Αφηρημένο

παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα (PDAC) είναι ένα θανατηφόρο καρκίνο με κακή πρόγνωση που χαρακτηρίζεται από υπερβολική ενεργοποίηση μιτογόνου οδού και σημειώνονται χημειοαντίσταση σε ένα ευρύ φάσμα των χημειοθεραπευτικών φαρμάκων. Διπλή ειδικότητα πρωτεΐνη φωσφατάση 1 (DUSP1) είναι ένας βασικός αρνητικός ρυθμιστής των ενεργοποιημένων από μιτογόνα πρωτεϊνικών κινασών (MAPKs). Ωστόσο, DUSP1 υπερεκφράζεται στα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος (ΕΚΣ) σε PDAC όπου ενισχύει παράδοξο σχηματισμό αποικιών σε μαλακό άγαρ και προωθεί

in vivo

ογκογονικότητας. Ωστόσο, δεν είναι γνωστό εάν η υπερέκφραση DUSP1 συμβάλλει στην PDAC χημειοαντίσταση. Χρησιμοποιώντας BxPC3 και COLO-357 ανθρώπινη ΚΕΣ, δείχνουμε ότι γεμσιταβίνης ενεργοποιεί c-Jun Ν-τερματικής κινάσης (JNK) και ρ38 μιτογόνο κινάση ενεργοποιημένη πρωτεΐνη (ρ38 ΜΑΡΚ), κλειδί κινάσες σε δύο μεγάλες μονοπάτια σηματοδότησης στρες-ενεργοποιημένες. ενεργοποίηση JNK και ρ38 ΜΑΡΚ γεμσιταβίνη επαγόμενη μεσολαβεί αυξημένη απόπτωση, αλλά επίσης ρυθμίζει προς τα πάνω μεταγραφικά DUSP1, όπως αποδεικνύεται από τα αυξημένα επίπεδα mRNA DUSP1 και RNA πολυμεράση II φόρτωσης στο σώμα γονίδιο DUSP1. Αντιστρόφως, shRNA μεσολάβηση αναστολή της DUSP1 ενισχύει την ενεργοποίηση JNK και ρ38 ΜΑΡΚ και gemcitabine χημειοευαισθησίας. Χρησιμοποιώντας δοξυκυκλίνη επαγόμενου knockdown του DUSP1 σε καθιερωμένες ορθοτοπική παγκρεατικών όγκων, βρήκαμε ότι ο συνδυασμός γεμσιταβίνης με αναστολή DUSP1 βελτιώνει την επιβίωση των ζώων, εξασθενεί την αγγειογένεση, και ενισχύει αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο, σε σύγκριση με γεμσιταβίνη μόνο. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η γεμσιταβίνη μεσολάβηση προς τα πάνω ρύθμιση του DUSP1 συμβάλλει σε ένα βρόχο αρνητικής ανάδρασης που εξασθενεί ευεργετικές δράσεις της σχετικά με τις οδούς του στρες και την απόπτωση, αυξάνοντας την πιθανότητα ότι η στόχευση DUSP1 σε PDAC μπορεί να έχει το πλεονέκτημα της ενίσχυσης της γεμσιταβίνης χημειοευαισθησίας ενώ καταστέλλει την αγγειογένεση.

Παράθεση: Liu F, Gore AJ, Wilson JL, Korc Μ (2014) DUSP1 είναι ένα μυθιστόρημα-στόχος για την ενίσχυση καρκίνο του παγκρέατος ευαισθησία των κυττάρων στην γεμσιταβίνη. PLoS ONE 9 (1): e84982. doi: 10.1371 /journal.pone.0084982

Επιμέλεια: Rajesh Agarwal, Πανεπιστήμιο του Κολοράντο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 23 του Οκτωβρίου του 2013? Αποδεκτές: 27 Νοέμ 2013? Δημοσιεύθηκε: 7 Γενάρη του 2014

Copyright: © 2014 Liu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από National Cancer Institute (NCI) επιχορήγηση CA-R37-075059 στο ΜΚ, που χορηγούνται από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Murray Korc είναι μια Συντακτική μέλος του Διοικητικού Συμβουλίου PLoS ONE. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα (PDAC) είναι η τέταρτη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο που σχετίζονται με το οι ΗΠΑ, με ετήσια θνησιμότητα από σχεδόν 38.000, διάμεση επιβίωση 6-7 μηνών και ένα ποσοστό πενταετούς επιβίωσης του 6% [1]. Ενώ εκτομή παρατείνει την επιβίωση και προσφέρει μια πιθανή θεραπεία, το 80-85% της PDAC είναι unresectable κατά τη στιγμή της διάγνωσης, λόγω της παρουσίας μακρινών μεταστάσεων, περιτοναϊκή σπορά, ή εισβολή σε παρακείμενες ζωτικές δομές [2]. Η γεμσιταμπίνη χημειοθεραπευτικό παράγοντα (2 ‘, 2’-διφθοροδεοξυκυτιδίνη, dFdC) υπήρξε το πρότυπο φροντίδας για τους ασθενείς με τοπικά προχωρημένο ή μεταστατικό καρκίνο [3]. Πρόσφατα, η Υπηρεσία Τροφίμων και Φαρμάκων ενέκρινε το συνδυασμό γεμκιταβίνης και συλλαμβάνω-πακλιταξέλη, η οποία βασίζεται στη διαπίστωση ότι ο συνδυασμός αυτός βελτίωσε τη συνολική επιβίωση σε 8,5 μήνες έναντι 6,7 μηνών μόνο με γεμσιταβίνη [4]. Είναι γενικά αποδεκτό ότι η βελτίωση της ανταπόκρισης σε γεμσιταβίνη σε PDAC θα οδηγούσε σε πρόσθετη αύξηση στην επιβίωση των ασθενών.

Η αντίσταση του PDAC να γεμσιταβίνης και πολλών άλλων χημειοθεραπευτικών παραγόντων οφείλεται, εν μέρει, σε ένα ευρύ φάσμα γενετικών και επιγενετικές μεταβολές που οδηγούν σε ανώμαλη ενεργοποίηση της επιβίωσης των κυττάρων και αντι-αποπτωτικών οδών [5], μια έντονη desmoplasia η οποία παρεμβαίνει με την παράδοση του φαρμάκου στη μάζα του όγκου [6], [7], και αλλαγές στην έκφραση των βασικών μορίων που εμπλέκονται στην γεμσιταβίνη πρόσληψη, η ενδοκυτταρική ενεργοποίηση και εκροής [8]. Υπάρχει επείγουσα ανάγκη, επομένως, να προωθήσει την κατανόηση των μηχανισμών που διέπουν χημειοαντίσταση στο PDAC, προκειμένου να επινοήσουν νέες και πιο αποτελεσματικές στρατηγικές χημειοθεραπευτικά.

Ανώμαλη ενεργοποίηση μιτογόνο πρωτεϊνικές κινάσες που ενεργοποιούνται (ΜΑΡΚ) παίζει κρίσιμο ρόλο στη ρύθμιση της κυτταρικής επιβίωσης και απόπτωσης [9], [10]. MAPKs μπορούν να ομαδοποιηθούν σε τρεις οικογένειες: εξωκυτταρικό σήμα ρυθμιζόμενη κινάση (ERK), c-Jun-NH2 κινάση (JNK) και ρ38 ΜΑΡΚ [9], [10]. Κατά τη διέγερση με μιτογόνο ή περιβαλλοντικό στρες, οι MAPKs ενεργοποιούνται μέσω φωσφορυλίωσης σε τυροσίνης και θρεονίνης τους με ανάντη κινάσες MAP2K [9], [10]. Ενεργοποιημένος MAPKs φωσφορυλιώνουν ένα φάσμα υποστρωμάτων στόχων, συμπεριλαμβανομένων των πρωτεϊνικών κινασών και μεταγραφικών παραγόντων που εμπλέκονται στην ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, της διαφοροποίησης, την επιβίωση και απόπτωση [9], [10]. Παρά την ύπαρξη των οδών αλληλοπαρεμβολών μεταξύ των διαφόρων MAPKs, οι περισσότερες ενδείξεις υποστηρίζουν την ιδέα ότι ενεργοποιημένη ERK προάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την επιβίωση, και την κινητικότητα, ενώ JNKs και MAPKs p38 ρυθμίζουν αρνητικά την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και επάγουν αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο σε απόκριση σε περιβαλλοντικό στρες [9] , [10].

Η διπλή-εξειδίκευση φωσφατάση (DUSP) οικογένεια πρωτεϊνών αποτελείται από 25 μέλη [11]. DUSPs μπορεί αποφωσφορυλιώνει τόσο η θρεονίνη /σερίνη και τυροσίνης των υποστρωμάτων τους και έτσι λειτουργούν ως αρνητικοί ρυθμιστές της MAPKs [11]. DUSP1 /MKP-1 είναι μια πυρηνική φωσφατάση ΜΑΡΚ οποία είναι άμεση μεταγραφική στόχος της ρ53, E2F-1, c-Jun, και ATF2, και ότι επάγεται σε απόκριση προς οξειδωτικό στρες, υποξία, και άλλες καταπονήσεις όπως θρεπτική στέρηση και χημειοθεραπευτικά φάρμακα [12] – [14]. DUSP1 υπερεκφράζεται σε ένα εύρος των επιθηλιακών όγκων, συμπεριλαμβανομένων PDAC, καρκίνο του πνεύμονα μη-μικρού κυττάρου, του μαστού, των ωοθηκών, του γαστρικού και του καρκίνου του προστάτη πρώιμου σταδίου [15] – [20], και αυτή η υπερέκφραση συσχετίζεται με κακή επιβίωση των ασθενών σε καρκίνο των ωοθηκών [18]. Η αυξημένη έκφραση DUSP1 στον καρκίνο του μαστού συσχετίζεται αντίστροφα με τη δραστικότητα JNK και των δεικτών απόπτωσης, γεγονός που υποδηλώνει ένα αντι-αποπτωτικό ρόλο των DUSP1 μέσω της δραστηριότητα προς JNK [17]. Προς στήριξη αυτού του συμπεράσματος, τα καρκινικά κύτταρα που υπερεκφράζουν DUSP1 είναι ανθεκτικά στη χημειοθεραπεία και συνδέτη Fas απόπτωση που επάγεται, ενώ η μείωση των επιπέδων DUSP1 χρησιμοποιώντας ένα μικρό παρεμβαλλόμενο RNA ενισχύει την ευαισθησία σε αυτούς τους παράγοντες [21] – [23]. Αντιστρόφως, σε ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) αυξημένα επίπεδα DUSP1 συσχετίζονται με καλύτερη πρόγνωση [24]. Επιπλέον, DUSP1 ρυθμίζει αρνητικά σηματοδότηση ERK σε κύτταρα HCC, αναστέλλοντας έτσι το δυναμικό πολλαπλασιασμού τους, γεγονός που υποδηλώνει ότι DUSP1 είναι ένα ογκοκατασταλτικό γονίδιο σε HCC [24]. Έτσι, οι δηλητηριώδεις συνέπειες της DUSP1 υπερέκφρασης είναι πιθανό καρκίνο συγκεκριμένες.

ανέφερε ότι DUSP1 υπερεκφράζεται σε PDAC, και ότι αντινόημα μεσολάβηση καταστολή της έκφρασης DUSP1 μειώνει την ανάπτυξη του όγκου σε γυμνά ποντίκια [15]. Δεν είναι γνωστό, όμως, αν DUSP1 θα μπορούσε να είναι ένας στόχος για τη βελτίωση της απόκρισης σε γεμσιταβίνη χημειοθεραπεία με βάση σε PDAC. Μπορούμε πλέον να καταδείξει ότι γεμσιταμπίνη ενεργοποιεί JNK και p38 MAPK, οδηγώντας έτσι σε αυξημένη απόπτωση και μεταγραφή DUSP1. Αντιστρόφως, shRNA μεσολάβηση αναστολή της DUSP1 ενισχύει την ενεργοποίηση ΜΑΡΚ JNK και ρ38 gemcitabine επαγόμενη και ευαισθητοποιεί PDAC κύτταρα να gemcitabine. Χρησιμοποιώντας ένα δοξυκυκλίνη επαγόμενο στρατηγική για την καταστολή DUSP1 σε καθιερωμένες ορθοτοπική παγκρεατικών όγκων, δείχνουμε ότι ο συνδυασμός γεμσιταβίνης με αναστολή DUSP1 παρατείνει την επιβίωση, εξασθενεί την αγγειογένεση, και ενισχύει τον αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο. Έτσι, DUSP1 μπορεί να είναι ένα πιθανό θεραπευτικό στόχο για την ενίσχυση της ευαισθησίας PDAC να γεμσιταβίνη.

Αποτελέσματα

JNK και p38 ΜΑΡΚ μονοπάτια σηματοδότησης που ενεργοποιούνται σε απόκριση Γεμσιταβίνη

Τα αποτελέσματα της gemcitabine επί της ανάπτυξης PCC αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ. Σε όλες τις τρεις κυτταρικές γραμμές, γεμσιταβίνη εξασκείται μία δοσο-εξαρτώμενη ανασταλτική της ανάπτυξης δράση. AsPC-1 ήταν πιο ανθεκτικά στην gemcitabine, με μια IC50 μεγαλύτερη από 100 ng /mL, ενώ BxPC-3 και COLO-357 κύτταρα ήταν πιο ευαίσθητα σε gemcitabine, με τιμές IC50 από 10 ng /ml και 5 ng /ml, αντίστοιχα ( Σχ. 1Α).

(Α) AsPC-1, BxPC-3, και COLO-357 κύτταρα επωάστηκαν για 48 ώρες απουσία ή παρουσία διαφόρων συγκεντρώσεων της γεμσιταβίνης, και προσδιορισμοί ΜΤΤ διεξήχθησαν. Τα δεδομένα είναι τα μέσα ± SEM 3 πειραμάτων. * P & lt? 0,05? ** P & lt? 0,01, σε σύγκριση με τον έλεγχο. (Β) AsPC-1, BxPC-3, και τα κύτταρα COLO-357 επωάστηκαν για χρόνους που υποδεικνύονται με 100 ng /ml, 10 ng /ml, και 5 ng /ml γεμσιταβίνης, αντίστοιχα, και αναλύθηκαν με ανοσοστύπωση. (C) κύτταρα BxPC-3 επωάστηκαν για 48 ώρες με 10 ng /ml γεμσιταβίνη (G), απουσία ή παρουσία 10 μΜ SB203580 (SB) ή 10 μΜ SP600125 (SP), και αναλύθηκαν με ανοσοστύπωση.

για να αξιολογηθούν οι επιδράσεις της γεμσιταβίνης στην ενεργοποίηση των MAPKs, τα κύτταρα επωάστηκαν με gemcitabine σε συγκέντρωση κοντά στις αντίστοιχες IC50 τους s. Σε BxPC-3 και COLO-357, gemcitabine που προκαλείται από τη φωσφορυλίωση της p38 MAPK και JNK, βασικά κινάσες σε δύο μεγάλα μονοπάτια σηματοδότησης στρες ενεργοποιείται (Εικ. 1Β). Η γεμσιταβίνη αύξησε επίσης τα επίπεδα της φωσφο-c-Jun σε αυτά τα κύτταρα (Σχ. 1Β). Δεδομένου ότι φωσφο-c-Jun είναι μια κοινή προς τα κάτω στόχος του p38 ΜΑΡΚ και ΙΝΚ πορείες, η παρατήρηση αυτή επιβεβαίωσε την ενεργοποίηση της ρ38 ΜΑΡΚ και σηματοδότηση JNK. Επιπλέον, τα επίπεδα της διασπασμένης κασπάσης 3 και PARP διασπάται συσχετίζεται με ρ38 ΜΑΡΚ, JNK, και ενεργοποίηση c-Jun, υποδεικνύοντας ότι η ρ38 ΜΑΡΚ και ΙΝΚ πορείες μεσολαβούν αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο σε απόκριση σε γεμσιταβίνη (Εικ. 1Β). Αντίθετα, AsPC-1 κύτταρα ήταν περισσότερο ανθεκτικά σε gemcitabine, όπως αποδεικνύεται από την απουσία της p38 ΜΑΡΚ και ενεργοποίηση JNK και τα χαμηλότερα επίπεδα του διασπασμένη κασπάση 3 και διασπασμένη PARP, ακόμη και σε μία συγκέντρωση τόσο υψηλή όσο 100 ng /mL (Σχ. 1Β). Για να καθοριστεί εάν η γεμσιταβίνη απόπτωση που επάγεται μέσω ρ38 ΜΑΡΚ και ενεργοποίηση JNK, BxPC-3 κύτταρα επωάστηκαν με γεμσιταβίνη σε απουσία ή παρουσία του ρ38 ΜΑΡΚ (SB203580) ή αναστολείς JNK (SP600125). Τα επίπεδα διασπασμένη PARP και διασπασμένη κασπάση 3 μειώθηκαν κατά SB203580 και SP600125, όταν προστίθενται σε γεμσιταβίνη (Εικ. 1 C). Έτσι, σε ευαίσθητες κυτταρικές σειρές, γεμσιταβίνη ενεργοποιεί p38 ΜΑΡΚ και σηματοδότηση της JNK που επάγει αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο, ενώ η γεμσιταβίνη-αντίσταση συνδέεται με χαμηλότερα επίπεδα απόπτωσης και σημαντικά εξασθενημένο ενεργοποίησης p38 ΜΑΡΚ /ϋΝΚ.

Γεμσιταβίνη Ενεργοποιεί DUSP1 Μεταγραφή μέσω JNK και ρ38 ΜΑΡΚ σηματοδότησης

Θεωρώντας ότι DUSP1 είναι ένας ρυθμιστής κλειδί των δραστηριοτήτων ΜΑΡΚ [11], εξετάσαμε έπειτα την έκφραση της DUSP1 σε απόκριση γεμσιταβίνη και τον υποκείμενο μηχανισμό που ρυθμίζει την έκφρασή του. Σε αμφότερες τις BxPC-3 και COLO-357 κύτταρα, DUSP1 mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης προκλήθηκαν στις 24 ώρες και 48 ώρες μετά γεμκιταβίνη προσθήκης, που συμπίπτει με την ενεργοποίηση του ρ38 ΜΑΡΚ και JNK (Εικ. 2Α). Αντίθετα, δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές μεταβολές στα επίπεδα DUSP1 σε AsPC-1 κύτταρα γεμσιταβίνη ανθεκτικά, συνεπής με τα χαμηλά επίπεδα της απόπτωσης και της απουσίας ρ38 ΜΑΡΚ και ενεργοποίηση JNK κατά την κατεργασία (Σχ. 2Α).

(Α) AsPC-1, BxPC-3, και COLO-357 κύτταρα επωάστηκαν για τους υποδεικνυόμενους χρόνους με 100 ng /ml, 10 ng /ml, και 5 ng /ml γεμσιταβίνης, αντίστοιχα, και τα επίπεδα DUSP1 εκτιμήθηκαν με Q- PCR και ανοσοστύπωμα. (B, C) BxPC-3 και COLO-357 κύτταρα επωάστηκαν για 24 ώρες με 10 ng /ml και 5 ng /ml γεμσιταβίνης, αντίστοιχα, απουσία ή παρουσία 10 μmol /L U0126, 10 μmol /L SP600125, 10 μmol /L SB203580, ή και τα δύο SP600125 και SB203580, και Q-PCR (Β) και RNA πολυμεράση II ChIP ακολουθούμενη από Q-PCR για την περιοχή του σώματος γονίδιο DUSP1 (C) διεξήχθησαν. Όλα τα δεδομένα είναι τα μέσα ± SEM 3 πειραμάτων. * P & lt? 0,05? ** Ρ & lt?. 0,01, σε σύγκριση με τον έλεγχο

Η

Σε απόκριση σε διάφορα ερεθίσματα, ο παράγοντας μεταγραφής ΑΡ-1 (c-Jun, c-Fos, ΑΤΡ2), η οποία είναι η κύρια κατάντη στόχος της p38 ΜΑΡΚ και σηματοδότηση JNK, έχει δειχθεί ότι συνδέουν με τον υποκινητή DUSP1 και ρυθμίζουν την μεταγραφή του [14], [25]. Για να καθοριστεί εάν p38 ΜΑΡΚ και JNK σηματοδότησης μεσολαβούν την επαγωγή της έκφρασης DUSP1 με γεμσιταβίνη, BxPC-3 και COLO-357 κύτταρα κατεργάστηκαν με γεμσιταβίνη σε απουσία ή παρουσία του SB203580, SP600125, ή συνδυασμός τους. SB203580 και SP600125 μείωσε την επαγωγή των επιπέδων DUSP1 mRNA από γεμσιταμπίνη, ενώ ο συνδυασμός τους μπλοκαριστεί εντελώς αυτή την επαγωγή. Αντίθετα, ERK αναστολή με U0126 απέτυχε να αλλάξει γεμσιταβίνη μεσολάβηση επαγωγή DUSP1, υποστηρίζοντας το συμπέρασμα ότι η p38 MAPK και ΙΝΚ αντί ERK σηματοδότησης μεσολαβήσει επαγωγή DUSP1 με γεμσιταβίνη (Εικ. 2Β).

Η αύξηση DUSP1 τα επίπεδα mRNA θα μπορούσε να οφείλεται σε αυξημένη μεταγραφική δραστικότητα ή σταθερότητα μετα-μεταγραφικό mRNA. Ως εκ τούτου, χρωματίνη ανοσοκαταβύθιση έναντι RNA πολυμεράση II, που είναι το βασικό συστατικό του μηχανισμού μεταγραφής, έγινε το επόμενο διενεργείται, που ακολουθείται από Q-PCR για την ποσοτικοποίηση της ποσότητας του RNA πολυμεράση II δεσμεύεται με την περιοχή του σώματος του γονιδίου DUSP1. Αυτή η δοκιμασία επιτρέπει την άμεση μέτρηση του δραστικού στάδιο επιμήκυνσης και αντικατοπτρίζει την μεταγραφική δραστικότητα του γονιδίου DUSP1. Επωάζοντας BxPC-3 και τα κύτταρα COLO-357 με γεμσιταβίνη για 24 ώρες αύξησε την ποσότητα του RNA πολυμεράση II φόρτωσης στην περιοχή του σώματος του γονιδίου της DUSP1 κατά 6 φορές και 12 φορές αντίστοιχα (Σχ. 2C), που δείχνουν προς μεταγραφική ενεργοποίηση DUSP1 με gemcitabine . SB203580 και SP600125, αλλά όχι U0126, ανέστειλε την γεμσιταβίνη επαγόμενη αύξηση της ποσότητας της RNA πολυμεράσης II που σχετίζεται με το σώμα γονίδιο DUSP1 (Σχ. 2C). Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η p38 MAPK και JNK μεσολαβεί σηματοδότησης DUSP1 μεταγραφική ενεργοποίηση από γεμσιταμπίνη.

Διακοπή της DUSP1 Αρνητική ανάδραση Ενισχύει χημειοευαισθησία να Γεμσιταβίνη και Cisplatin

Για να διερευνηθεί η επίδραση της αποσιώπησης DUSP1 σχετικά με τις δραστηριότητες ΜΑΡΚ και τηςχημειοευαισθησίας γεμσιταβίνη, AsPC-1, BxPC-3, και COLO-357 κύτταρα σταθερώς μετάγονται με φακοϊό εκφράζουν shRNA έναντι DUSP1 ή μη στόχευση ελέγχου σκαρφάλωμα και στη συνέχεια επωάστηκαν με διάφορες συγκεντρώσεις gemcitabine. Σε όλες τις τρεις κυτταρικές γραμμές, DUSP1 knockdown χρησιμοποιώντας δύο Τα siRNAs αύξησε τις ανασταλτικές δράσεις ανάπτυξης της γεμσιταβίνης. Έτσι, φίμωση DUSP1 μετατοπίζεται τις τιμές IC50 για gemcitabine σε AsPC-1, BxPC-3 και COLO-357 κύτταρα από 500 έως 10 ng /ml, από 10 έως 5 ng /ml, και από 5 έως 2,5 ng /ml, αντίστοιχα (Εικ. 3Α). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι DUSP1 knockdown ενισχυμένη γεμσιταβίνη χημειοευαισθησία, και ότι οι ευαισθητοποίηση είχαν πιο έντονη σε κύτταρα με υψηλή χημειοαντίσταση.

AsPC-1, BxPC-3, και COLO-357 κύτταρα σταθερώς μετάγονται με φακοϊό εκφράζουν shRNA κατά τον έλεγχο αγωνίζομαι ή DUSP1. (Α) Τα κύτταρα επωάστηκαν για 48 ώρες απουσία ή παρουσία διαφόρων συγκεντρώσεων της γεμσιταβίνης, και προσδιορισμοί ΜΤΤ διεξήχθησαν. Τα δεδομένα είναι τα μέσα ± SEM 3 πειραμάτων. * P & lt? 0,05? ** P & lt? 0,01, σε σύγκριση με τον έλεγχο. (Β) AsPC-1, BxPC-3, και COLO-357 κύτταρα επωάστηκαν για τους υποδεικνυόμενους χρόνους με 100 ng /ml, 10 ng /ml, και 5 ng /ml γεμσιταβίνης, αντίστοιχα, και αναλύθηκαν με ανοσοστύπωση.

Το αντίσωμα αντι-DUSP1 αποκάλυψε συνήθως 2 στενά-μεταναστεύουν ζώνες σε κηλίδες Western (Εικ. 2-3). Ωστόσο, DUSP1 knockdown με δύο πολύ συγκεκριμένες Τα siRNAs που στοχεύουν ειδικά DUSP1 σιγήσει έκφραση του κάτω ζώνη (Σχ. 3Β), δείχνοντας ότι η άνω ζώνη ήταν μη ειδική. DUSP1 knockdown με τα ίδια υψηλά συγκεκριμένες Τα siRNAs ενισχύεται επίσης gemcitabine επαγόμενη απόπτωση, όπως αποδεικνύεται από τα αυξημένα επίπεδα της διασπασμένης ΡΑΚΡ και διασπασμένη κασπάση 3 (Σχ. 3Β). Τα υψηλότερα επίπεδα της γεμσιταβίνης επαγόμενης φωσφο-ρ38 ΜΑΡΚ και φωσφο-ΙΝΚ επίσης σημειωθεί DUSP1 knockdown κυττάρων, σε σύγκριση με τον έλεγχο σκαρφάλωμα, γεγονός που υποδηλώνει ότι φίμωση DUSP1 de-καταστέλλεται p38 ΜΑΡΚ και σηματοδότηση της JNK, οδηγώντας έτσι σε αυξημένη αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο σε απόκριση gemcitabine (Σχ. 3Β).

Θεωρώντας ότι η γεμσιταβίνη μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε συνδυασμό με cisplatin ή 5-φθοριοουρακίλη για τη θεραπεία τοπικά προχωρημένο ή μεταστατικό PDAC [26], [27], από την επόμενη προσπάθησαν να προσδιορίσουν κατά πόσον στόχευσης DUSP1 θα έχουν παρόμοιες επιδράσεις ευαισθητοποίησης σε άλλους χημειοθεραπευτικούς παράγοντες εκτός γεμσιταβίνη. Για το σκοπό αυτό, BxPC-3 και COLO-357 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά shRNA έναντι DUSP1 ή σκαρφάλωμα ελέγχου υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις σισπλατίνης. Σε αμφότερες τις BxPC-3 και COLO-357 κύτταρα, DUSP1 knockdown μειωμένη του IC50 από 2 να 0,5 μg /ml, και επίσης ενίσχυσε την επαγόμενη από cisplatin αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο, όπως αποδεικνύεται από τα αυξημένα επίπεδα της διασπασμένης ΡΑΚΡ και διασπασμένη κασπάση 3 (Σχ. 4Α, 4Β). Τα υψηλότερα επίπεδα σισπλατίνης επαγόμενης φωσφο-ρ38 ΜΑΡΚ και φωσφο-ΙΝΚ διαπιστώθηκαν επίσης σε κύτταρα με DUSP1 knockdown (Εικ. 4Β), και παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με κύτταρα ASPC-1 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η διακοπή της αρνητικής ανάδρασης επί p38 ΜΑΡΚ και σηματοδότηση της JNK καταστέλλοντας DUSP1 θα μπορούσαν να ενισχύσουν την απόπτωση και να βελτιωθεί η χημειοευαισθησία του καρκίνου του παγκρέατος σε πολλαπλούς χημειοθεραπευτικούς παράγοντες.

BxPC-3 και COLO-357 κύτταρα ήταν σταθερά μεταγωγή με φακοϊό εκφράζοντας shRNA κατά τον έλεγχο αγωνίζομαι ή DUSP1. (Α) Τα κύτταρα επωάστηκαν για 48 ώρες απουσία ή παρουσία διαφόρων συγκεντρώσεων της γεμσιταβίνης, και προσδιορισμοί ΜΤΤ διεξήχθησαν. Τα δεδομένα είναι τα μέσα ± SEM 3 πειραμάτων. * P & lt? 0,05? ** P & lt? 0,01, σε σύγκριση με τον έλεγχο. (Β) BxPC-3 και COLO-357 κύτταρα επωάζονται με 2 μg /ml σισπλατίνης για τους ενδεδειγμένους χρόνους, και ανοσοαποτύπωση πραγματοποιήθηκε.

Η

Νοκ ντάουν της DUSP4, άλλης πυρηνικής DUSP, αποτυγχάνει να ενισχύσει τηςχημειοευαισθησίας

Είμαστε δίπλα φρόντισε να διαπιστώσει αν ενισχυμένη χημειοευαισθησία είναι μοναδική για DUSP1 σιγαστήρα ή ένα κοινό χαρακτηριστικό στόχευσης οποιαδήποτε μέλη της οικογένειας DUSP. Ως εκ τούτου, επιλέξαμε να νοκ ντάουν DUSP4 /MKP-2, λόγω της ομοιότητάς του με DUSP1 από την άποψη της υποκυτταρικού εντοπισμού και της προτίμησης του υποστρώματος [11]. AsPC-1 και BxPC-3 κύτταρα σταθερά μεταγωγή με φακοϊό κωδικοποίηση shRNA έναντι DUSP4 ή μη στόχευση έλεγχο αγωνίζομαι. Επιτυχής αποσιώπηση των DUSP4 επιβεβαιώθηκε με ανοσοαποτύπωση (Εικ. 5Β). Ωστόσο, DUSP4 knockdown απέτυχε να επηρεάσει ΜΑΡΚ ενεργοποίηση ή την απόκριση σε γεμσιταβίνη σε δύο κυτταρικές σειρές (Σχ. 5Α, 5Β). Έτσι, DUSP1 είναι ένας πιθανός θεραπευτικός στόχος για δυναμικοποίηση στρες που ενεργοποιείται MAPKs σηματοδότησης και την ενίσχυση της gemcitabine χημειοευαισθησία, η οποία δεν είναι απαραίτητα ένα κοινό χαρακτηριστικό όλων των μελών της οικογένειας DUSP.

AsPC-1 και τα κύτταρα BxPC-3 ήταν σταθερή μεταγωγή με φακοϊό εκφράζοντας shRNA κατά τον έλεγχο αγωνίζομαι ή MKP2. (Α) Τα κύτταρα επωάστηκαν για 48 ώρες απουσία ή παρουσία διαφόρων συγκεντρώσεων της γεμσιταβίνης, και προσδιορισμοί ΜΤΤ διεξήχθησαν. (Β) κύτταρα BxPC-3 AsPC-1 και επωάστηκαν για τους υποδεικνυόμενους χρόνους με 100 ng /ml και 10 ng /ml γεμσιταβίνης, αντίστοιχα, και ανοσοκηλίδωση διεξήχθη. Τα δεδομένα είναι τα μέσα ± SEM 3 πειραμάτων.

Η

Γεμσιταβίνη και DUSP1 Νοκ ντάουν Συνδυάστε να παρατείνει την επιβίωση, το μετριασμό του όγκου αγγειογένεση και τον πολλαπλασιασμό και την ενίσχυση της απόπτωσης

Είμαστε δίπλα προσπάθησε να αξιολογήσει την επίδραση αναστολής DUSP1 επί gemcitabine χημειοευαισθησία σε ένα ορθοτοπικό μοντέλο ποντικού. Για να μελετηθεί η θεραπευτική δυνατότητα στόχευσης DUSP1 σε πλήρως τεκμηριωθεί παγκρεατικών όγκων, μπορούμε σταθερή μεταγωγή COLO-357 ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος με φακοϊό εκφράζουν δοξυκυκλίνη επαγόμενο shRNA έναντι DUSP1 ή μη στόχευσης ελέγχου σκαρφάλωμα, πριν από την ένεση των κυττάρων στο πάγκρεας του ανοσοανεπάρκεια ποντίκια σε μια κατάσταση ΤΕΤ-OFF. Δύο εβδομάδες αργότερα, τα κύτταρα που εκφράζουν δοξυκυκλίνη επαγόμενο shRNA έναντι DUSP1 ή σκαρφάλωμα έλεγχο σχηματίζονται όγκους παρόμοιου μεγέθους, τα οποία θα μπορούσαν να ψηλαφείται εύκολα. Όλα τα ποντίκια απεικονίστηκαν την ημέρα 15 μετά την εγχείρηση, με τη χρήση υψηλής υπερήχων ανάλυση, και οι όγκοι του όγκου υπολογίστηκαν με βάση την αποκτηθείσα 3-D εικόνες, επιβεβαιώνοντας ότι οι δύο ομάδες που σχηματίζονται όγκοι του ίσου όγκου (Εικ. 6). Ξεκινώντας την ημέρα 18 μετά την εγχείρηση, η δοξυκυκλίνη χορηγείται συνεχώς στο πόσιμο νερό, και τα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε 2 ομάδες για να λάβουν όχημα ή γεμσιταβίνη (50 mg /kg, ενδοπεριτοναϊκή ένεση, δυο φορές την εβδομάδα). Η γεμσιταβίνη μόνη ή DUSP1 αποσιώπηση μόνο απέτυχαν να παρατείνει την επιβίωση των ζώων (Εικ. 7Α). Ωστόσο, η σύγκριση των shRNA-σκαρφάλωμα /ομάδα γεμσιταβίνη και την ομάδα shRNA-DUSP1 /γεμσιταβίνη αποκάλυψε ότι DUSP1 knockdown δημιουργείται ένα σημαντικό πλεονέκτημα επιβίωσης σε παρουσία γεμσιταβίνης (p = 0,037) (Σχ. 7Α). Η αύξηση του χρόνου επιβίωσης ήταν ακόμη μεγαλύτερη κατά τη σύγκριση της ομάδας shRNA-DUSP1 /γεμσιταβίνη με το shRNA-σκαρφάλωμα ομάδα /όχημα (ρ = 0,009), γεγονός που υποδηλώνει ότι DUSP1 σίγασης αυξημένη ευαισθησία gemcitabine

in vivo

(Σχ. 7Α ).

COLO-357 κύτταρα σταθερά μετάγονται με φακοϊό εκφράζουν Tet-επαγόμενο έλεγχο shRNA (shScramble) ή DUSP1 στόχευση shRNA (shDUSP1). Τα κύτταρα εγχύθηκαν στο πάγκρεας των ποντικών με ανοσοανεπάρκεια, και 15 ημέρες αργότερα, οι όγκοι απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα Vevo2100 υψηλής ανάλυσης υπερήχων. (Α-Β) Αντιπροσωπευτικές εικόνες υπερήχων υψηλής ανάλυσης (Α) και τον ποσοτικό προσδιορισμό των όγκων του όγκου χρησιμοποιώντας 3D κοιλιακό σαρώσεις (Β) δείχνουν ότι πριν Dox ή θεραπειών γεμσιταβίνη, shScramble και όγκους shDUSP1 (Τ, που υποδεικνύεται από τα βέλη) ήταν παρόμοιες σε μέγεθος . Δεδομένων στο (Β) είναι οι μέσες τιμές ± SEM.

Η

ανοσοανεπάρκεια ποντίκια που φέρουν ορθοτοπική όγκους που προέρχονται από την Κόλο-357 κύτταρα τα οποία εκφράζουν σταθερά δοξυκυκλίνη επαγόμενο shRNA έναντι έλεγχο αγωνίζομαι ή DUSP1 δόθηκαν δοξυκυκλίνη στο πόσιμο νερό και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με έκδοχο ελέγχου (φυσιολογικός ορός) ή γεμσιταβίνη (50 mg /kg, ip, δύο φορές την εβδομάδα). επιβίωση (Α) Kaplan-Meier. * P & lt? 0,05, σε σύγκριση με αγωνίζομαι θεραπεία με γεμσιταβίνη?

## ρ & lt? 0,01, σε σύγκριση με αγωνίζομαι αγωγή με φυσιολογικό ορό. (Β) μέτρηση Q-PCR των επιπέδων mRNA DUSP1. (Γ) χρώση TUNEL και ανοσοϊστοχημική ανάλυση των κυττάρων CD34, Κί67, και διασπασμένη κασπάση 3. Scale, 20 μm. (Δ) Ποσοτικοποίηση. Τα δεδομένα είναι τα μέσα ± SEM 3 πειραμάτων. * P & lt? 0,05? ** P & lt?. 0.01, σε σύγκριση με αγωνίζομαι αγωγή με φυσιολογικό ορό

Η

Σε συμφωνία με το

in vitro

ευρήματα, η θεραπεία με γεμσιταβίνη αυξημένα επίπεδα DUSP1 mRNA σε όγκους shRNA-αγωνίζομαι. Οι περισσότεροι από τους όγκους shRNA-DUSP1 είχαν σχετικά χαμηλά επίπεδα DUSP1, ενώ ένας όγκος έδειξαν υψηλά επίπεδα DUSP1, πιθανώς λόγω μικρότερης έκθεσης δοξυκυκλίνη ή μόλυνσης με τα γειτονικά μη καρκινικό ιστό, κατά τη συγκομιδή του δείγματος. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η δοξυκυκλίνη που προκαλείται από την επιτυχή έκφραση shRNA. Ωστόσο, λόγω της υψηλής μεταβλητότητας μεταξύ κάθε ποντίκι, η διαφορά στα επίπεδα DUSP1 μεταξύ των διαφόρων ομάδων δεν ήταν στατιστικά σημαντική (Σχ. 7Β).

Για να αξιολογηθούν τα αποτελέσματα της DUSP1 σιγαστήρα και θεραπεία γεμσιταβίνη στην αγγειογένεση του όγκου, τον πολλαπλασιασμό, και την απόπτωση, ιστοί όγκου επόμενη αναλύθηκαν με ανοσοϊστοχημική χρώση για CD34 (αγγειογένεση) και Ki67 (πολλαπλασιασμός), καθώς επίσης και από τερματικό δεοξυνουκλεοτιδυλοτρανσφεράσης άκρο επισήμανση dUTP nick (TUNEL) και διασπασμένη κασπάση 3 ανοσοαντιδραστικότητα, δύο από τα οποία είναι δείκτες της απόπτωσης. Η γεμσιταβίνη ελαφρώς εξασθενημένα σήματα CD34 και Ki67, ενώ DUSP1 knockdown είχε σημαντική ανασταλτική δράση επί χρώση CD34 και μια πιο μετριοπαθή αλλά πολύ σημαντική ανασταλτική επίδραση στην Κί67 χρώσης (Σχ. 7C, 7D). DUSP1 αποσιώπηση οδήγησε επίσης σε αυξημένη διασπασμένη κασπάση 3 ανοσολογική αντίδραση και σήματα TUNEL, σε σύγκριση με τους όγκους ελέγχου αγωνίζομαι, υποδεικνύοντας ότι υπήρξε αύξηση σε αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο μετά DUSP1 νοκ ντάουν. Η αύξηση της κασπάσης 3 διάσπαση και τον κατακερματισμό του DNA ήταν ακόμη μεγαλύτερη όταν συνδυάζεται DUSP1 φίμωση με γεμσιταβίνη (Σχ. 7C, 7D). Έτσι, η στόχευση DUSP1

in vivo

οδήγησε σε καταστολή της αγγειογένεσης και του πολλαπλασιασμού των κυττάρων του καρκίνου, και ενισχυμένη gemcitabine επαγόμενη απόπτωση.

Συζήτηση

JNK1, -2, και -3 είναι κωδικοποιείται από

MAPK8

,

MAPK9

και

MAPK10

, αντίστοιχα, και εναλλακτικό μάτισμα προκαλεί τουλάχιστον δέκα ισομορφές [9]. Αντίθετα, p38 ΜΑΡΚ-α, -β, -γ και -δ κωδικοποιούνται από

MAPK14

,

MAPK11

,

MAPK12

, και

MAPK13

, αντίστοιχα, και υπάρχουν δύο εναλλακτικά ματισμένων ισομορφών του

MAPK14

[9]. Σε παγκόσμιο επίπεδο, JNK και ρ38 ΜΑΡΚ ενεργοποιήθηκε στρες οδούς επάγουν απόπτωση σε ορισμένες περιπτώσεις, αλλά ενισχύει την επιβίωση σε άλλες, ανάλογα με το είδος-ειδικές διαφορές κυττάρων, την ένταση και τη διάρκεια της σηματοδότησης, και η παρουσία ή απουσία του στιχομυθία με άλλες οδούς σηματοδότησης [9].

στην παρούσα μελέτη, εξακριβώθηκε ότι η γεμσιταμπίνη ενεργοποιημένο JNK και p38 MAPK, προκαλώντας έτσι την απόπτωση στα ΚΕΣ. Ενώ ο ρόλος των ειδικών ισομορφών δεν αξιολογήθηκε, γεμσιταβίνη ενεργοποιούμενη JNK και σηματοδότηση ΜΑΡΚ p38 επάγεται επίσης μεταγραφή DUSP1, όπως αποδεικνύεται από τα αυξημένα επίπεδα DUSP1 mRNA και αυξημένη RNA πολυμεράση II φόρτωσης στο σώμα γονίδιο DUSP1. Επιπλέον, shRNA μεσολάβηση αναστολή της DUSP1 ενισχυμένης JNK και ρ38 ΜΑΡΚ ενεργοποίηση γεμσιταβίνης επαγόμενη και ευαισθητοποιημένα κύτταρα PDAC να γεμσιταβίνη και σισπλατίνη, οδηγώντας σε μειωμένη πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την αυξημένη PARP και κασπάσης 3 διάσπασης. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η γεμσιταβίνη διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση της JNK και ρ38 ΜΑΡΚ οδηγεί στην προς τα πάνω ρύθμιση του DUSP1, η οποία με τη σειρά της συμβάλλει σε ένα βρόχο αρνητικής ανάδρασης που εξασθενεί JNK και ρ38 ΜΑΡΚ δραστηριότητες, παρεμβαίνοντας έτσι με τις ευεργετικές δράσεις της γεμσιταβίνης σχετικά με τις οδούς του στρες και απόπτωσης (Εικ. 8). Αυτές οι παρατηρήσεις εγείρουν την πιθανότητα ότι DUSP1 μπορεί να είναι ένας δυνητικός θεραπευτικός στόχος για την ενίσχυση της ευαισθησίας PDAC σε πολλαπλές χημειοθεραπευτικούς παράγοντες. Επιπλέον, DUSP1 στόχευση οδηγεί σε αυξημένα επίπεδα ρ-ERK1 και ERK2 ρ-[15], και την ενεργοποίηση ERK σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα ενισχύει gemcitabine χημειοαντίσταση [28]. Έτσι, γεμσιταμπίνη που προκαλείται από αυξήσεις στις JNK και τις δραστηριότητες της p38 ΜΑΡΚ είναι ζωτικής σημασίας για την προ-αποπτωτικών δράσεων της.

Γεμσιταβίνη ενεργοποιεί JNK και p38 ΜΑΡΚ (p38) σηματοδότησης, η οποία μεσολαβεί αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο. Ενεργοποιημένα JNK και ρ38 ΜΑΡΚ έπειτα αυξορρυθμίζουν μεταγραφή DUSP1, το οποίο ρυθμίζει αρνητικά δραστικότητα σηματοδότησης JNK και ρ38 ΜΑΡΚ και εξασθενούν γεμσιταβίνης-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο. Η αναστολή DUSP1 σε συνδυασμό με θεραπεία γεμσιταβίνη ενισχύει σημαντικά χημειοευαισθησία των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων.

Η

Η ελαττωμένη DUSP1 καταστέλλει την έκφραση αγγειογόνων παραγόντων, όπως SH2D2A και VEGF-C σε καρκίνο του πνεύμονα μη-μικρού κυττάρου ( NSCLC) κύτταρα και λειτουργικές δοκιμασίες έχουν επιβεβαιώσει το ρόλο της στην προώθηση DUSP1 αγγειογένεσης όγκου [29]. Επιπλέον, σε δείγματα ανθρώπινου NSCLC, DUSP1 συνεντοπίζεται με CD31-θετικά αγγειακές δομές, και μια στενή συσχέτιση μεταξύ της αυξημένης έκφρασης του VEGF-C και DUSP1 έχει αποδειχθεί [29]. Τα αποτελέσματα αυτά υποστηρίζουν την ιδέα ότι DUSP1 μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην αγγειογένεση των όγκων. Αν και PDAC χαρακτηρίζεται από έντονη desmoplasia και υποαιμάτωση, παρουσιάζει επίσης μια υψηλή ροπή προς μετάσταση μέσω αιματογενή ή λεμφικού διαδρομές, ακόμη και όταν ο πρωτογενής όγκος είναι μικρός [30]. Επιπλέον, PDAC εκθέματα εστίες μικρο-αγγειογένεσης και υπερεκφράζουν πολλαπλών προ-αγγειογόνοι παράγοντες, και ενισχυμένη αγγειογένεση, επίπεδα VEGF-A υψηλή ορού, και αυξημένη έκφραση VEGFR-2 έχουν συσχετισθεί με χειρότερη πρόγνωση σε ασθενείς PDAC [30]. Μαζί, αυτές οι εκθέσεις υπογραμμίζουν τη δυνητική σημασία της ανώμαλης αγγειογένεσης σε PDAC και εμπλέκουν DUSP1 ως συμβολή σε αυτή τη διαδικασία.

Χρησιμοποιώντας δοξυκυκλίνη επαγόμενο νοκ ντάουν της DUSP1 σε καθιερωμένες ορθοτοπική όγκους του παγκρέατος, στην παρούσα μελέτη διαπιστώσαμε ότι ο συνδυασμός γεμσιταβίνης με DUSP1 αναστολή παρατεταμένη επιβίωση των ζώων και την ενισχυμένη αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο, σε σύγκριση με μόνη γεμσιταβίνη. Επιπλέον, DUSP1 knockdown αξιοσημείωτα εξασθενημένο πολλαπλασιασμό PCC και αγγειογένεση όγκου. Η χρήση των ανοσοποιητικού ανεπαρκή ποντίκια αποκλείει την εκτίμηση της συνέπεια της αναστολής DUSP1 στο ανοσοποιητικό σύστημα ή για μακροφάγων αριθμό και την ενεργοποίηση εντός της μάζας του όγκου του παγκρέατος. Δεδομένου ότι DUSP1 είναι γνωστό ότι ρυθμίζουν τον πολλαπλασιασμό των μακροφάγων και ενεργοποίηση [31], μελέτες με συγγενή ή γενετικά μοντέλα ποντικών του PDAC θα απαιτηθούν για την αντιμετώπιση αυτής της πτυχής της λειτουργίας DUSP1 σε PDAC.

Οι μηχανισμοί που οδηγούν σε αυξημένη DUSP1 έκφραση σε PDAC δεν είναι γνωστές. Έχει αποδειχθεί, όμως, ότι η υποξία μπορεί να ρυθμίζει προς τα πάνω DUSP1 μεταγραφή [14], και PDAC είναι μια ιδιαίτερα δεσμοπλαστικού όγκου με ένα αξιοσημείωτα υποξικό μικροπεριβάλλον [5] – [7]. Επιπλέον, υπό την παρουσία του οξειδωτικού στρες, E2F1 επάγει έκφραση DUSP1 [13], και E2F1 υπερεκφράζεται σε PDAC ως συνέπεια της RB δυσλειτουργίας και ενεργοποίηση υπερβολική ΡΙ3Κ [32], [33]. Λαμβανόμενα μαζί με τα παρόντα ευρήματα, οι παρατηρήσεις αυτές υποδηλώνουν ότι PDAC μπορεί να είναι «γεμάτοι» να παρουσιάζουν αυξημένη ενεργοποίηση DUSP1 σε απόκριση προς γεμσιταβίνη, και προτείνουν ότι η στόχευση DUSP1 σε PDAC θα μπορούσε να ενισχύσει τις ευεργετικές δράσεις της γεμσιταβίνης με την προώθηση της απόπτωσης και καταστολή πολλαπλασιασμού παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων και την αγγειογένεση των όγκων

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Όλες οι μελέτες σε ζώα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Θεσμικών ζωικά Φροντίδα και Χρήση του Πανεπιστημίου της Ιντιάνα (Αριθμός άδειας: 10108).. Όλες οι μελέτες σε ζώα που περιγράφονται διεξήχθησαν σε συμφωνία με τα αποδεκτά πρότυπα ανθρώπινη φροντίδα των ζώων και όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία.

Cell Culture

AsPC-1 και BxPC-3 ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος ήταν ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA). COLO-357 κύτταρα ήταν ένα δώρο από τον Dr. R. Metzger στο Πανεπιστήμιο Duke, και αρχικά τοποθετήθηκαν σε καλλιέργεια από τον Morgan,

et al

., [34] από έναν ασθενή με μεταστατικό PDAC. Έχουν χρησιμοποιηθεί εκτενώς [15], [35], [36], και είχαν επικυρώνονται από χρωμοσωμική ανάλυση. κύτταρα BxPC-3 AsPC-1 και αναπτύχθηκαν σε RPMI 1640, και COLO-357 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε DMEM. Εκτός εάν ορίζεται διαφορετικά, μέσα συμπληρώθηκαν με ορό 5% εμβρυϊκό ορό (FBS), 100 μονάδες /ml πενικιλίνη, και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη (πλήρες μέσο).

3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2 -υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου (ΜΤΤ) δοκιμασία

ΜΤΤ δοκιμασία διεξήχθη όπως περιγράφεται [35].

ανοσοαποτύπωσης

ανοσοκηλίδωση πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [ ,,,0],35] με τη χρήση αντισωμάτων κατά των ακόλουθων αντιγόνων: PARP, κασπάση-3, διασπασμένη κασπάση 3 (Asp175), φωσφο-ρ38 ΜΑΡΚ (Thr180 /Tyr182), ρ38 ΜΑΡΚ, φωσφο-ΙΝΚ (G9), και φωσφο-c-Jun ( Ser63) από την Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ? DUSP1 (C-19), MKP2 (S-18), JNK (FL) και ERK2 (C-14), από την Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA.