Αφηρημένο

Ptp4a3

(κοινώς γνωστό ως PRL-3) είναι ένα αινιγματικό μέλος του

Ptp4a

οικογένεια του πρενυλιωμένων φωσφατασών τυροσίνης πρωτεΐνης που είναι εντόνως εκφρασμένα σε πολλούς ανθρώπινους καρκίνους. Παρά την ισχυρή συσχετίσεις με μετάσταση όγκου και κακή πρόγνωση των ασθενών, υπάρχει πολύ περιορισμένη κατανόηση του ρόλου αυτής της οικογένειας γονιδίου σε κακοήθεια. Ως εκ τούτου, δημιουργήσαμε ένα γονίδιο-στοχευμένη μοντέλο ποντικού νοκ-άουτ για

Ptp4a3

, το πιο ευρέως μελετηθεί

Ptp4a

μέλος της οικογένειας. Τα ποντίκια με έλλειψη για

Ptp4a3

ήταν καταφανώς κανονικό. Λιγότεροι ομόζυγα-null αρσενικά παρατηρήθηκαν κατά τον απογαλακτισμό, ωστόσο, και διατήρησαν μια μειωμένη μάζα του σώματος. Αν και

Ptp4a3

κανονικά συνδέεται με τον καρκίνο τελικού σταδίου και μετάσταση, παρατηρήσαμε αυξημένη

Ptp4a3

έκφραση στο κόλον των ποντικών άγριου τύπου αμέσως μετά τη θεραπεία με το αζοξυμεθάνιο καρκινογόνο. Για να διερευνήσουν το ρόλο του

Ptp4a3

σε κακοήθεια, χρησιμοποιήσαμε το πιο ευρέως μελετηθεί κολίτιδα σχετιζόμενη με το μοντέλο καρκίνου του παχέος εντέρου ποντικών. Τα ποντίκια άγριου τύπου υπέστη επεξεργασία με θειικό αζοξυμεθάνιο και δεξτράνη νατρίου αναπτύσσονται περίπου 7-10 όγκων ανά ποντίκι στο άπω κόλον. Η προκύπτουσα καρκινικός ιστός έχει 4 φορές πιο

Ptp4a3

mRNA σε σχέση με το φυσιολογικό επιθήλιο του παχέος εντέρου και αυξημένη PTP4A3 πρωτεΐνη.

Ptp4a3-

null ποντίκια ανέπτυξαν 50% λιγότερους όγκους του παχέος εντέρου από ποντίκια άγριου τύπου μετά από έκθεση σε αζοξυμεθάνιο και δεξτράνη θειικού νατρίου. Όγκοι από το

Ptp4a3

-null ποντίκια είχαν αυξημένα επίπεδα τόσο IGF1Rβ και c-myc σε σύγκριση με τους όγκους κορεσμένη με

Ptp4a3,

προτείνοντας μια βελτιωμένη κυτταρική σηματοδότηση εμπλοκή μονοπατιού απουσία της φωσφατάσης. Αυτά τα αποτελέσματα παρέχουν την πρώτη οριστική αποδεικτικά στοιχεία που εμπλέκουν

Ptp4a3

στην ογκογένεση του παχέος εντέρου και τονίζουν την δυνητική αξία της φωσφατάσης ως θεραπευτικό στόχο για το πρώιμο στάδιο κακοήθη νόσο

Παράθεση:. Zimmerman MW, Homanics GE, Λάζο JS (2013) Στοχευμένη διαγραφή του Μετάσταση-Associated φωσφατάση

Ptp4a3

(PRL-3) Καταστέλλει ποντικού καρκίνου του παχέος εντέρου. PLoS ONE 8 (3): e58300. doi: 10.1371 /journal.pone.0058300

Επιμέλεια: Manlio Vinciguerra, University College London, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 22 Νοεμβρίου, 2012? Αποδεκτές: πρώτης Φεβρουαρίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 28, Μαρτίου, 2013

Copyright: © 2013 Zimmerman et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό ήταν χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας επιχορήγησης AA10422 και την υποτροφία F31AA019597A. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η πρωτεΐνη φωσφατάσης τυροσίνης-4A3 (

Ptp4a3

), μαζί με το

Ptp4a1

και

Ptp4a2

, περιλαμβάνουν την 4α-οικογένεια των πρωτεϊνικών φωσφατασών τυροσίνης. Αυτή η μικρή οικογένεια γονιδίων αναφέρεται συνήθως ως φωσφατασών της αναγέννησης ήπατος (PRL), λόγω της ανακάλυψης των

Ptp4a1

στα αναγέννηση ηπατικά κύτταρα ποντικών μετά από μερική ηπατεκτομή [1]. Η σημαντική ομολογία (& gt? 75% ταυτότητα αμινοξέων) βρέθηκε μεταξύ των

Ptp4a

τα μέλη της οικογένειας μπορεί να υποδηλώνει παρόμοια ενζυμολογία αλλά και οι τρεις μέλη της οικογένειας διατηρημένων όλη είδη θηλαστικών, υποδηλώνοντας μη περιττών βιολογικούς ρόλους για το καθένα. Η

in vivo

ιδιότητες και τις λειτουργίες αυτών των αινιγματική φωσφατασών παραμένουν εξαιρετικά δύσκολα κατανοητές.

Το ενδιαφέρον για

Ptp4a3

μπορεί να αποδοθεί στο σημαντικό δυναμικό του ως βιοδεικτών και ως θεραπευτικό στόχο για κακοήθεις καρκίνους. Πολλοί ανθρώπινοι καρκίνοι εκφράζουν υψηλά επίπεδα PTP4A3 συμπεριλαμβανομένων όγκων του παχέος εντέρου [2], του μαστού [3], ωοθήκη [4], το ήπαρ [5], το στομάχι [6], και στρώμα [7], και αυξημένη έκφραση PTP4A3 συσχετίζεται συχνά με αυξημένη εισβολή όγκου και η φτωχή πρόγνωση [8]. Επιπλέον, έκτοπη υπερέκφραση PTP4A3 ενισχύει τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και εισβολή

in vitro

[9]. Ενώ οριστική απόδειξη ελλείπει,

Ptp4a3

έχει προταθεί για να διαμορφώνει πολλαπλές οδούς σηματοδότησης που περιλαμβάνουν SRC [10], Rho ΘΤΡάσες [9], και ΡΙ3Κ-Akt [11] σε διάφορες μορφές καρκίνου. Η πολυπλοκότητα των αλλαγών οδού δει όταν

Ptp4a3

υπερεκφράζεται μπορεί επίσης να αντανακλά την ικανότητά της να ενεργεί ως φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης 5-φωσφατάσης [12]. Δεν υπάρχουν αναφορές έχουν δείξει συμπερασματικά ένα ρόλο για

Ptp4a3

στη φυσιολογία των φυσιολογικών κυττάρων ή ιστών.

αζοξυμεθάνιο (ΑΟΜ) είναι ένα προκαρκινογόνου ότι όταν μεταβολίζεται στο παχύ έντερο είναι μεταλλαξιογόνος και κινεί ογκογένεση. ΑΟΜ σε συνδυασμό με τον φλεγμονώδη παράγοντα θειικό νάτριο δεξτράνης (DSS) παράγει ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο μοντέλο ποντικού που αναπαράγει πιστά κακοήθειες του κόλον καθοδηγείται από χρόνιες φλεγμονώδεις καταστάσεις όπως η ελκώδης κολίτιδα [13]. Αρκετές οδοί σηματοδότησης εμπλέκονται στην παθογένεση του ΑΟΜ που προκαλείται καρκίνος του παχέος εντέρου, συμπεριλαμβανομένων KRAS [14], β-κατενίνης [15], c-MYC [16], Ινσουλίνη Αυξητικός Παράγοντας-1 υποδοχέα β (IGF1Rβ) [17], και μετασχηματίζοντας Growth Factor β (ΤΟΡβ) [18]. Είναι ενδιαφέρον,

Ptp4a3

έχει αναγνωριστεί ως μια άμεση ρυθμιστική στόχος της TGFβ σηματοδότησης στον καρκίνο του παχέος εντέρου [19].

Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήσαμε μια προσέγγιση γονιδιακής στόχευσης για να δημιουργήσει τα ποντίκια που στερούνται

Ptp4a3

και να ανακρίνουν τον πιθανό ρόλο του

Ptp4a3

στο παχύ έντερο ογκογένεση. έκθεσης ΑΟΜ έντονα αυξημένη

Ptp4a3

έκφραση στο παχύ έντερο.

Ptp4a3

-null ποντικοί ήταν ανθεκτικοί σε ογκογένεση του παχέος εντέρου που εμπλέκουν το γονίδιο αυτό στην παθογένεση της κακοήθους νόσου. Επιπλέον, οι όγκοι που προέρχονται από

Ptp4a3

-null ποντίκια overexpresssed τον καρκίνο που σχετίζεται IGF1Rβ και c-myc προτείνοντας συμμετοχή αυτών των ογκογόνων οδών σηματοδότησης.

Αποτελέσματα

Δημιουργία Ptp4a3 μεταλλαγμένα ποντίκια

διαταράσσεται η

Ptp4a3

γενωμικού τόπου με τη χρήση του συστήματος Cre-Ιοχ του ανασυνδυασμού ειδικής θέσεως με βάση τη θέση του δυο θέσεις ΙοχΡ εισάγονται (Εικ. 1Α και λεπτομερέστερα στο σχ. S1) . Μεταλλαγμένα ποντίκια διασταυρώθηκαν με το στέλεχος /6J C57BL για τουλάχιστον πέντε γενεές. Το αλληλόμορφο knockout δημιουργήθηκε από τη διέλευση

Ptp4a3-

floxed ποντικών με διαγονιδιακούς ποντικούς που εκφράζουν CRE-ανασυνδυάση καθοδηγείται από μια γενική προαγωγό (EIIA) να ανασυνδυάζεται την περιοχή-στόχο και να δημιουργήσουν παγκόσμια knockout ποντικών [20]. Παρεμβολή της θέση ΙοχΡ 3 ‘κατέστρεψε μια ενδογενή θέση HindIII αυξάνοντας το μέγεθος του γενωμικού DNA θραύσμα που παράγεται με πέψη περιορισμού από 5,6 να 10,2 kb. Μεταγενέστερες διαγραφή της αλληλουχίας στόχου μείωσε το μέγεθος του θραύσματος περιορισμού από 10,2 να 6,4 kb. Τα διακριτά μεγέθη των ζωνών που αντιστοιχούν σε κάθε αλληλόμορφο που παρατηρείται όταν αναλύεται με υβριδισμό κατά Southern με ένα ανιχνευτή ~ 300 bp που αντιστοιχεί στο εξώνιο 6 (Εικ. 1Β).

Α) Η

Ptp4a3

floxed αλληλόμορφο ήταν δημιουργήθηκε με εισαγωγή θέσεων ΙοχΡ (κόκκινο αιχμές βελών) γύρω από το εξόνιο 2. Αυτή η μετάλλαξη είχε σαν αποτέλεσμα την διακοπή ενός HindIII αλληλουχία που αυξάνει το μέγεθος του θραύσματος DNA που παράγεται με πέψη περιορισμού από 5,6 να 10,2 kb. Μετά την έκφραση της Cre ρεκομπινάσης, η αλληλουχία μεταξύ των θέσεων ΙοχΡ απομακρύνεται αφήνοντας μία μοναδική θέση ΙοχΡ και μειώνοντας το μέγεθος του τεμαχίου διασπάσεως σε 6,4 kb. Αυτή η μετάλλαξη έχει ως αποτέλεσμα τη διαγραφή του κωδικονίου έναρξης προκαλώντας μια μετάλλαξη μετατόπισης πλαισίου που παράγει ένα μη λειτουργικό προϊόν πρωτεΐνης. Β) Ανάλυση κηλίδας Southern του γονιδιωματικού ϋΝΑ χρησιμοποιήθηκε για να παρακολουθεί αυτές τις γενετικές αλλαγές και ποντίκια που περιέχουν το γονότυπο άγριου τύπου, floxed, ή αλληλόμορφα νοκ-άουτ. Κάθε λωρίδα είναι από ένα άτομο ποντικό. Γ) Η ποσοτική ανάλυση RT-PCR σε ολικό mRNA από εμβρυϊκό ιστό της καρδιάς δεν αποκάλυψε καμία αλλαγή στο

Ptp4a1

και

Ptp4a2

επίπεδα του mRNA, ενώ

Ptp4a3

μειώθηκε και δεν ανιχνεύεται στο ετερόζυγο και ομόζυγη-null ιστού, αντίστοιχα. (* = Ρ & lt? 0,05? N = 4 /γονότυπος). Δ) Το προϊόν πρωτεΐνης PTP4A3 ήταν ανιχνεύσιμη με κηλίδα western σε ολόκληρη την πρωτεΐνη λύματα από άγριου τύπου και ετερόζυγο ιστό της καρδιάς του εμβρύου, αλλά όχι σε ομόζυγη

Ptp4a3-

null δείγματα.

Η

Μια ανάλυση & gt? 500 νεογνά που παρήχθησαν με ετερόζυγο ζεύγη ζευγάρωμα υποδεικνύεται όλες οι πιθανές γενότυποι παρατηρήθηκαν στο προκύπτον απογόνους. Ενώ παρατηρήθηκαν θηλυκά στις αναμενόμενες αναλογίες του Mendel, σημειώσαμε μία σημαντική μείωση (ρ & lt? 0,05) στον αριθμό των

Ptp4a3

-null άρρενες σε απογαλακτισμό σε σχέση με την προβλεπόμενη συχνότητα (Πίνακας 1). Λαμβάνοντας υπόψη τη διαπίστωση αυτή, είναι πιθανό ότι νοκ-άουτ αρσενικά είτε διέθετε ένα μειονέκτημα επιβίωση ή ότι

Ptp4a3

-null γεννητικά κύτταρα είχαν ένα φαινότυπο προκατάληψη.

Ptp4a3

-null αρσενικά ποντίκια εμφάνισαν μια κατά προσέγγιση 10% μείωση στο βάρος σώματος (ρ & lt? 0.003) και 7% μείωση του δείκτη μάζας σώματος (ρ & lt? 0.004) σε σύγκριση με νεογνά άγριου τύπου σε 6 εβδομάδων ηλικίας (Σχ. S2). Αυτός ο φαινότυπος φάνηκε επίσης να περιορίζεται σε αρσενικά ποντίκια ως θηλυκό

Ptp4a3

-null ποντίκια δεν παρουσίασαν σημαντική μείωση της μάζας του σώματος ή το δείκτη μάζας σώματος.

Η

Επειδή εμβρυϊκού καρδιακού ιστού είχε προηγουμένως προταθεί για να έχουν υψηλά επίπεδα

Ptp4a3

έκφραση [21], από την επόμενη πραγματοποιήθηκε ποσοτική RT-PCR επί του συνολικού RNA δειγμάτων από εμβρυϊκό ιστό καρδιάς (E19.5) για τον προσδιορισμό των επιπέδων σχετικής mRNA του

Ptp4a1

,

Ptp4a2,

και

Ptp4a3.

Ενώ

Ptp4a1

και

Ptp4a2

επίπεδα παρέμειναν παρόμοια μεταξύ των γονότυπων,

Ptp4a3

mRNA μειώθηκε σε ετερόζυγη ιστό και δεν είναι ανιχνεύσιμος σε δείγματα από

Ptp4a3

-null εμβρυϊκού καρδιακού ιστού (Εικ. 1 C). Έτσι, η αποζημίωση για

Ptp4a3

απώλεια από την ρύθμιση προς τα πάνω είτε μέλη της οικογένειας

Ptp4a1

ή

Ptp4a2

σε επίπεδο mRNA αποκλείστηκε. προϊόντα λύσης πρωτεΐνης από εμβρυϊκό καρδιακό ιστό αναλύθηκαν με κηλίδα Western για την παρουσία του πρωτεϊνικού προϊόντος PTP4A3. Ενώ ανιχνεύσιμη σε δείγματα από έμβρυα άγριου τύπου, PTP4A3 ήταν χαμηλότερη σε προϊόντα λύσης από ετερόζυγα έμβρυα και ομόζυγα-null ιστός δεν περιείχαν ανιχνεύσιμη PTP4A3 (Σχ. 1D). Εκτός από τις προαναφερθείσες φαινοτυπικές παρατηρήσεις, τα ποντίκια χωρίς λειτουργική

Ptp4a3

εμφανίστηκε κατάφωρα κανονική σχέση με την ίδια γέννα άγριου τύπου.

Έκφραση και νοκ-άουτ του Ptp4a3 σε ιστούς ποντικιού

Επειδή η έκφραση της ενδογενούς PTP4A3 πρωτεΐνη σε φυσιολογικούς ιστούς δεν έχει χαρακτηριστεί πλήρως, εξετάσαμε δείγματα πρωτεΐνης ιστού από άγριου τύπου και

Ptp4a3

-null ποντίκια. Πρώτον, ανιχνεύθηκαν διάφορους τύπους ιστών για έκφραση πρωτεΐνης PTP4A3 με κηλίδα Western (Εικ. S3). Εμβρυϊκή καρδιά, εμβρυϊκό έντερο, καρδιά ενήλικος, σκελετικό μυ, πάγκρεας, πνεύμονα, σπλήνα, εγκέφαλο, θύμο, κόλον και λεπτό έντερο εξέφρασαν ανιχνεύσιμα επίπεδα του PTP4A3 σε αντίθεση με το ήπαρ και τους νεφρούς, η οποία δεν είχε καμία ανιχνεύσιμη πρωτεΐνη PTP4A3. Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν επίσης την αποτελεσματικότητα της συνολικής προσέγγισης διαγραφή γονιδίου, καθώς κανένας πρωτεΐνη PTP4A3 ήταν ανιχνεύσιμη σε κανένα από τα προϊόντα λύσης από

Ptp4a3

-null ποντίκια. Η ιστολογική ανάλυση πραγματοποιήθηκε επίσης σε άγριου τύπου και

Ptp4a3

-null δείγματα ιστού (Εικ. S4). Κατά την εξέταση πολλαπλούς τύπους ιστών, δεν εμφανείς ανωμαλίες παρατηρήθηκαν και όλα τα δείγματα εμφανίστηκαν ποιοτικά φυσιολογικό.

Ptp4a3 έκφραση αυξάνει αμέσως μετά την έκθεση του ΑΟΜ

Δεδομένου ότι τα χαμηλά επίπεδα της PTP4A3 ήταν ανιχνεύσιμα στο φυσιολογικό επιθήλιο του παχέος εντέρου, προσδιορίσαμε

Ptp4a3

έκφραση γονιδίων αμέσως μετά από τη θεραπεία με το εντερικό ΑΟΜ προκαρκινογόνου (12,5 mg /kg) ή ελέγχου φυσιολογικού ορού σε άγριου τύπου C57BL /6J ποντικούς. Οι ποντικοί θυσιάστηκαν 8 και 24 ώρες μετά την ένεση του ΑΟΜ και επιθηλιακών κυττάρων παχέως εντέρου συνελέγησαν για ανάλυση. Σύνολο mRNA απομονώθηκε και ποσοτική RT-PCR πραγματοποιήθηκε σε δοκιμασία για

Ptp4a3

επίπεδα γονιδιακής έκφρασης. Είναι ενδιαφέρον ότι,

Ptp4a3

ρυθμίζεται αυξητικά κατά 78% στις 8 ώρες και 60% στις 24 ώρες σε ΑΟΜ που έλαβαν φυσιολογικό επιθηλιακό σχέση με τον έλεγχο (σχ. 2C). προϊόντα λύσης πρωτεΐνης από ποντικούς που υπέστησαν αγωγή ΑΟΜ υποδηλώνουν ότι τα επίπεδα της πρωτεΐνης PTP4A3 αυξάνονται επίσης σε αυτούς τους ιστούς (Σχ. 2D). Ενώ ο ρόλος του

Ptp4a3

στον καρκίνο του παχέος εντέρου είναι παραδοσιακά πιστεύεται ότι περιλαμβάνει τους όγκους προχωρημένου σταδίου και μετάσταση, το εύρημα αυτό υποδηλώνει μια πιθανή ρόλο σε πρώιμο στάδιο της νόσου και ογκογένεση.

α) ο ΑΟΜ -DSS παράδειγμα θεραπεία που χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη διαθέτει μια εφάπαξ δόση ΑΟΜ ακολουθούμενο από 3 κύκλους θεραπείας του DSS στο πόσιμο νερό. Β) Ιστολογική αναπαράσταση του φυσιολογικού ιστού του παχέος εντέρου σε σχέση με ιστό όγκου αποδεικνύει την αποτελεσματικότητα του μοντέλου ΑΟΜ-DSS. Μετά από έναν κύκλο θεραπείας DSS, κρύπτη δυσπλασία και διήθησης μονοπύρηνων κυττάρων ήταν εμφανείς. Όγκου ιστού ήταν παρούσα τόσο στο 12 και 16 εβδ τελικά σημεία. Πριν από τη θυσία, οι ποντικοί υποβλήθηκαν σε αγωγή με BrdU για 4 ώρες και ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων οπτικοποιήθηκε με χρώση με ένα αντίσωμα BrdU. Γ) Ποσοτική RT-PCR χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί

Ptp4a3

έκφραση γονιδίου σε φυσιολογικό ιστό κόλου επιθηλιακά μετά από αγωγή είτε με ΑΟΜ ή ελέγχου φυσιολογικού ορού.

Ptp4a3

ήταν αυξημένα 73% στον ιστό του παχέος εντέρου μετά από όταν μετράται 8 ώρες μετά την ένεση και το 60% σε 24 ώρες (* = p & lt? 0,001? N = ομάδα 6 /θεραπεία? Bars = SEM). Δ) στυπώματος Western των προϊόντων λύσης του παχέος εντέρου έδειξε μια αύξηση στην PTP4A3 πρωτεΐνη μετά από έκθεση ΑΟΜ. E) Ποσοτική RT-PCR έδειξε αλλαγές στα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης του

Ptp4a

μέλη της οικογένειας στην κανονική του παχέος εντέρου και καρκινικό ιστό.

Ptp4a3

ήταν αυξημένα 3,7 φορές (** = ρ & lt? 0,01), ενώ η

Ptp4a1

και

Ptp4a2

επίπεδα ήταν σημαντικά μειωμένη (* = p & lt? 0,0001 και p & lt? 0.05, αντίστοιχα) (n = 15, bars = SEM). F) ανάλυση στυπώματος Western καταδεικνύει υψηλότερα επίπεδα πρωτεΐνης PTP4A3 σε όγκους του παχέος εντέρου σε σύγκριση με φυσιολογικό ιστό. G) Κηλίδα Western σε συνδυασμό με ανάλυση qRT-PCR έδειξε επίσης ότι κατά τη σύγκριση

Ptp4a3

επίπεδα mRNA (πάνω από κάθε λωρίδα) να PTP4A3 πρωτεΐνη, υψηλή έκφραση του γονιδίου φάνηκε να αντιστοιχούν στα υψηλότερα επίπεδα πρωτεΐνης.

Knockout του Ptp4a3 καταστέλλει τον σχηματισμό εντερικών όγκων

για να διερευνήσει ένα δυναμικό λειτουργικό ρόλο για

Ptp4a3

στο σχηματισμό όγκων, υποβάλλαμε τα ποντίκια σε ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο μοντέλο ΑΟΜ-DSS κολίτιδας που σχετίζεται καρκίνο του παχέος εντέρου. Άγριου τύπου και

Ptp4a3

– μηδενικοί ποντικοί εγχύθηκαν με μία απλή δόση του ΑΟΜ (12,5 mg /kg) ακολουθούμενη από τρεις κύκλους 2,5% κατανάλωση DSS (σχήμα 2Α).. Αυτό το μοντέλο παράγει διακριτά ιστολογικές αλλαγές σε σχέση με τους φυσιολογικούς ελέγχους, συμπεριλαμβανομένης της φλεγμονής που αντιστοιχεί στο DSS θεραπεία, και την επακόλουθη δυσπλασία (Εικ. 2Β). Οι όγκοι ήταν οπτικά εμφανείς στο άπω κόλον των ποντικών φυσικού τύπου κατά την θυσία στις 12 ή 16 εβδομάδες μετά την αρχική θεραπεία ΑΟΜ και ήταν (Εικ. 2Β και 3Α). Όπως υποδεικνύεται στην Εικόνα 3Β,

Ptp4a3

-null ποντίκια εμφανίζουν μια μείωση κατά 54% του αριθμού των όγκων (ρ & lt? 0.004) μετά 16 εβδομάδες θεραπείας. Παρά το γεγονός ότι κατά μέσο όρο λιγότερους όγκους παρατηρήθηκαν σε 12 εβδομάδες σε

Ptp4a3

-null ποντίκια σε σχέση με τον άγριο τύπο, αυτό δεν ήταν στατιστικά σημαντική (p & gt? 0,2). Είναι ενδιαφέρον ότι, ο αριθμός των όγκων (p = 0.05), καθώς και διάμετρος όγκου (Ρ & lt? 0.001) ήταν σημαντικά αυξηθεί από 12 σε 16 εβδομάδες, ενώ

Ptp4a3

-null όγκοι δεν αυξήθηκαν σημαντικά σε αριθμό ή μέγεθος. Η μέση διάμετρος των όγκων που παράγονται από αυτό το μοντέλο ήταν 3-4 mm (Σχ. 3C).

Α) Εικόνα που απεικονίζει την εμφάνιση του φυσικού τύπου και

Ptp4a3

-null ιστό κόλου ακόλουθες 16 εβδ αγωγή με ΑΟΜ-DSS. Β) Ο μέσος αριθμός των όγκων καταγράφηκε σε ποντίκια με γονότυπο μετά από 12 και 16 εβδομάδες θεραπείας. Ο μέσος αριθμός των όγκων αυξήθηκε σημαντικά σε ποντικούς άγριου τύπου μεταξύ των 12 έως 16 εβδ χρόνος σημεία (* = ρ = 0.05). Κατά τη διάρκεια αυτής της περιόδου, ο αριθμός των όγκων παρατηρήθηκε σε

Ptp4a3

-null ποντίκια ήταν η ίδια (ρ = 0.70). Στους 12 εβδ, τα ποντίκια φυσικού τύπου (η = 6) δεν έχουν σημαντικά περισσότεροι όγκοι ανά ποντικό από

Ptp4a3

-null (n = 5) ποντικούς (ρ = 0,27). Σε 16 εβδομάδες, τα ποντίκια φυσικού τύπου (n = 14) που εμφανίζονται σημαντικά λιγότερο όγκους ανά ποντικό από

Ptp4a3

-null ποντικών (n = 7) (** = ρ & lt? 0.005). Γ) Το μέγεθος του όγκου (μετρήθηκε με μέση διάμετρος του όγκου για κάθε ποντικό) προσδιορίστηκε σε κάθε χρονικό σημείο. Η διάμετρος του όγκου παρατηρήθηκε να αυξηθούν σημαντικά σε άγριου τύπου ποντικούς από 12 έως 16 εβδ (* = ρ & lt? 0.001). Καμία σημαντική διαφορά δεν παρατηρήθηκε σε

Ptp4a3

-null ποντίκια από 12 έως 16 Εβδομάδων, ή μεταξύ των γονότυπων είτε χρονικό σημείο. Μπαρ = SEM.

Η

Ptp4a3 είναι αυξημένη σε ΑΟΜ-παράγωγα όγκων του παχέος εντέρου

Επειδή η υψηλή έκφραση του PTP4A3 έχει αναφερθεί σε ανθρώπινα πρωτογενή όγκων του παχέος εντέρου [22], εξετάσαμε

Ptp4a3

έκφραση στο μοντέλο ποντικού του καρκίνου του παχέος εντέρου. Πρώτον, ολικό mRNA εκχυλίστηκε από ιστό όγκου από ποντικούς άγριου τύπου και ποσοτική RT-PCR χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί το επίπεδο έκφρασης του κάθε

Ptp4a

μέλος της οικογένειας (Σχ. 2Ε). Σε σχέση με το φυσιολογικό επιθήλιο του παχέος εντέρου,

Ptp4a3

ήταν αυξημένα 3,7 φορές κατά μέσο όρο (p & lt? 0,01). Ενώ σημαντική ανομοιογένεια

Ptp4a3

έκφραση παρατηρήθηκε, που κυμαίνονται από 1,4 να 6,7 φορές προς τα πάνω ρύθμιση,

Ptp4a3

επίπεδα του mRNA σε ιστό όγκου ήταν σταθερά υψηλότερες από το φυσιολογικό ιστό για κάθε δείγμα που δοκιμάστηκε (n = 15 ). Είναι ενδιαφέρον ότι, τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης του

Ptp4a1

και

Ptp4a2

ήταν και οι δύο μειωτικά 64% και 36% (ρ & lt? 0.0001 και ρ & lt? 0,05), αντίστοιχα, σε όγκους του παχέος εντέρου σε σχέση με το φυσιολογικό ιστό. τα επίπεδα πρωτεΐνης σε φυσιολογικό PTP4A3 λύματα επιθηλιακά κόλον ήταν πολύ χαμηλές όταν προσδιορίζεται με κηλίδωση Western (Σχ. 2F). Σε αντίθεση, PTP4A3 ήταν εύκολα ανιχνεύσιμη, αλλά μεταβλητή, σε δείγματα όγκων του παχέος εντέρου. Όπως θα ήταν αναμενόμενο, δεν φαίνεται να υπάρχει κάποια συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων της πρωτεΐνης PTP4A3 και τα επίπεδα του mRNA (εικ. 2G) εκεί. Η έλλειψη λειτουργικών αντισωμάτων για PTP4A1 και PTP4A2 δεν επέτρεψε την αξιολόγηση των επιπέδων πρωτεΐνης όγκου για τα εν λόγω μέλη της οικογένειας.

Απώλεια Ptp4a3 αυξάνει την έκφραση IGF1Rβ και c-myc σε όγκους

Στη συνέχεια εξετάσαμε προϊόντα λύσης που λαμβάνονται από τόσο άγριου τύπου και

όγκων Ptp4a3

-null του παχέος εντέρου. Χρησιμοποιήσαμε πρώτη σειρά αντίστροφη πρωτεΐνη φάση για την ανάλυση των επιπέδων πάνω από 130 διαφορετικά προϊόντα πρωτεΐνης που περιέχεται σε άγριου τύπου και

Ptp4a3

-null όγκους (Εικ. S5). Ενώ τα επίπεδα πρωτεΐνης σε αυτούς τους όγκους παρουσίασαν σημαντική ανομοιογένεια, δύο γνωστοί ογκογονικές πρωτεΐνες σηματοδότησης, την κινάση τυροσίνης υποδοχέα IFG1Rβ και τον παράγοντα μεταγραφής c-MYC εκφράστηκαν σε υψηλότερα επίπεδα σε

Ptp4a3

-null όγκων (Σχ. 4Α). Μετά την ποσοτικοποίηση, IGF1Rβ πρωτεΐνη ήταν κατά μέσο όρο 2,1 φορές υψηλότερη (p & lt? 0.001) και c-myc ήταν περίπου 2,5 φορές υψηλότερη (p & lt? 0,02) στο

Ptp4a3

-null σε σχέση με τους όγκους άγριου τύπου του παχέος εντέρου (Εικ. 4Β-C). Σε αντίθεση, δεν παρατηρήσαμε σημαντική διαφορά στην ενεργοποίηση ΑΚΤ μεταξύ των γονότυπων (Εικ. 4D). Το αποτέλεσμα αυτό υποδηλώνει ότι οι όγκοι μπορεί ενδεχομένως να αντισταθμίσει

Ptp4a3

ανεπάρκεια όμως αλλαγμένη μονοπάτια σηματοδότησης.

Α) δείγμα Cluster του heatmap που παράγεται από την ανάλυση RPPA που πραγματοποιήθηκε με τη χρήση προϊόντων λύσεως του όγκου του παχέος εντέρου από ΑΟΜ-DSS αντιμετωπίζονται άγριου τύπου και

Ptp4a3

-null ποντίκια. στόχοι της πρωτεΐνης ήταν είτε υψηλότερα (κίτρινο), κάτω (μπλε), ή αμετάβλητη (μαύρο). Β) Τα επίπεδα πρωτεΐνης επιβεβαιώθηκαν με ανάλυση Western blot λύματα όγκων του παχέος εντέρου από άγριου τύπου και

Ptp4a3

-null ποντίκια. IGF1Rβ και πρωτεΐνη c-myc επιλέχθηκαν λόγω του ότι φαίνεται να είναι τα πιο σταθερά ρυθμισμένη προς τα πάνω τις πρωτεΐνες στο

Ptp4a3

-null δείγματα. Γ) Όταν ποσοτικά, τα επίπεδα της πρωτεΐνης IGFIRβ ήταν 2,1 φορές υψηλότερη σε

Ptp4a3

-null όγκους (ρ & lt? 0.001). Δ) τα επίπεδα της πρωτεΐνης c-myc ήταν 2,5 φορές υψηλότερη σε

Ptp4a3

-null όγκους (ρ & lt? 0,02). Ε) Τα επίπεδα των ενεργοποιημένων ΑΚΤ, όπως υποδεικνύεται από φωσφορυλίωση των Ser473, δεν ήταν σημαντικά διαφορετικό από το γονότυπο σε σχέση με την συνολική πρωτεΐνη ΑΚΤ.

Η

Συζήτηση

Ο αριθμός των γονιδίων που έχουν εμπλακεί στην ανάπτυξη και εξέλιξης του ορθοκολικού καρκίνου. Προηγούμενες μελέτες γονιδιακής έκφρασης προφίλ εντοπίστηκαν 144 γονίδια τα οποία πάνω ρυθμισμένα σε μεταστατικό ορθοκολικό ήπατος δείγματα [2]. Το μόνο γονίδιο, όμως, που ανυψώθηκε με συνέπεια σε όλες τις μεταστατικού δειγμάτων ήταν

Ptp4a3

. Τόσο η γονιδιακή ενίσχυση και την ενίσχυση της μεταγραφικής δραστηριότητας είναι πιθανό αιτιώδη για τα υψηλά επίπεδα. Παρά την προφανή σημασία του

Ptp4a3

στη βιολογία του όγκου, την κατανόησή μας για τη λειτουργικότητα του

Ptp4a3

είναι εις ολόκληρον περιορισμένη οφείλεται εν μέρει στην απουσία του πληροφοριακού ζωικά μοντέλα. Το γονίδιο στοχευμένη μοντέλο ποντικού για διάσπαση του

Ptp4a3

γονιδιακού τόπου που έχουμε αναπτύξει είναι χρήσιμη όχι μόνο για τη μελέτη των φαινοτυπικών αλλαγών που συμβαίνουν με την παγκόσμια απώλεια της φωσφατάσης, αλλά και για τις μελλοντικές έρευνες στον ιστό και χρονική συγκεκριμένο γονίδιο διαγραφή και τις αλληλεπιδράσεις συνεργασίας με άλλα γονίδια, συμπεριλαμβανομένων των δύο άλλων μελών του

Ptp4a

οικογένεια. Το μοντέλο μας προβλέπει ότι τα ποντίκια μπορούν να επιβιώσουν εν απουσία ενός λειτουργικού

Ptp4a3

γονίδιο, αν και υπήρχαν ένα ελαφρώς μικρότερο αριθμό αρσενικών ποντικών που παράγονται, και είναι σε θέση να ζήσουν μέχρι τη λήξη τους, υπό κανονικές συνθήκες, χωρίς σημαντικές ελλείψεις υγείας . Αυτό έρχεται σε αντίθεση με ό, τι έχει αναφερθεί με ποντίκια που στερούνται το εντόνως ομόλογο

Ptp4a2,

η οποία πιστεύεται ότι είναι η πιο εκφράζεται παντού μέλος της οικογένειας υπό κανονικές συνθήκες.

Ptp4a2

-null ποντίκια εμφάνισαν ελαττωματικό πλακούντα ανάπτυξη και τα δύο φύλα έδειξαν καθυστερημένη ανάπτυξη στα εμβρυϊκά και ενήλικα στάδια [23].

Ptp4a2

απώλεια μειώνει τις spongiotrophoblast και φθαρτό στρώματα του πλακούντα αλλοιώνοντας μεταφορά θρεπτικών συστατικών και προκαλεί εμβρυϊκή καθυστέρηση της ανάπτυξης. Επιπλέον, η απώλεια του

Ptp4a2

αποτελέσματα στην αδρανοποίηση ΑΚΤ, η οποία δεν ήταν εμφανής στα δεδομένα μας σχετικά με

Ptp4a3

απώλεια. Συλλογικά, οι διαφορές στα δύο μοντέλα διαγραφή του γονιδίου είναι συνεπείς με τις μη επικαλυπτόμενες λειτουργίες αυτών των δύο στενοί συγγενείς φωσφατάση.

Η διαγραφή της PTP4A3 πρωτεΐνης επιβεβαιώθηκε με ανάλυση κηλίδας Western χρησιμοποιώντας μια ποικιλία από προϊόντα λύσης ιστού από άγριου τύπου και

Ptp4a3

-null ποντίκια. Αν και οι αρχικές μελέτες πρότειναν

Ptp4a3

έκφραση περιορίστηκε στην καρδιά, τους σκελετικούς μύες και το πάγκρεας [24], τα δεδομένα μας αποκάλυψε ένα περισσότερο πανταχού παρόντες πρότυπο έκφρασης. Ενώ παρατηρήθηκαν τα υψηλότερα επίπεδα PTP4A3 σε εμβρυϊκή καρδιά, η πρωτεΐνη ήταν επίσης ανιχνεύσιμη σε χαμηλότερα επίπεδα στην καρδιά ενηλίκων, τους σκελετικούς μύες, τον σπλήνα, το πάγκρεας, εγκέφαλο, πνεύμονα, θύμο, κόλον και λεπτό έντερο? καμία πρωτεΐνη PTP4A3 ήταν ανιχνεύσιμη το ήπαρ ή τους νεφρούς.

Επειδή η ανθρώπινη PTP4A3 είναι ενοχοποιηθεί στην παθογένεση του ανθρώπινου μεταστατικού ορθοκολικού καρκίνου, ερευνήσαμε την επίδραση του

Ptp4a3

διαγραφή σε ένα μοντέλο ποντικού του παχέος εντέρου Καρκίνος. Η θεραπεία με ΑΟΜ /DSS είναι ένα από τα πιο δημοφιλή μοντέλα ποντικού όγκου κόλου και του στελέχους C57BL /6J στην οποία επαναδιασταυρώθηκε αυτό το μοντέλο είναι ιδιαίτερα ευαίσθητα στην κολίτιδα σχετιζόμενη με τον καρκίνο [13], [16], [17].

Ptp4a3

παραδοσιακά ταξινομηθεί ως γονίδιο που σχετίζεται με μετάσταση και δεν είναι γνωστό ότι εμπλέκονται στα πρώτα στάδια της εξέλιξης του καρκίνου. Στην παρούσα μελέτη, θα παρέχουν αποδείξεις ότι οι

Ptp4a3

επίπεδα πρωτεΐνης mRNA και PTP4A3 αυξήθηκαν αμέσως μετά την έκθεση σε ΑΟΜ, το βήμα για την έναρξη της μοντέλο καρκίνου του παχέος εντέρου μας. Αυτό είναι σημαντικό απόδειξη ότι PTP4A3 θα μπορούσε να εμπλέκεται επίσης στην προ-νεοπλασματικών στάδιο της κακοήθειας.

Ποντίκια υποβάλλονται σε μοντέλο /DSS ΑΟΜ αναπτύχθηκε με συνέπεια όγκους στην απομακρυσμένη περιοχή του παχέος εντέρου. Αυτές οι πρωτογενείς όγκοι εμφανίζονται σταθερά υψηλότερα επίπεδα

Ptp4a3

σχέση με το φυσιολογικό επιθήλιο του κόλου – παρόμοιο με αυτό που παρατηρείται σε ανθρώπους ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου [22]. Αξίζει να σημειωθεί ότι, τα ποντίκια με έλλειψη για

Ptp4a3

είχε & gt? 50% μείωση στο σχηματισμό όγκων παρέχοντας περαιτέρω ενδείξεις ότι

Ptp4a3

αποτελεί βασικό μεσολαβητή της εξέλιξης του καρκίνου του παχέος εντέρου. Παρ ‘όλα αυτά, η πλήρης απουσία της PTP4A3 φωσφατάση ήταν ανεπαρκής για να καταργήσει την καρκινογένεση του παχέος εντέρου, γεγονός που υποδηλώνει ότι ένα υποσύνολο των όγκων δεν μπορούν να απαιτούν

Ptp4a3

ως οδηγός της νόσου. Αυτό υποστηρίζεται από το εύρημα ότι δεν είναι όλοι οι όγκοι σε αυτό το μοντέλο είχε υψηλή. (& Gt? 2-φορές προς τα πάνω ρύθμιση)

Ptp4a3

επίπεδα έκφρασης

Το ζωικό μοντέλο που έχουμε αναπτύξει παρουσιάζει μια μοναδική ευκαιρία για να εξεταστεί ο ρόλος των

Ptp4a3

στη βιολογία του όγκου. έκθεσης ΑΟΜ προκαλεί βλάβες στο DNA και γονοτοξικό στρες. Μια εξέχουσα απάντηση σε βλάβη του DNA είναι η επαγωγή του

p53

, η οποία μπορεί να προκαλέσει

Ptp4a3

έκφραση [25] και μπορεί να παρέχει μια εξήγηση για την επαγωγή της

Ptp4a3

στο παχύ έντερο του ΑΟΜ αγωγή ποντίκια. Επιπλέον,

Ptp4a3

έχει αναγνωριστεί ως άμεση ρυθμιστική στόχος της TGFβ σηματοδότησης σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. Το ενεργό σήμα ΤΟΡβ επάγει Smad3 /4 σύνδεση προς το

Ptp4a3

γενωμικού τόπου και έτσι η αναστολή της μεταγραφής του γονιδίου [19]. Απώλεια ΤΟΡβ είναι ένα συχνά παρατηρούμενο φαινόμενο σε καρκίνο του παχέος εντέρου του ανθρώπου [26], καθώς και το μοντέλο ποντικού ΑΟΜ του καρκίνου του παχέος εντέρου [18]. Είναι πιθανό ότι αυτό το γεγονός συμβάλλει αυξημένα

Ptp4a3

έκφραση γονιδίου στον καρκίνο μέσω Smad3 /4 αδρανοποίηση. Είναι ενδιαφέρον, ένα μοντέλο ποντικού με ανεπάρκεια για

Smad3

έχει αναφερθεί ότι αναπτύσσουν αυθόρμητα καρκίνο του παχέος εντέρου [27], και

Smad4

ανεπάρκεια επιδεινώνει σημαντικά ένα μοντέλο ποντικού καρκίνου του παχέος εντέρου [28]. Ο σχηματισμός των νεοπλασματικών αλλοιώσεων στο

Ptp4a3

-null ποντίκια μπορεί να είναι η συνέπεια της εμπλοκής των πρόσθετων οδών αυξητικού παράγοντα σηματοδότηση ή ογκογονίδια, όπως IFG1Rβ και c-myc. c-myc είναι γνωστό ότι αυξάνεται σε όγκους μετά από ΑΟΜ επεξεργασία /DSS και τόσο IFG1Rβ και c-myc ήταν σημαντικά αυξημένα στο

Ptp4a3

-null όγκους σε σχέση με προέρχονται όγκους άγριου τύπου.

Ενώ η

Ptp4a3

προϊόν του γονιδίου αρχικά θεωρήθηκε ότι εμπλέκεται στη μετάσταση του όγκου και της νόσου προχωρημένο στάδιο, τα αποτελέσματά μας παρέχουν ενδείξεις για πιθανούς ρόλους σε άλλα στάδια της νόσου συμπεριλαμβανομένης της προ-νεοπλασματικό μετασχηματισμό και στις αρχές της καρκινογένεσης. Η έννοια της θεραπευτικά στόχευσης

Ptp4a3

θα μπορούσε, επομένως, να είναι ελκυστικό σε πολλαπλά στάδια του καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

Δημιουργία

Ptp4a3

μεταλλαγμένα ποντίκια

Ο φορέας στόχευσης γονιδίου υπό όρους κατασκευάστηκε χρησιμοποιώντας ένα φάγων που βασίζεται

Ε. coli

σύστημα ανασυνδυασμού [29]. Οι ειδικότερες λεπτομέρειες σχετικά με την κατασκευή του φορέα και στόχευσης στρατηγική που περιγράφεται στο Σχ. S1. Εμείς ειδικά στοχευμένη εξόνιο 2 επειδή περιείχε την θέση έναρξης της μεταγραφής και ήταν απαραίτητες για τη σωστή μετάφραση του mRNA αντιγράφου. Μετά την επιμόλυνση του κατασκευάσματος εντός R1 εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων [30], οι ποντικοί δημιουργήθηκαν από σωστά στοχευμένη κλώνους χρησιμοποιώντας πρότυπες τεχνικές ζωικής παραγωγής χιμαιρικών με C57BL /6J βλαστοκύστες. Το μυθιστόρημα στέλεχος επαναδιασταυρώθηκε να C57BL /6J (Το Εργαστήριο Jackson) για & gt? 5 γενιές και ποντίκια για τα πειράματα που παράγεται με τη χρήση ετερόζυγο αναπαραγωγικά ζευγάρια. Η γονοτύπηση διεξήχθη με ανάλυση κηλίδος Southern με ραδιοσημασμένο ανιχνευτή που αντιστοιχεί σε ~ 300 bp από εξώνιο 6, η οποία ήταν εκτός του φορέα στόχευσης γονιδίου. Αυτή η μελέτη διεξήχθη σύμφωνα με τις συστάσεις στον Οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας. Όλα τα σχετικά πρωτόκολλα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και Χρήση του Πανεπιστημίου του Πίτσμπουργκ.

ΑΟΜ μοντέλο καρκίνου

άγριου τύπου και

Ptp4a3

-null ποντίκια (αρσενικά, 6 -8 εβδομάδες) χορηγήθηκε μία απλή δόση του ΑΟΜ (12,5 mg /kg) (Sigma) σε στείρο φυσιολογικό ορό με ένεση ΙΡ. λύση DSS (2,5%) (MP Biomedicals) δόθηκε

κατά βούληση

για 7 ημέρες ακολουθούμενη από 14 δ της κανονικής πόσιμου νερού και αυτού του κύκλου επαναλήφθηκε συνολικά 3 φορές [13]. Πειραματικό ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία στις 12 ή 16 εβδομάδες μετά την έναρξη της θεραπείας, κατά την οποία ιστός σημείο κόλον απομονώθηκε, ξεπλύθηκε, και άνοιξε διαμήκως για ανάλυση. Όγκου και φυσιολογικό ιστό είτε καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο ή βυθίζεται σε 10% ουδέτερη ρυθμισμένη φορμαλίνη. Για κάθε ποντικό, οι μεμονωμένοι όγκοι μετρήθηκαν και μετρήθηκαν με ένα ψηφιακό παχύμετρο και μέσος αριθμός όγκων και διάμετρο προσδιορίστηκαν για κάθε γονότυπο.

Western ανάλυση κηλίδος

Τα κύτταρα και οι ιστοί υποβλήθηκαν σε λύση χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό RIPA και ποσοτικά με δοκιμασία Bradford. Ένα συνολικό δείγμα πρωτεΐνη των 40 μg διαχωρίστηκε χρησιμοποιώντας Novex αντιδραστήρια SDS-PAGE (Invitrogen) και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν σε ρυθμιστικό Οδύσσεια (LiCor Biosciences) και επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα όλη τη νύκτα ακολουθούμενο από δευτερογενή φθορίζοντα αντισώματα σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών. Χρησιμοποιήσαμε τα ακόλουθα εμπορικά διαθέσιμα πρωτογενή αντισώματα: PTP4A3 κλώνος 318 (Santa Cruz Biotechnology), GAPDH, IGF1Rβ, c-myc, π-ΑΚΤ (S473), και AKT (Cell Signaling Technology)

Ποσοτική RT-. PCR

Ολικό RNA εκχυλίστηκε από ιστό χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤπζοΙ σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Invitrogen). Ένα σύνολο 500 ng mRNA μετετράπη σε cDNA με χρήση του κιτ σύνθεσης πρώτου κλώνου iScript (Bio-Rad). Οι εκκινητές (Πιν. S1) που χρησιμοποιούνται για την ενίσχυση του στόχου αραιώθηκαν σε μια τελική συγκέντρωση 500 ρΜ, και παρακολούθηση σε πραγματικό χρόνο της αντίδρασης PCR διεξήχθη σε ένα Biorad iQ5 θερμοκυκλωτή με 2Χ SYBR Green βασικού μείγματος (Bio-Rad). Το ακόλουθο πρόγραμμα διεξήχθη για 40 κύκλους: 95 ° C για 0:30? 58 ° C για 1:00? και 72 ° C για 0:30.

αντίστροφη σειρά πρωτεΐνης φάση

λύματα Πρωτεΐνη (100 μg το καθένα) από δείγματα όγκων του παχέος εντέρου (n = 5 /γονότυπος) μετουσιώθηκαν και αποστέλλονται κατεψυγμένα σε MD Anderson Cancer Κέντρο (Houston, ΤΧ) για ανάλυση. Εν συντομία, προϊόντα λύσεως ήταν δύο φορές-αραιωμένο σειριακή για 5 αραιώσεις και μαζεύτηκαν σε πλακίδια νιτροκυτταρίνης επικαλυμμένα, ανιχνεύθηκαν με αντισώματα, και οπτικοποιήθηκαν με διαμινοβενζιδίνη χρωματομετρική αντίδραση. Σχετικά επίπεδα πρωτεΐνης για κάθε δείγμα προσδιορίσθηκαν δια παρεμβολής από κάθε καμπύλες αραίωσης από την πρότυπη καμπύλη ολίσθησης αντίσωμα. Όλα τα σημεία των δεδομένων ομαλοποιήθηκαν για πρωτεΐνη φόρτωση και μετασχηματίζεται σε γραμμική τιμή. Γραμμική τιμές μετατράπηκαν σε αξία Log2 και στη συνέχεια μέση επίκεντρο για την ιεραρχική ανάλυση συστάδων. Ο θερμικός χάρτης δημιουργήθηκε στο Cluster 3,0 ως ιεραρχική σύμπλεγμα χρησιμοποιώντας Pearson Correlation και ένα κέντρο μετρική (πρόσθετες λεπτομέρειες παρέχονται είναι Εικ. S5).

Στατιστικά

Η στατιστική ανάλυση των απογόνων γονότυπο ήταν υπολογίζονται η Chi-τετράγωνο τεστ σύγκριση των παρατηρούμενων και αναμενόμενων αποτελεσμάτων. Δεδομένα από κυτταρικές δοκιμασίες, western blot, και ποσοτικοποιήσεις qRT-PCR αναλύθηκε με χρήση του 2-tailed t-test. Και στις δύο περιπτώσεις, η σημασία ορίστηκε ως p ≤ 0,05.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

doi: 10.1371 /journal.pone.0058300.s001

(PDF)

Εικόνα S2.

doi: 10.1371 /journal.pone.0058300.s002

(PDF)

Εικόνα S3.

doi: 10.1371 /journal.pone.0058300.s003

(PDF)

Εικόνα S4.

doi: 10.1371 /journal.pone.0058300.s004

(PDF)

Εικόνα S5.

doi: 10.1371 /journal.pone.0058300.s005

(PDF)

Πίνακα S1.

doi:. 10.1371 /journal.pone.0058300.s006

(PDF)

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς θα ήθελαν να ευχαριστήσω Carolyn Φέργκιουσον για την τεχνική εμπειρογνωμοσύνη και τη βοήθειά της