Αφηρημένο

Ο καρκίνος του προστάτη είναι η πιο κοινή μορφή καρκίνου μεταξύ των ανδρών στις Ηνωμένες Πολιτείες. Η κυτοκίνη IL-6 ενεργοποιεί διάφορες οδούς του καρκίνου του προστάτη, αλλά ανάντη της οδού trans-σηματοδότησης του παραμένει ελάχιστα κατανοητή. Στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε το ρόλο της IL-6 στην έκφραση γονιδίων PDCD4 και πώς το microRNA miR-21 ρυθμίζει αυτή τη διαδικασία σε προστάτη καρκινικές κυτταρικές σειρές PC-3 και LNCaP. Το πρότυπο έκφρασης του PDCD4 από δείγματα από ανθρώπινο καρκίνο του προστάτη, προκαρκινικές αλλοιώσεις, και καλοήθους υπερπλασίας του προστάτη ερευνήθηκε με ανοσοϊστοχημεία. PDCD4 μεταγραφή και μετάφραση ανιχνεύθηκαν με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR (qRT-PCR) και ανάλυση στυπώματος Western, αντιστοίχως. Η στοχευμένη ρύθμιση της PDCD4 με miR-21 αναλύθηκε σε PC-3 και LNCaP κύτταρα, και η επίδραση της IL-6 επί της έκφρασης PDCD4 μελετήθηκε in vitro. έκφραση PDCD4 σε δείγματα από τους τύπους 3 ιστών αυξάνεται σταδιακά, και τα επίπεδα έκφρασης του PDCD4 και του ειδικού προστατικού αντιγόνου συσχετίζεται αρνητικά. Τα επίπεδα PDCD4 mRNA και της πρωτεΐνης σε PC-3 και LNCaP κύτταρα μορφομετατραπέντα με αντι-miR-21 κατασκευές ήταν χαμηλότερες από εκείνες στα κύτταρα ελέγχου. Η έκφραση του PDCD4 αναστάλθηκε από την IL-6, αλλά αυτό το αποτέλεσμα ήταν εξασθενημένη σε κυτταρικές σειρές με χαμηλή έκφραση του miR-21. Η μελέτη μας δείχνει ότι η ρύθμιση της PDCD4 από miR-21 είναι στοχευμένες και IL-6 αναστέλλει την έκφραση του γονιδίου PDCD4 στο PC-3 και LNCaP κύτταρα μέσω της στοχευμένη λειτουργία των miR-21 στο PDCD4. Τα ευρήματα αυτά υποστηρίζουν την εφικτότητα των μελλοντικών προσπαθειών για τη θεραπεία διάγνωση και γονίδιο για τον καρκίνο του προστάτη που βασίζονται σε IL-6, miR-21, και PDCD4

Παράθεση:. Dong Β, Shi Ζ, Wang J, Wu J , Yang Z, Fang K (2015) IL-6 Αναστέλλει την Στοχευμένες διαμόρφωση των PDCD4 από miR-21 στον καρκίνο του προστάτη. PLoS ONE 10 (8): e0134366. doi: 10.1371 /journal.pone.0134366

Συντάκτης: Craig Ν Robson, Βόρεια Ινστιτούτο για την Έρευνα του Καρκίνου, ΗΝΩΜΕΝΟ ΒΑΣΙΛΕΙΟ

Ελήφθη: 19 Φεβρουαρίου, 2015? Αποδεκτές: 8 του Ιουλίου του 2015? Δημοσιεύθηκε: 7, Αυγούστου, 2015

Copyright: © 2015 Dong et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς έλαβαν ειδική χρηματοδότηση για το έργο αυτό από το Τμήμα Heath της επαρχίας Γιουνάν (Grant No.2010NS053). Ο χρηματοδότης δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη είναι η πιο κοινή μορφή καρκίνου και η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο σχετίζονται μεταξύ των ανδρών στις Ηνωμένες Πολιτείες. Στην Κίνα, η συχνότητα εμφάνισης του καρκίνου του προστάτη αυξάνεται κάθε χρόνο. Η ιντερλευκίνη-6 (IL-6) είναι μία πλειοτροπική κυτοκίνη που διεγείρει τον πολλαπλασιασμό και ρυθμίζει βασικά κυτταρικά γεγονότα στον καρκίνο του προστάτη [1]. Η έκφραση της IL-6 είναι αυξημένα σε προχωρημένο καρκίνο του προστάτη [2] και συσχετίζεται με το βαθμό Gleason του καρκίνου του προστάτη [3] και της εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη [4]. Η IL-6 είναι ένας σημαντικός ενεργοποιητής της κινάσης /μετατροπέα σήματος Janus και ενεργοποιητής της μεταγραφής 3 μονοπατιού στον καρκίνο του προστάτη [5]. IL-6 μπορεί επίσης να ενεργοποιήσει το ενεργοποιείται από μιτογόνο κινάσης πρωτεΐνης [6]. Ωστόσο, η IL-6 ανάντη μονοπάτι trans-σηματοδότησης στον καρκίνο του προστάτη παραμένει λίγο κατανοητή.

Προγραμματισμένος θάνατος κυττάρου 4 (PDCD4) είναι ένας καταστολέας της ογκογένεσης, της προόδου των όγκων, και εισβολή που δρα με ή χωρίς πρόκληση εκκινητή. PDCD4 ήταν η πρώτη καταστολέας βρέθηκε να στοχεύουν μετάφραση [7]. PDCD4 αλληλεπιδρά με έναρξη μετάφρασης παράγοντες eIF4A και eIF4G να αναστέλλουν τη μετάφραση σε ένα mRNA ειδικό τρόπο, που οδηγεί στην αναστολή των προ-ογκογόνο παράγοντες [8]. Η υπερέκφραση του PDCD4 αναστέλλει ογκογένεση και την εξέλιξη του όγκου σε ένα διαγονιδιακό μοντέλο ποντικού και αναστέλλει καρκινικών κυττάρων εισβολής in vitro.

Τα microRNAs (Mirs) είναι μικρά RNAs μη κωδικοποιητική που είναι μετα-μεταγραφική ρυθμιστές της γονιδιακής έκφρασης και σημαντικοί ρυθμιστές πολλών φυσιολογικών και παθολογικών διαδικασιών. Mirs επηρεάζουν επίσης την παραγωγή της πρωτεΐνης [9] και διαδραματίζουν καίριο ρόλο σε διαφορετικούς τύπους όγκων στον άνθρωπο [10]. έκφραση miR-21 είναι υψηλότερη σε ορισμένες στερεούς όγκους [11-13], περιλαμβανομένων των όγκων του προστάτη, σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς [14]. Επιπλέον, miR-21 είναι ένα ογκογονίδιο με αντιαποπτωτικών λειτουργία [15]. miR-21 αναστέλλει την απόπτωση στο ανδρογόνο ανεξάρτητες κυτταρικές γραμμές καρκίνου του προστάτη μεταστατικό ανδρογόνο-αρνητικών και PC-3 και DU-145 και μπορούν να ρυθμίζουν κινητικότητα και εισβολή σε αυτές τις κυτταρικές γραμμές [16].

Σε αυτή τη μελέτη, προσδιορίσαμε αν το IL-6 ρυθμίζει την έκφραση του γονιδίου PDCD4 και καθόρισε το ρόλο του miR-21 σε αυτή τη διαδικασία στη καρκίνου του προστάτη κυτταρικές γραμμές LNCaP και PC-3.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια

Οι κυτταρικές σειρές PC-3 και LNCaP ελήφθησαν από την Κουνμίνγκ Ινστιτούτο Ζωολογίας, κινεζική Ακαδημία Επιστημών. Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη IL-6 αγοράστηκε από την R &? D Systems (Minneapolis, ΜΝ). Gibco RPMI 1640 και ορό εμβρύου μόσχου αγοράστηκαν από την Life Technologies (Grand Island, ΝΥ)? HyClone 0,25% trypsinase από την GE Healthcare Επιστημών Ζωής (Piscataway, NJ)? και DMSO από τη Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ). Anti-miR-21 αναστολέα και αντι-miR-21 αρνητικού ελέγχου αγοράστηκαν από την ΑΒΙ Biotech (ΗΠΑ). Lipofectamine 2000 αγοράστηκε από την Invitrogen (Carlsbad, CA). Το κιτ RNAiso Plus για την απομόνωση του RNA, PrimeScript RT κιτ αντιδραστηρίων για cDNA αντίστροφη μεταγραφή, και τέλεια Real Time κιτ για την ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (qRT-PCR) αγοράστηκαν από την Takara Bio (Mountain View, CA) μαζί με το δείκτη DL1000 DNA . Αστάρια για το

PDCD4

και

GAPDH

ελήφθησαν από Sangon (Κίνα). Ανθρώπινο αντίσωμα μονοκλωνικό αντίσωμα και πολυκλωνικό κουνελιού αντι-PDCD4 αντι-β-ακτίνης αγοράστηκαν από Abcam (Cambridge, ΜΑ). IgG αντι-κουνελιού, HRP-συνδεδεμένη αντίσωμα αγοράστηκε από την Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ). Το κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης BCA και το ρυθμιστικό υλικό λύσεως RIPA αγοράστηκαν από Beyotime Ινστιτούτο Βιοτεχνολογίας (Κίνα). Επί τόπου κιτ υβριδισμού για HSP και DAB αγοράστηκαν από LBP Biotech Company (Κίνα).

Τα δείγματα ασθενούς

Είκοσι δείγματα το καθένα από καρκίνο του προστάτη, προκαρκινικές αλλοιώσεις, και η καλοήθης υπερπλασία του προστάτη δείγματα ιστών από ασθενείς με προστάτη άτυπη αδενωματώδη υπερπλασία, προστατική ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία, ή καλοήθη υπερπλασία του προστάτη, αντίστοιχα, που παρέχονται από το Τμήμα Παθολογίας, το δεύτερο Ενταγμένο Νοσοκομείο Κουνμίνγκ Ιατρικό Πανεπιστήμιο, Yunnan, Κίνα, από τον Ιανουάριο του 2010 έως τον Οκτώβριο του 2011. Όλα τα δείγματα που καθορίζονται στο φορμαλίνη, εγκλεισμένα σε παραφίνη, και τεμαχίστηκαν.

Κυτταροκαλλιέργεια

LNCaP και κυττάρων PC-3 καλλιεργήθηκαν σε 25-mL πλάκες σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, πενικιλλίνη ( 100 U /mL), και στρεπτομυκίνη (100 μg /mL) σε 37 ° C, 5% CO

2 θερμοκοιτίδα. Το μέσο καλλιέργειας αλλάζονται κάθε δεύτερη μέρα.

Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου

έκφραση PDCD4 προσδιορίστηκε με ανάλυση qRT-PCR. Κύτταρα (5 × 10

5) σπάρθηκαν σε κάθε φρεάτιο πλακών 6 φρεατίων, καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες, και επωάστηκαν με IL-6 (0, 5, ή 10 ng /mL) για 24 ώρες. RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ εκχύλισης RNA RNAiso Plus σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. ποιότητα του RNA μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ αντιδραστηρίου PrimeScript RT σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, πριν RNA μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA. Οι ακόλουθοι εκκινητές PDCD4 Χρησιμοποιήθηκαν: ανάντη εκκινητή 5′-CCTGAATTAGCACTGGATACTCCT-3 ‘και καθοδικά εκκινητή 5′-CTAGCCTGCACACAATCTACAGTT-3’. Οι ακόλουθοι εκκινητές GAPDH χρησιμοποιήθηκαν: πρόσθιος εκκινητής 5′-TCACTTTGTCACAGCCCAAG-3 ‘και αντίστροφος εκκινητής 5′-AGCAAGCAAGCAGAATTTGG-3’. Αντίστροφη μεταγραφή εκτελέστηκε στους 37 ° C για 15 λεπτά (αντίδραση μεταγραφής αντίστροφος), που ακολουθείται από 85 ° C για 5 s (αντίδραση αδρανοποίηση της αντίστροφης μεταγραφάσης), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η ενίσχυση διεξήχθη υπό τις ακόλουθες συνθήκες: για 2 κύκλους στους 95 ° C για 30 s το καθένα, που ακολουθείται από 40 κύκλους στους 95 ° C για 5 s και 60 ° C για 30 s

ανάλυση κηλίδος Western

κύτταρα (5 × 10

5) σπάρθηκαν σε κάθε φρεάτιο πλακών 6 φρεατίων, καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες, και επωάστηκαν με IL-6 (0, 5, ή 10 ng /mL) για 24 ώρες . Η συνολική πρωτεΐνη εκχυλίζεται χρησιμοποιώντας το ρυθμιστικό λύσης RIPA, και η συγκέντρωση πρωτεΐνης μετρήθηκε με τη δοκιμασία BCA. Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν ανάλογα με το μέγεθος με ηλεκτροφόρηση, μεταφέρθηκε σε μεμβράνη, και επωάζονται με τα ακόλουθα αντισώματα: PDCD4 αντίσωμα, 1: 5000? β-ακτίνη αντίσωμα, 1: 8000? και δευτερεύον αντίσωμα, 1: 5000. ImageQuant LAS4000 (GE Healthcare Life Sciences) χρησιμοποιήθηκε για την εικόνα των πηκτών.

κυττάρων επιμόλυνσης και IL-6 θεραπεία

Κύτταρα (5 × 10

5) σπάρθηκαν σε κάθε φρεάτιο πλάκες 6-φρεατίων και καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες για να εξασφαλιστεί ότι η ενσωμάτωση των επιμολυσμένων κυττάρων ήταν τουλάχιστον 60%. Το μέσο αλλάχθηκε μία φορά πριν από την επιμόλυνση 4-h σε μέσο ελεύθερο από αντιβιοτικά με Lipofectamine 2000, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η τελική συγκέντρωση του αναστολέα αντι-miR-21 και αρνητικός έλεγχος ήταν 30 ηΜ. Το μείγμα μετεμβολιασμού επωάζεται σε θερμοκρασία δωματίου για 20 λεπτά και στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε 37 ° C, 5% CO

2 εκκολαπτήριο για 30 λεπτά. Το μέσο αντικαταστάθηκε με φρέσκο, ελεύθερο αντιβιοτικών RPMI 1640 μετά από 6 ώρες. Τα κύτταρα επωάστηκαν με ή χωρίς IL-6 (10 ng /mL) για 24 ώρες πριν να συλλέγονται και χρησιμοποιούνται για qRT-PCR και κηλίδας Western αναλύσεις για την ανίχνευση της έκφρασης PDCD4.

Ανοσοϊστοχημική ανάλυση

ο καρκίνος του προστάτη, προκαρκινικές αλλοιώσεις, και καλοήθη δείγματα ιστού προστατικής υπερπλασίας κόπηκαν σε 2-mm-φέτες πάχους και μονιμοποιήθηκαν σε 10% φορμαλίνη για 24 ώρες. Οι φέτες στη συνέχεια αποπαραφινοποιήθηκαν, αντιγόνο ανακτήθηκε από αυτούς, και επωάστηκαν σε υπεροξείδιο του υδρογόνου για 15 λεπτά. Το πρώτο αντίσωμα (50 μί? Συγκέντρωση 1: 500) προστέθηκε σε κάθε φέτα και επωάστηκαν στους 4 ° C όλη τη νύκτα. HRP Polymer (HRP δευτερογενούς αντισώματος) προστέθηκε σε πλύθηκε διαφάνειες, και πλάκες επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. Στη συνέχεια, 1 mL DAB Plus υπόστρωμα προστέθηκε στάγδην σε κάθε διαφάνεια μαζί με 2 σταγόνες DAB συν Chromogen και επωάστηκαν για 10 λεπτά. Τα πλακίδια πλύθηκαν, αντίθετη χρώση, και αφυδατωμένο πριν την προσθήκη του διαφανές μέσο στερέωσης και καλυπτρίδες. Όλες οι φέτες αξιολογήθηκαν ξεχωριστά με 2 παθολόγους και βαθμολογούνται ως -, +, ++ ή +++, ανάλογα με το βάθος της χρώσης PDCD4 στο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα. Μπορούμε επίσης να εντοπίσει τα βασικά κύτταρα με χρώση p63.

Στατιστικές αναλύσεις

Τα δεδομένα αναλύθηκαν από το SPSS17.0 στατιστικό λογισμικό. Η Chi-τετράγωνο τεστ χρησιμοποιήθηκε για την εκτίμηση των διαφορών μεταξύ των εκφράσεων του PDCD4 και PSA. Η δοκιμή Shapiro-Wilk χρησιμοποιήθηκε για να εξετάσει την κανονικότητα των δεδομένων από ανοσοϊστοχημική ανάλυση, και μονόδρομη ANOVA χρησιμοποιήθηκε για να συγκριθεί η διαφορά μεταξύ των ομάδων παρέμβασης. τουλάχιστον σημαντική διαφορά του Fisher της δοκιμής (LSD) χρησιμοποιήθηκε για τη δοκιμή διαφορές μεταξύ των 2 ομάδων.

Ηθική Δήλωση

Η μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας του Δευτέρου Ενταγμένο Νοσοκομείο Ιατρικό Πανεπιστήμιο Κουνμίνγκ και διεξάγεται σύμφωνα με τη Διακήρυξη του Ελσίνκι. Η ανάγκη να λάβει γραπτή συγκατάθεση είχε παραιτηθεί από το διοικητικό συμβούλιο θεσμική αναθεώρηση, διότι αυτό ήταν μια αναδρομική μελέτη. τα αρχεία των ασθενών ήταν ανώνυμα πριν από την ανάλυση.

Αποτελέσματα

έκφραση PDCD4 σε τύπους ιστού του προστάτη

PDCD4 πρωτεΐνη εκφράζεται κυρίως στο κυτταρόπλασμα, αλλά εκφράστηκε επίσης, σε μικρότερο έκταση στον πυρήνα των δειγμάτων προκαρκινικών προστάτη και της υπερπλασίας του προστάτη. Υπήρχε μια σημαντική διαφορά στο πρότυπο έκφρασης PDCD4 μεταξύ δείγματα καρκίνου του προστάτη, προστατική ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία, και προστατικής υπερπλασίας (Σχήμα 1). Σε φτωχά διαφοροποιημένο καρκίνωμα, η έκφραση PDCD4 ήταν χαμηλή ή απούσα. έκφραση PSA ήταν υψηλότερη σε δείγματα από καρκίνο του προστάτη από εκείνα από καλοήθη υπερπλασία του προστάτη (Σχήμα 1). Τα αποτελέσματα από PSA και χρώση PDCD4 σε διαφορετικούς τύπους ιστού του προστάτη αποκάλυψε ότι η λιγότερο διαφοροποιημένη ο καρκίνος του προστάτη, τόσο χαμηλότερο είναι το επίπεδο της έκφρασης PDCD4 και όσο υψηλότερο είναι το επίπεδο της έκφρασης PSA. Τα αποτελέσματα της χρώσης ρ63 έδειξε ότι τα βασικά κύτταρα ήταν άφθονο σε ΒΡΗ, σπανίζουν σε ΡΙΝ και απούσα σε PCa ιστού (Εικόνα 1).

Στον καρκίνο του προστάτη, σημαντική ποσότητα της κανονικής αδένα λείπει. Οι φωλιές του καρκίνου σχηματίζονται με ακανόνιστες αδένες ηθμοειδή, και ο καρκίνος διεισδύει το μυϊκό ιστό και κυτταρόπλασμα. Αυτό το πρότυπο χρώσης βαθμολογήθηκε PDCD4 (+), PSA (+++). Στην προστατική ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία, το πρότυπο χρώσης βαθμολογήθηκε PDCD4 (++), PSA (++). Σε υπερπλασία του προστάτη /αδενική υπερπλασία, το μοτίβο πυρηνική χρώση βαθμολογήθηκε PDCD4 (+++), PSA (+/-). Η έκφραση των PDCD4 και PSA ήταν διαφορετικά (

x

2 = 8.632,

P

& lt? 0,05) μεταξύ των τύπων 3 ιστού. Στη δοκιμή κατάταξης Spearman, τα επίπεδα έκφρασης των PDCD4 και PSA μεταξύ των 3 τύπων ιστών του προστάτη συσχετίζεται αρνητικά (-1 & lt?

r

& lt? 0).

Η

Επίδραση της miR-21 αναστολή επί της έκφρασης PDCD4

Ένα miR-21-ρυθμίζονται τόπο στην 3’UTR της PDCD4 έχει αναφερθεί σε κύτταρα HeLa αυχενικού καρκινώματος [17]. Για να καθοριστεί εάν miR-21 ρυθμίζει επίσης την έκφραση PDCD4 στον καρκίνο του προστάτη, κυτταρικές σειρές LNCaP PC-3 και επιμολύνθηκαν με αναστολέα miR-21 να μειώσει την ποσότητα του ενδογενούς miR-21 πριν από τη μέτρηση PDCD4 mRNA και η έκφραση της πρωτεΐνης με πραγματικού χρόνου PCR και ανοσοστύπωση, αντίστοιχα. Το επίπεδο έκφρασης mRNA PDCD4 ήταν υψηλότερη στην ομάδα επιμολυσμένα ό, τι σε οποιαδήποτε από τις ομάδες ελέγχου, με την έκφραση σε κύτταρα LNCaP είναι υψηλότερο από ότι σε κύτταρα PC-3 (σχήμα 2α) (

F

= 20.562,

P

& lt? 0.001). έκφραση πρωτείνης PDCD4 αυξήθηκε μετά LNCaP και κυττάρων PC-3 επιμολύνθηκαν με τον αναστολέα miR-21 (Σχήμα 2β) (κύτταρα PC-3:

Z

= -3,920,

P

& lt? 0.001 ? κύτταρα LNCaP:.

Z

= 3.883,

P

& lt? 0.001), γεγονός που υποδηλώνει ότι PDCD4 ρυθμίζεται από miR-21 σε αυτές τις κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη

qRT- αποτελέσματα PCR που δείχνουν μια αύξηση στην έκφραση του mRNA του PDCD4 PC-3 και LNCaP κύτταρα μορφομετατραπέντα με αναστολέα miR-21, υποδεικνύοντας ότι PDCD4 το ​​mRNA εκφράζεται διαφορικά μεταξύ των δύο ομάδων. Μεταξύ των miR-21-ανέστειλε κυττάρων, έκφραση PDCD4 mRNA σε κύτταρα LNCaP ήταν σημαντικά υψηλότερη από ότι σε κύτταρα PC-3. έκφραση PDCD4 mRNA του LNCaP και PC-3 κυττάρων ρυθμίζεται προς τα κάτω μετά από μια θεραπεία 24 ώρες με διαφορετικές συγκεντρώσεις IL-6. (Β) ανάλυση κηλίδας Western που δείχνει μια αύξηση στα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης PDCD4 σε PC-3 και LNCaP κύτταρα μορφομετατραπέντα με τον αναστολέα miR-21. Μη επιμολυσμένα και τα κύτταρα αρνητικού ελέγχου ήταν κατετάγη 1 έως 6 στη δοκιμή κατάταξη των ζευγών δειγμάτων. Τα επίπεδα της πρωτεΐνης έκφρασης PDCD4 των LNCaP και PC-3 κυττάρων ρυθμίζεται προς τα κάτω μετά από μια θεραπεία 24 ώρες με διαφορετικές συγκεντρώσεις IL-6.

Η

έκφραση PDCD4 μετά IL-6 θεραπεία

Τα αποτελέσματα από την ανάλυση qRT-PCR αποκάλυψε μια σημαντική μείωση στην μεταγραφή του PDCD4 σε PC-3 και LNCaP κύτταρα μετά από προθεραπεία με IL-6 (5 ή 10 ng /mL? Σχήμα 3α). Τα αποτελέσματα από την ανάλυση κηλίδος Western αποκάλυψε μια σημαντική μείωση στη μετάφραση της PDCD4 μετά από προθεραπεία με IL-6 (5 ή 10 ng /mL? Σχήμα 3b). Επιπλέον, υπήρχε μια αρνητική συσχέτιση μεταξύ της συγκέντρωσης της IL-6 και το επίπεδο της προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης PDCD4. έκφραση PDCD4 μειώθηκε περισσότερο σε PC-3 κύτταρα από ό, τι στα κύτταρα LNCaP. PC-3 και LNCaP κύτταρα σταθερά επιμολυσμένα με τον αναστολέα miR-21 και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με IL-6 (10 ng /mL) για τον προσδιορισμό του ρόλου του miR-21 στη ρύθμιση της έκφρασης PDCD4 από την IL-6. Και στις δύο PC-3 και LNCaP κύτταρα, το επίπεδο του mRNA PDCD4 και έκφραση πρωτεΐνης στα επιμολυσμένα ομάδες ήταν υψηλότερη από ότι σε καμία από τις ομάδες ελέγχου ή τις ομάδες αρνητικού ελέγχου (Σχήμα 4). Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, PDCD4 ήταν ο στόχος της ρύθμισης miR-21 και IL-6 ανέστειλε την έκφραση PDCD4 μέσω miR-21.

Τα επίπεδα της έκφρασης PDCD4 mRNA σε LNCaP και PC-3 κύτταρα ρυθμίζεται προς τα κάτω μετά από μια 24- h θεραπεία με IL-6 σε 0, 5, ή 10 ng /mL. Η διαφορά υπήρχε στατιστική σημασία (α) μεταξύ τους. Η ίδια διαφορά παρατηρήθηκε επίσης στα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης PDCD4 (β). (Α) έκφραση mRNA PDCD4 των LNCaP και PC-3 κυττάρων ρυθμίζεται προς τα κάτω μετά από μια θεραπεία 24 h με IL-6 σε 10 ng /mL. (Β) έκφραση PDCD4 πρωτεΐνη LNCaP και PC-3 κυττάρων ρυθμίζεται προς τα κάτω μετά από μια θεραπεία 24 h με IL-6 σε 10 ng /mL,

Η

έκφραση πρωτεΐνης PDCD4 ήταν σημαντικά υψηλότερη σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη επιμολυσμένα με το miR-21-αναστολέα πριν IL-6 θεραπεία σε σχέση με τα κύτταρα που δεν επιμολύνθηκαν με τον αναστολέα (μονόδρομη δοκιμή ANOVA:

F

value = 241.781,

P

& lt? 0,05) . Επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης PDCD4 σε επιμολυσμένα και μη επιμολυσμένα κύτταρα και των δύο κυτταρικές σειρές ήταν σημαντικά διαφορετικές (δοκιμή LSD:

P

& lt? 0,05).

Η

Συζήτηση

αυτή η μελέτη, βρήκαμε ότι η έκφραση της πρωτεΐνης PDCD4 μειώθηκε με μείωση στην έκταση της διαφοροποιήσεως του ιστού του προστάτη. Η παρατήρηση αυτή υποδηλώνει ότι η έκταση της κακοήθειας σε προστάτη καρκινικούς ιστούς σχετίζεται με PDCD4 έκφρασης. Ένα παρόμοιο μοτίβο παρατηρείται σε καρκίνους του πεπτικού συστήματος [18], ο καρκίνος του ήπατος [19], πορογενές καρκίνωμα του μαστού [20], και ρινοφαρυγγικού καρκίνου του [21]. Δεδομένου ότι τα επίπεδα έκφρασης του PDCD4 διαφέρουν με την έκταση της νόσου στους ιστούς του προστάτη, PDCD4 μπορεί να είναι μια πολλά υποσχόμενη δείκτης όγκου τόσο για τη διάγνωση και τη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη (Σχήμα 1). Βρήκαμε επίσης ότι PDCD4 εκφράστηκε τόσο σε αυλού κύτταρα και τα βασικά κύτταρα σε καλοήθη υπερπλασία του προστάτη, αλλά σε ιστούς ΡΙΝ και PCa εκφράζεται κυρίως σε αυλού κύτταρα (Σχήμα 1), και οι εκφράσεις του PDCD4 και PSA είχαν συσχετίζονται αρνητικά στους ιστούς του προστάτη, γεγονός που υποδηλώνει ότι η διάγνωση του καρκίνου του προστάτη μπορεί να διευκολυνθεί με συνδυασμό την ανίχνευση των 2 παράγοντες.

η μελέτη μας διαπίστωσε επίσης ότι PDCD4 είναι ένας στόχος της ρύθμισης miR-21 σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη. miR-21 είναι γνωστό ότι υπερεκφράζεται σε πολλούς τύπους συμπαγών όγκων. Ώριμη miR-21 μπορεί να μειώσει την έκφραση PDCD4 με διέγερση της οδού ΤΟΡ-β, η οποία είναι ένας ρυθμιστής του PDCD4 [22]. Επιπλέον, μια συντηρημένη τόπος πρωτεΐνη έχει ταυτοποιηθεί στην αλληλουχία PDCD4, μέσω των οποίων miR-21 ρυθμίζει την έκφραση PDCD4 να επάγει εισβολή και μετάσταση όγκου [23]. Συνεπής με τα προηγούμενα ευρήματα [24,25], η μελέτη μας υποστηρίζει ότι το miR-21 και PDCD4 έχουν μια αρνητική συσχέτιση με miR-21 μειώνοντας την έκφραση PDCD4 και επαγωγή των καρκινικών κυττάρων εισβολής και μακρινή μετάσταση.

Για να προσδιορίσετε αν το miR -21 και PDCD4 εκφράσεις ήταν διαφορετικές σε ανδρογόνο-εξαρτώμενη και ανεξάρτητη από ανδρογόνο καρκίνο του προστάτη, πραγματοποιήσαμε μελέτες μας στην μη εξαρτώμενου από ανδρογόνα καρκίνου του προστάτη κυτταρική γραμμή PC-3 και το ανδρογόνο-εξαρτώμενη κυτταρική γραμμή καρκίνου του προστάτη LNCaP. Σε αμφότερες τις κυτταρικές γραμμές, PDCD4 ήταν ένας στόχος της miR-21 στο μεταγραφικό και μεταφραστικό επίπεδο. Ωστόσο, ο μηχανισμός δράσης των miR-21 στη ρύθμιση PDCD4 ήταν διαφορετική στα ανδρογόνα εξαρτώμενα και ανδρογόνο-ανεξάρτητα κύτταρα, με miR-21 αναστολή που επηρεάζουν την έκφραση PDCD4 σε μεγαλύτερο βαθμό σε PC-3 κύτταρα από ό, τι στα κύτταρα LNCaP. Έτσι, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι το γονίδιο PDCD4 είναι ο στόχος της ρύθμισης miR-21 σε καρκίνο του προστάτη.

Τα κυκλοφορούντα επίπεδα της IL-6 σε στερεούς όγκους μπορεί να είναι προγνωστικής σημασίας σε ασθενείς με μεταστατικό και ορμόνες πυρίμαχων προστάτη του καρκίνου [26]. IL-6 προωθεί τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκίνου του προστάτη με την ενεργοποίηση του υποδοχέα ανδρογόνων (AR), και αυτό το αποτέλεσμα αναστέλλεται από αντι-ανδρογόνα όπως βικαλουταμίδης [27]. Επιπλέον, miR-21 μπορεί να ρυθμίζει την έκφραση AR κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του καρκίνου του προστάτη. [28] Οι μελέτες μας δείχνουν ότι miR-21 προάγει την ανάπτυξη των κυττάρων καρκίνου του προστάτη με προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης του PDCD4. Ως εκ τούτου, AR μπορεί να είναι ο κοινός στόχος για την IL-6 και miR-21 σε καρκίνο του προστάτη, με miR-21 παίζει έναν διαμεσολαβητικό ρόλο στην ενεργοποίηση της IL-6 για τη ρύθμιση της έκφρασης PDCD4. Επίσης, IL-6 επηρεάζει την έκφραση PDCD4 όλη την ανάπτυξη του καρκίνου του προστάτη σε τόσο ανδρογόνο-εξαρτώμενη καρκίνου του προστάτη και ανεξάρτητου από ανδρογόνο καρκίνου του προστάτη.

Συμπεράσματα

Αυτή η μελέτη παρέχει πειραματικά δεδομένα για την οδήγηση μελλοντικές προσπάθειες στη γονιδιακή θεραπεία του καρκίνου του προστάτη και διάγνωσης που βασίζονται σε IL-6, miR-21, και PDCD4.

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Δρ Zhiwei γιουάν για βοήθεια σχετικά με ανοσοϊστοχημική ανάλυση.