Αφηρημένο

O

6-μεθυλγουανίνη-DNA μεθυλοτρανσφεράση (MGMT) είναι ένα από τα κύρια πρωτεΐνη επιδιόρθωσης του DNA ότι εξουδετερώνει την alkalyting παράγοντα που προκαλείται από βλάβες του DNA με την αντικατάσταση O

6-μεθυλγουανίνη (μεταλλαξιογόνες βλάβη) πίσω στη γουανίνη, τελικά καταστέλλοντας τα λάθη αναντιστοιχία και το διπλό σταυρωτές συνδέσεις σκέλος. Εξονικές μεταβολές στη μορφή νουκλεοτιδίου πολυμορφισμός μπορεί να οδηγήσει σε αλλοιωμένη πρωτεϊνική δομή που με τη σειρά του μπορεί να οδηγήσει στην απώλεια της λειτουργίας. Στην παρούσα μελέτη, εστιάσαμε στον πληθυσμό φόβος για την υψηλή έκθεση σε αλκυλιωτικούς παράγοντες, λόγω τυπικών και εξειδικευμένες διατροφικές τους συνήθειες. Για το σκοπό αυτό, οι ασθενείς με γαστρικό καρκίνο συγκεντρώθηκαν έξω από επελέγησαν ο πληθυσμός για την μεταλλακτική διαλογής μιας συγκεκριμένης επιρρεπής σε λάθη περιοχή του γονιδίου MGMT. Βρήκαμε ότι σχεδόν το 40% των υπό μελέτη νεοπλασματικών δείγματα έτρεφε παρερμηνεύσιμη μετάλλαξη στο κωδικόνιο

151 με αποτέλεσμα σε σερίνη σε ισολευκίνη παραλλαγή. Αυτή η παραλλαγή είχε ως αποτέλεσμα επιφέρει τη δομική διαταραχή, στη συνέχεια ακολούθησε σε ένα σημαντικό στοιχειομετρική διακύμανση στον τομέα αναγνώρισης, πρόσδεσης υποστρώματος και εκλεκτικότητα βρόχο του ενεργού κέντρου της πρωτεΐνης MGMT, όπως παρατηρείται υπό εικονικό μικροσκόπιο προσομοίωσης μοριακής δυναμικής (MDS). Η ατομική διορατικότητα MGMT πρωτεΐνης με υπολογιστική προσέγγιση έδειξε μια σημαντική αλλαγή στο εσωτερικό πρότυπο μοριακό δεσμό υδρογόνου, με αποτέλεσμα να τις παρατηρούμενες διαρθρωτικές ανωμαλίες. Για να εξεταστεί περαιτέρω τις μεταλλακτική επιπτώσεις στην ρυθμιστική βύσματα του MGMT που συγκρατεί την πρωτεΐνη σε ένα DNA-Binding θέση, μια ανάλυση που βασίζεται MDS διεξήχθη σε, όλα τα γνωστά φυσικά αλληλεπιδρούν αμινοξέα συγκεντρωμένοι ουσιαστικά σε ομάδες με βάση τη θέση και τη λειτουργία τους. Τα αποτελέσματα προκύπτουν από τη φυσική λειτουργική ομαδοποίηση των πρωτεϊνών έδειξαν ότι το ταυτοποιημένο μετάλλαξη στην περιοχή του ενεργού κέντρου της πρωτεΐνης MGMT προκαλεί την τοπική και παγκόσμια αποσταθεροποίηση μιας πρωτεΐνης είτε με εξάλειψη των σταθεροποιητικό γέφυρες άλατος στο σύμπλεγμα C3, C4, και C5 ή με τοπικά αποσταθεροποίηση της «hing πρωτεΐνη σταθεροποίηση» χαρτογραφηθεί στο σύμπλεγμα C3-C4, που προηγείται του ενεργού κέντρου

Παράθεση:. Chikan NA, Bukhari S, Shabir Ν, Amin A, Σάφι S, Qadri RA, et al. (2015) Ατομικής Insight στην Altered O

6-μεθυλγουανίνη-DNA μεθυλοτρανσφεράσης Αρχιτεκτονική πρωτεΐνης σε γαστρικό καρκίνο. PLoS ONE 10 (5): e0127741. doi: 10.1371 /journal.pone.0127741

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Reiner Albert Veitia, Institut Jacques Monod, Γαλλία

Ελήφθη: 16 Δεκ, 2014? Αποδεκτές: 19 Απριλίου του 2015? Δημοσιεύθηκε: May 26, 2015

Copyright: © 2015 Chikan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

χρηματοδότηση:. η έρευνα χρηματοδοτήθηκε από το Πανεπιστήμιο VIT επιστημονικός συνεργάτης επιχορήγηση και ο οργανισμός χρηματοδότησης δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Αν και μειώνεται, η ασθένεια του καρκίνου του στομάχου, σύμφωνα με GOLOBOCON 2012 είναι. εξακολουθεί να είναι η τρίτη κυριότερη αιτία θανάτου από καρκίνο παγκοσμίως [1, 2]. Στην παθογένεση της νόσου αυτής, διάφορες γενετικές και μοριακές μεταβολές λαμβάνουν χώρα οδηγούν στην κακοήθη μετασχηματισμό του γαστρικού βλεννογόνου [3]. Αυτός ο μετασχηματισμός είναι μια διαδικασία πολλαπλών σταδίων που περιλαμβάνει τις ανωμαλίες σε σημαντικές κυτταρικές λειτουργίες, όπως η επιδιόρθωση του DNA, πρόσφυση, μεταγωγής σήματος, κυτταρική διαφοροποίηση και άλλοι [4,5]. Αλκυλίωση καρκινογόνα όπως Ν-νιτρωδοδιμεθυλαμίνη, Methyl νιτροζουρία (NMU), Ν-μεθυλ-Ν’-νιτρο-Ν-νιτρογουανιδίνη κλπ οδηγήσει στο σχηματισμό O

6-μεθυλγουανίνη, ένα προϊόν προσθήκης DNA των οποίων η παρουσία οδηγεί στην επαγωγή μεταλλάξεων ( G: C-Α: Τ μετάπτωση) και έχει ως αποτέλεσμα την ανάπτυξη του καρκίνου του [6-10].

MGMT

είναι το ένζυμο που είναι υπεύθυνο για την επισκευή προσαγωγές O

6-μεθυλγουανίνη [11-13]. MGMT είναι ένα αυτοκτονικό ένζυμο που απομακρύνει μία ομάδα μεθυλίου από το Ο

6-θέση σε γουανίνη και την μεταφέρει στο δικό κατάλοιπο κυστίνης του στο κωδικόνιο 145 στην πρωτεΐνη, αδρανοποιώντας έτσι το ίδιο κατά την επισκευή γουανίνη [14]. Σύμφωνα με την έκθεση του NMU, έχουν MGMT ελαττωματικού ποντίκια παρατηρήθηκαν για την ανάπτυξη του καρκίνου [15], ενώ ως διαγονιδιακά ποντίκια που φέρουν επιπλέον αντίγραφα του γονιδίου ξένων MGMT ήταν λιγότερο επιρρεπείς στη νόσο [16] .Η, γενετικός πολυμορφισμός του ενζύμου αυτού έχει αποδειχθεί ότι είναι ένας πιθανός παράγοντας κινδύνου για τον καρκίνο [17-22]. Συνεπώς, η παρούσα μελέτη εστιάζει στην μεταλλακτική χαρακτηριστικών των επιρρεπής σε λάθη περιοχή του εξονίου 5 της MGMT το οποίο κωδικοποιεί για την ενεργή θέση της πρωτεΐνης, δηλαδή ενεργή θέση που περιβάλλεται από περιοχές υπεύθυνες για εκμετάλλευση επάνω του DNA [13]. Ο εκπρόσωπος του πληθυσμού των ασθενών με καρκίνο του στομάχου που έχει επιλεγεί για την παρούσα μελέτη παρουσιάζει μια μοναδική ομάδα ουσιαστικά είναι ιδιαίτερα εκτεθειμένα σε διατροφικές αλκυλιωτικούς παράγοντες [6, 23-28].

Η χρήση του

Insilico

τεχνικές για να κατανοήσουν την επίδραση του πολυμορφισμού στην πρωτεϊνική δομή και τη δυναμική υπήρξε στην πράξη και μια πληθώρα δουλειά έχει γίνει στο θέμα αυτό [29-32]. Η υποβοηθούμενη από υπολογιστή μέθοδοι πρόβλεψης με χρήση εξελικτικών και τη δομή πρόβλεψη βασίζεται δίνει μια εικόνα για την επιζήμια ικανότητα του πολυμορφισμού [33]. Οι μοριακή δυναμική μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να παρακολουθήσει τις διαμορφωτικές μεταβολές ο πολυμορφισμός μπορεί να προκαλέσει στην πρωτεΐνη. Αυτές οι διαμορφωτικές μεταβολές στην τρισδιάστατη δομή της πρωτεΐνης μπορεί να επηρεάσει τις φυσιολογικές συγγένειες και διάφορες βιοχημικές αλληλεπιδράσεις οδό. Για να εξεταστεί η επίδραση της μετάλλαξης σε εξελικτικής καθώς και ατομικό επίπεδο, Insilico προβλέψεις χρησιμοποιώντας διαφορετικά servers καθώς και MDS του άγριου τύπου (wt) και Mutant (Mu) πρωτεΐνη MGMT διεξήχθη. Για τροχιές πρωτεΐνη MDS και ανάλυση ατομική αλληλεπίδραση, gromacs χρησιμοποιήθηκαν ενσωματωμένο εργαλεία. Ανάλυση των κύριων συστατικών (PCA) διεξήχθη για να εκτιμηθεί η ευκαμψία και των δύο δομών. Ελεύθερη ενέργεια τοπία (FEL) των ιθαγενών και Mu MGMT μελετήθηκαν επίσης να κατανοήσουν την επίδραση της μετάλλαξης.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Το τμήμα εξόνιο 5 του γονιδίου MGMT, ενισχύθηκε επιτυχώς από όλα τα δείγματα . Αμπλικόνια μετά αλληλουχίας έδειξε μια μετάλλαξη μεταστροφής στο κωδικόνιο 151AGC, οι αλληλουχίες των οποίων έχουν υποβληθεί σε αριθμούς πρόσβασης GeneBank φέρει KM000795 και KM000796. Η in silico εργαλεία για τη μελέτη της πιθανής βλαπτική επίδραση της μετάλλαξης επελέγησαν σχολαστικά, έτσι ώστε κάθε παράγοντας έχει εξεταστεί και το διπλό ελέγχεται με άλλο εργαλείο το οποίο χρησιμοποιεί διαφορετικό αλγόριθμο. Οι λεπτομέρειες των servers που χρησιμοποιούνται στη μελέτη μας που περιγράφονται στο S1 πίνακα, όπου υπάρχει αλγόριθμο, που εργάζονται και τα κριτήρια για την πρόβλεψη είναι δεδομένη. Επιλεγμένο διακομιστή προβλέπει η μετάλλαξη να είναι επιζήμια. Οι τροχιές προσομοίωσης MDS για 30ns τρέξει για κβ και της μεταλλαγμένης πρωτεΐνης αναλύθηκαν εκτενώς χρησιμοποιώντας gromacs ενσωματωμένο εργαλεία. S1 Σχήμα δείχνει μία nsSNP στο κωδικόνιο 151 που οδηγεί σε μία παρερμηνεύσιμη μετάλλαξη από Ser σε Ile, διαφορετικά σε μορφή άγριου τύπου, βοηθά σε αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-DNA [34-36]. Όπως φαίνεται στο σχήμα 1, wtMGMT. (PDBID: 1T39) SER 151, εκτός από την πραγματοποίηση κανονική ηλεκτροστατική αλληλεπίδραση με θυμίνη σχηματίζονται επίσης δύο δεσμούς υδρογόνου με αυτό μέσω αμιδικών άζωτο

Η

Το σχήμα 2 δείχνει τις στιγμιότυπα των δύο κ.β. και Mu δομές σε διαφορετικά χρονικά διαστήματα, που προβλέπουν τη σύνοψη της επίδρασης της μετάλλαξης σε διαρθρωτική δυναμική των MGMT. Από snap πυροβολισμούς, η δομή Mu πλην οποίες προκύπτουν επεκτάθηκε διαμόρφωση, σχηματίζεται επίσης ελικοειδή διαμόρφωση σε αριθμό αμινοξέος 87 έως 90, δίνοντας μια ιδέα ότι η μετάλλαξη δεν ευνοεί τη δομική συμπαγές της πρωτεΐνης, η οποία inturn οδηγεί σε κίνδυνο και εκτραπέντος διαμόρφωση του έχει μια σημαντική διαρθρωτική αλλαγή που είναι ζωτικής σημασίας στην πρόκληση defunct της λειτουργίας των πρωτεϊνών [37]. Μετά οπτική ανάλυση, g_rms εργαλείο χρησιμοποιήθηκε για να υπολογιστεί η RMSD για άτομα πρωτεΐνη, χρησιμοποιώντας την εκκίνηση δομή ως σημείο αναφοράς. Η μεταλλαγμένη δομή έδειξε απότομη αύξηση στην RMSD σε περίπου 17 ns. Στις παρατηρώντας την ανωμαλία στο επίπεδο δομή, διαπιστώσαμε ότι ελικοειδών και βρόχου περιεχόμενο του μεταλλαγμένου δομή ποικίλει (Σχήμα 3Α). Η RMSD από το μέσο όρο του χρόνου αναφέρεται ως RMSF, g_rmsf χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό του ατομικού τυπική απόκλιση και σε παρατήρηση, η δομή Mu έδειξαν υψηλότερη ευκαμψία. Η RMSF των δύο δομών έδειξε μια μικρή αλλαγή στο υπόλειμμα 151, αλλά ποικίλλει σημαντικά σε μία περιοχή βρόγχου πρωτεΐνης του 27 φτάνοντας τα 53 (σχήμα 3Β), το οποίο θα μπορούσε να είναι η συνισταμένη μιας διαμοριακής μεγάλης εμβέλειας παραλλαγή τριτογενή αλληλεπίδραση. Σε εργαλείο r_rmsf η επιλογή-OQ χρησιμοποιήθηκε για να μετατρέψει την τιμή RMSF σε τιμές Παράγοντα Β και σιωπηρή τους στη μέση διάρθρωση (μπλε αντιπροσωπεύει την πιο σταθερή και πιο κόκκινο διακυμάνσεις). Το συγκριτικό παράγοντα Β προβολής (S2A σχήμα) σε βάρος και Mu MGMT δείχνει κυρίως τις διακυμάνσεις διακυμάνσεις εντός του μέσου όρου της δομής, δίνοντάς μας μια εικόνα για την αλλαγή της διακύμανσης μοτίβο μεταξύ των δύο δομών. Το μοτίβο χρωματισμός είναι προεπιλεγμένη κυμαίνονται μεταξύ μπλε σε κόκκινο. Μια σημαντική αλλαγή στη διακύμανση που παρατηρείται στη δομή Mu, εκτός από την οποία ο μέσος διάταξη δευτερεύουσα δομή (S2B σχήμα) διέφεραν σημαντικά το οποίο και πάλι σημαίνει ότι η Mu μπορεί να είναι επιζήμια για την επιδιόρθωση του DNA.

Τα στιγμιότυπα ανακτήθηκαν σε κάθε διάστημα 5 ns κατά μήκος της προσομοίωσης 30 ns.

η

(Ένθετα Α και Β) δείχνει τις σχετικές δομές στο σημείο RMSD άλμα. υπόλειμμα RMSF (β) MGMT κατά μήκος της MDS και το βέλος που δείχνει έξω προς την περιοχή που δείχνει τη μέγιστη διακύμανση. (Γ) Η RMSD εναντίον μονάδες Ατομικής. Οικόπεδο δείχνουν εξαιρετικά ασταθείς καμπύλη Mu με κόκκινο χρώμα.

Η

Για να αναλύσουμε το σχήμα της πρωτεΐνης σε κάθε δεδομένη στιγμή, g_ περιστρέφομαι εργαλείο χρησιμοποιήθηκε, η οποία υπολογίζει την ακτίνα περιστροφής μιας ομάδας ατόμων κατά μήκος του x -, γ- και άξονα Ζ, ως συνάρτηση του χρόνου. Τα αποτελέσματά μας αποδεικνύουν την σημαντική απόκλιση σε ακτίνων περιστροφής στη δομή Mu, πέρασε μετά από 17 ns τρέξει (S3 Εικ). Ενώ καθώς είναι γνωστό ότι η δομή MGMT δεν μεταβάλλεται με την μεγάλη έκταση σε σύγκριση με δομή MGMT δεσμευμένο-DNA, ενδεικτική της σταθερής δεσμευμένης δομής μέσω στενή σύνδεση των υπολειμμάτων αναγνώρισης (Ala126, Ala127, Ala129, Gly131 και Gly132), και Ser93, Thr95, Gln115, Asn123 και Ser151, αλληλεπιδρώντας με το φωσφορικό σκελετό του DNA [36] ωστόσο, δεδομένου ότι η Radi περιστροφής καταγράφηκε να αυξηθεί λόγω της μετάλλαξης και ως εκ τούτου προτείνει την εκτεταμένη ανέτρεψε δομή της πρωτεΐνης προφανώς αδέξια μετατοπίζει το δάχτυλο αργινίνη (intrahelical τοποθετηθεί Arg128) από τη θέση του, η οποία είναι υπεύθυνη για την προώθηση της κτύπημα των νουκλεοτιδίων στο ενεργό κέντρο MGMT, έτσι θα μπορούσε να βλάψει την επιμέλεια που απαιτείται για την αφαίρεση O

6-μεθυλγουανίνη προσαγωγού από το DNA

Επιπλέον, όπως ξέρουμε ότι κάθε αμινοξύ έχει τη δική του υδροφοβικότητα αξίας του, το αρχικό υπόλειμμα άγριου τύπου και έχουν εισαχθεί προσφάτως μεταλλαγμένο υπόλειμμα διαφέρουν σε αυτό το ξενοδοχείο. Για την αξιολόγηση αυτή, χρησιμοποιήσαμε εργαλείο g_sas οποία υπολογίζει υδρόφοβα, υδρόφιλα και συνολική SASA της πρωτεΐνης πάροδο του χρόνου. Η μεταλλαγμένη δομή έχει μεγαλύτερη SASA η οποία συσχετίζεται με τις προηγούμενες εύρημα μας της αυξημένης Rg σε μεταλλαγμένη δομή (S4 Εικ). Για να ελέγξετε το αποτέλεσμα της Mu σχετικά με τη διάρθρωση MGMT ελλιμενίζεται με το DNA ΠΣΠ ID: 1T39 [38], χρησιμοποιήσαμε Discovery στούντιο για να χρωματίσει και να υπολογιστεί η υδροφοβικότητα σύμφωνα με Kyte-Dolittle κλίμακας (S5 σχήμα). Η υδροφοβικότητα κβ και πέντε υπόλειμμα τρέχουσας μέσης τιμής υδροφοβικότητας ήταν -0.8 και 0,94 αντίστοιχα, ενώ οι αντίστοιχες τιμές για υπόλειμμα Mu ήταν σημαντικά υψηλότερες σε 4,5 και 2, δείχνοντας έτσι ότι το υπόλειμμα Mu είναι πιο υδρόφοβο από ό, τι το υπόλειμμα wt. Το ευρετήριο απόκλιση στις τιμές της μεταλλαγμένης πρωτεΐνης υδροφοβικότητα σε σχέση με την πρωτεΐνη βάρος θα μπορούσε να επηρεάσει βαθιά τη stiochiochemistry του σχηματισμού δεσμού υδρογόνου μεταξύ του ενζύμου και του DNA, όπως είναι προφανές από S5 Εικ. Στη συνέχεια, η δυσμενής σύνδεσης Enzyme-DNA μπορεί να οδηγήσει σε μη ανταπόκριση του ενζύμου σε σχέση με το συνεταιρισμό λειτουργικότητά του.

Για την περαιτέρω κατανόηση της μετάλλαξης στη δυναμική των πρωτεϊνών, που χωρίζεται σημαντικά αμινοξέα που συμμετέχουν σε φυσική αλληλεπίδραση με DNA και Mg

+ ιόντων σε ομάδες (Σχήμα 4), ανάλογα με τη θέση και τις εισφορές στο σύνδεσης DNA, βάση κτύπημα και επιδιόρθωση του DNA [36] τους. Cluster1 περιείχε πέντε αμινοξέα που αφορούν σε συγκεκριμένα σύνδεσης DNA. SER93, PHE94, THR95, Asn123 και LYS125. Cluster 2 περιείχε μόνο αμινοξύ ARG 135 εμπλέκονται επίσης στο DNA σύνδεσης. Cluster 3 περιείχε τρία αμινοξέα TYR114, GLN115 και SER151 όπου TYR 114 εμπλέκεται στην βάση κτύπημα που απαιτούνται για την επιδιόρθωση του DNA και τα άλλα δύο έχουν ρόλους στο DNA σύνδεσης. Cluster 4, εκτός του ότι περιέχει την ομάδα 3 αμινοξέα, περιείχε CYS145 το οποίο είναι ένα ενεργό κέντρο του MGMT, υπεύθυνη για την επιδιόρθωση του DNA. Cluster 5 αποτελούνται τρία αμινοξέα (CYS24, HIS29 και HIS85) όλα της τα οποία αλληλεπιδρούν με Mg

+ ιόντων. g_rama εργαλείο χρησιμοποιήθηκε για να δημιουργήσει φ /psi δίεδρο συνδυασμοί των επιλεγμένων συστάδων και χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό των γωνιών ως συνάρτηση του χρόνου. οικόπεδο περίγραμμα τους δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας την ενέργεια ελάχιστα να καταλάβουν τις αντίστοιχες της κινητικότητάς τους (S6 σχήμα). Όλα τα επιλεγμένα clusters επλήγησαν από την μετάλλαξη από SER151 να ILE151. Για να κατανοήσουμε το φαινόμενο, ιδιαίτερα σε σύμπλεγμα 3 και 4, το PSI /φ διανομές που αφορούν την επισημανθεί ενέργειας ελάχιστα χαράχθηκαν (Σχήμα 5). Η διαφορά στην κορυφή περιοχή της ενέργειας ελάχιστα μπορεί να παρατηρηθεί σε αντίστοιχες κ.β. και Mu clusters, δίνοντας ξεχωριστή εντύπωση δυνατόν imparity στην επιδιόρθωση του DNA.

Η

Για βαθύτερη κατανόηση της δομικής μεταβολής που παρατηρείται μέχρι τώρα, έχουμε εξετάσει ενδο σχηματισμό δεσμού υδρογόνου των επιλεγμένων συστάδων χρησιμοποιώντας g_hband εργαλείο, τα αποτελέσματα των οποίων έχουν δειχθεί στο Σχήμα 6. Όλα τα συμπλέγματα επιλέγονται για αυτή την ανάλυση δείχνουν τη μείωση στο μέσο αριθμό δεσμών υδρογόνου ανά πλαίσιο στο μεταλλαγμένο δομή αναμένουμε Cluster 1. η αύξηση του αριθμού των μέσων δεσμούς υδρογόνου ανά πλαίσιο στο Cluster 1 λεπτό σε σύγκριση με τις μεταβολές που παρατηρούμε. Η συνολική μείωση της μέσης σχηματισμό δεσμού υδρογόνου ανά πλαίσιο είναι στην συν-σχέση με αυξημένη RMSF και Rg σε μεταλλαγμένη δομή. Το αποτέλεσμα που παράγεται από αυτήν την ανάλυση είναι οριστικά συνεπάγεται την ανωμαλία που παρατηρείται μέχρι σήμερα με την αλλαγή στο εσωτερικό πρότυπο δεσμό υδρογόνου.

Η

Για να κατανοήσουμε την επίδραση αυτής της μετάλλαξης για την παγκόσμια συσχετίζονται κινήσεις σε ατομικό προσομοιώσεις, PCA, μια μαθηματική τεχνική που να είναι αποτελεσματική στον χαρακτηρισμό των γενικών αναδίπλωση και μη αναδίπλωση χαρακτηριστικά της πρωτεΐνης, χρησιμοποιήθηκε. Η τεχνική προσδιορίζει κυρίαρχο κινήσεις στην πρωτεΐνη με εκχύλιση κύριος τρόπους που εμπλέκονται στην κίνηση εμπλέκονται στο μόριο. Οι κύριες συνιστώσες της κίνησης πρωτεΐνης υπολογίζεται ως τα ιδιοδιανύσματα (EV) της μάζας σταθμίζονται covariance μήτρα των ατόμων πρωτεΐνης. Ο υπολογισμός των τιμών αυτών διεξήχθη με τη χρήση μεθόδου ουσιώδη δυναμική (ED) σύμφωνα με το πρότυπο πρωτόκολλο [39] διαθέσιμη εντός του πακέτου λογισμικού GROMACS. Δύο από τα πρώτα οκτώ Ev για αυτόν το λογαριασμό για περισσότερο ότι το 85% του συνολικού κίνηση του συστήματος επιλέχθηκαν για ανάλυση, η προεξοχή πάροδο του χρόνου και RMSF διακύμανση του οποίου απεικονίζεται στο Σχ 7. Τόσο το Ευ του συνενώθηκαν σε ένα ενιαίο τροχιά? ο συνδυασμός παρήγαγε ένα κοινό σύνολο Principal Component (PC) ιδιοδιανύσματα για κ.β. και Mu MGMT, ώστε να καταστεί δυνατή η άμεση σύγκριση μεταξύ διαφορετικών συστημάτων. Οι τροχιές ελήφθησαν με τη χρήση G-COVAR και g-anaeig της gromacs κοινής ωφελείας. Στο Σχήμα 8 (Α) τις προβολές, PC 1 έναντι PC 2, και των δύο δομών εκτοξεύονται (μαύρο wt /κόκκινο Mu), το σύμπλεγμα που λαμβάνεται από κ.β. δομή είναι σταθερή, όπου η προβολή δύο πρώτα PC του μεταλλαγμένου καλύπτει ένα μεγάλη περιοχή. Για περαιτέρω ανάλυση των προεξοχών PC, ελεύθερη ενέργεια τους επιφάνειες χαράχθηκαν (Σχήμα 8Β), η οποία αποκάλυψε ότι η σταθερότητα του wt πάνω από το τρέξιμο είναι ομοιόμορφη την πάροδο του χρόνου σε σύγκριση με Mu με βάση τις λεκάνες ενέργεια ελάχιστα που σχηματίζεται από τα δύο. Οι δομές, με την ελάχιστη ενέργεια ανακτήθηκαν από το ελεύθερο τοπίο ενέργεια σε διαφορετικά χρονικά σημεία. Οι δομές στη δεξιά πλευρά κάθε προεξοχής σε σχήμα 8 (C) του PC είναι από την αρχή της προσομοίωσης στα αριστερά ένα από το εγγύς άκρο του προσομοίωσης. Η ανάλυση αυτή ήταν ζωτικής σημασίας για τη διευκρίνιση της σε κίνδυνο ελεύθερη ενεργειακό τοπίο της δομής Mu, μια παρατήρηση ότι εκτός επιβεβαιώνουν με τα προηγούμενα αποτελέσματά μας, έχει οριστικά συνεπάγεται μια δραστική διαμορφωτική αλλαγή στη δομή Mu.

Μαύρο και πράσινο χρώμα αντιπροσωπεύει κ.β. και Mu αντίστοιχα (β) RMSF όλων των ατόμων και των δύο φορέων.

Η

(β) FEL τόσο τις κινήσεις που δημιουργούνται ξεχωριστά. (Γ) Ξεχωριστή δύο διαστάσεων απεικονίσεις του PCA τόσο βάρος και Mu MGMT με το ένθετο των τριών πιο σταθερές δομές σε διαφορετικό σημείο του χρόνου.

Η

Συμπέρασμα

δυσαρμονίες της επιδιόρθωσης του DNA και αιτιολογία καρκίνου είναι συνώνυμα με έναν τρόπο που είναι η εμφάνιση της μετάλλαξης που έχει γίνει ευρέως αποδεκτή ως η βάση του καρκίνου. Μία μετάλλαξη σε μία πρωτεΐνη επιδιόρθωσης του DNA που θα μπορούσε να διαταράξει τη λειτουργία του (S7 Σχήμα) μπορεί να δημιουργήσει pretumorigenic περιβάλλον και μπορούν να βοηθήσουν στην εξέλιξη του καρκίνου σε οποιοδήποτε στάδιο. MGMT είναι ένα από τα σημαντικά πρωτεΐνης επιδιόρθωσης του DNA έχει ουσιαστικό ρόλο στη διατήρηση της γονιδιωματικής σταθερότητας αφαιρώντας O

6Methyleguanine προσαγωγές. Έτσι, ένας σημαντικός γενετικός πολυμορφισμός σε αυτή την πρωτεΐνη θα έχει επίδραση στην ανάπτυξη του καρκίνου και της εξέλιξης της. Δεδομένου ότι καμία από τις μελέτες μέχρι σήμερα έχει αναφερθεί ανάλυση μεταλλάξεων των MGMT χρησιμοποιώντας MDS, που μας έχει ζητηθεί κυρίως να εξετάσει τη δυνατότητα των MGMT να μεταλλαχθεί σε ένα διαβαθμισμένο πληθυσμό όπου η κατανάλωση τροφών που περιέχουν υψηλότερα επίπεδα των ενώσεων Ν-νιτρωδο είναι κοινή και το γαστρικό καρκίνος είναι διαδεδομένη.

Η χρήση μοριακής δυναμικής για τη μελέτη της επίδρασης των νέων μετάλλαξη στο κωδικόνιο

151 μας έχει δώσει μια εικόνα για την αρχιτεκτονική των δύο δομών σε ατομικό επίπεδο πάνω από ένα τρέξιμο της περιόδου 30 ns . Η επίδραση της μετάλλαξης δεν περιορίζεται μόνο σε γειτνίαση του, αλλά και προσκρούει στη συνολική δομή, συμπεριλαμβανομένων δευτερεύοντα στοιχεία σε διαφορετικές θέσεις της πρωτεΐνης. Οι διαρθρωτικές μεταβάσεις παρατηρήθηκαν σε δευτερεύοντα στοιχεία, προωθεί την κατάρρευση των διαρθρωτικών αρχιτεκτονική της πρωτεΐνης MGMT Mu. Η FEL λαμβάνεται με quasiharmonic ανάλυση (PCA) κατέληξε επίσης στο συμπέρασμα ότι η μετάλλαξη επηρεάζει σημαντικά τη σταθερότητα του MGMT την πάροδο του χρόνου, ένας παράγοντας που μπορεί να παρεμποδίσει την κανονική στοιχειομετρική μόδας της επιδιόρθωσης του DNA των MGMT.

Η διερευνηθούν μετάλλαξη στο εξόνιο 5 φαίνεται να σχετίζεται με την μετάλλαξη του οδηγού, το οποίο φαίνεται να επηρεάζει την αλληλεπίδραση του DNA /πρωτεΐνης, ένας σημαντικός παράγοντας που μπορεί να επηρεάσει σύνδεσης DNA, βάση κτύπημα και τελικά την επισκευή του μηχανισμού, το οποίο εάν η εξασθενημένη, θα μπορούσε επίσης να οδηγήσει σε μεγάλη αύξηση του γονιδιώματος σε O

6 προσαγωγές γουανίνη μεθυλο οδηγεί σε αυξημένη γενωμική αστάθεια.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθικοί κανόνες

Τα πρωτόκολλα /πειράματα που περιλαμβάνουν τη χρήση ανθρώπινων δειγμάτων εξετάστηκαν δεόντως και εγκρίθηκαν από το Πανεπιστήμιο Επιτροπή για τα Ανθρώπινα Δεοντολογίας (UHEC), Πανεπιστήμιο VIT, Vellore (UHEC-VIT /2011).

ασθενείς και συλλογή ιστών

Ένα σύνολο των 30 ασθενών που έχουν διαγνωστεί με γαστρικό καρκίνωμα εισαχθεί προς Sheri-Κασμίρ Ινστιτούτο Ιατρικών Επιστημών (ακροθιγώς), Σριναγκάρ θεωρήθηκαν για τη μελέτη. Οι ασθενείς που υποβάλλονται σε χειρουργική επέμβαση ως η κύρια θεραπεία σε διάφορα στάδια της νόσου στρατολογήθηκαν για τη μελέτη με τη συγκατάθεσή τους. Τα χαρακτηριστικά των ασθενών που μελετήθηκαν παρατίθενται στον Πίνακα S2.

δείγματα όγκων 5mm

3 αποκόπηκαν από χειρουργικά δείγματα εντός της μάζας του όγκου, εκτός από το περιθώριο. Δίπλα μη νεοπλασματικά δείγματα παρόμοιων διαστάσεων ελήφθησαν από το περιθώριο εκτομής, περίπου 10 χιλιοστά από την άκρη μακροσκοπική όγκου και στη συνέχεια επιβεβαιώθηκε, όπως καλοήθεις με συνήθεις ιστοπαθολογία στο ακροθιγώς. Ένα σύνολο 30 όγκων και 30 δείγματα φυσιολογικού ιστού συλλέχθηκαν και αποθηκεύτηκαν στους -80

° C μέχρι την ανάλυση.

εξαγωγή DNA και Polymerase Chain

Αντίδραση

DNA εκχυλίστηκε από 2 χιλιοστά

3 δείγματα ιστού χρησιμοποιώντας κιτ εκχύλισης DNA (Hi Pura θηλαστικών Γονιδιωματική Απομόνωση DNA Kit-HIMEDIA). Συγκέντρωση και την ποιότητα του DNA μετρήθηκε με συνήθεις spectrophotometeric ανάλυση. Ενίσχυση του εξωνίου 5 περιοχές του εξωνίου MGMT, διεξήχθη σε κλίση minicycler (Eppendorf) σε ένα 25 μΐ μίγμα αντίδρασης που περιέχει 1 μΙ (400 ng /μl) γενωμικού DNA, DNA πολυμεράση {ρυθμιστικό 1Χ PCR (200mM Tris HCl, 200mM ΚΟΙ, 50 mM, (ΝΗ4) 2 SO4) που παρέχεται με 25mM MgCl2, Fermentas}, νερό χωρίς νουκλεάση και 1 μΙ προς τα εμπρός (5′-GCCCGTGCAGGTACGGTCTT-3 ‘) και ανάστροφα (5′- AGCTCCCGCTCCCTTGAGCC-3’) εκκινητές κάθε μία. Η θερμοκρασία ανόπτησης ήταν βελτιστοποιημένη στους 65,5 ° C. Για να διευκολυνθεί η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης ανάλυση (PCR) προϊόντων για μετάλλαξη, αλληλούχιση προϊόν PCR διεξήχθη.

SNP Βλάβη Πρόβλεψη.

Η πρόβλεψη βλάβη του πολυμορφισμού διεξήχθη χρησιμοποιώντας SIFT [40] , Polyphen-2 [41], PhD-SNP [42], MutPred [43], SNAP [44], SNPs & amp? Πηγαίνετε [45] και PoPMuSiC [46].

Μοριακή δυναμική προσομοίωση

μελέτες MDS πραγματοποιήθηκαν από Gromacs 4.5.3 πακέτο [47]. Για κβ MGMT, η 1QNT δομή ΠΠ [48] χρησιμοποιήθηκε ως δομή εκκίνησης για MDS. ΑοοβΙτγδ Discovery Studio [49] χρησιμοποιήθηκε για να κάνει το ενιαίο σημείο μετάλλαξης στην άγρια ​​δομή τύπου. Και οι δύο, κβ και Mu MGMT εφαρμόστηκαν με GROMOS96 43a1 δυναμικό πεδίο και στη συνέχεια τοποθετείται σε ένα μοντέλο ενός προ-εξισορροπημένη υδατόλουτρο και αντίθετα ιόντα προστέθηκαν για να επιτευχθεί ένα ουδέτερο κουτί χρησιμοποιώντας το «Genion» εργαλείο που έρχεται μαζί με το πακέτο gromacs. Διαλύτης μόρια συγκρατούνται στην αρχική θέση με μία δύναμη συγκράτηση των 100kcal /mol για 5000 βήματα πριν να υποβληθούν σε ελαχιστοποίηση ενέργειας για 5.000 επανάληψη. Για τη ρύθμιση της θερμοκρασίας στο εσωτερικό του κουτιού, χρησιμοποιήθηκε Berendsen μέθοδος σύζευξης της θερμοκρασίας [50]. Ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις υπολογίζονται βάσει της μεθόδου Particle Mesh Ewald [51]. Ιονίζουσα κατάσταση των υπολειμμάτων, πίεση και άλλες παράμετροι που στην κανονική σειρά. Μη συνδεδεμένο λίστα ζεύγος ενημερώθηκε μετά από κάθε 10 βήματα και διαμορφώσεων φυλάχτηκαν κάθε 2 δευτερόλεπτα pico (ps). προσομοίωσης συγκράτησης θέση για 500 ps εφαρμόστηκε για να επιτρέψει μόρια διαλύτη για να εισέλθουν στην περιοχή κοιλότητα της δομής. Τέλος, το σύστημα υποβλήθηκε σε MDS για 30 δευτερόλεπτα νανο (ns). Απόκλιση μέσης τετραγωνικής ρίζας (RMSD), Root Mean Square διακύμανσης (RMSF), Διαλύτης προσβάσιμη περιοχή της επιφάνειας (SASA), ακτίνα περιστροφής (Rg) και PCA πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το ενσωματωμένο gromacs εργαλεία. g_hbond χρησιμοποιήθηκε για να υπολογιστεί ο αριθμός των διακριτών δεσμών υδρογόνου που σχηματίζονται από συγκεκριμένα υπολείμματα σε άλλα αμινοξέα μέσα στην πρωτεΐνη κατά τη διάρκεια της προσομοίωσης (ΝΗ δεσμό). g_sham χρησιμοποιήθηκε εκτενώς για την απόκτηση δωρεάν ενεργειακό τοπίο. Γραφήματα χαράχθηκαν χρησιμοποιώντας Γκρέις GUI toolkit 5.1.22 έκδοση ενώ ως ελεύθερη ενέργεια τοπία χαράχθηκαν χρησιμοποιώντας gnuplot 4.6.0 έκδοση. Όλες οι απεικονίσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας Pymol, Ligplus, VMD [52] και τα γραφήματα χαράχθηκαν χρησιμοποιώντας Χάρη προγράμματος [53] και Gnuplot. Τροχιές αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το ενσωματωμένο εργαλείο για τη διανομή GROMACS.

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 Εικ. α) Ένα αντιπροσωπευτικό χρωματογράφημα MGMT εξόνιο 5 δείχνει την μονό ζεύγος βάσης, G & gt?. Τ στη θέση 151 όπως υποδεικνύεται από ένα βέλος στο νεοπλασματικό χρωματογράφημα

β) Ευθυγράμμιση εξόνιο 5 αλληλουχία η οποία ενισχύθηκε από νεοπλασματικών και μη νεοπλασματικών ιστού (παρακείμενο φυσιολογικό) με εκείνη του άγριου τύπου (αναφοράς-αλληλουχίας που αποκτώνται από NCBI) μεταφράστηκε και ο SNP χαρτογραφηθεί δείχθηκε να αλλάξει από Σερίνη σε Ισολευκίνη

doi:. 10.1371 /journal.pone.0127741.s001

(ΔΕΘ)

S2 Εικ. (Α) Μέσος όρος Τριτοβάθμια δομές χρωματισμένα σύμφωνα με τις αξίες Bfactor (β) Μέσος όρος Δευτεροβάθμια δομή εκπροσώπηση των δύο δομών

doi:. 10.1371 /journal.pone.0127741.s002

(ΔΕΘ)

S3 Εικ. (Α) τις ακτίνες περιστροφής του βάρους και Mu MGMT εμφανίζονται χωριστά.

(β) Rg όλων των ατόμων της βάρος και Mu MGMT συναρτήσει του χρόνου στα 300Κ.

Βάρος είναι represted από μαύρο και Mu by Green.

doi: 10.1371 /journal.pone.0127741.s003

(ΔΕΘ)

S4 Εικ. Διαλύτη προσβάσιμη περιοχή της επιφάνειας του βάρος (μαύρο) και Mu (πράσινο) MGMT την πάροδο του χρόνου σε 300Κ

doi:. 10.1371 /journal.pone.0127741.s004

(ΔΕΘ)

S5 Εικ. Μεταβολή χρώματος (Επιφανειακή Πρωτεΐνη σύμφωνα με την κλίμακα Kyte-Doolittle) σε μεταλλαγμένη περιοχή και τη γραφική αναπαράσταση της μεταβολής σε κλίμακα Kyte-Doolittle σε μόνο αμινοξύ και πέντε μέσος τρέξιμο υδροφοβίας των δύο WT και Mu MGMT

doi:. 10.1371 /journal.pone.0127741.s005

(ΔΕΘ)

S6 Εικ. εξαρτώνται από το χρόνο οικόπεδο Ramachandran Contour όλων των επιλεγμένων συστάδων την πάροδο του χρόνου, κάθε γραμμή που δείχνει την μετάβαση των 1.

doi: 10.1371 /journal.pone.0127741.s006

(ΔΕΘ)

S7 Εικ. Αναπαράσταση με εικόνες του GC: AT μετάβαση από μειωμένη MGMT

doi:. 10.1371 /journal.pone.0127741.s007

(ΔΕΘ)

S1 πίνακα. Πρόβλεψη πολυμορφισμός χρησιμοποιώντας διαφορετικούς διακομιστές

doi:. 10.1371 /journal.pone.0127741.s008

(DOCX)

S2 πίνακα. Χαρακτηριστικά των Ασθενών Μελέτης

doi:. 10.1371 /journal.pone.0127741.s009

(DOCX)

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς θα ήθελαν να αναγνωρίσουν Dr. Daniele Granata για του είδους εισροές για την ελεύθερη ενέργεια τοπία.