησαν επειδή περιείχαν & gt? 80% του ιστού του όγκου και καλή ποιότητα του RNA μπορεί να απομονωθεί από αυτούς. Για RT-PCR, χρησιμοποιήθηκαν 6 μη-προοδευτική και 6 προοδευτική θραύση κατεψυγμένα δείγματα ιστού ασθενών. Για IHC 9 μη-προοδευτική και 9 προοδευτική ενσωματωμένα σε παραφίνη δείγματα ιστού ασθενών ήταν διαθέσιμα. Ιστών και η συλλογή κλινικών δεδομένων για την τρέχουσα ερευνητική μελέτη εγκρίθηκε από την Ιατρική Επιτροπή Ηθικής του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Gasthuisberg και οι ασθενείς έδωσαν γραπτή συγκατάθεση για τη συλλογή των ιστών και τη συλλογή κλινικών δεδομένων για όλους τους ερευνητικούς σκοπούς.

κυττάρων πολιτισμού

Για όλα τα πειράματα κυτταρικής γραμμής, Ishikawa κυτταρικές σειρές καρκίνου του ενδομητρίου σταθερά επιμολυσμένα με PRA (IKPRA-1), PRB (IKPRB-1) ή PRA και PRB (IKPRAB-36) (προηγουμένως περιγράφεται από Smit-Koopman et al. [30]) καλλιεργήθηκαν και διατηρήθηκαν σε κανονικό μέσο καλλιέργειας (DMEM /F12 Glutamax, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) με την παρουσία 5% ορό εμβρύου μόσχου (Invitrogen) συμπληρωμένο με πενικιλίνη και στρεπτομυκίνη (Invitrogen). Νεομυκίνη (ICN Biomedicals, Costa Mesa, CA, USA) και υγρομυκίνη (Invitrogen) 1:200 χρησιμοποιήθηκαν για τη διατήρηση επιλογής. Για όλους τους προσδιορισμούς, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο καλλιέργειας DMEM /F12 συμπληρωμένου με Glutamax πενικιλλίνη και στρεπτομυκίνη (Invitrogen), που περιέχει 5% απογυμνωμένο από ξυλάνθρακα FCS (Invitrogen) με την προσθήκη υγρομυκίνης και νεομυκίνη.

Ανοσοϊστοχημεία

μελέτες IHC για CD4 (Sanbio BV, Uden, The Netherlands), CD8 (Dako, Glostrup, Δανία), FoxP3 (Natutech, Frankfurt am Main, Γερμανία) και PRA + ΖΗΤΗΜΑ (υποδοχέα προγεστερόνης Ab-8, NeoMarkers, Fremont, CA, USA) πραγματοποιήθηκαν σε τμήματα 4 μm παραφίνης για Starfrost-slides (Knittel, Braunschweig, Γερμανία). Πριν από την επώαση με το πρωτεύον αντίσωμα, τα πλάκες αποπαραφινοποιήθηκαν σε ξυλόλιο και επανυδατώθηκαν σε 70% αιθανόλη. Για χρώση CD4 + και CD8 + Τ-λεμφοκυττάρων, τα πλακίδια μικροκύματα στους 850 Watt σε Tris /EDTA ρΗ 9,0 για 15 λεπτά. Η ενδογενής δραστικότητα υπεροξειδάσης αποκλείστηκε με 30% Η

2O

2 σε PBS για 5 λεπτά. Πρωτογενή αντισώματα εφαρμόστηκαν σε αντίστοιχα 1:160 (CD4) και 1:200 (CD8) σε Tris /HCl ρΗ 8,0 και επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. Μετά από πλύση με Tris /HCl ρΗ 8,0, οι τομές επωάστηκαν για 30 λεπτά. σε θερμοκρασία δωματίου με βιοτινυλιωμένο δευτερογενές αντίσωμα (Dako, 1:400). Μετά από πλύση με Tris /HCL, το υπόστρωμα διαμινοβενζιδίνη (Dako) χρησιμοποιήθηκε για την οπτικοποίηση της αντιδραστικότητας αντιγόνου-αντισώματος.

Για FoxP3, πλακίδια μπλοκαρίστηκαν (υπεροξειδάση απενεργοποίηση) για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (RT) σε 30 % Η

2O

2 σε μεθανόλη και βραστά (ανάκτηση αντιγόνο) σε ένα κιτρικό ρυθμιστικό ρΗ 6,0 για 15 λεπτά. Πρωτογενής αντίσωμα εφαρμόστηκε σε 1:25 και επωάστηκαν στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Μετά την πλύση με PBS, τα πλακίδια επωάστηκαν για 30 λεπτά. με ένα δευτερεύον αντίσωμα κουνελιού-αντι-αρουραίου (DAKO, 1:150) και επωάστηκαν για 30 λεπτά. με ΑΒ-συγκρότημα (Dako). Το υπόστρωμα διαμινοβενζιδίνη (Dako) χρησιμοποιήθηκε για την οπτικοποίηση της αντιδραστικότητας αντιγόνου-αντισώματος.

Για τη χρώση PRA + PRB, η ενδογενής δράση υπεροξειδάσης αποκλείστηκε επί 5 λεπτά σε RT σε ένα 10% Η

2O

2 σε διάλυμα μεθανόλης και τα πλακίδια μικροκύματα (ανάκτηση αντιγόνου) σε ένα φούρνο μικροκυμάτων σε 850 Watt σε 10 ηΜ ρυθμιστικό διάλυμα κιτρικού οξέος ρΗ 6,0 (ϋΑΚΟ) για 15 λεπτά. Μετά από ψύξη σε θερμοκρασία δωματίου πλακίδια πλύθηκαν με PBS και αποκλείστηκαν για 30 λεπτά με 0,3% BSA /PBS. Πρωτογενής αντίσωμα εφαρμόστηκε στις 1:50 και επωάστηκαν στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Μετά την πλύση με PBS, τα πλακίδια επωάστηκαν για 30 λεπτά με ένα βιοτινυλιωμένο δευτερεύον αντίσωμα κατσίκας αντι-ποντικού (Dako, 1:400). Μετά τη δεύτερη πλύση τα πλακίδια επωάστηκαν για 30 λεπτά με ΑΒ-σύμπλοκο (Dako, 1:01:50). Το υπόστρωμα διαμινοβενζιδίνη (Dako) χρησιμοποιήθηκε για την οπτικοποίηση της αντιδραστικότητα. Όλα τα πλακίδια με αιματοξυλίνη για 30 s, έπειτα αφυδατώθηκαν και τοποθετημένα.

Για τη χρώση βιμεντίνης, μία δοκιμασία για επούλωση της πληγής διεξήχθη σε πλάκες 2-καλά θαλάμου (Lab-Tek, Thermo Fisher Scientific, Waltham, ΜΑ , USA), υπό την παρουσία και απουσία 1 ηΜ οξικής μεδροξυ-προγεστερόνη (ΜΡΑ), και τερματίστηκε μετά από 48 ώρες. Τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές με PBS, μονιμοποιήθηκαν με 4% φορμαλδεΰδη /PBS για 15 λεπτά και κατέστησαν διαπερατά με 0,3% Triton100 /PBS για 5 λεπτά. Μετά την πλύση, η ενδογενής δράση υπεροξειδάσης αποκλείστηκε με 10% Η

2O

2 σε μεθανόλη για 5 λεπτά. Τα πλακίδια πλύθηκαν και στη συνέχεια δεσμεύτηκαν για 30 λεπτά με 0,3% BSA /PBS. Το αντι-βιμεντίνη αντίσωμα (Invitrogen) εφαρμόστηκε στις 1:50 και τα πλακίδια επωάστηκαν για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά την πλύση με PBS, τα πλακίδια επωάστηκαν με ένα δευτερεύον αντίσωμα GFP-φθορισμού κατσίκας-αντι-ποντικού (Invitrogen) σε 1:500. Μετά την πλύση, τα πλακίδια επωάστηκαν για 5 λεπτά με ϋΑΡΙ Nucleic Acid διαλύματος βαφής (Invitrogen) για την πυρηνική χρώση. Μετά τον τερματισμό της αντίδρασης με dH

2O, οι πλάκες τοποθετούνται και φθορίζουσες εικόνες ελήφθησαν με την Αχίορίαπ 2 Imaging μικροσκόπιο φθορισμού (Carl Zeiss AG, Jena, Germany).

Μετρώντας TILs

Μετά την κηλίδωση, τα πλακίδια σαρώθηκαν με το σαρωτή διαφανειών NDP (Hamamatsu, Hamamatsu City, Japan) και CD4, CD8 και FoxP3 θετικά ενδοδιηθητικά όγκου λεμφοκύτταρα (TILs) μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό J εικόνας (National Institutes of Health, Bethesda, MD , ΗΠΑ). Ο αριθμός των TILs προσδιορίστηκε μέσα στον όγκο (ενδονεοπλασματική), στην άκρη του όγκου (Tumor Edge) και στην ενδομητρίου /μυομήτριο συνόρων (ΕΜ). Η πλήρης άκρη του όγκου και του ενδομητρίου /μυομήτριο σύνορα αξιολογήθηκαν για την παρουσία TILs. Η εντός του όγκου καταμέτρηση πραγματοποιήθηκε μετρώντας την TILs σε 10 διαφορετικές τυχαία διάλεξε περιοχές (1170 μm × 932 μm) που επιλέγεται από έναν ανεξάρτητο ερευνητή, έτσι ώστε να εξαφανισθεί προκαταλήψεις του παρατηρητή.

WST1 δοκιμασία

Για την WST1 δοκιμασία πολλαπλασιασμού, κυτταρικές σειρές IKPRA-1, IKPRB-1 και IKPRAB-36 καλλιεργήθηκαν απουσία ή παρουσία ΜΡΑ σε μια πλάκα (Corning Costar, Cambridge, ΜΑ, USA) 96 φρεατίων. Κατά το χρόνο 0, τα κύτταρα επωάστηκαν με WST1 αντιδραστήριο κυτταρικού πολλαπλασιασμού (Roche, Βασιλεία, Ελβετία) για 3 ώρες στους 37 ° C και η απορρόφηση μετρήθηκε με τη Microplate Reader (BioRad, μοντέλο 550, Hercules, CA, USA). Μετά τη βασική μέτρηση οι κυτταρικές γραμμές καλλιεργήθηκαν υπό την παρουσία και απουσία 1 ηΜ MPA για 96 ώρες και σε 96 ώρες, η δοκιμασία WST1 επαναλήφθηκε.

δοκιμασίες Μετανάστευση

Για την επούλωση των πληγών δοκιμασίας, IKPRA-1, κυτταρικές γραμμές IKPRB-1 και IKPRAB-36 καλλιεργήθηκαν σε ένα πλακίδιο 6 φρεάτων (Corning Costar). Μετά την επαγωγή του τραύματος, τα κύτταρα επωάστηκαν με 1 ηΜ ΜΡΑ για 96 ώρες. Επούλωση πληγών επαληθεύτηκε κάθε 24 ώρες από τη φωτογραφία, και αναλύθηκαν με μέτρηση κλείσιμο του τραύματος.

Για την τροποποιημένη δοκιμασία Boydon, τα κύτταρα σπάρθηκαν στο άνω φρεάτιο ενός τροποποιημένου θαλάμου Boydon (Transwell, 8 μm πόρους, ένθετα 24 mM, 6 φρεατίων, Corning Costar) σε 2.5 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο σε παρουσία ή απουσία του 1 ηΜ MPA. Επιπλέον ως μάρτυρας, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ένα θάλαμο Boyden με την παρουσία ή απουσία του 1 ηΜ MPA σε συνδυασμό με 100 ηΜ του αντι-progestagin Org31489 (Organon, Oss, The Netherlands). Μετά από 96 ώρες, τα κύτταρα που είχαν μεταναστεύσει διαμέσου του φίλτρου μέσα στο κατώτερο φρεάτιο ή στον πυθμένα του ενθέματος θρυψινοποιήθηκαν και μετρήθηκαν κάτω από το μικροσκόπιο.

κηλίδωση Western

IKPRA-1, IKPRB- 1, κυτταρικές σειρές IKPRAB-36 και IKLV-8 καλλιεργήθηκαν απουσία ή παρουσία 1 ηΜ MPA για 96 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε λύση σε 0 ° C στο Cell Lysis Buffer (Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ, USA) για 5 λεπτά . Στη συνέχεια, τα κύτταρα αποξέστηκαν, φυγοκεντρήθηκαν στις 14.000 rpm για 10 λεπτά και το υπερκείμενο απομακρύνθηκε. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το Protein Assay Kit (Pierce, Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) και από κάθε δείγμα 4.5 μg πρωτεΐνης σε 30 μι ρυθμιστικό διάλυμα λύσης + BSA φορτώθηκε σε πήκτωμα 10% SDS-PAGE. Κηλίδωση Western πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τυποποιημένες διαδικασίες. Το στυπόχαρτο αποκλείστηκε για 30 λεπτά σε RT με ρυθμιστικό διάλυμα αποκλεισμού (LI-COR Biotechnology, Lincoln, ΝΕ, USA) και στη συνέχεια επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C χρησιμοποιώντας αντι-hFOXO1 πολύκλωνο αντίσωμα κουνελιού (1:5000, Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA) σε ρυθμιστικό διάλυμα φραγμού (LI-COR Biotechnology). Στη συνέχεια, η κηλίδωση μεμβράνη επωάστηκε με το δευτερεύον αντίσωμα κατσίκας αντι-κουνελιού IgG (IRDye 800CW, 1:5000, LI-COR Biotechnology) για 30 λεπτά σε RT και πλύθηκαν. Ως μάρτυρας φόρτωσης, η μεμβράνη επωάστηκε για 30 λεπτά με το μονοκλωνικό αντι-β-ακτίνης (1:1000, Sigma-Aldrich, Saint Louis, ΜΟ, USA), πλύθηκαν με PBS και επωάστηκαν για 30 λεπτά με τη δευτερεύουσα αιγείου IgG αντι-ποντικού (IRDye 680CW, 1:5000, LI-COR Βιοτεχνολογίας). Οι ειδικές ζώνες πρωτεΐνης ανιχνεύθηκαν με τη χρήση της σάρωσης του συστήματος Οδύσσεια (LI-COR Biotechnology).

RNA-απομόνωση, αναλύσεις γονιδιακής έκφρασης και ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR

Τα δείγματα ασθενούς ιστού κόπηκαν (5 μm, κρυοστάτη) και κάθε 10

ου τμήματος ήταν αυτός βάφονται και αναθεωρήθηκε από τον παθολόγο (PCE) για να αξιολογήσει το φορτίο του όγκου. Μόνο τα τμήματα που περιέχουν & gt? 80% του όγκου λύθηκαν σε ΤπζοΙ (Invitrogen) και υποβλήθηκε σε υπερήχους επί 1 λεπτό. Η κυτταρική γραμμή που εκφράζει Ishikawa PRA και PRB (IKPRAB-36) καλλιεργήθηκε για 48 ώρες απουσία ή παρουσία 1 ηΜ MPA (n = 3), τοποθετήθηκε σε πάγο και λύθηκαν σε ΤπζοΙ (Invitrogen).

διαχωρισμός φάσεων πραγματοποιήθηκε με 0,2 ml χλωροφορμίου και φυγοκέντρηση για 15 λεπτά. Το υπερκείμενο μεταφέρθηκε και ισοπροπανόλη προστέθηκε για καταβύθιση του RNA. Το καταβυθισθέν RNA πλύθηκε με 75% αιθανόλη. Όλα τα RNA καθαρίστηκε με το κιτ καθαρισμού Rneasy Minelute (Qiagen, Venlo, Ολλανδία). Ποσότητα και την ποιότητα του RNA εκτιμήθηκε με τη χρήση του Nanodrop (Nanodrop, Wilmington, DE, USA) και Βιο-αναλυτή (Aligent, Santa Clara, CA, USA).

RNA που απομονώθηκε από το υλικό του ασθενούς και κυτταρική σειρά σημάνθηκε σύμφωνα με τα πρωτόκολλα Affymetrix επισήμανση και σημασμένο RNA εφαρμόσθηκε σε ευρεία γονιδιακή έκφραση συστοιχίες (GeneChips Affymetrix U133plus2 περιέχει 54.614 σύνολα ανιχνευτή, που αντιπροσωπεύουν περίπου 47.000 μεταγραφές (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA)). Χρησιμοποιώντας RMA (Στιβαρή πολλαπλών σειρά ανάλυση [31]), κανονικοποίηση των πρώτων δεδομένων έγινε για να είναι σε θέση να παράγει τις λίστες των γονιδίων και τελικά υπολογίζει σημαντικά γονιδίων που ρυθμίζονται με τη χρήση του SAM (Πανεπιστήμιο του Stanford, Stanford, CA, USA [32]). Κατάλογοι των SAM ρυθμιζόμενων γονιδίων (1,25 φορές ή περισσότερο? Δέλτα-τιμές που μοιάζει με ρ & lt? 0,05) φορτώθηκαν στην οδό Ingenuity βοηθήσει λογισμικό για την αξιολόγηση της συμμετοχής των διαφορετικών βιολογικών οδών (ευστροφία, Redwood City, CA, USA). Για τα υλικά ασθενή πρώτες λίστες των ρυθμιζόμενων γονιδίων (1,25 φορές ή περισσότερο) φορτώθηκαν σε Ingenuity

Όλα τα δεδομένα μικρο-array είναι MIAME συμβατό και ανεπεξέργαστα δεδομένα έχει κατατεθεί στη βάση δεδομένων MIAME συμβατό GEO κάτω σειρά:. GSE29437 (που αποτελείται από GSE29435: δεδομένα κυτταρική σειρά? και GSE29436: δεδομένων των ασθενών)

τα γονίδια για ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR ταυτοποιήθηκαν με ανάλυση μικρο-συστοιχία και η ανάλυση μονοπατιού.. RNA μεταγράφηκε σε cDNA με τη χρήση του ενός κύκλου κιτ σύνθεσης cDNA Affymetrix (Affymetrix). Για τις προσδιοριζόμενες γονίδια, αστάρια διατάχθηκαν και ελέγχθηκαν (ένας κατάλογος των εκκινητών περιλαμβάνεται στον πίνακα S1). Το γονίδιο housekeeping β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένα γονίδιο αναφοράς. RT-PCR και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα CFX RT-PCR (Bio-Rad, Veenendaal, Ολλανδία).

Στατιστικά

Για τις στατιστικές αναλύσεις των CD4 +, CD8 + και Foxp3 + κυττάρων μετρήσεις, τροποποιημένα στοιχεία Boyden δοκιμασία θαλάμου, τα δεδομένα προσδιορισμού WST1 και δεδομένα RT-PCR, SPSS 15.0 χρησιμοποιήθηκε (ΙΒΜ, Armonk, NY, USA). Για την κανονική κατανομή των δεδομένων ένα t-test και λοξή δεδομένα ένα Mann-Whitney U-test διεξήχθη για να αξιολογηθεί Ρ-τιμές. Μια τιμή Ρ & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Για τον υπολογισμό της p-value των οργανωμένων μονοπατιών, την εφευρετικότητα οδός βοηθήσει το λογισμικό χρησιμοποιεί την ακριβή δοκιμασία κατά Fisher.

Αποτελέσματα

Τα χαρακτηριστικά των ασθενών (Πίνακας 1)

Η

Οι ασθενείς με (n = 9) και χωρίς (η = 9) συμπεριλήφθηκαν προοδευτική καρκίνο του ενδομητρίου. Όλοι οι ασθενείς υποβλήθηκαν σε πρωτογενή περιλαμβάνονται συνολικό abdominal- ή λαπαροσκοπικά υποβοηθούμενη κολπική υστερεκτομή και αμφοτερόπλευρη σαλπιγγοωοθηκεκτομή σε συνδυασμό με αφαίρεση λεμφαδένων. Καμία από τις γυναίκες έλαβαν χημειοθεραπεία και μόνο μία γυναίκα στην ομάδα προοδευτική ασθένεια δόθηκε ακτινοθεραπεία μετά από χειρουργική επέμβαση. Ιστοπαθολογική υποτύπων ήταν ενδομητριοειδές (n = 17) και αναμίχθηκε ενδομητριοειδές /mucinoid (n = 1). τάξεων όγκου ήταν 1 (n = 7), 2 (n = 4) και 3 (n = 7) και FIGO στάδια ήταν Ia (n = 11) και Ib (n = 7). Στην ομάδα προοδευτική ασθένεια και τα 9 ασθενείς είχαν ένα ή περισσότερα επεισόδια τοπικής υποτροπής και 4 ασθενείς ανέπτυξαν μία ή πολλαπλές απομακρυσμένες μεταστάσεις. Οι υποτροπές ήταν κολπική, πυελική ή (retro) περιτοναϊκή, και μεταστατικές θέσεις ήταν οι πνεύμονες (n = 3), το ήπαρ (η = 1), σπλήνα (n = 1) και ο εγκέφαλος (n = 1). Κλινική παρακολούθηση μέχρι σήμερα ήταν διαθέσιμες για όλους τους ασθενείς. Στο μη-προοδευτική ομάδα 8 ασθενείς είναι σήμερα απαλλαγμένα από τη νόσο και 1 ασθενής πέθανε στη συνέχεια. Στην ομάδα προοδευτική ασθένεια 3 ασθενείς είναι απαλλαγμένες από τη νόσο και 6 ασθενείς απεβίωσαν από τη νόσο του ενδομητρίου τους που σχετίζονται με τον καρκίνο. Τα χαρακτηριστικά των ασθενών παρουσιάζονται λεπτομερώς στον Πίνακα 1.

κατάσταση του υποδοχέα της προγεστερόνης και την ανίχνευση των CD4 + Τ-βοηθητικά, CD8 + κυτταροτοξικά Τ-κύτταρα και FoxP3 + ρυθμιστικά Τ-κύτταρα σε μη προοδευτική και προοδευτική ασθένεια

Η παρουσία διηθητικών λεμφοκυττάρων όγκου έχει συσχετιστεί με παρατεταμένη επιβίωση στον καρκίνο του ενδομητρίου [17], [18]. Επιπλέον, η απώλεια του υποδοχέα προγεστερόνης (PR) έκφραση σε καρκίνο του ενδομητρίου έχει βρεθεί να είναι ένας παράγοντας κινδύνου για προοδευτική ασθένεια [33]. Προκειμένου να τεκμηριώσει τη σχέση μεταξύ άθικτο σηματοδότησης PR και την παρουσία των λεμφοκυττάρων που διεισδύουν σε μη-προοδευτική νόσο, ανοσοϊστοχημική χρώση και, όταν έγιναν κατάλληλα, ποσοτικές μετρήσεις.

Όπως επεξηγείται στο Σχ. 1Α, σε προοδευτική ασθένεια ανοσοϊστοχημική χρώση για τα CD4 +, CD8 + και Foxp3 + Τ-λεμφοκυττάρων φαίνεται μειωμένη σε σύγκριση με χρώση σε μη προοδευτική νόσο. Ποσοτικοποίηση του αριθμού των CD4 +, CD8 + και Foxp3 + Τ-λεμφοκυττάρων σε προοδευτική νόσο επιβεβαιώθηκε πράγματι ένα μικρότερο αριθμό των θετικών κυττάρων που βρίσκεται στην ενδομητρίου-μυομήτριο συνόρων (Σχ. 1Β, ΕΜ), στην άκρη του όγκου (Σχ. 1 Β, Edge όγκου) και εντός του όγκου (Σχ. 1Β, ενδονεοπλασματική). Αν οι μειωμένου αριθμού κυττάρων ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ των μη-προοδευτική και προοδευτική ενδομητρίου καρκινικούς ιστούς υποδεικνύεται στο σχήμα (Σχήμα 1Β).

Α:. Επισκόπηση των ανοσοϊστοχημική χρώση για CD4, CD8 και FoxP3 στην πρωτοβάθμια ενδομητρίου καρκίνος δείγματα σε μη προοδευτική νόσο (n = 9) σε σύγκριση με προοδευτική ασθένεια (n = 9) (μεγέθυνση 0,4x, ένθετο 10x). Μη-προοδευτική δείχνει ασθένεια προφέρεται χρώση, ενώ προοδευτική δείχνει νόσου μειώνεται χρώση. Η κλίμακα-bar αντιπροσωπεύει το 10 mm. Β: Ποσοτικοποίηση της CD4, CD8 και μετρήσεις κυττάρων FoxP3 στην άκρη του όγκου (Tumor Edge), στον όγκο (ενδονεοπλασματική) και σχετικά με την ενδομητρίου-μυομήτριο συνόρων (ΕΜ σύνορα). * Υποδηλώνει ρ-τιμή & lt? 0,05 (Mann-Whitney U-test). Γ και Δ: Αντιπροσωπευτικά μη προοδευτική (C) και προοδευτική (D) ιστούς ασθενών υπέστησαν βαφή για CD4, CD8 και PRA + PRB και δείχνουν μια θετική συσχέτιση μεταξύ της παρουσίας του TILs και την έκφραση του PR. Η μεγέθυνση είναι 5x και η κλίμακα μπαρ αντιπροσωπεύει το 1 mm. Ασθενείς 6 και 11 και οι δύο περιλαμβάνονται στο αναλύει το μικρο-συστοιχία. Επιπλέον ασθενής 11 είχε μόνο υποτροπιάζουσας νόσου, ενώ ασθενής 12 είχε υποτροπιάζοντα και μεταστατική νόσο.

Η

Επιπλέον, εξετάζοντας διαδοχικούς τμήματα στο μη προοδευτική ασθένεια για την έκφραση των υποδοχέων προγεστερόνης (PR) αποκάλυψε ότι η παρουσία των CD4 + και CD8 + Τ-λεμφοκύτταρα συσχετίσθηκε θετικά με την παρουσία της χρώσης PR (Εικ. 1Γ και 1Δ).

αναλύει την έκφραση του γονιδιώματος σε επίπεδο πρωτογενούς ιστού του ενδομητρίου καρκινώματος

Για να διερευνήσουν κατά πόσον η συσχέτιση μεταξύ PR σηματοδότηση και η παρουσία των διηθητικών λεμφοκυττάρων όγκου θα μπορούσε να υποδεικνύει μια αιτιολογικός σχέση, μια ανάλυση έκφρασης mRNA του γονιδιώματος σε επίπεδο επί snap-κατεψυγμένα πρωτογενή δείγματα ενδομητρίου καρκινώματος από 4 ασθενείς χωρίς και 4 ασθενείς με προοδευτική ασθένεια εκτελέστηκε. Σε επίπεδο επιμέρους γονίδιο παρατηρήθηκε ότι μία αξιοσημείωτη αριθμός χημειοκινών και κυτοκινών ρυθμίζονται διαφορικά μεταξύ μη προοδευτική και προοδευτική ασθένεια (Πίνακας S2). Για παράδειγμα, η χημειοκινών CCL21 (-1.5x), CXCL9 (-2.9x), CXCL10 (-2.1x) και CXCL14 (τρία σύνολα δεδομένων σήμερα: -33.0x? -20.5x? -6.4x, Αντίστοιχα) ήταν όλα τα κάτω ρυθμίζεται σε προοδευτική ασθένεια, ενώ οι κυτοκίνες IL-8 (2.0x? 5.7x? 9.5x) και IL32 (1.9x) ήταν πάνω ρυθμισμένα σε προοδευτική ασθένεια (Πίνακας S2). Επιπλέον, προηγούμενη εργασία από την ομάδα μας έχει δείξει ενεργοποίηση του σηματοδότηση Wnt /β κατενίνης σε προοδευτική ασθένεια [25] και σε συμφωνία με αυτήν την σειρά των Wnt /β-κατενίνης inhibitory- και στόχος γονίδια χάθηκαν από την προοδευτική ασθένεια (DKK1, DKK4 και WIF1) (Πίνακας S2).

είναι ενδιαφέρον ότι, ένας αριθμός των ανωτέρω αναφερθέντων γονιδίων που ρυθμίζεται προς τα κάτω σε προοδευτική νόσο, έχουν περιγραφεί στη βιβλιογραφία για να ρυθμίζεται προς τα πάνω με προγεστερόνη (CXCL14 [34], DKK1 [25], ΜΜΡ7 [35] και SFRP4 [36]). Αυτό είναι σε συμφωνία με το εύρημα ότι οι δημόσιες σχέσεις έκφρασης (σε πρωτεΐνη και το επίπεδο έκφρασης του mRNA (Εικ. 1Γ και 1Δ και Πίνακας S2) ρυθμίζεται προς τα κάτω σε προοδευτική ασθένεια.

Μετά την αναθεώρηση πορείες ρυθμίζονται μεταξύ μη-προοδευτική και προοδευτική ασθένεια, ρύθμιση ενός αριθμού οδών που εμπλέκονται στην καρκινογένεση και διεισδυτική νόσο και που εμπλέκονται στην ανοσολογικής βρέθηκε να ρυθμίζεται σημαντικά: Ιντεγκρίνης Σηματοδοσίας, Molecular Mechanisms of Cancer, Antigen Παρουσίαση Pathway, μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα Signaling, IGF-1 σηματοδότηση, ο ρόλος των ιστών παράγοντας κατά του καρκίνου, των λευκοκυττάρων εξαγγείωση σηματοδοσίας, ΕΚΚ /ΜΑΡΚ σηματοδότηση, καρκίνο του παχέος εντέρου Μετάσταση σηματοδοσίας (η οποία περιλαμβάνει Wnt /σηματοδότησης κατενίνης β), FGF σηματοδοσίας, ΡΑΚ σηματοδότησης, κ.λπ. (ο πλήρης κατάλογος των οργανωμένων μονοπατιών και διαδοχικές π-αξίες τους μπορεί να προσεγγιστεί από τον πίνακα S3).

για ένα αριθμό γονιδίων (CXCL14, DKK1, DKK4, PEG10 και WIF1) ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR πραγματοποιήθηκε προκειμένου να εξακριβωθεί ρύθμιση (Εικ. 2).

CXCL14, επιλέχθηκαν DKK1, DKK4, WIF1 και PEG10 από τα αποτελέσματα μικρο-array και επαλήθευσε με πραγματικού χρόνου RT-PCR. Η σημαντικότητα υπολογίστηκε με χρήση Mann-Whitney U-test. Μια τιμή ρ 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

Η

Η επίδραση της προγεστερόνης για τη μετανάστευση των καρκίνο του ενδομητρίου κυτταρικές σειρές Ishikawa

Για την περαιτέρω επιβεβαιώνουν τον πιθανό ρόλο για προγεστερόνη στη ρύθμιση εισβολή, Ishikawa κυτταρικές σειρές καρκινώματος του ενδομητρίου σταθερά επιμολυσμένα με PRA, PRB, ή PRA και PRB [30] καλλιεργήθηκαν παρουσία ή απουσία του MPA για διάφορες χρονικές περιόδους και χρησιμοποιούνται σε δύο διαφορετικά πειράματα μετρήσεως κυτταρική μετανάστευση. Για την επαλήθευση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων κατά τη διάρκεια των διαφορετικών πειραμάτων μια δοκιμασία πολλαπλασιασμού WST1 διεξήχθη η οποία έδειξε ότι κατά την αναφερόμενο χρονοδιάγραμμα θα μπορούσε να ανιχνευθεί καμία σημαντική διαφορά στον πολλαπλασιασμό μεταξύ των κυττάρων επωάστηκαν με ή χωρίς ΜΡΑ.

Στο Σχήμα 3, διαφορετικών κυτταρικών Ishikawa γραμμές υποβλήθηκαν σε μια δοκιμασία για επούλωση της πληγής με την παρουσία ή απουσία του MPA (1 ηΜ) για έως 96 ώρες. Παρατηρήθηκε ότι στα σταθερώς εκφράζουν PRB (IKPRB-1) και PRA + PRB εκφράζουν (IKPRAB-36) κυτταρικές σειρές Ishikawa, MPA ανέστειλε κλείσιμο του χειροκίνητα προκλήθηκε τραύμα (Σχ. 3Α-D). Επιπλέον, όταν βάφονται την άκρη του τραύματος για την μεσεγχυματικών βιμεντίνη δείκτη, παρατηρήθηκε ότι με την παρουσία της έκφρασης βιμεντίνης ΜΡΑ μειώθηκε σαφώς (Σχ. 3Ε). Δίπλα σε αυτή την λεπτομέρεια στην έκφραση της βιμεντίνης, τα συνολικά επίπεδα vimentin μειώθηκαν σε IKPRB-1 και IKPRAB-36 κυτταρικές σειρές επωάστηκαν με 1 nM ΜΠΕ. Παρατηρήθηκε επίσης ότι στην σταθερώς εκφράζουν PRA (IKPRA-1) κυτταρική γραμμή Ishikawa, ούτε την θεραπεία του τραύματος ούτε βιμεντίνη έκφραση επηρεάστηκε από MPA (Σχ. 3Α και 3Ε).

IKPRA-1 (Α), κύτταρα IKPRB-1 (Β) και IKPRAB-36 (C) καλλιεργήθηκαν απουσία (λευκά σφαίρες) ή παρουσία (μαύρες σφαίρες) του 1 ηΜ MPA και χρησιμοποιήθηκαν για μία ανίχνευση επούλωση της πληγής (n = 3) και το κλείσιμο των πληγή μετρήθηκε ως ποσοστό του συνόλου κλεισίματος (100% σημαίνει ότι το τραύμα είναι ανοιχτή, 0% σημαίνει ότι η πληγή έχει κλείσει). D δείχνει αντιπροσωπευτικές εικόνες της διαδικασίας της επούλωσης τραυμάτων με κόκκινο πληγή. Ε δείχνει IF για πυρήνες (DAPI) και η έκφραση vimentin στην επεμβατική μπροστά του το χέρι που προκλήθηκε τραύμα. Σε αυτό το σχήμα, το τραύμα ήταν πάντοτε βρίσκεται στη δεξιά πλευρά.

Η

Στο Σχήμα 4, μια άλλη προσέγγιση χρησιμοποιήθηκε για να μελετηθεί η μεταναστευτική ικανότητα των διαφορετικών κυτταρικών γραμμών Ishikawa παρουσία ή απουσία της προγεστερόνης. Παρατηρήθηκε ότι για IKPRB-1, καθώς και IKPRAB-36 κύτταρα, η μετανάστευση σε ένα τροποποιημένο θάλαμο Boyden αναστέλλεται υπό την παρουσία προγεστερόνης. Επιπλέον, για την κυτταρική γραμμή IKPRA-1 δεν παρατηρήθηκε μια τέτοια απόκλιση ρύθμιση της μετανάστευσης υπό την επίδραση του MPA.

IKPRA-1, IKPRB-1 και IKPRAB-36 κύτταρα καλλιεργήθηκαν απουσία (μαύρες κουκίδες ) ή παρουσία (λευκές κουκκίδες) του 1 ηΜ MPA σε ένα τροποποιημένο θάλαμο Boyden. Μετά από 96 ώρες, τα κύτταρα που είχαν μεταναστεύσει διαμέσου των πόρων του άνω φρεάτιο μετρήθηκαν. Ο αριθμός αντιπροσωπεύει τρία ανεξάρτητα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. * Υποδηλώνει μια p-τιμή & lt? 0,05 (Mann-Whitney U-test)

Η

ανάλυση της έκφρασης του γονιδιώματος-πάνω από Ishikawa καρκίνο του ενδομητρίου κυτταρική σειρά

Για την περαιτέρω progesterone- έγγραφο. επαγόμενη αναστολή της κυτταρικής μετανάστευσης και να διερευνηθεί η εμπλοκή της σηματοδότησης προγεστερόνης σε διείσδυση Τ-λεμφοκυττάρων, IKPRAB-36 κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 48 ώρες παρουσία ή απουσία 1 ηΜ MPA και χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση έκφρασης γονιδιώματος κλίμακα. Παρατηρήθηκε ότι το 1616 τα γονίδια ήταν σημαντικά ρυθμίζονται από την προγεστερόνη στην IKPRAB-36 κυτταρική γραμμή (1029 πάνω ρυθμισμένα, 587 ρυθμισμένα προς τα κάτω, ο Πίνακας S4).

Χρησιμοποιώντας ανάλυση μονοπατιού Ingenuity σημαντικά ρυθμισμένων γονιδίων, τα ακόλουθα