Αφηρημένο

Ιστορικό

Οι διάφοροι μηχανισμοί που εμπλέκονται στην p120-κατενίνης 1/3 ρύθμιση της προόδου του κυτταρικού κύκλου δεν έχουν ακόμη διευκρινιστεί μέχρι σήμερα.

Μέθοδοι και Ευρήματα

Βρήκαμε ότι τόσο η κυκλίνη D1 και κυκλίνης Ε θα μπορούσε να αποκατασταθεί αποτελεσματικά με την επιστροφή των p120ctn-1A ή p120ctn-3A σε p120ctn εξαντληθεί καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Όταν η έκφραση της κυκλίνης D1 έχει αποκλειστεί από συν-επιμόλυνση με siRNA-κυκλίνης D1 σε p120ctn εξαντλημένα κύτταρα αποκαθιστώντας p120ctn-1A ή 3Α, η έκφραση της κυκλίνης Ε ήταν ελαφρώς μειωμένη, δεν αυξήθηκε, υποδηλώνοντας ότι ισομορφές p120ctn 1 και 3 δεν μπορεί προηγούμενους ρυθμίζουν κυκλίνης Ε άμεσα, αλλά μπορεί να το πράξει μέσω up-ρύθμιση της κυκλίνης D1. Είναι ενδιαφέρον ότι, η υπερέκφραση του p120ctn-1A αυξημένη β-κατενίνης και την έκφραση D1 κυκλίνης, ενώ συν-διαμόλυνση με siRNA που στοχεύει β-κατενίνης καταργεί την επίδραση της p120ctn-1Α σε ανοδική ρύθμιση της κυκλίνης D1, υποδηλώνοντας ένα ρόλο β-κατενίνης στην μεσολάβηση p120ctn-1A ρυθμιστική λειτουργία για την έκφραση της κυκλίνης D1. Από την άλλη πλευρά, η υπερέκφραση του p120ctn ισομορφής 3Α ελαττωμένη πυρηνικού εντοπισμού Kaiso, μειώνοντας έτσι τη δέσμευση του Kaiso να KBS στον υποκινητή της κυκλίνης D1 και ενισχύοντας έτσι την έκφραση του γονιδίου της κυκλίνης D1 ανακουφίζοντας την επίδραση του καταστολέα Kaiso. Επειδή υπερεκφράζουν NLS-p120ctn-3A (p120ctn-3A πλασμίδια πυρηνικού εντοπισμού στόχου) ή την αναστολή των πυρηνικών εξαγωγή p120ctn-3 από Leptomycin Β (ΕΜΒ) προκάλεσε μετατόπιση του Kaiso στον πυρήνα, είναι εύλογο ότι η πυρηνική εξαγωγή Kaiso είναι p120ctn- 3-εξαρτώμενη.

Συμπεράσματα

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι οι ισομορφές p120ctn 1 και 3 πλειορύθμιση κυκλίνη D1, και ως εκ τούτου κυκλίνη Ε, με αποτέλεσμα την προαγωγή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου σε πνεύμονα καρκινικών κυττάρων πιθανότατα μέσω διαφορετικών μεσολαβητών της πρωτεΐνης, δηλαδή, β-κατενίνης για ισομορφή 1 και Kaiso, ένα αρνητικό μεταγραφικό παράγοντα της κυκλίνης D1, για την ισομορφή 3.

Παράθεση: Jiang G, Wang Υ, Dai S, Liu Υ , Stoecker Μ, Wang Ε, et al. (2012) P120-κατενίνης ισομορφές 1 και 3 ρυθμίζουν τον πολλαπλασιασμό και κυτταρικού κύκλου Κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα μέσω της β-κατενίνης και Kaiso αντίστοιχα. PLoS ONE 7 (1): e30303. doi: 10.1371 /journal.pone.0030303

Συντάκτης: Vladimir V. Kalinichenko, Ιατρικό Κέντρο Νοσοκομείο Σινσινάτι των παιδιών, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 2 Οκτωβρίου 2011? Αποδεκτές: 13, Δεκεμβρίου, 2011? Δημοσιεύθηκε: 20 Ιαν 2012

Copyright: © 2012 Jiang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (χορηγεί 81.071.905 σε Enhua Wang, 30901475 για να Yan Wang, 81071717 για να Shundong Dai, και 30.900.562 στην Yang Liu). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

στα καρκινικά κύτταρα, β-κατενίνης, ένας βασικός παράγοντας της κανονικής οδού σηματοδότησης Wnt, συσσωρεύεται στο κυτταρόπλασμα και στη συνέχεια μετατοπίζεται εντός του πυρήνα για να σχηματίσει ένα σύμπλοκο με τον παράγοντα μεταγραφής Lef /TCF (Lef, λεμφοειδή ενισχυτή παράγοντας? TCF, πρωτεΐνη παράγοντα Τ-κυττάρων), η οποία στη συνέχεια ενεργοποιεί Wnt αποκρίνονται γονιδίων, συμπεριλαμβανομένων κυκλίνης D1 [1]. Προηγουμένως, έχουμε αναφέρει ότι ένα από τα ισόμορφα p120ctn, p120ctn-1, θα μπορούσαν να ρυθμίζουν την έκφραση β-κατενίνης, ενώ ένα άλλο p120ctn ισομορφή, p120ctn-3, δεν θα μπορούσε [2] – [3]. Είναι ενδιαφέρον ότι, και τα δύο p120ctn ισομορφές 1 και 3 θα μπορούσαν να επηρεάσουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, οι οποίες είναι γνωστό ότι προκαλείται από την κυκλίνη D1 [2] – [4]. Είναι επομένως λογικό να υποθέσουμε ότι p120ctn-1 ρυθμίζει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και κυτταρικού κύκλου μέσω της β-κατενίνης που προκαλείται ανοδική ρύθμιση της κυκλίνης D1. Ωστόσο, ο υποκείμενος μοριακός μηχανισμός με τον οποίο p120ctn-3 ρυθμίζει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου είναι ακόμα ασαφές αυτή τη στιγμή.

προηγούμενη μελέτη μας έδειξε ότι Kaiso, μια πυρηνική ΤΔΕ /POZ-ZF (ΤΔΕ, Broad συγκρότημα, Tramtrack, Bric à brac? POZ, ιό ευλογιάς και δακτύλου ψευδαργύρου? ZF, δακτύλου ψευδαργύρου) παράγοντα μεταγραφής, θα μπορούσε να συνδεθεί με p120ctn σε ιστό καρκίνου του πνεύμονα και καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων [5]. Αν και είναι γνωστό ότι είναι ένα συστατικό του συμπλόκου /p120ctn Kaiso, κάθε άτομο ισομορφή p120ctn μπορούσαν να έχουν διαφορετική συγγένεια δέσμευσης ενώ για Kaiso [6]. Ενδιαφέρον, η περιοχή υποκινητή της κυκλίνης D1 περιέχει KBS (θέσεις Kaiso δέσμευσης), μια αλληλουχία DNA συναίνεση που θα μπορούσε να αναγνωριστεί από Kaiso [7] – [8]. Ως εκ τούτου, η κυκλίνη D1 μπορεί επίσης να είναι ένα δυνητικό κατάντη γονίδιο στόχο του Kaiso [9] – [10]

Δεδομένου ότι η περιοχή πρόσδεσης του Kaiso με p120ctn είναι εντελώς επικαλύπτεται με την ειδική αλληλουχία DNA του KBS στοιχείο στη κυκλίνης. D1 υποκινητή [9] – [11], υποθέτουμε ότι p120ctn-3 θα μπορούσε να ανταγωνιστεί με KBS στη γονιδιακή D1 κυκλίνης να δεσμεύεται με Kaiso και καταργεί Kaiso διαμεσολαβούμενη καταστολή της κυκλίνης D1, ενισχύοντας έτσι την έκφραση της κυκλίνης D1, καθώς και κυκλίνη Ε , η οποία θα προωθήσει τελικά την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. Για να ελέγξετε την υπόθεσή μας στην παρούσα μελέτη, θα ανασυσταθεί p120ctn-1Α και 3Α, αντίστοιχα, p120ctn εξαντλημένα κύτταρα και υπερεκφράζεται ή γκρέμισε Kaiso ή β-κατενίνης να δοκιμάσουν τις επιπτώσεις στην έκφραση της κυκλίνης D1 και κυκλίνης Ε Ο στόχος ήταν να διερευνηθεί η δυναμικό διαφορετικούς μοριακούς μηχανισμούς με τους οποίους p120ctn-1 και 3 ρυθμίζουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τον κυτταρικό κύκλο σε κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα. Δύο μεταλλάξεις διαγραφής του p120ctn ισομορφή 1, οι οποίες ποικίλλουν σε Ν-τερματικό δομές τους, κατασκευάστηκαν για να μελετήσει τις διάφορες λειτουργίες του p120ctn-1 και 3.

Αποτελέσματα

Τόσο p120ctn 1Α και 3Α θα μπορούσε πλειορύθμιση κυκλίνη D1 και την έκφραση κυκλίνης Ε, που επηρεάζουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου στα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα

είτε p120ctn δρα ως καταστολέας όγκων ή μετάστασης ενός υποκινητή εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από το αν η έκφραση της Ε-καδερίνης είναι κάτω -regulated, έχασε εντελώς από τη διασταύρωση κυττάρου-κυττάρου ή ανέπαφο [12]. Ως εκ τούτου, είναι πολύ σημαντικό να καθοριστεί εάν Ε-καδερίνης είναι εντοπισμένη επί της μεμβράνης των ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα. Σε αυτή τη μελέτη, επιβεβαίωσε ότι δεν υπάρχει ορατή μεμβρανώδη εντοπισμός του είτε p120ctn-1/3 ή Ε-καδερίνης πρωτεϊνών σε Α549 ή SPC κυτταρικές σειρές (Σχήμα S1). Αντ ‘αυτού έδειξαν κυρίως κυτταροπλασματική κατανομή. Μετά p120ctn χτυπήθηκε κάτω σε κύτταρα Α549, οι εκφράσεις της κυκλίνης D1 και κυκλίνης Ε μειώθηκαν σημαντικά σε επίπεδα τόσο της πρωτεΐνης (Εικόνα 1Α) και μεταγραφή (Σχήμα S2A). Σύμφωνα, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ήταν ουσιαστικά κατασταλεί (

σ

& lt? 0.01, Σχήμα 1Β), που υποδεικνύεται από περισσότερες G

1 κύτταρα φάσης και λιγότερο κύτταρα φάσης S ανιχνεύθηκε (

σ

= 0.001 , Σχήμα 1 C). Επιπλέον, η κυκλίνη D1 και η κυκλίνη Ε μπορεί να αποκατασταθεί αποτελεσματικά με επιστροφή του p120ctn-1A ή p120ctn-3A σε p120ctn εξαντλημένα κύτταρα Α549 κυτταρικού κύκλου (Σχήμα 2Α και το Σχήμα S2B), και ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων και θα μπορούσε επίσης να αποκατασταθεί, πιθανώς αντιστοιχεί στην κορεσμός της κυκλίνης D1 και κυκλίνη E (

ρ

& lt? 0,05, Σχήμα 2Β και C). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν στα κύτταρα SPC-Κ2 στο οποίο p120ctn έκφραση συνταγματικά εξαντληθεί (Σχήμα S3).

(Α) Τα αποτελέσματα της ανάλυσης κηλίδας Western έδειξε ότι οι πρωτεΐνες κυκλίνης D1 (*,

p

= 0.001) και κυκλίνης Ε (*,

σ

= 0.004) ήταν σημαντικά μειωμένη μετά p120ctn χτυπήθηκε κάτω σε κύτταρα Α549. (Β και Γ) Τα αποτελέσματα του ΜΤΤ και κυτταρομετρία ροής έδειξε κατέστειλε πολλαπλασιαστική ικανότητα των κυττάρων, αυξημένη G

1 κύτταρα φάσης (*,

σ

= 0,001) και μείωσε κύτταρα φάσης S (*,

p

= 0.001) ανιχνεύθηκαν σε κύτταρα Α549 με γκρέμισε p120ctn. Όλες οι συγκρίσεις έγιναν με τις ομάδες των κυττάρων Α549 ή κύτταρα επιμολυσμένα μόνο με φορέα.

Η

(Α) p120ctn-1Α ή 3Α πλασμίδια επιμολύνθηκαν σε κύτταρα Α549 εξαντλημένο από p120ctn (SI-ρ120 + 1A ή si-p120 + 3Α), που δείχνει τα σημαντικά ανακτηθούν τα επίπεδα της πρωτεΐνης της κυκλίνης D1 (*,

σ

& lt? 0.001, **,

σ

& lt? 0.001) και κυκλίνης Ε (* ,

σ

& lt? 0.001, **,

σ

& lt? 0,01). (Β και Γ) Τα αποτελέσματα του ΜΤΤ και κυτταρομετρία ροής έδειξε ότι ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός αποτελεσματικά αποκαταστάθηκε (

σ

& lt? 0.01), G

1 κύτταρα φάση ήταν σημαντικά μειωμένη (*,

p

= 0.001 **,

σ

= 0,004) και τα κύτταρα φάσης S ήταν σημαντικά αυξημένα (*,

σ

= 0.004 **,

σ

= 0,028 ) μετά p120ctn εξαντλημένα κύτταρα Α549 επιμολύνονται με p120ctn-1A ή 3Α. Όλες οι συγκρίσεις γίνονται προς τις ομάδες των κυττάρων Α549 και τα κύτταρα επιμολύνθηκαν μόνο με φορέα.

Η

Στη συνέχεια διαπιστώθηκε ότι η εξάντληση κυκλίνη D1 από siRNA σε κύτταρα Α549 οδήγησε επίσης στη μείωση της έκφρασης κυκλίνης Ε ( Σχήμα 3Α και Σχήμα S4A), καταστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων (

ρ

& lt? 0,01, Εικόνα 3Β), ανύψωση του G

1 κύτταρα φάσης και μείωση στα κύτταρα φάσης S (

p

= 0.009, Εικόνα 3C), τα οποία ήταν συγκρίσιμη με την παρεμβολή του p120ctn. Σε αντίθεση, καμία αλλαγή στην έκφραση D1 κυκλίνης παρατηρήθηκε όταν η κυκλίνη Ε εξαντλημένο από siRNA (Σχήμα 3Α και Σχήμα S4A), υποδηλώνοντας μια μονόδρομη ρυθμιστική σχέση μεταξύ κυκλίνης D1 και κυκλίνη Ε Είναι ενδιαφέρον ότι, όταν siRNA-κυκλίνης D1 ήταν συν-επιμολύνθηκαν με p120ctn ισομορφή 1 ή 3 εντός των κυττάρων εξαντλούνται του p120ctn, η έκφραση της κυκλίνης Ε δεν αυξήθηκε αλλά μειώθηκε ελαφρά (Εικόνα 3D και Σχήμα S4B) και παρατηρήθηκε ένα παρόμοιο φαινόμενο όταν κυκλίνη D1 αποκλείστηκε με μονοκλωνικά επώαση αντίσωμα (100 ng /ml, 48 ώρες) σε p120ctn ανασυσταθεί κύτταρα (Σχήμα S5). Το εύρημα αυτό υποδηλώνει ότι p120ctn ισομορφών 1 και 3 δεν θα μπορούσε να ρυθμίζουν άμεσα κυκλίνη Ε, αλλά θα μπορούσε να το κάνει μέσω πάνω ρύθμιση της κυκλίνης D1. Όλα αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι p120ctn προάγει εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου με up-ρύθμιση κυκλίνη D1, η οποία στη συνέχεια ενισχύει την έκφραση της κυκλίνης Ε

(Α) εξάντληση Κυκλίνη D1 με siRNA σε κύτταρα Α549 οδήγησε σε μειωμένη έκφραση κυκλίνης Ε, αλλά αντίθετα, η έκφραση της κυκλίνης D1 δεν άλλαξε σημαντικά (

σ

= 0,944) σε κύτταρα με χτύπησε κάτω κυκλίνη Ε με siRNA, υποδηλώνοντας μια μονόδρομη ρυθμιστική σχέση μεταξύ κυκλίνης D1 και κυκλίνη Ε (Β και Γ) εξάντληση κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων κυκλίνης D1 (

σ

& lt? 0.01), αυξημένα G

1 κύτταρα φάση (

σ

= 0,016) και μειώθηκαν κύτταρα φάσης S (

p

= 0.009). (δ) μετά συν-επιμόλυνση του siRNA-κυκλίνης D1 με p120ctn ισομορφή 1 ή 3 στα κύτταρα εξαντλούνται από p120ctn για 48 ώρες, η έκφραση της κυκλίνης Ε δεν αυξήθηκε, αλλά μειώθηκε ελαφρά. Όλα αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι p120ctn προάγει εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου με up-ρύθμιση κυκλίνη D1, η οποία στη συνέχεια ενισχύει την έκφραση της κυκλίνης Ε η σύγκριση γίνεται με την ομάδα ελέγχου των κυττάρων που επιμολύνθηκαν με μη στοχευμένη siRNA ή μόνο με φορέα.

p120ctn ισομορφή 1 θα μπορούσε να ρυθμίζουν την έκφραση D1 κυκλίνης μέσω της β-κατενίνης

Από το έχουμε επιβεβαιώσει ότι τόσο p120ctn-1A και p120ctn-3A θα μπορούσε να ρυθμίζουν κυκλίνη D1, τέθηκε το ερώτημα κατά πόσον η υποκείμενων μοριακών μηχανισμών ήταν η ίδια μεταξύ των δύο ισομορφών. Για να απαντήσουμε σε αυτό το ερώτημα, p120ctn-1A και p120ctn-3Α αντίστοιχα επιμολύνονται σε p120ctn γκρέμισε κύτταρα ΕΣΠ, τα οποία ορίστηκαν ως SPC-K2. Η υπερέκφραση του p120ctn-1Α μπορεί να ενισχύσει την έκφραση β-κατενίνης (* ρ = 0.001, Εικόνα 4Α), αλλά η υπερέκφραση του p120ctn-3A είχε ουσιαστικά καμία επίδραση στην πρωτεΐνη β-κατενίνης (** ρ = 0.769, Εικόνα 4Α). Ενδιαφέροντος, ούτε p120ctn-1 ούτε το 3 φάνηκε να έχει επίδραση στην μεταγραφή του β-κατενίνης (* p = 0,463, ** p = 0,401, Εικόνα 4Β).

κύτταρα SPC-Κ2 είχαν επιμολυνθεί με p120ctn α-1Α ή 3Α αντίστοιχα, και η έκφραση της β-κατενίνης και Kaiso μετρήθηκε με κηλίδα western (Α) και RT-PCR (Β). Η έκφραση της πρωτεΐνης του β-κατενίνης ήταν σημαντικά αυξημένη (*,

σ

= 0,001) στα κύτταρα επιμολυσμένα με p120ctn-1A cDNA, αλλά δεν παρουσίασαν σημαντική μεταβολή (**

p

= 0,769) σε p120ctn-3A υπερεκφράζουν SPC-K2. Ούτε p120ctn-1 ούτε το 3 θα μπορούσε να επηρεάσει τη μεταγραφή του

β-κατενίνης

(*

σ

= 0,463, **

σ

= 0,401) ή την έκφραση της Kaiso. Όλες οι συγκρίσεις γίνονται στην ομάδα των κυττάρων που επιμολύνθηκαν μόνο με φορέα.

Η

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5, κάτω ρύθμιση β-κατενίνης με siRNA (SI-β-CAT) είχε ως αποτέλεσμα μειωμένες κυκλίνη έκφραση D1 σε Α549, και να χτυπήσει κάτω p120ctn (si-ρ120) οδήγησε σε μειωμένη ενεργή β-κατενίνης και κυκλίνη D1. Επιπλέον, η ενεργός β-κατενίνης και κυκλίνης D1 επίπεδα θα μπορούσε να αποκατασταθεί με επιμόλυνση p120ctn-1A (SI-ρ120 + 1Α). Ωστόσο, η έκφραση της κυκλίνης D1 δεν αποκαταστάθηκε με συν-επιμόλυνση p120ctn-1Α και siRNA -β-κατενίνης (SI-ρ120 + 1A + si-β-cat), υποδηλώνοντας ότι p120ctn-1A πάνω ρυθμισμένα κυκλίνη D1 μέσω β-κατενίνης. Επιμόλυνση του p120ctn-3A στα κύτταρα εξαντλούνται του p120ctn (si-p120 + 3A) δεν θα μπορούσε να ρυθμίζουν τα επίπεδα των ενεργών β-κατενίνης αλλά θα μπορούσε να αποκαταστήσει σε μεγάλο βαθμό την έκφραση D1 κυκλίνης, υπονοώντας ότι p120ctn-3 up-ρυθμίζει την έκφραση της κυκλίνης D1 ανεξάρτητων του β-κατενίνης. Επιπλέον, όταν p120ctn-3A ήταν συν-επιμολύνθηκε σε κύτταρα Α549 εξαντλούνται τόσο p120ctn και β-κατενίνης (SI-ρ120 + 3A + si-β-cat), η έκφραση της κυκλίνης D1 ήταν σημαντικά αυξημένη σε σύγκριση με την ομάδα εξαντλημένο από p120ctn και β-κατενίνης χωρίς να αποδοθεί η p120ctn-3A (SI-p120 + si-β-γάτα)? λαμβάνοντας υπόψη ότι καμία αλλαγή στο ενεργό επίπεδο β-κατενίνης παρατηρήθηκε σε p120ctn και β-κατενίνης διπλή κύτταρα εξαντλούνται, παρά την φαινομενική επιστροφή τους p120ctn-3A (SI-p120 + 3A + si-β-γάτα). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε πειράματα που διεξάγονται σε κύτταρα SPC (Σχήμα 5). Δύο ενδιαφέροντα ευρήματα παρατηρήθηκαν στη μελέτη μας. 1). Η επίδραση της p120ctn-1A για την έκφραση της κυκλίνης D1 φάνηκε να είναι πιο σημαντικό από ό, τι εκείνη των p120ctn-3Α, δεδομένου ότι η έκφραση της κυκλίνης D1 προκαλείται από την αποκατάσταση της p120ctn-3A ήταν πάντα χαμηλότερη από εκείνη που προκαλείται από την επιστροφή των p120ctn-1A ή ακόμη χαμηλότερα από μη επεξεργασμένα κύτταρα? 2). Η αποκατάσταση της κυκλίνης D1 προκαλείται από την επιστροφή του p120ctn-3A στα κύτταρα εξαντλούνται τόσο p120ctn και β-κατενίνης (SI-p120ctn + 3A + si-β-cat) φάνηκε να είναι ατελής σε σύγκριση με τα κύτταρα εξαντλούνται από p120ctn μόνο ( si-p120 + 3Α). Η διαφορά μεταξύ αυτών των δύο ομάδων θα μπορούσε να εξηγηθεί από την ενδογενή β-κατενίνης στην τελευταία, η οποία καταστέλλεται συνεργικά με siRNA-β-κατενίνης στην πρώην.

Η έκφραση της ενεργού β-κατενίνης και κυκλίνη D1 ήταν σημαντικά μειωμένη σε κύτταρα Α549 (β-κατενίνης, +

σ

& lt? 0.001, ++

σ

& lt? 0.001, κυκλίνη D1, +

σ

= 0.003, + +

σ

= 0,004) κατά της β-κατενίνης ή p120ctn είχε παρέμβει (si-β-γάτα ή si-p120). Η έκφραση της ενεργού β-κατενίνης (*

σ

= 0,001) και η κυκλίνη D1 (*

ρ

& lt? 0.001) ανέκαμψε όταν η έκφραση p120ctn-1Α ανασυστάθηκε με επιμόλυνση p120ctn-1A cDNA ( si-p120 + 1Α). Συν-επιμόλυνση των p120ctn-1Α και το siRNA που στοχεύει β-κατενίνης (SI-p120 + 1A + si-β-γάτα) δεν έδειξε καμία αλλαγή της κυκλίνης D1 (

Δ

σ

= 0,248) έκφρασης, υποδηλώνοντας ότι p120ctn-1A up-ρυθμίζει κυκλίνη D1 μέσω β-κατενίνης. Αποκατάσταση p120ctn-3A (SI-p120 + 3Α) δεν αύξησε την έκφραση της ενεργού συμμετοχής της β-κατενίνης (**

σ

= 0,891), αλλά θα μπορούσε να εξακολουθούν να αποκαταστήσει την έκφραση της κυκλίνης D1 (**

p

= 0,001), υπονοώντας ότι p120ctn-3-up ρυθμίζει την έκφραση της κυκλίνης D1 ανεξάρτητη από β-κατενίνης. Η συν-επιμόλυνση του p120ctn-3A και τα siRNAs που στοχεύουν p120ctn /β-κατενίνης (SI-ρ120 + 3A + si-β-cat) θα μπορούσε να αυξήσει σημαντικά την έκφραση D1 κυκλίνης σε Α549 κυτταρική γραμμή σε σύγκριση με την ομάδα του p120ctn /β-κατενίνης siRNA επιμόλυνση μόνο (si-p120 + si-β-γάτα,

ΔΔ

σ

& lt? 0.01), ενώ, συν-επιμόλυνση των p120ctn-3Α φαίνεται να έχει καμία επίδραση στα επίπεδα των ενεργών β κατενίνης. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε κύτταρα SPC. Σημειώστε, αν και η έκφραση της κυκλίνης D1 αποκαθίσταται με την επιστροφή του είτε p120ctn 1Α ή p120ctn 3Α, η επίδραση διάσωσης είναι πιο σημαντικό από p120ctn 1Α παρά από p120ctn 3Α. Η διαφορά μεταξύ της ομάδας σι-ρ120 + 3Α και την ομάδα si-ρ120 + 3A + si-β-γάτα μπορεί να εξηγηθεί από την επίδραση της υπολειμματικής ενδογενούς β-κατενίνης στην πρώτη. Αυτή η επίδραση των υπολειμματικών ενδογενούς β-κατενίνης μπορεί επίσης να φανεί από τη διαφορά μεταξύ si-ρ120 και ρ120-si + σι-β-cat σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές. Μία συνεργιστική δράση με αποτέλεσμα το επιπλέον μείωση τόσο β-κατενίνης και κυκλίνης D1 μπορεί να δει κανείς στην τελευταία ομάδα.

Η

β-κατενίνης παρατηρήθηκε διανομή σε Α549 και SPC κύτταρα τόσο πυρήνα και του κυτταροπλάσματος υπό συνεστιακή μικροσκόπιο λέιζερ. σήμα του έγιναν σημαντικά ασθενέστερη σε αντίστοιχες υποκυτταρική ζώνες όταν p120ctn είχε εξαντληθεί. Η υπερέκφραση του p120ctn-1A οδήγησε σε ένα ισχυρότερο σήμα β-κατενίνης. Σε αντίθεση, p120ctn-3A δεν έχει αισθητή επίδραση στην έκφραση της β-κατενίνης (Σχήμα S6).

Για να ελέγξετε περαιτέρω τη λειτουργία αυτών των δύο ισομορφών, επιμολύναμε δύο μεταλλάξεις διαγραφής του p120ctn-1, Μ1 και Μ2 , στο p120ctn εξαντλημένο κύτταρο Α549 (Εικόνα 6). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι Μ1 θα μπορούσε να ρυθμίζουν β-κατενίνης, αλλά δεν μπορούσε M2, υπονοώντας ότι τα υπολείμματα Ν-56-101 αμινοξέων του p120ctn-1 είναι απαραίτητα για μέχρι ρύθμισης β-κατενίνης. Ως εκ τούτου, μπορεί να οφείλεται σε διαγραφή του Ν-56-101 υπολειμμάτων αμινοξέων για p120ctn-3 να αποτύχει να ρυθμίζει το επίπεδο της πρωτεΐνης β-κατενίνης.

Δύο μεταλλάγματα διαγραφής του p120ctn-1, Μ1 και Μ2 επιμολύνθηκαν σε p120ctn εξαντλημένα κύτταρα Α549. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι Μ1 θα μπορούσε να ρυθμίζουν β-κατενίνης (***

ρ

& lt? 0.001), ενώ Μ2 δεν μπορούσε (****

σ

= 0,175). M1 θα μπορούσε να ρυθμίζουν την έκφραση της κυκλίνης D1 (***

σ

& lt? 0.001), αλλά M2 δεν θα μπορούσε (****

σ

= 0,906). Ως εκ τούτου, μπορεί να οφείλεται σε διαγραφή των υπολειμμάτων Ν-56-101 αμινοξέων για p120ctn-3 να αποτύχει να ρυθμίσει β-κατενίνης. Όλες οι συγκρίσεις γίνονται στην ομάδα των κυττάρων συν-επιμολυσμένα μόνο με φορέα.

Η

p120ctn ισομορφή 3 θα μπορούσε να αυξάνει την έκφραση της κυκλίνης D1 με τη ρύθμιση της πυρηνικής /κυτταροπλασματικής μεταφοράς του Kaiso

Για να δοκιμαστεί εάν Kaiso έχει ένα ρόλο στην ρύθμιση της έκφρασης της κυκλίνης D1, εμείς παροδικά επιμολυσμένα Kaiso σε κύτταρα Α549, τα οποία εκφράζουν μόνο μια μικρή ποσότητα Kaiso. Kaiso υπερέκφραση οδήγησε σε μειωμένη κυκλίνη D1 και την έκφραση της κυκλίνης Ε (Σχήμα 7Α και Σχήμα S7A). Αντίστοιχα, όταν Kaiso χτυπήθηκε κάτω από siRNA, υπήρχε ενισχυμένη κυκλίνη D1 και την έκφραση της κυκλίνης Ε στα κύτταρα SPC, τα οποία εκφράζουν σχετικά υψηλά επίπεδα Kaiso (Σχήμα 7Β και το Σχήμα S7B).

αναλύσεις Western blot (Α) δείχνουν την αυξημένη έκφραση Kaiso σε κύτταρα Α549 επιμολύνονται με Kaiso cDNA. Kaiso υπερέκφραση αξιοσημείωτα κάτω-ρυθμίζεται η έκφραση της κυκλίνης D1 (p = 0,000) και η κυκλίνη Ε (ρ = 0.003). (Β) κηλίδας Western αναλύσεις δείχνουν μειωμένη έκφραση των Kaiso στα κύτταρα SPC επιμολυσμένα με Kaiso siRNA. Kaiso παρεμβολή αύξησε σημαντικά την έκφραση της κυκλίνης D1 (p = 0,001) και η κυκλίνη Ε (ρ = 0.012). Συνολικά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι Kaiso μπορεί να ρυθμίζει την έκφραση της κυκλίνης D1 και κυκλίνη Ε (C) χρωματίνης ανοσοκαταβύθιση (μάρκας) δοκιμασία επιβεβαίωσε το μονοκλωνικό αντίσωμα Kaiso θα μπορούσε να επιταχύνει το θραύσμα υποκινητή γονιδίου της κυκλίνης D1 που περιέχει KBS. Kaiso θα μπορούσε να συνδεθεί με KBS του υποκινητή κυκλίνης D1. Όλες οι συγκρίσεις γίνονται με την ομάδα κυττάρων επιμολυσμένων μόνο με φορέα

Η

Χρησιμοποιώντας BLAST για να βρει την αλληλουχία κυκλίνης D1 υποκινητή. (GenBank: AY439218.1), εντοπίσαμε τη συγκεκριμένη αλληλουχία δέσμευσης Kaiso (KBS , TCCTGCNA), η οποία βρίσκεται στην περιοχή των -1059 bp σε -1066 bp. Η δοκιμασία τσιπ συνέχεια διεξήχθη και έδειξε ότι Kaiso συνδέθηκε με KBS στον υποκινητή κυκλίνης D1 και στις δύο Α549 και SPC κύτταρα (Σχήμα 7C).

συνανοσοκαθίζησης διεξήχθη ακόλουθες κυτταρικές κλασματοποίηση. Οι δοκιμασίες αποκάλυψαν ότι η p120ctn μονοκλωνικό αντίσωμα θα μπορούσε να επιταχύνει αποτελεσματικά Kaiso πρωτεΐνη τόσο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα, ενώ το ειδικό p120ctn-1, 2 μονοκλωνικά αντισώματα (6H11) δεν θα μπορούσε να το κάνει (Σχήμα 8Α και Β). Όταν επαναλάβαμε τη συν-ανοσοκατακρήμνιση μετά υπερέκφραση ισομορφών p120ctn 1 και 3, αντίστοιχα, δείχθηκε ότι η υπερέκφραση του p120ctn-3A οδήγησε σε περισσότερες Kaiso πρωτεΐνη καταβυθίστηκε από το μονοκλωνικό αντίσωμα p120ctn, αλλά δεν υπήρξε καμία αλλαγή μετά την υπερέκφραση του p120ctn-1A σε σύγκριση με το μάρτυρα. Όταν χρησιμοποιήθηκαν η ειδική p120ctn-1, 2 μονοκλωνικά αντισώματα (6H11), Kaiso μπορούσε ακόμη να μην καθιζάνει μετά p120ctn-1Α αυξήθηκε σημαντικά (Εικόνα 8C). Δεδομένου ότι υπάρχουν κυρίως p120ctn ισομορφή 1 και 3 και στις δύο καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικές σειρές, πιστεύαμε ότι Kaiso μπορεί να δεσμεύονται να p120ctn ισομορφή 3, αλλά όχι να p120ctn ισομορφή 1 in vivo δεδομένων των πιο πάνω αποτελέσματα.

(Α και προσδιορισμούς Β) Συν-ανοσοκατακρήμνιση έδειξε ότι p120ctn μονοκλωνικό αντίσωμα (το κάτω πάνελ αριστερής στήλης στο Σχήμα 8Α), αλλά όχι συγκεκριμένη p120ctn-1,2 μονοκλωνικό αντίσωμα (6H11) (το κάτω πάνελ δεξιά στήλη στο Σχήμα 8Α), μπορεί να καθιζάνει αποτελεσματικά Kaiso πρωτεΐνη τόσο στον πυρήνα και στο κυτταρόπλασμα (Σχήμα 8Β). Ωστόσο, το μονοκλωνικό αντίσωμα Kaiso δεν μπορεί να επιταχύνει αποτελεσματικά p120ctn (το πάνω πάνελ μεσαία στήλη στο σχήμα 8Α). (C) Συν-ανοσοκατακρήμνιση με επαρκή p120ctn mAb μετά υπερέκφραση p120ctn-1 ή 3 ισομορφή έδειξε ότι η υπερέκφραση του p120ctn-3 οδήγησε σε περισσότερες Kaiso πρωτεΐνη καταβυθίστηκε σε κύτταρα Α549. Καμία αλλαγή δεν ανιχνεύθηκε όταν p120ctn ισομορφή 1 υπερεκφράζεται σε σύγκριση με τον έλεγχο. Ειδικά p120ctn-1, 2 μονοκλωνικά αντισώματα (6H11) δεν θα μπορούσε να επιταχύνει Kaiso όταν p120ctn ισομορφή 1 αυξήθηκε σημαντικά. Σημειώστε την παρουσία του p120ctn μετά συγκαταβύθιση με 6H11 αλλά απουσία Kaiso στο ίζημα, γεγονός που υποδηλώνει δεν υπάρχει σημαντική αλληλεπίδραση μεταξύ ρ120 ισομορφή 1, 2 και Kaiso. Δεδομένου ότι υπάρχουν κυρίως p120ctn ισομορφών 1 και 3 και στις δύο καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικές σειρές, πιστεύαμε ότι Kaiso μπορεί να δεσμεύονται να p120ctn ισομορφή 3, αλλά να μην p120ctn ισομορφή 1 σε βιολογικό περιβάλλον.

Η

Kaiso κυρίως εντοπισμένη στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων SPC, τα οποία εκφράζουν σχετικά υψηλά επίπεδα p120ctn. Αντίθετα, σχεδόν όλοι οι πρωτεΐνες Kaiso είναι παρούσες με πυρηνικά διανομής σε κύτταρα SPC-Κ2, οι οποίες έχουν p120ctn εξαντληθεί. Διαφορετικά αποτελέσματα των δύο p120ctn ισομορφών σε Kaiso υποκυτταρικό εντοπισμό εξετάστηκαν μετά από την επιστροφή των δύο ισομορφών αντίστοιχα κύτταρα SPC-K2. Αποκατάσταση p120ctn ισομορφής 3 με επιμόλυνση p120ctn-3Α προκαλείται από κυτταροπλασματική κατανομή Kaiso του, ενώ Kaiso παρέμεινε ουσιαστικά στους πυρήνες των κυττάρων SPC-K2 όταν p120ctn ισομορφή 1 αποκαταστάθηκε με επιμόλυνση p120ctn-1A (Σχήμα S8A). Ομοίως, Kaiso ήταν κυρίως εντοπισμένη στους πυρήνες των κυττάρων Α549, τα οποία εκφράζουν μόνο μια μικρή ποσότητα p120ctn. Η υπερέκφραση του p120ctn-1A δεν μετέβαλε σημαντικά την κατανομή των Kaiso, ενώ η υπερέκφραση του p120ctn-3A είχε ως αποτέλεσμα Kaiso εξαγωγή από τον πυρήνα (Σχήμα S8B). Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι ένα υψηλό επίπεδο p120ctn-3Α μπορεί να είναι σε θέση να προωθήσει την πυρηνική εξαγωγή Kaiso, αλλά p120ctn-1A δεν φαίνεται να έχουν αυτή τη λειτουργία.

Επιπλέον, όταν τα κύτταρα Α549 επιμολυσμένα με p120ctn-3A επωάστηκαν με LMB να μπλοκάρει την πυρηνική εξαγωγή του p120ctn ισομορφής 3, Kaiso σημειώθηκε να περιορίζεται στον πυρήνα μαζί με p120ctn ισομορφή 3. Αντιστοίχως, η υπερέκφραση του p120ctn-3A με επιμόλυνση NLS-p120ctn-3Α, ένα p120ctn-3A πυρηνικών στόχος πλασμίδιο εντοπισμό, σε κύτταρα SPC-Κ2 είχε ως αποτέλεσμα την κατανομή των Kaiso κυρίως στον πυρήνα (Σχήμα S8B).

Εμείς επιβεβαίωσε περαιτέρω την κυτταροπλασματική και πυρηνική διανομή των p120ctn και Kaiso με κηλίδωση Western μετά την κυτταρική κλασματοποίηση (Σχήμα 9Α ). Τα αποτελέσματα ήταν σύμφωνα με αυτά που παρατηρήθηκαν στα πειράματα ανοσοφθορισμού που περιγράφονται παραπάνω.

(Α) Επιμόλυνση των p120ctn-3Α σε κύτταρα Α549 αυξήθηκε σημαντικά Kaiso στο κυτταρόπλασμα (CYTO, *, ρ = 0.000) και μειωμένη Kaiso σε ο πυρήνας (NE, *, p = 0.000). Ωστόσο, καμία σημαντική διαφορά του υποκυτταρικού εντοπισμού του Kaiso βρέθηκε μεταξύ κυττάρων υπερέκφραση p120ctn-1A και κύτταρα ελέγχου (CYTO, **, ρ = 0.135, ΒΑ, **, ρ = 0.774). Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι ένα υψηλό επίπεδο p120ctn-3Α μπορεί να είναι σε θέση να προωθήσει την πυρηνική εξαγωγή Kaiso, αλλά p120ctn-1A δεν φαίνεται να έχουν αυτή τη λειτουργία. Επώαση κυττάρων επιμολυσμένα με p120ctn-3A με LMB ή επιμόλυνση NLS-p120ctn-3Α σε κύτταρα Α549 αυξήθηκε πυρηνικής p120ctn-3A (*, ρ = 0.000, ή +, ρ = 0.000) και της πυρηνικής Kaiso (ΝΕ, +, p = 0,000 ή ++, ρ & lt? 0.001), αλλά μειωμένη κυτταροπλασματική Kaiso (CYTO, +, p = 0,000 ή ++, ρ = 0,002) σε σύγκριση με τα κύτταρα με μόνο υπερεκφράζεται p120ctn-3Α, υπονοώντας ότι η πυρηνική εξαγωγή του Kaiso είναι πιθανό να είναι p120ctn-3-εξαρτώμενη. (Β) p120ctn-1A υπερέκφραση δεν άλλαξε η δέσμευση του Kaiso να KBS στον υποκινητή της κυκλίνης D1, ενώ p120ctn-3A υπερέκφραση μείωσε σημαντικά τη σύνδεση του Kaiso να KBS στον υποκινητή της κυκλίνης D1.

Η

μερικά ενδιαφέροντα αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε μετέπειτα δοκιμασίες chip. Η υπερέκφραση του p120ctn-3Α μείωσε σημαντικά τη σύνδεση του Kaiso να KBS, ενώ η υπερέκφραση του p120ctn-1A δεν άλλαξε τη σύνδεση (Σχήμα 9Β).

Εν κατακλείδι, οι παραπάνω ευρήματα υποδεικνύουν ότι p120ctn-3A πιθανό ανάντη ρυθμίζουν την κυκλίνη D1, διευκολύνοντας την πυρηνική εξαγωγή Kaiso, και ως εκ τούτου, καταργώντας την αρνητική επίδραση της Kaiso στη γονιδιακή έκφραση D1 κυκλίνης.

Συζήτηση

Δείξαμε ότι η εξάντληση των p120ctn στο Α549 και SPC κύτταρα, τα οποία δεν δείχνουν μεμβρανώδη εντοπισμός p120ctn, οδήγησε σε αυξημένη κύτταρα σε φάση G1 και μειωμένη κυττάρων σε φάση S καθώς και μειωμένη πολλαπλασιασμού των κυττάρων, υποδεικνύοντας p120ctn μπορεί να επηρεάσει την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Επειδή παρατηρήθηκε μειωμένη έκφραση της κυκλίνης D1 και κυκλίνη Ε στα p120ctn εξαντλημένα κύτταρα, θεωρήθηκε ότι p120ctn μπορούσε ρυθμίζουν την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, μεταβάλλοντας την έκφραση της κυκλίνης D1 και κυκλίνη Ε, τα ουσιώδη διαμορφωτές της G0 /G1-S σημείο ελέγχου [13]. Νικόλας T. et al. ανέφεραν ότι p120ctn ισομορφή 3 θα μπορούσαν να επηρεάσουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του κυτταρικού κύκλου και σταθεροποιώντας κυκλίνη Ε [4]. Σε αντίθεση, τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ένα διαφορετικό μηχανισμό από το γεγονός ότι η αυξημένη έκφραση της κυκλίνης Ε αντιστοιχούσε σε πάνω ρύθμιση της κυκλίνης D1 στα κύτταρα εξαντλούνται από p120ctn αλλά γεμάτος είτε p120ctn-1A ή 3Α. Επιπλέον, όταν χτύπησε κάτω κυκλίνη D1 από siRNA στα κύτταρα εξαντλούνται από p120ctn, η έκφραση της κυκλίνης Ε δεν αυξήθηκαν αλλά μειώθηκαν ελαφρώς, αν και p120ctn ισομορφή 1 ή 3 προφανώς αποκαταστάθηκε με συν-επιμόλυνση του είτε DNA πλασμιδίου ισομορφή. Ένα παρόμοιο φαινόμενο παρατηρήθηκε όταν κυκλίνη D1 μπλοκαρίστηκε από το μονοκλωνικό αντίσωμα επώασης (100 ng /ml, 48 ώρες) σε p120ctn ανασυσταθεί κύτταρα, υποδηλώνοντας έναν κεντρικό ρόλο της κυκλίνης D1 σε ρύθμιση της έκφρασης κυκλίνης Ε είτε p120ctn ισομορφή 1 ή ισομορφή 3. Επιπλέον , όταν η μετάφραση της κυκλίνης D1 mRNA σε Α549 διακόπηκε από siRNA, και οι δύο τα επίπεδα μεταγραφής και πρωτεΐνες της κυκλίνης Ε ήταν αντίστοιχα ρυθμισμένα προς τα κάτω, γεγονός που υποδηλώνει p120ctn ενδέχεται όχι μόνο να σταθεροποιήσει E πρωτεΐνη κυκλίνης όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, αλλά επίσης να προάγει την μεταγραφή της κυκλίνης Ε, προφανώς μέσω μια ενισχυμένη έκφραση της κυκλίνης D1.

τα στοιχεία στην παρούσα μελέτη έδειξε τόσο p120ctn ισομορφή 1 και 3 θα μπορούσαν να ρυθμίζουν την έκφραση της κυκλίνης D1, αν και δεν έχει πλήρως διαλευκανθεί το πώς οι διάφορες ισομορφές p120ctn, ιδιαίτερα ισομορφή 3 , την επίτευξη αυτής της λειτουργίας. Η μελέτη μας έδειξε ότι p120ctn ισομορφή 1 θα μπορούσε πλειορύθμιση της έκφρασης του β-κατενίνης, ειδικά η αύξηση της ενεργού μορφής της β-κατενίνης, ενώ ισομορφή 3 θα μπορούσε να αλληλεπιδράσει με Kaiso. Αν και p120ctn ισομορφή 1 υπερεκφράζεται σε κύτταρα Α549 επιμολύνονται με p120ctn-1A, ο /Kaiso σύμπλοκο p120ctn-1 παρέμεινε απαρατήρητα, υπονοώντας ένα χαμηλό επίπεδο p120ctn ισομορφής 1 σε Α549 δεν είναι η αιτία αυτής της μη ανιχνεύσιμο συμπλόκου πρωτεΐνης. Με αυτόν τον τρόπο, τα ερωτήματα που τίθενται ως προς το γιατί ισομορφή 1 δεν θα μπορούσαν να αλληλεπιδράσουν με Kaiso και γιατί ισομορφή 3 δεν θα μπορούσε να ρυθμίζουν β-κατενίνης. Υποθέσαμε ότι η λειτουργική διαφορά θα μπορούσε να οφείλεται στις δομικές παραλλαγές αυτών των δύο ισομορφών στο Ν-άκρο. Το ανθρώπινο γονίδιο CTNND1 αποτελείται από 21 εξώνια και κωδικοποιεί δυνητικά έως 48 ισομορφές της πρωτεΐνης λόγω των πολλαπλών εναλλακτικών εκδηλώσεων δια- και ενδο-εξονική μάτισμα [14]. Ανθρώπινα ισομορφές, που ορίζονται με 1 έως 4, διαφέρουν μεταξύ τους στο κωδικόνιο έναρξης που χρησιμοποιείται. Αρκετές περιοχές έχουν ταυτοποιηθεί σε p120ctn, συμπεριλαμβανομένου του περιελιγμένου τομέα σπείρας βρεθεί μόνο στο ισομορφή 1. Στην πραγματικότητα, p120ctn ισομορφή 1 είναι μεγαλύτερη από p120ctn ισομορφή 3 από τα υπολείμματα 101 αμινοξέων στο Ν-άκρο [14] – [15]. Προκειμένου να δοθεί απάντηση στα δύο ερωτήματα που δόθηκαν παραπάνω, κατασκευάσαμε δύο μεταλλάξεις του p120ctn ισομορφή 1 με περικομμένο αλληλουχίες πεπτιδίων στο Ν-τελικό άκρο (Μ1, Μ2).

Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι, πρώτον, η διαγραφή του Ν-τερματική 56-101 (Ν-56-101) υπολειμμάτων αμινοξέων σε p120ctn ισομορφή 3 θα μπορούσαν πιθανώς να εξηγήσουν την έλλειψη της ρυθμιστική επίδραση επί β-κατενίνης, ενώ p120ctn ισομορφή 1, το οποίο έχει ένα άθικτο Ν-τερματικό τομέα, παρουσίασαν θετική ρυθμιστική επίδραση (Σχήμα 6)? Δεύτερον, η ύπαρξη του Ν-1-55 υπολείμματα αμινοξέων, τα οποία σχηματίζουν μία συσπειρωμένη σπείρα τομέα, σε p120ctn ισομορφή 1 μπορεί δεσπόζει το αποτρέψει από δέσμευση σε Kaiso (Σχήμα S9), αν και τα υπολείμματα Ν-56-101 αμινοξέων μπορούν να παίξουν ένα δευτερεύοντα ρόλο στην αλληλεπίδρασή τους.

στην παρούσα μελέτη, έδειξε μια αυξημένη ενεργή μορφή της β-κατενίνης χωρίς αλλαγή στο επίπεδο της μεταγραφής στα κύτταρα με υπερέκφραση του p120ctn ισομορφής 1Α. Το εύρημα αυτό συμφωνεί με αυτό που έχει περιγραφεί προηγουμένως στη βιβλιογραφία. Έχει αναφερθεί ότι σε συνθήκες νίνο, p120ctn ισομορφή 1 άμεσα ή έμμεσα αλληλεπιδρά με μερικά από τα βασικά πρωτεΐνες που είναι γνωστό ότι ρυθμίζουν σταθερότητα β-κατενίνης, όπως Axin και GSK-3, επιπλέον, που μοιράζεται με β-κατενίνης ίδιων ρυθμιστικών μηχανισμών της μεταβολικής σταθερότητας [16]. Η υπερέκφραση του p120ctn ισομορφής 1 μπορεί να καταλαμβάνει περισσότερες θέσεις δέσμευσης για την καταστροφή συμπλέγματα που περιέχουν Axin και GSK-3β και, ως εκ τούτου, να προκαλέσει μειωμένη αποικοδόμηση της β-κατενίνης με την αντικατάστασή της από την καταστροφή συμπλέγματα. Οι θέσεις σύνδεσης του p120ctn με GSK-3β και CK1α βρίσκεται στο Ν-τερματικό πεδίο του p120ctn, και, ως εκ τούτου, η πρωτεΐνη p120ctn ισομορφή 1, που έχει τον πλήρη Ν-τελική περιοχή, να υποβληθεί σε ρύθμιση από την destruction- σύμπλοκο [16]. Τα ευρήματα σε αυτή τη μελέτη υποδηλώνουν ότι η πιο συγκεκριμένη περιοχή, ακριβώς τα κατάλοιπα Ν-56-101 αμινοξέων, μπορεί να εμπλέκεται στην αποικοδόμηση της ισομορφής p120ctn 1. Επιπλέον, p120ctn-1 M1 κατασκευάστηκαν σε αυτήν την μελέτη είναι δομικά το ίδιο όπως p120ctn ισομορφή 2 και επίσης έδειξε τα πάνω ρύθμιση β-κατενίνης (Σχήμα 6), υποδηλώνοντας ότι η p120ctn ισομορφή 2 θα μπορούσε επίσης να συνδυάσει με GSK-3β και CK1α και να ρυθμίζονται από την καταστροφή συμπλέγματος.

Ο περιελιγμένος τομέα σπείρας