Αφηρημένο

βιοδείκτες του καρκίνου διευκολύνει την προβολή και την έγκαιρη ανίχνευση, αλλά είναι γνωστό για λίγα μόνο είδη καρκίνου. Έχουμε αποδείξει την αρχή της επαγωγής όγκων να εκκρίνουν ένα βιοδείκτη ορού χρησιμοποιώντας έναν χορηγούνται συστηματικά φορέα απελευθέρωσης γονιδίου που στοχεύει όγκους για την επιλεκτική έκφραση ενός γενετικά κασέτας. Εμείς αξιοποιηθεί αναδιπλασιασμό όγκο επιλεκτική ενός υπό όρους αντιγραφικών ιός του απλού έρπητα (HSV) σε συνδυασμό με μια καθυστερημένη ιικό υποκινητή αντιγραφής εξαρτώμενη για την επίτευξη του όγκου-εκλεκτική έκφραση βιοδείκτη ως φορέας απελευθέρωσης γονιδίου παράδειγμα. Η αντιγραφή του ιού, κυτταροτοξικότητα και βιοδεικτών παραγωγής ήταν χαμηλές σε ηρεμία φυσιολογικά ανθρώπινα κερατινοκύτταρα ακροποσθίας και υψηλή σε καρκινικά κύτταρα

in vitro

. Μετά από ενδοφλέβια ένεση του ιού & gt? 90% των ποντικών που φέρουν όγκο εμφάνισαν υψηλότερα επίπεδα βιοδεικτών από τα ποντίκια που δεν φέρουν όγκο και κατά την νεκροψία, ανιχνεύσαμε ιός αποκλειστικά σε όγκους. Η στρατηγική μας αναγκάζει όγκων να εκκρίνουν ένα βιοδείκτη ορό θα μπορούσαν να είναι χρήσιμα για τον έλεγχο του καρκίνου σε ασθενείς υψηλού κινδύνου, και, ενδεχομένως, για την παρακολούθηση της ανταπόκρισης στη θεραπεία. Επιπλέον, επειδή ογκολυτικοί φορείς για ειδικές όγκου απελευθέρωσης γονιδίου είναι κυτταροτοξικά, μπορούν να συμπληρώσουν στρατηγική διαλογής μας ως «theragnostic» παράγοντα. Η προσέγγιση προσυμπτωματικό έλεγχο του καρκίνου που παρουσιάζονται σε αυτό το έργο εισάγει μια παραδειγματική στροφή στη χρησιμότητα της παράδοσης γονιδίου το οποίο εμείς προβλέπουμε να βελτιωθεί με εναλλακτικές φορείς με στόχο την παράδοση γονιδίων και της έκφρασης σε όγκους. Τελειοποίηση αυτής της προσέγγισης θα εγκαινιάσει μια νέα εποχή για την κλινική προσυμπτωματικό έλεγχο του καρκίνου που μπορούν να εφαρμοστούν στον ανεπτυγμένο και υπανάπτυκτη κόσμο

Παράθεση:. Browne AW, Leddon JL, Currier MA, Williams JP, Frischer JS, Collins MH, et al. (2011) Cancer Screening με συστηματική χορήγηση μιας γονιδιακής έκφρασης Παράδοση Vector Κωδικοποίηση Όγκων-Selective εκκρίσιμο βιοδεικτών. PLoS ONE 6 (5): e19530. doi: 10.1371 /journal.pone.0019530

Επιμέλεια: Syed A. Αζίζ, Health Canada, Καναδάς

Ελήφθη: 1, Μαρτίου 2011? Αποδεκτές: 31 Μάρτη, 2011? Δημοσιεύθηκε: May 11, 2011

Copyright: © 2011 Browne et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από την CancerFree παιδιά Παιδιατρική Cancer Research Alliance (AWB) και το βραβείο ΝΙΗ 1R01-CA114001-01A2 (TPC). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η έγκαιρη ανίχνευση του καρκίνου είναι ζωτικής σημασίας για να βελτιώσει τα ποσοστά ίασης, επειδή το στάδιο καρκίνου προβλέπει πρόγνωση. έχουν καρκίνο που σχετίζεται με βιοδείκτες αίματος έχουν εντοπιστεί σε μερικές καρκίνους όπως ειδικό προστατικό αντιγόνο (PSA) στον καρκίνο του προστάτη και άλφα εμβρυοπρωτεΐνη σε ορισμένες μορφές καρκίνου του ήπατος και βλαστικής σειράς. Βιοδείκτες δεν έχουν εντοπιστεί για τους περισσότερους καρκίνους παιδιατρική και πολλά ενήλικα καρκίνους. Νέες καινοτομίες στη συστηματική μεταφορά γονιδίων αυξήσει την προοπτική της επιλεκτικής παράδοσης και ενεργοποίηση γονιδίων που κωδικοποιούν εύκολα ανιχνεύσιμη βιοδείκτες στα καρκινικά κύτταρα που δεν παράγουν γνωστό βιοδείκτες ορό. Επιδιώξαμε να αναπτύξει μια στρατηγική πρωτότυπο προσυμπτωματικό έλεγχο του καρκίνου σύμφωνα με την οποία η γενετική πληροφορία που κωδικοποιεί μια καθολική βιοδείκτη ορού για τον καρκίνο θα εγχυθεί σε έναν ασθενή συστημικά, παραδίδονται και εκφράζονται εντός των κυττάρων όγκου σε ένα όγκο-επιλεκτικό τρόπο. Οι όγκοι θα αναγκάζονταν αποτελεσματικά για να εκκρίνουν ένα βιοδείκτη ορού, η οποία θα μπορούσε στη συνέχεια να μετρηθεί στο αίμα ή στα ούρα ως διαγνωστική εξέταση, ενώ οι ασθενείς χωρίς όγκο θα έδειχνε καθόλου ή μόνο χαμηλά επίπεδα βιοδεικτών μετά από συστηματική χορήγηση του φορέα απελευθέρωσης γονιδίου (Σχ. 1α)

(α) Βήματα για τη στρατηγική προσυμπτωματικό έλεγχο του καρκίνου έχουν ως εξής:. 1) Καρκίνος στόχευση ιό του απλού έρπητα (HSV) εγχέεται συστηματικά. 2) Μηχανική HSV αντιγράφεται εκλεκτικά σε όγκους, ενώ αποψιλώνονται από υγιείς μη-καρκινικούς ιστούς. 3) βιοδεικτών επιλεκτικά παράγεται σε όγκους. 4) Τα δείγματα αίματος συλλέγονται και αναλύονται για επίπεδα βιοδεικτών. 5) Τα επίπεδα ορού του εξωγενώς παραδίδεται βιοδείκτη είναι υψηλότερα σε ποντίκια που φέρουν όγκο από υγιή ποντίκια χωρίς όγκο. (Β) τους χάρτες Gene για άγριου τύπου HSV και νέα ανασυνδυασμένη RQ-M38G.

Η

εξωγενώς χορηγούμενο γονίδιο-κωδικοποιημένα βιοδείκτες απαιτούν όγκο στοχευμένη παράδοση ή /και την έκφραση του γονιδίου. Στόχευση μικρά μόρια και τα σωματίδια σε όγκους μπορεί να επιτευχθεί με παθητική ενισχυμένη διαπερατότητα και συγκράτησης (EPR) [1], [2], [3], συνδέτη-καθοδηγούμενη ενεργός στόχευση [4], [5], [6], [7 ], στο μικροπεριβάλλον του όγκου που εξαρτάται από τη στόχευση [8], [9], [10], ή ένας συνδυασμός κάθε [11]. Οι ιοί είναι φυσικώς απαντώμενα νανοσωματίδια βελτιστοποιηθεί για να παραδώσει γενετικών πληροφοριών σε κύτταρα-στόχους. Το κύριο πλεονέκτημα των ιών έναντι των μη ιικών φορέων για παράδοση DNA είναι εγγενής προτίμηση τους για αντιγραφή σε όγκους και η συνακόλουθη ενίσχυση του σήματος.

Ο ιός του απλού έρπητα (HSV) τύπου 1 είναι ένας φορέας παράδοσης μοντέλο γονίδιο επειδή μπορεί να μολύνει ένα ευρύ φάσμα τύπων ανθρωπίνων κυττάρων, μεταγωγή και τις δύο διαχωριστικές και αδρανή κύτταρα αποτελεσματικά, να κατασκευαστεί για να εκφράζουν προϊόντα διαγονιδίων, αποδέχονται διαγονίδια οδηγείται από ετερόλογη ή ομόλογη υποκινητές, είναι Γενετικής, έχει κλιμακούμενη παραγωγή, και μπορεί με ασφάλεια να ελεγχθεί με αντι-ιικά φάρμακα [ ,,,0],12]. Επιλεκτική μεταλλάξεις στα γονίδια HSV προσδίδουν την αντιγραφή του ιού του καρκίνου εκλεκτικές. Μετάλλαξη στα γονίδια που κωδικοποιούν HSV την ριβονουκλεοτιδική αναγωγάση μεγάλη υπομονάδα (ICP6 /U

L39) και την καθυστερημένη ιική πρωτεΐνη ICP34.5 (γ

134,5) περιορίζει στιβαρή την αντιγραφή του ιού σε όγκους [13], [14], [ ,,,0],15], [16] και έχουν αποδειχθεί ότι είναι ασφαλή σε κλινικές δοκιμές. Η ενεργοποίηση της αυστηρής αργά ιικό U

L38 γονίδιο εξαρτάται από προηγούμενες διαδοχική ενεργοποίηση της άμεσης και πρώιμα ιικά γονίδια και κυτταρικών παραγόντων μεταγραφής [17] και το U

υποκινητή L38 (U

L38p) έχει αποδειχθεί να ενεργοποιείται επιλεκτικά σε καρκινικά κύτταρα στο πλαίσιο της αρμόδιας γ αντιγραφής

134.5

– /- HSV μεταλλάγματα [18]. Η εξάρτηση της έκφρασης των όψιμων γονιδίων κατά την ενεργοποίηση από πρώιμα γονίδια καθιστά U

L38p ένα ισχυρό υποψήφιο για την παράδοση των διαγονιδίων σε κύτταρα καρκίνου με επιλεκτική έκφραση στο πλαίσιο ενός διπλού μεταλλαγμένου HSV λείπει ICP6 και γ

134,5.

Έχουμε αναπτύξει ένα HSV ως υπόδειγμα φορέα διανομής γονιδίων για την επαγωγή της έκκρισης βιοδείκτη επιλεκτικά από όγκους. Άλλοι έχουν ενσωματωθεί γονίδια που κωδικοποιούν εκκρινόμενης βιοδείκτες για ογκολυτική ιών ως ρεπόρτερ για δραστηριότητα του ιού [19], [20], [21], [22] και γονιδιακές κασέτες για τα γονίδια μη επεμβατική παρακολούθηση ιικών παραδίδεται [23]. Νάτριο-ιωδιούχο γονίδια συμμεταφορέα κωδικοποιούνται σε ογκολυτικοί ιοί διευκολύνει επίσης την απεικόνιση της πυρηνικής ιατρικής και της θεραπείας σε μολυσμένα όγκους [24], [25]. Πρόσφατα, ταυτοποιήθηκε και αναπτύχθηκε ως ένα ισχυρό νέο μόριο αναφοράς Gaussia λουσιφεράσης (gluc) [26] ώστε εύκολα εκκρίνεται από τα κύτταρα καθιστώντας το χρήσιμο τόσο για

in vitro

και

in vivo

εφαρμογές όπου κινητική έκφραση ενδιαφέρουν. Χρησιμοποιήσαμε gluc ως βιοδείκτη δείγμα για αυτή την απόδειξη της αρχής επειδή gluc είναι 1000 φορές πιο φωτεινή από άλλα λουσιφεράσες, είναι περισσότερο ευαίσθητη από εκκρινόμενη αλκαλική φωσφατάση, και είναι ανιχνεύσιμο στο αίμα και στα ούρα

in vivo

[27], [ ,,,0],28]. Χρησιμοποιώντας μια προσέγγιση που κατευθύνεται ανασυνδυασμού [29], σχεδιάσαμε μια μετάλλαξη του HSV, RQ-M38G, με gluc υπό τον έλεγχο του ύστερου ιικού υποκινητή U

L38 (Σχ. 1β).

Επιδιώξαμε να αξιολογήσει μηχανικής διάνυσμα παράδοσης ιικού γονιδίου μας σε ζωικά μοντέλα για αρκετούς διαφορετικούς τύπους όγκων σχηματίζονται διαφορετικές τοποθεσίες: ενδοπεριτοναϊκή, υποδόρια, ενδομυϊκή και ορθοτοπικό ενδονεφρική όγκους. Μετά από συστημική ένεση του φορέα απελευθέρωσης γονιδίου μας (RQ-M38G) στο αίμα των ποντικών που φέρουν όγκο, παρατηρήσαμε RQ-M38G παράγουν κυτταροτοξικότητα και βιοδείκτης παραγωγή καρκινικών κυττάρων-εξαρτώμενη. Σημειώσαμε επίσης αρκετές περιπτώσεις όπου RQ-M38G ήταν σε θέση να αναγκάσει μικροσκοπικά φορτία όγκου να παράγουν ανιχνεύσιμες βιοδεικτών στο αίμα. Αυτές οι πειραματικές δοκιμές απέδειξαν την αρχή της ανίχνευση όγκων από αναγκάζοντάς τους να εκφράσουν μια εκκρίσιμο βιοδείκτη.

Αποτελέσματα

In vitro

χαρακτηρισμός των μεταλλαγμένων HSV RQ-M38G

RQ-M38G μεσολάβηση gluc μεταγωγή, αντιγραφή και κυτταροτοξικότητα ελέγχθηκαν με μόλυνση μιας σειράς κυτταρικών τύπων με διάφορες συγκεντρώσεις του ιού και την εκτίμηση των επιπέδων gluc σε μέσο καλλιέργειας (Σχ. 2α, Σχ. S1), ιός αριθμό αντιγράφων γονιδιώματος (Σχ. 2b, Σχ. S2) και την κυτταροτοξικότητα (Σχ. 2γ, Σχ. S3) τις ημέρες 2, 4, και 6 μετά τη μόλυνση. Κυττάρων αντιγραφής εξαρτώμενη κυτταροτοξικότητα παρατηρήθηκε σε αντιγραφόμενα ανθρώπινης ακροποσθίας κερατινοκύτταρα (HFK-R), ενώ κυτταροτοξικότητα εξασθενημένος ή απουσιάζει σε διαφοροποιημένα /ηρεμίας ανθρώπινης ακροποσθίας κερατινοκύτταρα (HFK-Q) (Εικ. S3). Vero, μια αφρικανική κυτταρική σειρά νεφρού πράσινου πιθήκου που είναι γνωστή για την ανεκτική αντιγραφή του HSV, έδειξε υψηλή έκφραση gluC και RQ-M38G αντιγραφή παρακάτω χαμηλή δόση μόλυνσης RQ-M38G (ΜΟΙ = 0,001, 1 ιού ανά 1000 κύτταρα).

(α) Gaussia λουσιφεράσης (gluc) έκφραση διαγονιδίου, (β) την αντιγραφή του ιού, και (γ) κυτταροτοξικότητα μετά τη μόλυνση των κυττάρων Vero και μια ομάδα ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών με RQ-M38G (ΜΟΙ = 0,001).

Θα αξιολογηθεί η έκφραση του διαγονιδίου, τον πολλαπλασιασμό του ιού και κυτταροτοξικότητα μετά από μόλυνση RQ-M38G 5 ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών. SK-NEP_Luc (σάρκωμα Ewing) έδειξαν αυξημένη έκφραση gluc, την αντιγραφή του ιού και κυτταροτοξικών επιδεκτικότητα παρόμοια με τα κύτταρα Vero. Osteomet (οστεοσάρκωμα), STS26T_dsRed (MPNST), και S462.TY (MPNST) κάθε αποδειχθεί χαμηλότερη ευαισθησία σε όλες τις τρεις δοκιμασίες. Τέλος, αξιολογήθηκε η κυτταροτοξικότητα σε 3 καλά καθιερωμένα μοντέλα όγκου ποντικού που προέρχεται από ένα φόντο C57 /BL6 (Εικ. S3) και αρκετές αυθόρμητες θυρεοειδούς ποντικού ή μικρές γραμμές όγκου πνεύμονα που παράγεται από μια συνεργάτης (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). HGF116 (ραβδομυοσάρκωμα) ήταν η μοναδική κυτταρική γραμμή που δείχνει οποιαδήποτε μετρήσιμη κυτταροτοξικότητα, αλλά μόνο σε δόση υψηλή ιός (ΜΟΙ = 1, 1 μολυσματικού ιού ανά κύτταρο). Τα στοιχεία αυτά προσδιορίζονται SK-NEP_Luc ως πρωταρχικό στόχο για

in vivo

διαλογή χρησιμοποιώντας RQ-M38G ενώ άλλες ανθρώπινες κυτταρικές σειρές όγκων αναμένεται να είναι λιγότερο επιδεκτικά σε διαλογή με RQ-M38G.

Η συστηματική χορήγηση του RQ-M38G για τον εντοπισμό του όγκου παρουσία

Ελέγξαμε την καταλληλότητα του RQ-M38G ως φορέας απελευθέρωσης γονιδίου για να αναγκάσει όγκου-ειδικά έκκριση ενός βιοδείκτη μετά από συστηματική χορήγηση του RQ-M38G σε ποντικούς με και χωρίς όγκους . Έντεκα ποντίκια ενέθηκαν ορθοτοπικώς με 10

6 κύτταρα SK-NEP_Luc σε νεφρική subcapsule τους. όγκους ποντίκια εμφυτεύονται και ελέγχου ποντικών χωρίς-όγκο μετέπειτα εγχύθηκαν ενδοφλεβίως (ί.ν) με 1.2 × 10

7 pfu του RQ-M38G 5 εβδομάδες μετά την εμφύτευση του όγκου. Τις ημέρες 1, 4 και 7 παρακάτω ποντικούς ένεση ιός απεικονίστηκαν να προσδιορίσουν λουσιφεράση πυγολαμπίδας-θετικούς όγκους και συλλέχθηκαν δείγματα αίματος με οπισθοκογχική μάτι αιμορραγούν και προσδιορίστηκαν για gluc ορό (Εικ. 3α).

In vivo

απεικόνισης εντοπίστηκαν 10 από τους 11 ποντικούς που έλαβαν ενέσεις των καρκινικών κυττάρων είχαν σχηματίσει όγκους (Σχ. 3β). Ένα ποντίκι (# 9) δεν αποτέλεσαν ποτέ έναν όγκο και ένα ποντίκι (# 11) είχε έναν όγκο που ήταν ελάχιστα ανιχνεύσιμη. Σε όλα τα ποντίκια όπου το φορτίο του όγκου ήταν εμφανής (9 από 11), τα επίπεδα ορού ήταν gluc 15 έως 440 φορές υψηλότερη από ό, τι τα ποντίκια χωρίς όγκο, ενώ gluc ορού από τους άλλους δύο ποντικούς παρέμειναν κάτω από τα επίπεδα gluc ορού ποντικού ελέγχου (Σχ. 3). Ως εκ τούτου, RQ-M38G χορηγείται συστηματικά για την επαγωγή της παραγωγής βιοδείκτη ως αποτέλεσμα μια ευαισθησία ανίχνευσης 90% για SK-NEP_Luc φέρουν ποντικούς. Παρόμοια αποτελέσματα ήταν για όγκους σε διάφορες ανατομικές περιοχές (Εικ. S4).

(α) Χρονική πορεία της έκφρασης gluC στη νεφρική subcapsule (RSC) SK-NEP_Luc-ρουλεμάν και χωρίς-όγκο ποντικών με ένεση συστηματικά με 1.2 × 10

7 pfu ή RQ-M38G. Οι αριθμοί στο μύθο αντιπροσωπεύουν μεμονωμένα ποντίκια. (Β) η έκφραση gluC και

in vivo

απεικόνιση της SK-NEP_Luc ποντίκια που έφεραν τέσσερις ημέρες μετά από συστηματική ένεση 1,2 × 10

7 pfu του RQ-M38G. επίπεδα ορού gluC για ποντίκια με ένεση όγκου και ελέγχου που δεν έλαβαν ενέσεις όγκου (ραβδόγραμμα), και

in vivo

απεικόνιση της λουσιφεράσης των ποντικών που έλαβαν ενέσεις καρκινικών κυττάρων.

Η

Για να καθορίσει τη θέση του RQ-M38G σε ιστούς μετά iv ένεση και να επιβεβαιώσει ότι το σήμα gluc ορός που εκφράζονται από όγκους και όχι φυσιολογικά όργανα, τα όργανα συλλέχθηκαν από ποντικούς 7 ημέρες μετά τη μόλυνση με τον ιό και υποβλήθηκαν σε ανοσοφθορισμό για έκφραση GFP και ποσοτική PCR για γονιδιωμάτων ιού. Μόνο όγκων έδειξε έκφραση GFP τόσο ελέγχου (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα) και πειραματικά ποντίκια (Εικ. 4α) εγχύθηκε συστηματικά με RQ-M38G. Ποσοτική PCR για τον ιό αντιγράφων του γονιδιώματος αντανακλούσε την ίδια κατανομή του ιού σε ποντικούς που φέρουν όγκο όπως φάνηκε με την έκφραση GFP όπου τα αντίγραφα του ιού ήταν τουλάχιστον 2100 φορές υψηλότερη στους όγκους από τους υγιείς ιστούς (Σχ. 4β). Ανοσοφθορισμό και qPCR δείχνουν ότι η λοίμωξη από τον ιό κυριαρχούσε στον όγκο, ενώ είναι ελάχιστες σε υγιείς ιστούς. Ως εκ τούτου, η συστημικώς χορηγούμενη RQ-M38G προσδιορίζονται με επιτυχία την παρουσία όγκων SK-NEP_Luc αναγκάζοντας όγκους για την παραγωγή μίας εκκρινόμενης βιοδείκτη. Δείξαμε παρόμοια ευρήματα σε μοντέλα όγκων που είναι λιγότερο ευαίσθητα σε μόλυνση από τον ιό περιλαμβανομένων των μοντέλων των κακοήθων όγκων περιφερικού νευρικού ελύτρου (και στις δύο υποδόρια και ενδοπεριτοναϊκή τοποθεσίες) και οστεοσαρκώματος (Σχήματα S5, S6, S7).

(α) GFP ανοσοφθορισμού σε SK-NEP_Luc φέρουν ποντικών με και χωρίς χορήγηση συστημικών ιού. Οι ποντικοί που λαμβάνουν τον ιό (# 1 και # 2) έδειξε επιλεκτική έκφραση GFP στον όγκο, ενώ τα ποντίκια που δεν έλαβαν ιό (αριθ Virus Control) έδειξε παγκόσμια GFP-αρνητικότητα. μπαρ κλίμακας = 15 μm. (Β) Βιοκατανομή του ιού σε ποντίκια με όγκους SK-NEP_Luc μετά από συστηματική χορήγηση όπως καθορίζεται από qPCR για ιικών γονιδιωμάτων.

Η

Η επαγωγή της έκφρασης gluc σε όγκους από ενδοογκική ένεση ιό

σαφής διαφορά δεν παρατηρήθηκε μεταξύ των SK-NEP_Luc και τα τρία άλλα μοντέλα όγκου δοκιμάζονται που κάθε έδειξαν χαμηλότερα

in vitro

κυτταροτοξικότητα και την έκφραση gluC σε συνδυασμό με την χαμηλότερη έκφραση βιοδεικτών

in vivo

. Για να προσδιορίσετε αν παράδοση μεγαλύτερες δόσεις του ιού σε όγκους θα μπορούσε να αυξήσει

in vivo

έκφραση των βιοδεικτών, που χορηγείται RQ-M38G απευθείας σε όγκους από ενδοογκική ένεση σε μοντέλα S462.TY και Osteomet.

Ποντίκια που φέρει υποδόρια Osteomet πλευρό όγκων μεγαλύτερη από 200 mm

3 ενέθηκαν με 1.9 × 10

5 pfu ιού. Τα δείγματα αίματος συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν για gluc σε κάθε χρονικό σημείο (Σχ. S7a), ενώ δύο ποντίκια θυσιάστηκαν σε κάθε χρονικό σημείο και αναλύθηκαν για ιική γενωμική αντίγραφα με qPCR (Εικ. S7b). Τα επίπεδα ορού gluc σε αίμα από ποντίκια που φέρουν όγκους ενέθηκαν με RQ-M38G ήταν υψηλότερα από τα επίπεδα gluc σε έλεγχο μη-μολυσμένα ποντίκια, και αυξάνοντας gluc διαχρονικά εντοπιστεί ένα προφίλ παρόμοιο με τον αριθμό αντιγράφων ιού σε όγκους. Παρά 4000-πλάσια γονιδιωματική ενίσχυση σε όγκους, τα επίπεδα στον ορό αυξήθηκαν gluc μόνο 10-φορές πάνω από μη μολυσμένους ελέγχους. Εντός του όγκου ένεση με 8 × 10

3 pfu ή 8 × 10

7 pfu του ιού επανελήφθη σε όγκους S462.TY όταν οι όγκοι ήταν μεγαλύτερο από 500 mm

3. Τέσσερις ημέρες μετά την ε.τ. επίπεδα ορού gluc ένεση προσδιορίστηκαν όπως απεικονίζονται στο Σχ. S8. Όλοι οι ποντικοί που έλαβαν ένεση εντός του όγκου ιού κατέδειξαν υψηλότερα επίπεδα gluc από τους ελέγχους χωρίς όγκο χωρίς σημαντική διαφορά στη συγκέντρωση gluc μεταξύ της χαμηλής δόσης και της δόσης 10.000 φορές υψηλή ιού, υποδηλώνοντας τον κορεσμό στη χαμηλή δόση (τουλάχιστον μέσω της ενδονεοπλασματική διαδρομή).

ευαισθησία βιοδεικτών

Μικρές ζωικά μοντέλα που χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση ελάχιστη επιβάρυνση όγκου που υπάρχουν θεωρητικές προκλήσεις κλιμάκωσης κατά τη μετάφραση ευρήματα για την ανθρώπινη κλίμακα πρακτικότητα. Για την αντιμετώπιση αυτών των προκλήσεων επιδιώξαμε να αξιολογούν θεωρητικά όρια ανίχνευσης βιοδεικτών μας βασίζεται σε μια

in vitro

προσδιορισμό και τον εντοπισμό μικρών όγκων βάρη

in vivo

με 3 μεθόδους: IVIS απεικόνισης φωταύγειας, τον ιό με τη μεσολάβηση έκφραση gluC στην ιστολογική ανάλυση του ορού και μετά τη σφαγή. Ο όγκος του αίματος σε ένα ποντίκι είναι περίπου 2 mL (8% του 25 g ολικού σωματικού βάρους [30]). Σφαιρικό όγκου SKNEP-Luc που αποτελείται από 10

6 κυττάρων προσδιορίστηκε να είναι 1,83 mm σε διάμετρο με τη μέτρηση του όγκου που καταλαμβάνεται σε ένα φυγοκεντρημένο δείγμα από ίσο αριθμό κυττάρων, υποθέτοντας μικροί όγκοι αποτελούνται κυρίως από τα καρκινικά κύτταρα. Δέκα έως 1 εκατομμύριο κύτταρα τοποθετήθηκαν σε 2 ml μέσου καλλιέργειας κυττάρων και συν-μολύνθηκαν με RQ-M38G σε ΜΟΙ 3 για την εξασφάλιση κάθε κύτταρο θα πρέπει να μολυνθεί. Δύο ημέρες μετά τη μόλυνση μέσων κυτταρικής καλλιέργειας συλλέχθηκε και αναλύθηκε για συγκέντρωση gluc. Virus-μεσολάβηση gluC έκφραση θα μπορούσε να επιλυθεί με αξιοπιστία με την ταυτόχρονη μεταγωγής 1.000 κύτταρα, η οποία προσεγγίζει ένα σφαιρικό όγκο διαμέτρου 183 μικρομέτρων (Εικ. S9).

όγκους σαρκώματος Ewings (SKNEP-Luc) διαφόρων μεγεθών ιδρύθηκε το 11 ποντίκια με ένεση 10

6 κύτταρα εντός του αριστερού νεφρού subcapsularly σε 3 ομάδες ποντικών επί 3 συνεχόμενες εβδομάδες. Τα ποντίκια με όγκους που είχαν αναπτυχθεί πάνω από 2, 3 και 4 εβδομάδες και 4 ποντικούς ελέγχου άνευ όγκου μολύνθηκαν συστηματικά με 1 × 10

7 pfu του RQ-M38G. Τέσσερις ημέρες μετά τα ποντίκια μόλυνση απεικονίστηκαν μέσω IVIS, δείγματα αίματος συλλέγονται για gluc ποσοτικοποίηση, και τα ποντίκια θυσιάστηκαν για ιστολογική ταξινόμηση κατά μέγεθος του όγκου.

In vivo

απεικόνισης για έκφραση λουσιφεράσης αποκάλυψε ποντίκια προτεταμένα όγκους δραστικά διαφορετικό σε μέγεθος κατά τη στιγμή της μόλυνσης και της θυσίας (ακραία παραδείγματα φαίνεται στο Σχ. 5α). συγκέντρωση ορού gluc σε ποντικούς που φέρουν όγκο 4 ημέρες μετά την μόλυνση αποκάλυψε επίπεδα gluc μεγαλύτερη από παρομοίως μολυσμένα ποντίκια μάρτυρες χωρίς όγκο (Σχ. 5β). Η ιστολογική αξιολόγηση των όγκων σε κάθε ποντίκι αποκάλυψε μια μακροσκοπική όγκου και μικροσκοπικές εστίες όγκου στο ποντίκι

i

και

ii

αντίστοιχα (Σχ. 5γ).

α)

in vivo

απεικόνιση των δύο ποντίκια (

i

και

ii

) με πολύ διαφορετικές επιβαρύνσεις όγκου SKNEP-Luc. β) συγκέντρωση ορού gluC στο i ποντίκι, ii και τέσσερις όγκους ποντικών χωρίς έλεγχο 4 ημέρες μετά τη συστημική μόλυνση με 1 × 10

7 pfu του RQ-M38G. γ) αιματοξυλίνη και ηωσίνη μακροσκοπικές εικόνες των νεφρών που φέρουν όγκο (Τ = όγκος, μπαρ κλίμακα = 1 mm) και ένθετα των μικροσκοπικών εστιών όγκου στο νεφρικό παρέγχυμα του ποντικιού

ii

(γραμμή κλίμακας = 200 μm).

Συζήτηση

Έχουμε αναπτύξει μια νέα στρατηγική για τον έλεγχο του καρκίνου σύμφωνα με την οποία οι όγκοι αναγκάζονται να εκκρίνουν ένα βιοδείκτη. Έχουμε αναπτύξει μια υπό όρους αντιγραφική HSV, RQ-M38G, για να αναγκάσει επιλεκτικά τα καρκινικά κύτταρα να εκκρίνουν Gaussia λουσιφεράσης ως απόδειξη αυτής της στρατηγικής ελέγχου. ζώα που φέρουν όγκο δίνεται ενδοφλέβια RQ-M38G εξέφρασαν υψηλότερα επίπεδα βιοδεικτών σε σύγκριση με τα ζώα άνευ όγκου, η οποία έδειξε μόνο χαμηλά, έκφραση υποβάθρου. Η χρησιμότητα των rQM-38G για διαλογή φάνηκε να είναι μία συνάρτηση της ικανότητας ενός δεδομένου όγκου για να υποστηρίξει την αντιγραφή του HSV. Ανεξάρτητα από τον τύπο του όγκου ή την τοποθεσία, έλεγχο του όγκου με RQ-M38G ήταν εξαιρετικά ευαίσθητες στην παρουσία του όγκου.

Ένα κρίσιμο χαρακτηριστικό για τον προσυμπτωματικό έλεγχο του καρκίνου είναι η ικανότητα να ανιχνεύσει μικρούς όγκους, τελικά στους ανθρώπους. Ένα

a priori

ανησυχία ήταν ότι μικροί όγκοι μπορεί να σχετίζεται με λιγότερη επιφάνεια αγγειακών διαθέσιμο για την είσοδο του HSV. Αυτό το ζήτημα δεν φαίνεται να είναι ένας περιορισμός σε ποντίκια, διότι σε μερικά από τα μοντέλα ήμασταν σε θέση να ανιχνεύσουν όγκους τόσο μικρές όσο 4-5 mm σε διάμετρο (50 mm

3) και σε ένα άλλο μοντέλο που ανιχνεύονται μικροσκοπικές φορτίο του όγκου . Επεκτασιμότητα για τον άνθρωπο (με μεγαλύτερο όγκο αίματος) είναι δύσκολο να προβλεφθεί, αλλά είναι δυνατόν ορισμένες εκτιμήσεις.

In vitro

αξιολόγηση αύξηση του αριθμού των κυττάρων του όγκου SKNEP-Luc υποδεικνύει ότι μολύνει τόσο λίγα όσο 1000 κύτταρα σε έναν όγκο μέσα κυτταρικής καλλιέργειας ίση με ένα ποντίκι αίμα αποδόσεις όγκος ανιχνεύσιμη έκκριση gluc. Ως εκ τούτου, η ταυτόχρονη έκφραση των gluc από 1000 κύτταρα ανά πάσα στιγμή σε ένα ποντίκι είναι θεωρητικά ανιχνεύσιμο. Υπό αυτές τις συνθήκες να μολύνει 10% των κυττάρων σε έναν όγκο διαμέτρου 400 μm (10

4 κύτταρα) θα είναι ανιχνεύσιμη σε ένα ποντίκι. Όταν κλιμακώνεται από ένα ποντίκι σε έναν άνθρωπο το θεωρητικό όριο ανίχνευσης αυξάνεται κατά αναλογία 1:2600 (25 mg mouse:65 kg άνθρωπο) και την αραίωση του βιοδείκτη σε ένα μεγαλύτερο μέσο άνθρωπο όγκο αίματος 4,7 L. Χρησιμοποιώντας αυτούς τους αριθμούς, το θεωρητικό όριο ανίχνευσης όταν μολύνει το 10% των κυττάρων σε έναν όγκο αλλάζει από μία μάζα 394 um διάμετρο σε ένα ποντίκι σε μία διάμετρο όγκου 1-4 mm σε έναν άνθρωπο. Εάν μόνο το 1% των κυττάρων του όγκου μεταδιεγείρονται με ιό, οι όγκοι τόσο μικρό όσο 8,5 mm σε διάμετρο μπορεί να είναι ακόμα ανιχνεύσιμο χρήση αυτών των υπολογισμών. Αυτή η ευαισθησία υποδηλώνει ισχυρό δυναμικό για την ταυτοποίηση ελάχιστη επιβάρυνση του όγκου, ακόμη και όταν κλιμακωθεί σε ανθρώπινο αναλογίες.

Η ικανότητα αυτής της στρατηγικής διαλογής για να αποκαλύψει όγκων εξαρτάται από ιογενή παράγοντες, μικροπεριβάλλον του όγκου, και οι περιορισμοί ανίχνευση βιοδεικτών καθένα από τα οποία μπορεί να είναι ενισχυμένη για πραγματικό κόσμο πρακτικότητα. Εδώ χρησιμοποιήσαμε μια διπλά εξασθενημένο HSV να πραγματοποιήσει μια ειδική όγκου μεταγωγή και έκφραση γονιδίων. Αυτοί οι φορείς έχουν ήδη τεκμηριωθεί ότι είναι ασφαλή για ανθρώπινη χρήση [31]. Εναλλακτικές ιούς με μονά ή λιγότερο μεταλλάξεις εξασθένησης επιδείξει μεγαλύτερη ογκολυτικού ικανότητα είναι επίσης ήδη σε κλινικές δοκιμές (π.χ., HSV1716, δείτε www.clinicaltrials.gov, NCT00931931). Σύζευξη αυτή τη στρατηγική ελέγχου σε λιγότερο εξασθενημένους ιούς πιθανότατα θα διαφοροποιήσει τη χρησιμότητά της μεταξύ των διαφόρων στερεών κακοηθειών, καθώς και την ενίσχυση της θεραπευτικό συστατικό. Οι παράγοντες οι οποίοι είναι ταυτόχρονα και διαγνωστικές και θεραπευτικές ονομαστεί «theragnostic.» Είναι πιθανό η στρατηγική μας θα μπορούσε να βελτιωθεί περαιτέρω με τη χρήση ενός πιο ισχυρή καρκίνος που εξαρτάται από προωθητή για να οδηγήσει την έκφραση βιοδείκτη. Βελτιωμένη παράδοση φορέα για τον όγκο μπορεί επίσης να επιτευχθεί χρησιμοποιώντας στόχευση όγκων μικρό μόριο και νανοσωματίδια στρατηγικές πρόσληψης εξάρτημα όπως περιγράφηκε πρόσφατα με τη χρήση της εσωτερίκευσης RGD πεπτίδια [8]. Ενδεχόμενη εμπορευματοποίηση της προτεινόμενης στρατηγικής ελέγχου μας θα επωφεληθούν από τη χρήση βιοδεικτών που είναι ήδη σε ευρεία χρήση, όπως βhCG (τεστ εγκυμοσύνης), PSA (καρκίνος του προστάτη) και αFP (ήπαρ και τα γεννητικά κύτταρα κακοήθειες). Βιοδείκτη ευαισθησία της μεθόδου προσδιορισμού, στο πλαίσιο αυτής της στρατηγικής ελέγχου μπορεί ακόμα να βελτιωθεί εκθετικά όπως υλοποιείται με μικρορευστονικής τεχνολογίες [32], [33], [34], [35].

Μια σημαντική ανησυχία για την πρωτότυπη καρκίνο μέθοδο διαλογής αναπτύσσονται στην παρούσα εργασία είναι η ανάπτυξη μίας ανοσολογικής απόκρισης στον παράγοντα απελευθέρωσης γονιδίου ή του μετάγονται βιοδεικτών που θα αποκλείει την επανειλημμένη χρήση του εργαλείου διαλογής. Προηγούμενη εργασία στον τομέα έχει δείξει ότι οι προ-ανοσοποιημένα ζώα εξακολουθούν να αντιμετωπίζουν θεραπευτικό όφελος από HSV με σταθερή αποτελεσματικότητα [36]. Επειδή το 80% του γενικού πληθυσμού έχει εκτεθεί σε HSV, υλοποίηση αυτής της στρατηγικής ανίχνευσης με HSV θα εξαρτάται από την αποτελεσματικότητα της μηχανικής ΤΣ χορηγείται σε ανοσοϊκανά άτομα που έχουν προηγουμένως εκτεθεί σε άγριου τύπου στελέχη HSV.

In vitro

διαλογής για καρκινικές κυτταρικές σειρές ποντικού αποκάλυψε ότι όλες οι γραμμές ποντικού που εξετάσαμε παρουσίασαν συγκριτικά χαμηλή επιδεκτικότητα σε μόλυνση από εξασθενημένου μεταλλαγμένου ιού μας, στο ίδιο επίπεδο με την κανονική εν ηρεμία ανθρώπινα κύτταρα. In vivo μοντέλα HGF116 δεν έδειξαν ευαισθησία ιός εξής i.t. ή ί.ν. ένεση. Έτσι, είμαστε σε θέση να εκτιμήσει τη στρατηγική προσυμπτωματικό έλεγχο του καρκίνου μας σε ένα φυσιολογικό ανοσοποιητικό σύστημα μοντέλο μέχρι την ταυτοποίηση των μοντέλων ποντίκι που είναι πιο επιρρεπή σε ανθρώπινο HSV. Εφαρμογή της στρατηγικής αυτής μπορεί να εξελιχθεί με μη-ιικών φορέων [37] ή ιικών φορέων συγκαλύπτεται σε λιποσώματα [38].

Η πρόκληση του πληθυσμού σε ολόκληρη την προσυμπτωματικό έλεγχο του καρκίνου είναι η ανάπτυξη των κλινικών δοκιμασιών που είναι φορολογικώς πρακτική, καθολική σε ένα φάσμα τύπων καρκίνου, και εύκολο να εφαρμοστούν. Η φυσική εξέταση, ενώ προσιτές, συχνά αποτυγχάνει να εντοπίσει κακοήθειες που είναι βαθιά ή ασυμπτωματική. οφέλη απεικόνισης από υψηλή ευαισθησία, αλλά δεν μπορεί να διαφοροποιήσει πάντα μη ειδική ή καλοήθεις μάζες από κακοήθη νόσο (π.χ., οζίδια του πνεύμονα μπορεί να είναι κοκκίωμα ή καρκίνου), είναι οικονομικά δύσκολη και δύσκολο να εφαρμοστεί ευρέως. Με τον εντοπισμό των κατάλληλων βιοδεικτών, προσυμπτωματικού ελέγχου του καρκίνου θα μπορούσαν δυνητικά να είναι οικονομικά βιώσιμες με αυτοματοποιημένη σημείο της δοκιμής φροντίδας (POCT) τεχνολογίες (www.i-stat.com, www.biosite.com, www.siloambio.com [39]).

Αυτή η εργασία επιδεικνύει την αρχή της επαγωγής έκφρασης ενός διαγονιδίου εκκρινόμενης στον καρκίνο χρησιμοποιώντας ένα συστημικά χορηγούμενου παράγοντα απελευθέρωσης γονιδίου ως βιοδείκτη για διαλογή παρουσία όγκου. Το μυθιστόρημα αρχή ελέγχου πρότεινε και επέδειξε σε αυτό το έργο θα μπορούσε να κρατήσει άμεσες συνέπειες για τους ασθενείς με γνωστή κινδύνους καρκίνου, όπως η γενετική προδιάθεση (BRCA-1, μεταλλάξεις NF1) ή σε ασθενείς με ιστορικό καρκίνου που βρίσκονται σε υψηλό κίνδυνο για υποτροπή. Τελικά, η εξωγενής χορήγηση ενός παράγοντα απελευθέρωσης γονιδίου καρκίνος στόχευσης (λοιμώδη ή μη) θα μπορούσε να αναγκάσει κάθε κακοήθεια να εκκρίνουν ένα βιοδείκτη και θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως μια καθολική πρώτο βήμα για ολόκληρο τον πληθυσμό προσυμπτωματικό έλεγχο του καρκίνου. Ο αντίκτυπος αυτής της προσέγγισης θα φέρει επανάσταση στην τεχνολογία για την ανίχνευση του καρκίνου στα βιομηχανοποιημένα έθνη και τον αναπτυσσόμενο κόσμο, όπου απεικόνισης και διάγνωσης με βιοψία βάση μπορεί να μην είναι τόσο εύκολα διαθέσιμες.

Υλικά και Μέθοδοι

Cells και οι ιοί

κυτταρικές σειρές ανθρώπινου όγκου έχουν περιγραφεί στο παρελθόν [40], [41] ή αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) εκτός από SK-NEP_Luc, το οποίο ήταν ένα είδος δώρο από τον Jason Frischer (CCHMC, Cincinnati, ΟΗ). Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε ϋΜΕΜ ή μέσου McCoys 5Α (ATCC, SK-OV-3, SK-NEP_Luc) με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Hyclone, Logan, UT) και πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (Life Technologies, Carlsbad, CA). κυτταρικές σειρές ποντικού C57 /BL6 LLC

GFP [42] (Lewis καρκίνωμα του πνεύμονα) και Β16-BL6 (μελάνωμα) ήταν ευγενικό δώρο από τον Joe Palumbo (CCHMC, Cincinnati, ΟΗ) και HGF116 (ραβδομυοσάρκωμα) προήλθε από ένα γενετικά ποντίκι. Πρωτογενής ανθρώπινη ακροποσθία κερατινοκύτταρα (HFK) ήταν ένα είδος δώρο από τα Σούσα Wells (CCHMC, Cincinnati, ΟΗ), που αναπτύσσονται σε EpiLife Media (Cascade Biologics, Portland, OR) και διαφοροποιήθηκαν σε κατάσταση ηρεμίας κερατινοκυττάρων με 10% FBS και 1 mmol /L CaCl

2 [43]

RQ-M38G κατασκευάστηκε ως εξής: α. Το U

L38 υποκινητή απομονώθηκε από HSV rRp450 με PCR χρησιμοποιώντας εναρκτήρες σχεδιασμένους προηγουμένως [18] που είχαν τροποποιηθεί για να συμπεριλάβει ένα 5 ‘ BglII και 3 ‘θέσεις Hindlll (F1, R1 στον πίνακα S1) και κλωνοποιείται στις θέσεις ΒαΙΙΙ και Hindlll του pCMV-gluc (Invitrogen), αντικαθιστώντας τον υποκινητή CMV. Η κασέτα U

L38p-gluc ενισχύθηκε με PCR από pU

L38p-gluc με συμπερίληψη ενός 5’SpeI και 3 ‘EcoRI και κλωνοποιήθηκε εντός των θέσεων SpeI-EcoRI του «HSV-Quick» παλίνδρομο πλασμίδιο, ρΤ-OriSIE4 /5 [29] (ένα ευγενές δώρο από Yoshinaga Saeki, The State University του Οχάιο, Columbus, Ohio), με την οποία είχαν αφαιρεθεί των στοματικών (E4 /5 Κρη Ι θραύσμα. το προκύπτον πλασμίδιο, pT-U

L38p-gluc, χρησιμοποιήθηκε στο σύστημα HSVQuick BAC για να δημιουργήσει RQ-M38G [29]. τα εναύσματα για PCR ανάλυση και αλληλούχιση παρουσιάζονται στον πίνακα S2. οι ιοί πολλαπλασιάστηκαν και τιτλοδοτήθηκαν [44] με ανάλυση πλακών σε κύτταρα Vero. κυτταροτοξικότητα κυττάρων προσδιορίστηκε σε πλάκες ιστοκαλλιέργειας 96-φρεατίων χρησιμοποιώντας μία τροποποιημένη MTS /PMS δοκιμασία (Promega, Madison, WI).

Gaussia δοκιμασία λουσιφεράσης

δραστικότητα gluc εκτιμήθηκε με 10 δείγματα μι ιστοκαλλιέργειας μέσων ή ορό, με χημειοφωταυγή ανίχνευση [45] σε ένα φωτόμετρο autoinjecting με έγχυση 50 μL 50 μΜ συνελεντεραζίνης (Prolume, Pinetop, ΑΖ) σε κάθε δείγμα εις τριπλούν και ενσωμάτωση του σήματος για 2,5 δευτερόλεπτα [26].

βιοκατανομή

οι μελέτες σε ζώα ιό εγκρίθηκαν από Νοσοκομείο Θεσμικών Φροντίδας ζώων του Σινσινάτι των παιδιών και της Επιτροπής Χρήση (Animal πρωτόκολλο # 9D12095). 5-6 εβδομάδων σε ηλικία θηλυκών Balb /c αθυμικά γυμνά ποντίκια (Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, ΙΝ) εγχύθηκαν με 1-5 εκατομμύρια κύτταρα. Τα κύτταρα παρασκευάστηκαν σε 33% Matrigel (Becton Dickinson, Bedford, ΜΑ) και 66% ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο (PBS, ρΗ 7.4) για υποδόρια (υποδόρια, ενδοπεριτοναϊκά) ένεση και PBS μόνο για νεφρικές subcapsule (r.s.c) ή ενδοπεριτοναϊκή (i.p.) ένεση. Οι δόσεις του ιού που περιγράφονται στο κείμενο. Virus αιωρήθηκε σε 100-150 μλ PBS για ενέσιμα φλέβα της ουράς και 50-100 μΙ PBS για ενδοογκική ενέσεις, τα οποία κατανεμήθηκαν σε 5 κλάσματα όλο τον όγκο.

Παρασκευή ιστού και ανοσοφθορισμό

οι ιστοί μονιμοποιήθηκαν, ενσωματωμένο, και κόβεται σε τμήματα των 12 μικρόν με τη χρήση τυποποιημένων διαδικασιών. Οι τομές διαπερατά με 0,2% Triton-X σε PBS για 10 λεπτά, αποκλείστηκε σε 10% φυσιολογικό ορό κατσίκας για 60-90 λεπτά, και επωάζονται με κοτόπουλο αντι-GFP (# 16901, Millipore /Chemicon, Billerica, ΜΑ) για 60 λεπτά , ξεπλένονται τρεις φορές με PBS και επωάστηκαν με δευτερογενές αντίσωμα (αίγας αντι-κοτόπουλου FITC, Jackson ImmunoResearch, West Grove, ΡΑ), ξεπλύθηκαν με PBS και τοποθετείται με Fluoromount-G (Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Sciences, Hatfield, ΡΑ). Όλα τα πλακίδια κατόπιν απεικονίζεται με OpenLab Λογισμικό Imaging (Improvision, Waltham, ΜΑ) σε ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο φθορισμού Zeiss.

HSV γονιδίωμα ποσοτικοποίηση

DNA απομονώθηκε από τους ιστούς ποντικού χρησιμοποιώντας την απομόνωση Gentra Puregene DNA κιτ (Qiagen, Valencia, CA) και ποσοτικά χρησιμοποιώντας το φασματοφωτόμετρο NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE). Real-time PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του συστήματος ΑΒΙ 7500 (Applied Biosystem, Foster City, CA) [46]. Πρότυπα έγιναν από καθαρισμένο ιικό DNA HSV1716.

γονιδιακή έκφραση και αντιγραφή μελέτες RQ-M38G σε κυτταρικές γραμμές

Τα κύτταρα μολύνθηκαν σε τρυβλία 12 φρεατίων για 1 ώρα και συλλέχθηκαν στους χρόνους που δείχνονται. 100 uL του κυτταρικού εναιωρήματος χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση Gaussia λουσιφεράση, ενώ το υπόλοιπο κυτταρικό εναιώρημα υποβλήθηκε σε τρεις κύκλους ψύξης-απόψυξης και φυγοκεντρήθηκαν στα 20.000 χ g. Τα σφαιρίδια επαναιωρήθηκαν σε 200 μλ PBS. DNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το DNeasy αιμοποιητικού και κιτ Tissue (Qiagen, Valencia, CA). Fast πραγματικού χρόνου PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του 7900HT Fast Real Time PCR System (Applied Biosystem, Foster City, CA). Τυπική DNA ή DNA εξάγεται από τα μολυσμένα κύτταρα (40 ng) προστέθηκε σε 10 μι Kit SYBR Premix Ex Taq II (Takara, Otsu, Shiga, Japan), 1,6 μΙ ενός μίγματος εκκινητή κινάσης θυμιδίνης (ΤΚ 290-F: 5 ‘ ΤΕΕ CGA ACA TCT ACA CCA CAC AAC? TK 400-R: 5 ‘CGG CAT AAG GCA TGC CCA TTG TTA? καθένα στα 400 nm), 0,4 μι Rox (Takara) και PCR-ποιότητας νερό σε ένα τελικό όγκο 20 μl ανά αντίδραση. PCR ήταν 1 κύκλος των 95 ° C για 30 δευτερόλεπτα, 40 κύκλοι των 95 ° C για 3 δευτερόλεπτα, 60 ° C για 15 δευτερόλεπτα, και 72 ° C για 25 δευτερόλεπτα.

In vivo

απεικόνισης

Ποντίκια με ένεση ip με 150 mg /kg D-λουσιφερίνης (δαγκάνα Life Sciences, Hopkinton, ΜΑ) και απαθανατίστηκε από IVIS200 (Calipur Lifesciences).

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.