Αφηρημένο

Παρά τις προηγούμενες μελέτες που αποδεικνύουν τα χαρακτηριστικά του καρκίνου του παχέος εντέρου βλαστικά κύτταρα (CCSCs) και ο ρόλος της επιθηλιακής -mesenchymal μετάβασης (EMT) στην ανάπτυξη όγκων, παραμένει αμφιλεγόμενη ως προς τη σχέση μεταξύ CCSCs και EMT. Σε αυτή τη μελέτη, ώστε να παρουσιάσει μια εικόνα αυτής της σχέσης στον καρκίνο του παχέος εντέρου, αναπτύξαμε HCT116 και ΗΤ29 μοντέλα σφαίρα, η οποία είναι γνωστό ότι είναι τα κύτταρα εμπλουτίζοντας καρκινικά βλαστικά κύτταρα. Σε σύγκριση με τη γονική τους ομολόγους τους, τα κύτταρα σφαιροειδές εμφανίζεται κάτω ομοτυπική /heterotypic πρόσφυση, αλλά υψηλότερη in vitro μεταναστευτικών /επεμβατική ικανότητα, καθώς και υψηλότερες ογκογόνο και μεταστατικό δυναμικό in vivo. Τα κύτταρα σφαιροειδές έδειξαν επίσης ρυθμίζεται προς τα κάτω Ε-καδερίνης και πάνω ρυθμισμένα α-SMA και έκφραση βιμεντίνης, που είναι το τυπικό φαινότυπο EMT. Προκειμένου να διερευνηθεί κατά πόσον το φαινόμενο αυτό συνδέεται με την ενεργοποίηση των Wnt μονοπατιού /β-κατενίνης, εντοπίσαμε αρκετές βασικές σηματοδότησης μόρια. Σε σύγκριση με τα γονικά κύτταρα τους, HCT116 και τα κύτταρα ΗΤ29 σφαιροειδή αποδειχθεί κάτω-ρυθμιζόμενη έκφραση της ΟδΚ3β, αλλά επάνω ρυθμισμένη έκφραση των γυμνοσάλιαγκας και σαλιγκάρι. Και επίσης, η αυξητική ρύθμιση του πυρήνα β-κατενίνης σε κύτταρα σφαιροειδές έδειξε ότι η ελεύθερη β-κατενίνης πέρασε από το κυτταρόπλασμα προς κυτταρικό πυρήνα. Τα ευρήματά μας δείχνουν ότι σφαιροειδές κύτταρα έχουν τα χαρακτηριστικά των αρχέγονων κυττάρων του καρκίνου του παχέος εντέρου, και EMT μπορεί να ευθύνεται για βλαστική ικανότητα και κακοήθεια τους. Και επίμονη ενεργοποίηση των Wnt μονοπατιού /β-κατενίνης μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην EMT της CCSCs

Παράθεση:. Χαν Χ-Υ, Wei Β, Fang J-F, Zhang S, Zhang F-C, Zhang Η-Β, et al. (2013) Τα επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση Associates με τη συντήρηση των βλαστική ικανότητα σε σφαιροειδή βλαστικών-όπως ο καρκίνος του παχέος εντέρου κύτταρα. PLoS ONE 8 (9): e73341. doi: 10.1371 /journal.pone.0073341

Επιμέλεια: Giovanni Camussi, Πανεπιστήμιο του Τορίνο, Ιταλία

Ελήφθη: May 26, 2013? Αποδεκτές: 29 του Ιούλη, 2013? Δημοσιεύθηκε: 9 Σεπτεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 Han et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Επιστημών της Κίνας (Νο 81000960), βασικό έργο της Science Foundation της επαρχίας Γκουανγκντόνγκ (Αρ 10251008901000011) και των Θεμελιωδών Κονδυλίων Έρευνας για τις Κεντρικές πανεπιστήμια (Νο 12ykpy42). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του παχέος εντέρου αποτελεί την τρίτη συχνότερη αιτία θανάτων από καρκίνο σε όλο τον κόσμο, και το ποσοστό σχετικής επιβίωσης 5 ετών είναι μόλις 53,8 – 65,2%, παρά διαγνωστικές και θεραπευτικές εξελίξεις [1], [2]. Όγκου υποτροπής και μετάσταση είναι δύο κρίσιμα επιβίωση-παράγοντες που επηρεάζουν καρκίνου του παχέος εντέρου (CRC). Υπάρχει μια αυξανόμενη κατανόηση ότι επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) συμβάλλει στην εισβολή και μετάσταση όγκου [3], [4]. Όπως όλοι γνωρίζουμε, η EMT είναι μια εξαιρετικά συντηρημένη κυτταρική πρόγραμμα που επιτρέπει πολωμένο, καλά διαφοροποιημένα επιθηλιακά κύτταρα να μετατραπούν σε unpolarized, κινητικά μεσεγχυματικά κύτταρα. Η διαδικασία αυτή θεωρείται για την προώθηση ορθοκολικού καρκίνου των κυττάρων να εισβάλλουν στην βασική μεμβράνη και την γύρω μικροπεριβάλλον, όπως οι λεμφαδένες και η αγγειακή αίμα συστημάτων, τελικά συμβάλλουν στην ενδοκοινοτικών ή εξαγγείωση [5].

Πρόσφατα, αυξάνοντας στοιχεία δείχνουν ότι έναρξη και μεταστάσεις όγκου εξαρτώνται από ένα μικρό υπο-πληθυσμό των κυττάρων του όγκου που ονομάζεται καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) που φέρει απεριόριστες δυνατότητες αυτο-ανανέωση και την ικανότητα να διαφοροποιούνται σε διαφορετικούς πληθυσμούς που περιλαμβάνει έναν όγκο [6], [7], [8] , [9]. Σύμφωνα με αυτό το μοντέλο, ο καρκίνος βλαστικά κύτταρα να διατηρήσουν την καρκινογένεση, η αγγειογένεση, μετάσταση, και διαδικασία υποτροπή του ορθοκολικού καρκίνου [10]. Με άλλα λόγια, ο καρκίνος βλαστικά κύτταρα είναι υπεύθυνος για την κακοήθεια του καρκίνου του παχέος εντέρου. Αλλά πώς τα καρκινικά βλαστικά κύτταρα διατηρούν βλαστική ικανότητα τους, όπως η ικανότητα της μετανάστευσης, την εισβολή και τη μετάσταση; Πολλοί ερευνητές παρατήρησαν ότι μερικά καρκινικά κύτταρα (όπως ο καρκίνος του μαστού, καρκίνος του παχέος εντέρου, κ.λπ.) μπορούν να αποκτήσουν τα χαρακτηριστικά όπως ο καρκίνος βλαστικά κύτταρα μέσω επιθηλιακών-μεσεγχυματικά μετάβαση [11], [12], [13], [14]. Δηλαδή, EMT μπορεί να αναθέσει καρκινικών κυττάρων τα βλαστικά-όπως βιονομία, γεγονός που δείχνει ότι EMT μπορεί να συμμετέχει στη διατήρηση των βλαστική ικανότητα των CCSC. Όμως, η λεπτομερής σχέση μεταξύ καρκίνου και βλαστοκυττάρων ΕΜΤ δεν έχει αναφερθεί. Εν τω μεταξύ, διαδεδομένο ενεργοποίηση της Wnt /β-κατενίνης οδό σηματοδότησης σε σποραδικές CRC, είναι σχετική με ΕΜΤ [15]. Η παρούσα μελέτη στοχεύει να καταδείξει εάν οι βιονομία του καρκίνου του παχέος εντέρου βλαστικών κυττάρων και τη συντήρηση της βλαστική ικανότητα σχετίζονται με EMT ή όχι, και απεικονίζουν το ρόλο του /β-κατενίνης σηματοδοτικό μονοπάτι Wnt σε αυτή τη διαδικασία.

Υλικά και μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Όλα τα πειράματα που αφορούν τα ανθρώπινα συμμετέχοντες (συμπεριλαμβανομένης της συλλογής των δειγμάτων ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου) έχουν εγκριθεί από το Medical Research Επιτροπή Δεοντολογίας της Sun Yat-sen University, και διεξάγονται σύμφωνα με οι αρχές που διατυπώνονται στη Διακήρυξη του Ελσίνκι. Όλοι οι συμμετέχοντες που εμπλέκονται στη μελέτη υπέγραψαν τις ενημερωμένες μορφές συναίνεσης. Και όλα τα πειράματα σε ζώα διεξήχθησαν σύμφωνα με τις σχετικές εθνικές και διεθνείς κατευθυντήριες οδηγίες. Και το έργο αυτό εγκρίθηκε από την Επιτροπή Ιατρικών Ερευνών ζώων Δεοντολογίας της Sun Yat-sen University.

καλλιέργειας κυττάρων

HCT116 (ATCC, CCL-247) και ΗΤ29 (ATCC, ΗΤΒ-38) κόλον καρκινικές κυτταρικές σειρές διατηρήθηκαν σε DMEM /F12 συμπληρωμένο με 10% FBS, 200 U /ml πενικιλλίνη και 200 ​​μg /ml στρεπτομυκίνη. Tumorsphere μέσα (που ονομάζεται επίσης ως μέσο ελεύθερο ορού, SFM) αποτελείτο από DMEM media /F12 συμπληρωμένο με 1 × Β27 (Invitrogen), EGF (20 ng /ml, Peprotech), bFGF (10 ng /ml, Peprotech), ρουτίνα ινσουλίνη (5 μg /ml, Invitrogen), 200 U /ml πενικιλλίνη και 200 ​​μg /ml στρεπτομυκίνη. Για 3D πλωτή καλλιέργεια, HCT116 και ΗΤ29 κύτταρα αναπτύσσονται σε δύο διαστάσεων μονοστιβάδα υποβλήθηκαν σε πέψη με θρυψίνη, επαναιωρήθηκαν, και στη συνέχεια εμβολιάζεται σε πυκνότητα 2 × 10

6 κύτταρα σε SFM σε 100 mM εξαιρετικά χαμηλές πιάτα προσάρτησης (Corning) σε 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα CO2 /95% αέρα 5%.

Ανίχνευση της έκφρασης CD133 με κυτταρομετρία ροής

Τα κύτταρα που προέρχονται από καλλιέργειες μονοστιβάδας και σφαίρες εναιώρημα την ημέρα 7 μετά την πρωτογενή καλλιέργεια ήταν ανιχνεύεται για την έκφραση του CD133. Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές σε ψυχρό PBS, και στη συνέχεια τα κυτταρικά εναιωρήματα επωάστηκαν στους 4 ° C με 1:10 FITC-συζευγμένο μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού αντιανθρώπινο αντίσωμα CD133 (Ab, Miltenyi Biotec) για 45 λεπτά στο σκοτάδι. Μετά την επώαση, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές σε ψυχρό PBS με 1% BSA και επαναιωρήθηκαν σε 400 μΙ ψυχρού PBS με 1% BSA για ανάλυση κυτταρομετρίας ροής μέσα σε 1 ώρα (h).

ανοσοφθορισμού χρώση

το αντι-Lgr5 Ab (Abcam), αντι-ΟΚ20 Ab, αντι-Ε-καδερίνης Ab, αντι-β-κατενίνης Ab, αντι-α-SMA Ab και αντι-βιμεντίνης Ab (Santa Cruz Biotechnologies) παρασκευάστηκαν σύμφωνα με το πρωτόκολλα του κατασκευαστή. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδης και διαπερατά με 0,05% Triton Χ-100 σε PBS σε θερμοκρασία δωματίου για 20 λεπτά. Τα δείγματα δεσμεύτηκαν με 1% αλβουμίνη βόειου ορού (Sigma) και επωάστηκαν με κατάλληλο πρωτογενές αντίσωμα στους 37 ° C για 1 ώρα. Μετά το πλύσιμο εκτεταμένα, επωάστηκαν με Alexa Fluor-488 κατσίκας αντι-ποντικού IgG (Invitrogen) ή Fluor-Cy3 κατσίκας αντι-κουνελιού IgG (Jackson Immunoresearch) στους 37 ° C για 1 ώρα. Αντιχρωματισμός πυρήνων με ϋΑΡΙ (Invitrogen) διεξήχθη επίσης. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν και τοποθετήθηκαν για την παρατήρηση κάτω από ένα μικροσκόπιο σάρωσης ομοεστιακό (LSM-710, Zeiss). Εδώ, σε όλη αυτή χειρόγραφο, τα δεδομένα από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα έχουν αναλυθεί για να επαληθεύσει την αναπαραγωγιμότητα των αποτελεσμάτων.

Η ομοιογένεια και η προσκόλληση ετερογένεια δοκιμασία

Η ικανότητα προσκόλλησης των κυττάρων να ECM ελέγχθηκε με τη χρήση ινονηκτίνης (FN) -επικαλυμμένα πλάκες 96-φρεατίων (Corning). Single-κυτταρικά εναιωρήματα του σφαιροειδούς και προσκολλημένα κύτταρα τοποθετήθηκαν (10

5 /φρεάτιο), και επωάστηκαν στους 37 ° C για 2 ώρες, μετά πλύθηκαν με PBS για την απομάκρυνση των μη-συγκολλητικό κύτταρα. Delt OD του μήκους κύματος 570 nm ήταν αποφασισμένος να αντικατοπτρίζει τις FN-προσκολλημένα κύτταρα με τη χρήση κυττάρων Μετρώντας Kit-8 (Dojindo, Ιαπωνία). Η ικανότητα προσκόλλησης των κυττάρων σε ομογενή κύτταρα δοκιμάστηκε χρησιμοποιώντας πλάκες 96 φρεατίων μονοστιβάδα κυττάρων-στρωμένος. Σφαιροειδές και προσκολλημένα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες σε 10

5 ανά φρεάτιο, και επωάστηκαν στους 37 ° C για 60 λεπτά, 90 λεπτά, και 120 λεπτά. Στη συνέχεια, οι μη συγκολλητικές κύτταρα μετρήθηκαν και ομοτυπική συγκολλητική δραστικότητα υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον τύπο:. Ομοτυπική προσκόλληση (%) = (συνολικός αριθμός των κυττάρων – μη συγκολλητικό κύτταρα) /ολικά κύτταρα χ 100%

Μετανάστευση και εισβολή δοκιμασίες

μετανάστευση και δοκιμασίες εισβολής διεξήχθησαν σε 24-καλά επικοινωνούντα δοχεία με 8 μπι-πόρων ένθετα φίλτρο πολυανθρακικό (Corning). Ένα σύνολο 5 × 10

4 ή 10

5 διίσταται σφαιροειδές ή προσκολλητικά κύτταρα σπάρθηκαν σε μη επικαλυμμένα ή επικαλυμμένα με Matrigel ένθετα σε 100 μΙ ένθετα μέσου χωρίς ορό για τη μετανάστευση ή την εισβολή δοκιμασίες αντίστοιχα. Τα χαμηλότερα θάλαμοι πληρώθηκαν με 0.5 ml 10% FBS θρεπτικό μέσο συμπληρωμένο /F12 DMEM. Μετά από 24 ώρες ή /και 48 ώρες, τα κύτταρα στην άνω πλευρά του φίλτρου απομακρύνθηκαν και τα κύτταρα στην κάτω επιφάνεια του ενθέματος σταθεροποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες. Ο αριθμός βαμμένων κυττάρων μετρήθηκε υπό μικροσκόπιο φωτός. Οι δοκιμασίες διεξήχθησαν εις τριπλούν.

Western ανάλυση κηλίδος

ΟδΚ3β, β-κατενίνης, Slug, Snail και έκφραση αναλύθηκαν συνολικά εκχυλίσματα κυττάρων ή σε εκχυλίσματα πυρήνα διαχωρίστηκαν με 10% SDS-πολυακρυλαμιδίου ηλεκτροφόρηση και μεταφέρθηκε σε πολυβινυλιδενοφθορίδιο μεμβράνης (Millipore). Οι μεμβράνες πλύθηκαν σε Tris-ρυθμισμένο αλατούχο διάλυμα με Tween (TBST, που αποτελείται από 10 mM Tris-HCl, ρΗ 8, 150 mM NaCl, και 0,05% Tween 20), δεσμεύτηκαν 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου με 5% άπαχο γάλα σε TBST, τότε ανιχνεύθηκαν 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου με αντι-Ε-καδερίνης Ab, αντι-α-SMA Ab, αντι-βιμεντίνης Ab, αντι-ΟδΚ3β Ab, αντι-β-κατενίνης Ab, αντι-σαλιγκάρι Ab (Santa Cruz Biotechnologies), αντι -Slug Ab (BD Pharmingen), αντι-α-Tublin Ab και αντι-GAPDH Ab (Peprotech). Μετά την επώαση με δευτερογενές αντίσωμα χρένο υπεροξείδιο-συζευγμένο, ανοσοαντιδραστικές πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν με σύστημα ανίχνευσης ECL (Millipore). Ποσοτικές αναλύσεις των σημάτων ανοσοαποτύπωση ελήφθησαν μέσω ανάλυσης πυκνότητας χρησιμοποιώντας LAS4000 Λογισμικό εικόνας (Fuji Film). Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ προσδιορισμού πρωτεΐνης BCA (ThermoScientific Biosciences).

In vivo ογκογένεση

Για να καθοριστεί εάν τα κύτταρα σφαιροειδές είναι πιο ογκογόνο από προσκολλημένη ομολόγους τους in vivo, θα πραγματοποιηθεί την ανάπτυξη του όγκου και πειράματα μετάσταση στο ήπαρ. Μεμονωμένα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε PBS. Μια 100-μΙ αιώρημα που περιέχει 2 χ 10

6 προσκολλημένα κύτταρα ή κύτταρα σφαιροειδές ενέθηκαν υποδόρια (s.c.) στις λαγόνες 4- έως 6-εβδομάδων αρσενικούς BALB /C ηυ-ποντικού, που λήφθηκε από το Εργαστήριο Jackson. Υποδόρια διάμετροι των όγκων μετρήθηκαν με ένα ψηφιακό παχύμετρο κάθε δύο ή τρεις ημέρες, και ο όγκος του όγκου σε mm

3 υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον τύπο: Όγκος = πλάτος

2 × μήκος × 0,52. Στη συνέχεια, 3 ή 4 εβδομάδες αργότερα, οι ποντικοί θανατώθηκαν και τα τμήματα κατεψυγμένου ιστού (6 μm) υποδόριων όγκων έγιναν για παθολογικές ανίχνευση.

In vivo μετάσταση στο ήπαρ

ήπατος μεταστατικού μοντέλο χρησιμοποιήθηκε για να τον προσδιορισμό του μεταστατικού δυναμικού του σφαιροειδούς κυττάρων. ηπατικές μεταστάσεις ιδρύθηκαν από ενδοσπληνική ένεση 4 × 10

6 HCT116 σφαιροειδές ή προσκολλημένα κύτταρα και σπληνεκτομή έγινε 10 λεπτά μετά ενδοσπληνική ένεση για να αποφευχθεί η μετάσταση σπλήνα. Η συνολική κατάσταση της υγείας καταγράφηκε λεπτομερώς μία φορά την ημέρα. Εστιών στο ήπαρ μετάσταση εξετάστηκαν και μετρήθηκαν. Και τμήμα ιστού έγινε για χρώση αιματοξυλίνης-ηωσίνης για να επιβεβαιωθεί η παθολογική πηγή.

Στατιστική ανάλυση

Η στατιστική σημασία προσδιορίστηκε με μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από Bonferroni post-hoc τεστ για πολλαπλές συγκρίσεις ή t-test του Student. Για όλες τις δοκιμές, η P & lt? 0,05 ή & lt? 0,01 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική ή πολύ σημαντική

Αποτελέσματα

Μορφολογικά και βιολογικός χαρακτηρισμός των colonospheres

Όταν καλλιεργούνται σε μέσο χωρίς ορό. συμπληρωμένο με 1 × Β27, 20 ng /ml EGF και 10 ng /ml bFGF, και οι δύο HCT116 και ΗΤ29 καρκινικών κυττάρων κόλου αναπτύσσονται σε μεγάλα στρογγυλά, ασύνδετος αποικίες επιπλέοντα σφαιροειδές (ονομάζεται colonospheres) (Σχήμα 1). Μορφολογικά, η κανονική πολικότητα των προσκολλημένων κυττάρων εξαφανίστηκε στην colonspheres. Στη συνέχεια, προσδιορίζεται η συχνότητα των κυττάρων σχηματισμού σφαίρας εκτελώντας μια ακραία περιορισμό ανάλυση αραίωσης (ΕΛΔΑ) για τη γονική και σφαιροειδή που προέρχονται από κύτταρα HCT-116. Η συχνότητα για το σχηματισμό colonsphere βρέθηκε να είναι 5,5 φορές υψηλότερη σε σφαιροειδές κύτταρο από γονική κυτταρική γραμμή, υποδεικνύοντας ότι η κυτταρική σφαιροειδές είχε υψηλότερα αυτο-ανανέωση ικανότητας.

Τόσο HCT116 και ΗΤ29 μπορούν να σχηματίσουν μεγάλα στρογγυλά, ασύνδετος επιπλέοντα colonsphere 50-100 μm όταν καλλιεργηθούν σε SFM. ανάλυση FCM έδειξε ότι η αύξηση της έκφρασης CD133 από ≤1.2% έως και 60% -80%, όταν καλλιεργούνται σε SFM. Και έντονα έκφραση Lgr5 ανιχνεύθηκε με χρώση ανοσοφθορισμού. Αλλά ως δείκτη των διαφοροποιημένων επιθηλιακών κυττάρων, η έκφραση ΟΚ20 παρουσίασε αρνητική μεταβολή.

Η

Τα κύτταρα σφαιροειδές έδειξαν αυξημένη έκφραση του παχέος εντέρου CSC δείκτες-CD133 και Lgr5, αλλά εξασθενημένη έκφραση των διαφοροποιημένων ΟΚ20 επιθηλιακών κυττάρων δείκτη σε σύγκριση με αντίστοιχα γονικά κύτταρα τους. Η αναλογία των θετικών κυττάρων CD133 προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής σε γονικά και σφαιροειδή κύτταρα, βρέθηκαν να είναι περισσότερο από 80% σε colonospheres, σε αντίθεση με ≤1% παρατηρήθηκε σε γονικές κυτταρικές σειρές (Σχήμα 1). Όταν οι colonospheres υποβλήθηκαν σε χρώση ανοσοφθορισμού για Lgr5, παρατηρήσαμε φωτεινό χρώση Lgr5 στην επιφάνεια κάθε σφαιροειδούς κύτταρο υποδεικνύοντας την παρουσία ΚΕΠ σε colonosphere (Σχήμα 1). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα ΚΕΠ ήταν αποτελεσματικά εμπλουτισμένο σε colonospheres. Για την ανίχνευση πολλαπλής διαφοροποίησης, τα κύτταρα σφαιροειδή μεταφέρθηκαν μέσο που περιέχει ορό. Στη συνέχεια, ο φαινότυπος ανιχνεύθηκαν μετά από καλλιέργεια 4 εβδομάδων. Και παρατηρήσαμε ότι τα κύτταρα σφαιροειδή επανατοποθετηθεί στο πλαστικό και μετατράπηκε σε προσκολλημένα κύτταρα μορφολογικά, μαζί με τα κάτω ρυθμισμένη έκφραση CD133 /Lgr5 και μέχρι ρυθμίζονται ΟΚ20 (δεν φαίνεται). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι σφαιροειδές κύτταρα έχουν την ικανότητα της πολυ-διαφοροποίηση [10].

κύτταρα σφαιροειδές εμφανίσει χαμηλότερη πρόσφυση, αλλά υψηλότερη in vitro μεταναστευτικών /επεμβατική

χωρητικότητα

Για να επιβεβαιωθούν τα κακοήθη προφίλ του παχέος εντέρου που λαμβάνεται καρκινικά κύτταρα σφαιροειδές, πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς in vitro για την αξιολόγηση της προσκόλλησης και των μεταναστευτικών /επεμβατική ικανότητα των κυττάρων σφαιροειδές σε σύγκριση με τα προσκολλημένα ομολόγους τους. Τα αποτελέσματα της δοκιμασίας προσκόλλησης κυττάρου έδειξαν ότι σφαιροειδές κύτταρα έχουν χαμηλότερες ικανότητες τόσο προσκόλληση στην FN (ένα από τα βασικά συστατικά ECM) και προσκόλληση σε ομοιογενή γείτονές τους, σε σύγκριση με γονικά κύτταρα τους (Σχήμα 2Α και 2Β).

σφαιροειδές κύτταρα έχουν χαμηλότερες ικανότητες και των δύο συμφύσεις στην FN (Α) και ομοιογενή τους γείτονές τους (Β), σε σχέση με τη γονική τους ομολόγους τους. κύτταρα HCT116 /ΗΤ29 σφαιροειδές έδειξε 3.8-φορές (ρ & lt? 0,01) και 4-φορές (ρ & lt? 0.001) αύξηση στην χημειοτακτικές δυναμικού στις 24 ώρες (C). Περισσότερα κύτταρα σφαιροειδές ήταν σε θέση να εισβάλουν Matrigel σε σύγκριση με τη γονική αντίστοιχά τους (ρ & lt? 0.001 και ρ & lt? 0,05, αντίστοιχα, D).

Η

Βρήκαμε ότι σφαιροειδές κύτταρα εμφανίζουν μια σημαντική αύξηση στην κυτταρική κινητικότητα χρησιμοποιώντας φρεατίων θαλάμους μετανάστευσης. κύτταρα HCT116 /ΗΤ29 σφαιροειδές έδειξε 3.8-φορές (ρ & lt? 0,01) και 4-φορές (ρ & lt? 0.001) αύξηση στην χημειοτακτικές δυναμικού στις 24 ώρες αντίστοιχα, σε σύγκριση με τα προσκολλημένα αντίστοιχά τους (Σχήμα 2C). Και, επίσης, σημαντικά περισσότερα κύτταρα σφαιροειδές HCT116 /ΗΤ29 ήταν σε θέση να εισβάλουν Matrigel επικαλυμμένα με ένθετα σε θαλάμους μετανάστευσης Transwell από τη γονική τους ομολόγους τους (p & lt? 0.001 και p & lt? 0,05, αντίστοιχα) (Σχήμα 2D). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου σφαιροειδή, σε σύγκριση με τους ομολόγους τους προσκολλημένα είναι προικισμένα με χαμηλότερα πρόσφυση, και υψηλότερες μεταναστευτικές /επεμβατική ικανότητα, ένα λειτουργικό φαινότυπο που σχετίζεται με την επιθετικότητα του όγκου.

κύτταρα σφαιροειδές διαθέτουν υψηλότερη ογκογόνο και μεταστατικό δυναμικό σε vivo

Για να καθοριστεί εάν τα κύτταρα σφαιροειδές είναι πιο ογκογόνο και μεταστατικό από προσκολλημένη ομολόγους τους in vivo, θα πραγματοποιηθεί πειράματα ανάπτυξης όγκου και μετάσταση στο ήπαρ. Όταν 2 × 10

6 κύτταρα εμβολιάστηκαν υποδορίως σε γυμνά ποντίκια, όλα τα ποντίκια ανέπτυξαν όγκους. Μεταμοσχευθούν όγκοι επιβεβαιώθηκαν οι καρκίνοι του παχέος εντέρου με χρώση με αιματοξυλίνη-ηωσίνη. Και οι όγκοι των υποδόριων όγκων σε σφαιροειδές ομάδες κυττάρων ήταν σημαντικά υψηλότερη από εκείνη των προσκολλημένων κυττάρων ομάδων (Σχήμα 3Α, 3Β και 3C).

Οι όγκοι του υποδόριου όγκου σε HCT116 κύτταρα ομάδα σφαιροειδές ήταν σημαντικά υψηλότερες από ότι σε ομάδα κύτταρα HCT116 (Α, Β). κύτταρα σφαιροειδές ΗΤ29 έδειξε τα παρόμοια αποτελέσματα (C). Τα κύτταρα HCT116 σφαιροειδές αναπτυχθεί περισσότερο το συκώτι μεταστατικές εστίες από HCT116 (D, F). Οι μεταστατικοί όγκοι επιβεβαιώθηκαν ως καρκίνων του παχέος εντέρου με χρώση αιματοξυλίνης-ηωσίνης (Ε).

Η

Όπως αφορά την μετάσταση ήπατος, τέσσερα ποντίκια (4/5) που αναπτύχθηκε μετάσταση στο ήπαρ σε ομάδα κύτταρα HCT116 σφαιροειδές, αλλά μόνο ένας ποντικός (1/5) έκανε στο προσκολλημένα ομάδα (Σχήμα 3D). Οι μεταστατικοί όγκοι επιβεβαιώθηκαν επίσης ως καρκίνων του παχέος εντέρου με χρώση αιματοξυλίνης-ηωσίνης (Σχήμα 3Ε). Το αποτέλεσμα της ηπατικής μεταστατικών εστιών καταμέτρησης δείχνει τα παρόμοια αποτελέσματα (Εικόνα 3F). Οι συνολικές συνθήκες από τα ποντίκια στο σφαιροειδές ομάδα κύτταρα είναι χειρότερα από εκείνα προσκολλημένη ομάδα κυττάρων, και μερικοί από αυτούς ανέπτυξαν ασκίτη και σοβαρή απίσχνανση. Τα αποτελέσματα των in vivo πειράματα φαίνεται ότι τα σφαιροειδή που προέρχονται από κύτταρα που έχουν υψηλότερα ογκογόνο και μεταστατικό ικανότητες από τη γονική τους ομολόγους τους.

EMT-φαινοτύπου των κυττάρων σφαιροειδές που σχετίζονται με Wnt /β-κατενίνης σηματοδοτικό μονοπάτι

Για να αποδείξει αν υπήρχαν συνδέσεις μεταξύ των κακοήθων προφίλ των σφαιροειδές κυττάρων και EMT, ανιχνεύσαμε EMT-φαινότυπο τους. Τα αποτελέσματα των IF και Western Blotting έδειξαν ότι κάτω ρύθμιση της έκφρασης Ε-καδερίνης και ανοδική ρύθμιση του α-SMA και έκφραση βιμεντίνης σε HCT116 και ΗΤ29 colonospheres, σε σύγκριση με γονικά κύτταρα τους (Σχήμα 4 και 5). Δηλαδή, τα σφαιροειδή κύτταρα έχουν το χαρακτηριστικό των μεσεγχυματικών κυττάρων. Η ενεργοποίηση του μονοπατιού Wnt /β-κατενίνης έχει αναφερθεί ότι επάγει ΕΜΤ [16], [17]. Στη συνέχεια, οι βασικές μόρια στο μονοπάτι Wnt /β-κατενίνης ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας κηλίδωση Western. Σε σύγκριση με τα γονικά κύτταρα τους, HCT116 και τα κύτταρα ΗΤ29 σφαιροειδή αποδειχθεί κάτω ρύθμιση της έκφρασης ΟδΚ3β αλλά πάνω ρύθμιση της έκφρασης γυμνοσάλιαγκας και σαλιγκάρι. Και επίσης, η προς τα πάνω ρύθμιση του πυρήνα έκφρασης β-κατενίνης σε κύτταρα σφαιροειδές έδειξε ότι η ελεύθερη μεταφορά β-κατενίνης από κυτόπλασμα σε κυτταρικό πυρήνα (Σχήμα 5).

Αντιπροσωπευτικές μικροφωτογραφίες που απεικονίζει την υψηλότερη έκφραση της Ε-καδερίνης και ο εντοπισμός μεμβράνη του β-κατενίνης σε HCT116 και ΗΤ-29 προσκολλημένα κύτταρα από τα αντίστοιχα σφαιροειδές κύτταρα με χρώση ανοσοφθορισμού. Και υψηλότερη έκφραση της βιμεντίνης σε σφαιροειδή κύτταρα ανιχνεύθηκε σε σύγκριση με προσκολλημένα κύτταρα.

Η

Η σηματοδότηση /β-κατενίνης Wnt είναι μόνιμα ενεργοποιημένη στα κύτταρα σφαιροειδές, συμπεριλαμβανομένων των up-ρυθμιζόμενη έκφραση της βιμεντίνης, Slug, Snail, και της πυρηνικής β-κατενίνης, αλλά κάτω-ρυθμιζόμενη έκφραση της Ε-καδερίνης και ΟδΚ3β, συγκρίνοντας με τα αντίστοιχα γονικά κύτταρα.

Η

Συζήτηση

Η έννοια της ετερογένειας του όγκου, η οποία εικάζεται εκεί είχαν διαφορετικούς φαινοτύπους στον ιστό του όγκου, προτάθηκε για πρώτη φορά από Fidler IJ στα 70 s του τελευταίου αιώνα [18]. Η θεωρία του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων διαμορφώθηκε με βάση αυτή την ιδέα. έχουν καρκίνο βλαστικά κύτταρα έχουν οριστεί ως «κύτταρα εντός ενός όγκου που κατέχουν την ικανότητα αυτο-ανανέωσης και ότι μπορεί να προκαλέσει τα ετερογενή καταγωγές των καρκινικών κυττάρων που αποτελούν τον όγκο» σε ένα πρόσφατο American Association of Cancer Research (AACR) εργαστήριο [19] . Μέχρι σήμερα, η ύπαρξη των βλαστικών κυττάρων του καρκίνου επιβεβαιώθηκε σε αρκετά συμπαγείς όγκους. Και η πρόσφατη ταυτοποίηση των καρκινικών κυττάρων-έναρξη καρκίνου του παχέος εντέρου προσθέτει περαιτέρω στήριξη στον καρκίνο βλαστικών κυττάρων υπόθεση [7]. Σύμφωνα με αυτή τη θεωρία, ο μικρός υποπληθυσμός των καρκινικών βλαστοκυττάρων καταβάλλει το σύνολο χαρακτηριστικό της κακοήθειας, συμπεριλαμβανομένων εισβολή και μετάσταση.

Υπήρξαν αρκετές μέθοδοι για να ληφθεί καρκινικά βλαστικά κύτταρα. Η μέθοδος χρησιμοποιείται ευρέως για την απομόνωση ή τον εμπλουτισμό του παχέος εντέρου βλαστικών κυττάρων είναι κύτταρο διαλογή βασίζεται σε δείκτες κυτταρικής επιφάνειας, όπως CD133, CD44, Musasai-1, κλπ. [20] Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλευρά πληθυσμός dye-effluxing εκφράζουν ABCG2, ένα ΑΤΡ-σύνδεσης κασέτα ημι-μεταφορέα, απομονώθηκαν ως καρκινικά βλαστικά κύτταρα [21], [22], [23]. Στην παρούσα μελέτη, σφαιρίδια που αποκτήθηκαν όγκου από κυτταρικές γραμμές καρκίνου HCT116 και ΗΤ29 κόλου με καλλιέργεια σε μέσο άνευ ορού [24], [25]. Και η ακόλουθη ανάλυση έδειξε ότι CD133 και Lgr5 έκφραση αυτών των κυττάρων σφαιροειδούς ήταν υψηλότερη από τη γονική αντίστοιχά τους, ενώ η έκφραση ΟΚ20 ήταν μικρότερη η οποία αντιπροσωπεύει το διαφοροποιημένο ενδοθηλιακών κυττάρων. Και όταν καλλιεργήθηκαν σε μέσο που περιέχει ορό, τα κύτταρα σφαιροειδή πάλι συνδέεται με το πλαστικό και εμφανίζεται κάτω ρυθμισμένα CD133 /Lgr5 και μέχρι ρυθμιζόμενη έκφραση ΟΚ20 (δεν φαίνεται). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι σφαιροειδές κύτταρα έχουν την ικανότητα της πολυ-διαφοροποίησης. Επιπλέον, τα κύτταρα μπορούν να σχηματίσουν σφαιροειδή τις ίδιες σφαίρες, δείχνοντας ότι έχουν την αυτο-ανανέωση ικανότητας. Από αυτά τα αποτελέσματα, μπορούμε να βγάλουμε το συμπέρασμα ότι καρκινικά βλαστικά κύτταρα μπορεί να εμπλουτιστεί σε αυτά τα σφαιροειδή κύτταρα.

Πραγματοποιήσαμε μια σειρά λειτουργικών πειραμάτων, προκειμένου να λάβει περαιτέρω πληροφορίες για τη βιολογική συμπεριφορά αυτών των κυττάρων σφαιροειδές . Πρώτον, τα αποτελέσματα της δοκιμασίας προσκόλλησης έδειξε ότι σφαιροειδές κύτταρα επιδεικνύουν χαμηλότερες ικανότητες των δύο συμφύσεων στην FN (ένα από τα βασικά συστατικά ECM) και προσκόλληση σε ομοιογενή γείτονές τους. Αυτό ήταν να πω, αυτό το είδος των κυττάρων είναι πιο εύκολο να αποσπαστεί από το ECM και να απελευθερώσει από το μεγαλύτερο μέρος του όγκου. Και επίσης, σφαιροειδή κύτταρα εμφανίζουν υψηλότερη χωρητικότητα του in vitro τη μετανάστευση και την εισβολή, σε σύγκριση με προσκολλημένα αντίστοιχά τους. Όπως όλοι γνωρίζουμε, η ικανότητα της μετανάστευσης και διαλυτοποίηση της βασικής μεμβράνης είναι υποχρεωτικά για τη μετάσταση των καρκινικών κυττάρων. Έτσι, σφαιροειδές κύτταρα μπορούν να μεταναστεύσουν στην χημειοτακτικός παράγοντας πιο εύκολα. Και μπορεί να έχει περισσότερα διευκόλυνση των ενζύμων έκκριση διαλυτοποίηση της βασικής μεμβράνης, και πιο εύκολο να εισβάλει η μικροαγγείων τότε μεταναστεύσουν σε άλλα όργανα, μαζί με τη ροή του αίματος. Για να καθοριστεί εάν τα κύτταρα σφαιροειδές είναι περισσότερο ογκογονικά και μεταστατικά in vivo, την ανάπτυξη όγκου και μετάσταση στο ήπαρ πειράματα διεξήχθησαν. Και τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι όγκοι του υποδόριου όγκου σε σφαιροειδές ομάδες κυττάρων ήταν σημαντικά υψηλότερη από εκείνη των προσκολλημένων κυττάρων. Και επίσης, καταμέτρηση του ήπατος μεταστατικές εστίες έδειξε τα παρόμοια αποτελέσματα. Τα ευρήματα της in vivo πειράματα κατέδειξαν ότι τα κύτταρα που προέρχονται σφαιροειδή διαθέτουν υψηλότερη ογκογόνο και μεταστατικό ικανότητες από ό, τι η γονική αντίστοιχά τους.

Τα κύτταρα στις επεμβατικές μέτωπα έκθεμα αλλοιώσεις στα επιθηλιακά δομή και λειτουργία, που οδηγεί σε διάλυση του adherens κόμβους, απώλεια της κορυφής-βασικής πολικότητας, απώλεια των επιθηλιακών δεικτών, η αναδιοργάνωση των ακτίνης κυτταροσκελετού, επαγωγή ενός προγράμματος μεσεγχυματικών έκφρασης των γονιδίων και, στη συνέχεια, ενισχυμένη κινητικότητα και εισβολή: μια διαδικασία που αναφέρεται ως επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) [26] , [27], [28]. Σε γενικές γραμμές, Ε-καδερίνη, β-κατενίνης και α-κατενίνης συνδέονται προς σχηματισμό ενός συμπλόκου. Και η σύνδεση του συμπλόκου Ε-καδερίνης-β-κατενίνης α-κατενίνης με την ακτίνη κυτταροσκελετό είναι πολύ σημαντική για τη διατήρηση της κυτταρικής πολικότητας και προσκόλληση κυττάρου. Έτσι, η σωστή εντοπισμός της E-cadherin να adherens διασταυρώσεις είναι πολύ σημαντική για τη δημιουργία και τη σταθεροποίηση αυτών των μεσοκυττάρια συνδέσεις μεταξύ των κυττάρων HCT116 /ΗΤ29. Αυτή είναι μια σημαντική λειτουργία, ιδίως στο πλαίσιο της ογκογένεσης και της μετάστασης, γιατί μια απώλεια της Ε-καδερίνης στην επιφάνεια του κυττάρου έχει δειχθεί ότι παίζει ένα ρόλο στην πρόοδο του όγκου και τη μετάσταση [16], [29]. Στη μελέτη μας, τα κύτταρα σφαιροειδή απέδειξαν τα κάτω ρύθμιση της Ε-καδερίνης, και αυξητική ρύθμιση των α-SMA και βιμεντίνης, και τα δύο τελευταία μόρια είναι δείκτες των μεσεγχυματικών κυττάρων. Έτσι, τα κύτταρα σφαιροειδές εμφανίζουν τον φαινότυπο της EMT, σύμφωνα με τα αποτελέσματά μας. Και οι βιολογικές συμπεριφορές των σφαιροειδές κύτταρα σύμφωνα με τις μεσεγχυματικά κύτταρα, όπως τα μη πολικά μορφολογικό χαρακτήρα, χαμηλότερη πρόσφυση αλλά υψηλότερα in vitro μεταναστευτικών /επεμβατική ικανότητα.

Πρόσφατες μελέτες έχουν αναφέρει τον κεντρικό ρόλο των σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης μονοπάτι στην αυτο-ανανέωση των επιθηλιακών βλαστικών κυττάρων [30], [31]. Σε αντίθεση, απορύθμιση της οδού σηματοδότησης /β-κατενίνης Wnt έχει ενοχοποιηθεί στην καρκινογένεση κόλον [32], [33]. Έχει αναφερθεί ότι η εξαιρετικά διατηρημένη σηματοδοτικό μονοπάτι Wnt /β-κατενίνης συνδέεται στενά με EMT [34]. μονοπάτι σηματοδότησης Wnt /β-κατενίνης περιέχουν πολλά συστατικά, συμπεριλαμβανομένων Wnt πρωτεΐνες, Frizzled (Fz), Dishevelled (Dsh), APC /ΟδΚ3β /συγκρότημα Axin, β-κατενίνης, παράγοντας TCF /LEF μεταγραφής, και μερικά γονίδια στόχου (c-myc , κυκλίνη D, Survivin, σαλιγκάρι, γυμνοσάλιαγκας, κλπ). Γενικά, σε περίπτωση απουσίας του Wnt, το APC /ΟδΚ3β /Axin σύμπλοκο (σύμπλεγμα καταστροφής) έγκειται στο κυτταρόπλασμα, όπου δεσμεύεται και φωσφορυλιώνει β-κατενίνης. Ο τελευταίος στη συνέχεια εγκαταλείπει το συγκρότημα να ουβικουιτινωμένης από b-TrCP (η οποία συνδέεται με το φωσφορυλιωμένο «degron» μοτίβο σε β-κατενίνης), στη συνέχεια αποικοδομείται από το πρωτεάσωμα. Στην κατάσταση της ενεργοποίησης του μονοπατιού σηματοδότησης Wnt /β-κατενίνης, Wnt επάγει τη σύνδεση αξίνης με φωσφορυλιωμένη LRP. Το σύμπλοκο APC /ΟδΚ3β /Axin καταρρέει, και β-κατενίνη είναι σταθεροποιημένη. Το συσσωρευμένο β-κατενίνης σε κυτόπλασμα μετατοπίζεται στον πυρήνα, και δεσμεύεται με TCF /LEF, ενισχύει την έκφραση των γονιδίων στόχων, όπως Slug και σαλιγκάρι, που επάγουν ΕΜΤ και μετάσταση του καρκίνου του παχέος εντέρου [35]. Η ενεργοποίηση της Wnt σήμα, η αναστολή της APC /ΟδΚ3β /συγκρότημα Axin, πυρηνική μετατόπιση της β-κατενίνης, και up-ρύθμιση του γυμνοσάλιαγκας και σαλιγκάρι είναι τα βασικά σημεία της ρύθμισης EMT στον καρκίνο του παχέος εντέρου [36]. Στη μελέτη μας, κάτω ρύθμιση της ΟδΚ3β και up-ρύθμιση του Slug και της έκφρασης Σαλιγκάρι εντοπίστηκαν. Και επίσης, η προς τα πάνω ρύθμιση του πυρήνα έκφρασης της β-κατενίνης στα κύτταρα σφαιροειδές δείχνει ότι η δωρεάν μεταφορά β-κατενίνης από κυτταρόπλασμα σε κυτταρικό πυρήνα.

Εν κατακλείδι, η μελέτη μας παρέχει στοιχεία για την ύπαρξη του καρκίνου βλαστικών κυττάρων . Τα κύτταρα σφαιροειδές που προέρχονται από κυτταρικές σειρές HCT116 και ΗΤ29 εμπλουτισμό βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν. Σε σύγκριση με προσκολλημένη τους ομολόγους τους, τα πλωτά-σφαίρα που προέρχονται από κύτταρα που εμφανίζεται κάτω ομοτυπική /heterotypic πρόσφυση, αλλά υψηλότερη in vitro μεταναστευτικών /επεμβατική ικανότητα, καθώς και υψηλότερες ογκογόνο και μεταστατικό δυναμικό in vivo. Και καταδεικνύουν τυπικό φαινότυπο του ΕΜΤ (down-ρυθμιζόμενες Ε-καδερίνης και μέχρι ρυθμίζεται βιμεντίνης), που μπορεί να ευθύνεται για κακοήθεια τους. Και ενεργοποίηση της Wnt /β-κατενίνης οδού (κάτω ρύθμιση της ΟδΚ3β και up-ρύθμιση του Slug, σαλιγκάρι και του πυρήνα της β-κατενίνης) μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην EMT της CCSCs.

Ευχαριστίες

θα θέλαμε να ευχαριστήσουμε Qi Zhang, Cui-Ling Qi, Li-Jie Pan, και Yu Yang για βοήθεια στη διαδικασία του πειράματος.