Αφηρημένο

Ιστορικό

Ανίχνευση του καρκίνου του πνεύμονα σε πρώιμο στάδιο από δοκιμές διαλογής ευαίσθητα θα μπορούσε να είναι μια σημαντική στρατηγική για τη βελτίωση της πρόγνωσης. Ο στόχος μας ήταν να προσδιορίσει ένα πάνελ που κυκλοφορούν microRNAs στο πλάσμα, που θα συμβάλει στην έγκαιρη διάγνωση του καρκίνου του πνεύμονα.

Υλικό και Μέθοδοι

Plasma δείγματα από 100 πρώιμο στάδιο (Ι ΙΙΙΑ) μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) ασθενείς και 100 μάρτυρες μη καρκίνος σαρώθηκαν για 754 που κυκλοφορεί microRNAs μέσω qRT-PCR, χρησιμοποιώντας TaqMan microRNA Arrays. Λογιστικής παλινδρόμησης με ένα λάσο ποινή χρησιμοποιήθηκε για να επιλέξετε μια ομάδα microRNAs που εισάγουν διακρίσεις μεταξύ των περιπτώσεων και των ελέγχων. Η επικύρωση του εσωτερικού των διακρίσεων μοντέλο διεξήχθη από τον υπολογισμό της εκκίνησης αισιοδοξία διορθωμένη AUC για το επιλεγμένο μοντέλο.

Αποτελέσματα

Εντοπίσαμε ένα πάνελ 24 microRNAs με τη βέλτιστη απόδοση ταξινόμησης. Ο συνδυασμός αυτών των 24 microRNAs και μόνο θα μπορούσε διάκριση των περιπτώσεων καρκίνου του πνεύμονα από τους ελέγχους μη-καρκίνου με την AUC του 0,92 (95% CI: 0,87 – 0,95). Αυτή η ταξινόμηση βελτιωθεί σε AUC 0,94 (95% CI: 0,90-0,97) μετά την προσθήκη του φύλου, της ηλικίας και της κατάστασης του καπνίσματος με το μοντέλο. Η επικύρωση του εσωτερικού του μοντέλου δείχνουν ότι η διακριτική εξουσία του πίνακα θα είναι υψηλό όταν εφαρμόζεται σε ανεξάρτητα δείγματα με διορθωμένη AUC 0,78 μόνο για τον πίνακα 24-miRNA.

Συμπέρασμα

μας 24 -microRNA προγνωστικός βελτιώνει την πρόγνωση του καρκίνου του πνεύμονα πέρα ​​από αυτό των γνωστών παραγόντων κινδύνου

Παράθεση:. Wozniak MB, Scelo G, Muller DC, Mukeria Α, Zaridze D, Brennan P (2015) Κυκλοφορούν Τα microRNAs ως μη επεμβατική βιοδείκτες για Η έγκαιρη ανίχνευση του μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 10 (5): e0125026. doi: 10.1371 /journal.pone.0125026

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Jörg Δ Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Γερμανία

Ελήφθη: 16 Οκτωβρίου, 2014? Αποδεκτές: 19 Μαρτίου του 2015? Δημοσιεύθηκε: May 12, 2015

Copyright: © 2015 Wozniak et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Το TaqMan Ανθρωπίνων πειράματα microRNA Array είναι MIAME συμβατό και έχουν κατατεθεί στο Expression NCBI Gene Omnibus (GEO) βάση δεδομένων (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) υπό ένταξη GSE64591

Χρηματοδότηση:. Η συγγραφείς δεν έλαβε καμία ειδική χρηματοδότηση για το έργο αυτό

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνου

πνεύμονα είναι η πιο κοινή αιτία του καρκίνου θανάτου παγκοσμίως. Το 2012, 1.820.000 νέες περιπτώσεις, και 1.590.000 θανάτους που οφείλονται σε καρκίνο του πνεύμονα καταγράφηκαν, που αντιπροσωπεύει το 13% όλων των περιπτώσεων καρκίνου και το 19% όλων των θανάτων από καρκίνο αντίστοιχα [1]. Μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα (NSCLC) αντιπροσωπεύει περίπου το 80-85% όλων των περιπτώσεων καρκίνου του πνεύμονα και περιλαμβάνει κυρίως δύο ιστολογικών τύπων: αδενοκαρκίνωμα (AC) και καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων (SCC). Παρά τις προόδους στη θεραπεία, ένα συνολικό ποσοστό επιβίωσης 5 ετών μόνο το 16% [2] οφείλεται κυρίως σε προχωρημένο στάδιο κατά τη διάγνωση. Ανίχνευση του καρκίνου του πνεύμονα σε πρώιμο στάδιο από δοκιμές διαλογής ευαίσθητα θα μπορούσε να είναι μια σημαντική στρατηγική για τη βελτίωση των πνευμόνων πρόγνωση του καρκίνου.

Η δίκη Screening Εθνική πνεύμονα (NLST) με τη χρήση χαμηλής δόσης ελικοειδούς υπολογιστικής τομογραφίας (LDCT) σε υψηλής άτομα κινδύνου αποδεικνύει ότι μια μείωση κατά 20% της πνευμονικής ειδική θνησιμότητα λόγω καρκίνου και μείωση 6,7% σε όλα τα αίτια θνησιμότητας [3] μπορεί να επιτευχθεί. Παρ ‘όλα αυτά, η υψηλή ψευδώς θετικά ποσοστά NLST [4], το κόστος, και πιθανές βλάβες από την έκθεση σε ακτινοβολία υπογραμμίζουν την ανάγκη για απλή, μη επεμβατική και πιο προσιτές μεθοδολογίες για την αποτελεσματική έγκαιρη ανίχνευση του καρκίνου ως συμπληρωματικά βιοδείκτες.

Τα microRNAs (miRNAs) είναι μια ομάδα μικρών (~ μακρύ 22-νουκλεοτίδια) μη-κωδικοποίησης, μονόκλωνο RNA που ρυθμίζουν την έκφραση των γονιδίων μετα-μεταγραφικά. Οι εκτροπές στα επίπεδα έκφρασης των miRNAs έχουν βρεθεί σε σχέση με ογκογένεση και μετάσταση όγκου [5], συμπεριλαμβανομένων των NSCLC. Περισσότεροι από 2.500 ανθρώπινες αλληλουχίες miRNAs είναι γνωστές σήμερα [6]. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι τα miRNAs ορού και πλάσματος (που ονομάζεται κυκλοφορούν miRNAs) που υπάρχει μεγάλη υπόσχεση ως νέα μη επεμβατική βιοδείκτες για την έγκαιρη διάγνωση διαφόρων μορφών καρκίνου λόγω της ευκολίας πρόσβασης, και μακροπρόθεσμη σταθερότητα [7,8]. Στον καρκίνο των πνευμόνων, έχουν πολλά προφίλ έκφρασης των miRNAs έχουν ταυτιστεί με αξιοσημείωτα υψηλή προγνωστική αξία συμπεριλαμβανομένου ενός διαγνωστικού υπογραφής 34-miRNA με την AUC του 0,89 [9], ένα πάνελ 10-miRNA με την AUC του 0,97 στον ορό, καθώς και 16-miRNA αναλογίες ως υπογραφή του κινδύνου (AUC: 0.85) και διάγνωσης (AUC: 0,88) [10,11] σε δείγματα ασθενών με NSCLC πλάσμα

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει σημαντικές ανακολουθίες αν και αυτά βασίστηκαν σε περιορισμένο μέγεθος του δείγματος. ή να χρησιμοποιηθούν υποψήφιο miRNA προσεγγίσεις. Επιπλέον, ένα επίπεδο διαμάχη υπάρχει σε ότι miRNAs εντοπίζονται στο αίμα απλώς δείχνουν τις αλλαγές στα κύτταρα του αίματος δευτερεύουσα σε μια συνολική κακή κατάσταση υγείας και δεν είναι ειδικά για την παρουσία καρκίνου σε όργανο-στόχο. Αν και η μέτρηση της έκφρασης miRNA στο πλάσμα ή στον ορό έχει υποτεθεί ως μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση στη διάγνωση του καρκίνου του πνεύμονα, η έννοια απαιτεί περαιτέρω έρευνες για να αποδειχθεί η δυνητική χρήση της ως κλινική εφαρμογή. Δεν υπάρχει ισχυρή απόδειξη για το αν ορό ή το πλάσμα είναι ανώτερη για την αξιολόγηση των miRNAs, ωστόσο, πρόσφατες εκθέσεις δείχνουν ότι το πλάσμα μπορεί να είναι η προτιμώμενη επιλογή του δείγματος, δεδομένου ότι το RNA που απελευθερώνεται κατά τη διάρκεια της διαδικασίας πήξης μπορεί να μεταβάλει τη σύνθεση των κυκλοφορούντων miRNAs σε δείγματα ορού [12 ].

Εδώ, σας παρουσιάζουμε μια οθόνη έκφραση των miRNAs γονιδίωμα-ευρεία σε δείγματα πλάσματος από 100 περιπτώσεις NSCLC και 100 έλεγχοι στις οποίες προσδιορίζεται μια υπογραφή miRNA με υψηλή διαγνωστική αξία που είχε προσδιοριστεί μέσω αυστηρών στατιστικές προσεγγίσεις.

Αποτελέσματα

πληθυσμός μελέτη

Τα χαρακτηριστικά των 200 συμμετέχοντες στη μελέτη, συμπεριλαμβανομένων 65 ασθενών με πνευμονική SCC, 35 ασθενείς με πνευμονική AC και 100 ελέγχων που παρουσιάζονται στον πίνακα 1. Δεν υπήρχε η διαφορά του φύλου (περισσότεροι άνδρες μεταξύ των περιπτώσεων), ηλικία κατά την συνέντευξη (περιπτώσεις ήταν κατά μέσο όρο 1,5 χρόνια μεγαλύτερα από τους ελέγχους), το κάπνισμα κατάσταση (15% περισσότερο ρεύμα καπνιστών μεταξύ των περιπτώσεων) και την κατάσταση της κατανάλωσης αλκοόλ (περιπτώσεις περιλαμβάνεται 12% περισσότερες πρώην αλκοόλ καταναλωτές). ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα ήταν πρώιμο στάδιο IA-IIIA. Ο μέσος χρόνος παρακολούθησης ήταν 2,48 χρόνια. Κατά τη διάρκεια αυτής της περιόδου παρακολούθησης, 64 από τις 100 περιπτώσεις έχασαν τη ζωή τους και 36 ήταν ακόμα ζωντανός σε λογοκρισία.

Η

προφίλ μικρο-RNA στο πλάσμα

Για να αξιολογηθεί κατά πόσον συγκεκριμένες υπογραφές miRNA είναι ανιχνεύσιμες σε δείγματα πλάσματος ασθενών με πρώιμα στάδια του NSCLC, πραγματοποιήσαμε μια οθόνη υψηλής απόδοσης 754 miRNAs χρήση TaqMan Ανθρωπίνων microRNA πίνακες. Κατά μέσο όρο 235 και 115 miRNAs ανιχνεύθηκαν στην κάρτα Α και Β Κάρτα, αντίστοιχα (παρούσα σε τουλάχιστον 80 από 200 δείγματα είτε σε περιπτώσεις ή μάρτυρες) (Σχήμα 1). Τα προφίλ έκφρασης των miRNAs στο πλάσμα ήταν quantile εξομαλυνθεί και υποβάλλεται σε διαφορικές αναλύσεις έκφρασης μεταξύ των δειγμάτων NSCLC και τους ελέγχους. 350 ανιχνεύθηκαν miRNAs στο πλάσμα, 61 miRNAs βρέθηκαν να είναι σημαντικά διαφορικά εκφρασμένων μεταξύ των περιπτώσεων και ελέγχων καρκίνου του πνεύμονα (35 στην κάρτα Α, 26 στην Κάρτα Β) των οποίων 33 ρυθμίζεται προς τα πάνω και 28 μειωτικά miRNAs (τιμή p & lt? 0,05). Αυτές αποτελούνται 21 miRNAs εκφράζονται διαφορικά με σημαντική προσαρμοσμένη τιμή p διορθώθηκαν για πολλαπλές δοκιμές (Πίνακας 2). Παρά τη σημαντική διαφορική έκφραση, εποπτεύεται ιεραρχική ανάλυση ομαδοποίησης έδειξε ότι αυτό το σύνολο των 61 miRNAs δεν ήταν σε θέση να διακρίνουν σαφώς μεταξύ των περιπτώσεων καρκίνου του πνεύμονα και των ελέγχων (S1 Σχήμα).

Η

Μοντέλα πρόβλεψης

Για να επιλέξετε μια ομάδα miRNAs διάκριση μεταξύ των περιπτώσεων και των ελέγχων, ένα μοντέλο λογιστικής παλινδρόμησης με το λάσο ποινή ήταν εφοδιασμένο. Αυτή η ανάλυση εντόπισε μια ομάδα 24 miRNAs πλάσματος με βέλτιστη απόδοση ταξινόμησης (S2 και S3 σχήματα). Ο Πίνακας 3 δείχνει την πλήρη λίστα των επιλεγμένων miRNAs μέσα στον πίνακα. ανάλυση πολλαπλής λογιστικής παλινδρόμησης έδειξε ότι ο συνδυασμός των 24 miRNAs και μόνο θα μπορούσε διάκριση των περιπτώσεων καρκίνου του πνεύμονα από τους ελέγχους με πολύ υψηλή AUC 0,92 (95% CI: 0,87 – 0,95). Στο μοντέλο λογιστικής συμπεριλαμβανομένου του πίνακα 24-miRNA και προσαρμοσμένο για κύριους παράγοντες κινδύνου καρκίνου του πνεύμονα, δηλαδή το φύλο, την ηλικία κατά τη συνέντευξη και το κάπνισμα, η κατάταξη βελτιώθηκε σε μια AUC 0,94 (95% CI: 0,90-0,97) (Εικόνα 2) . Η βελτίωση στο μέγεθος της διάκρισης που αποδίδονται στον πίνακα 24-miRNA είναι σημαντική σε σύγκριση με εκείνη των μόνες τους κύριους παράγοντες κινδύνου για καρκίνο του πνεύμονα. Οι AUCs για την πλήρη υλικοτεχνική μοντέλα με και χωρίς τον πίνακα 24-miRNA ήταν 0,94 (95% CI: 0,90-0,97) και 0,72 (95% CI: 0,65 – 0,78), αντίστοιχα (Σχήμα 3). Η προγνωστική αξία ήταν παρόμοιου μεγέθους (AUC: 0,95? 95% CI: 0,91 – 0,98) κατά την αντικατάσταση του κατηγορική μεταβλητή κατάστασης του καπνίσματος από τη συνεχή πακέτα-έτη μεταβλητή. Αξίζει να σημειωθεί ότι, ακόμη και αν προέρχεται από δύο ιστολογικών τύπων, ο πίνακας 24 miRNA εκτελούνται εξίσου καλά τόσο ACs (AUC: 0,94) και κλώνοι ενός κυττάρου (AUC: 0,96). Ομοίως, ο προγνωστικός απέδωσε καλά για καρκίνους όλων των σταδίων (ΙΑ-IIIA), με μια AUC 0,96 για το στάδιο Ι (ΙΑ και ΙΒ? N = 49) των ασθενών, 0,98 για το στάδιο ΙΙ (στάδιο IIA και IIB? N = 21) ασθενών και 0,97 για τη φάση ΙΙΙΑ (n = 30) των ασθενών (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

η

η

η επικύρωση του εσωτερικού του επιλεγμένου μοντέλου πίνακα 24-miRNA (δηλαδή, την επικύρωση αντιπροσωπεύοντας μεταβλητότητα λόγω εκτίμηση παραμέτρων), χρησιμοποιώντας την αισιοδοξία εκκίνησης διορθωμένη AUC δείχνει ότι η διακριτική εξουσία του πίνακα θα είναι υψηλό όταν εφαρμόζεται σε ανεξάρτητα δείγματα (διορθωμένη AUC 0,86 μόνο για τον πίνακα 24-miRNA, 0,87 για το μοντέλο συμπεριλαμβανομένου του φύλου, της ηλικίας και του καπνίσματος κατάσταση και 0.89 για το μοντέλο με το πακέτο-χρόνια μεταβλητή). Η bootstrap αισιοδοξία διορθωθεί AUC, η οποία έλαβε υπόψη τη διαδικασία επιλογής ολόκληρο miRNA ταξινομητή (τιμωρείται Lasso λογιστικής παλινδρόμησης) ήταν 0,78.

Συζήτηση

Παρά τις εκτεταμένες εξελίξεις της απεικόνισης και σε συνδυασμό τρόπους θεραπείας, η 5- ποσοστό επιβίωσης χρόνο από καρκίνο του πνεύμονα έχει βελτιωθεί οριακά μόνο κατά τις τελευταίες δεκαετίες [2]. Μια μη επεμβατική, βιοδεικτών με γνώμονα την διαστρωμάτωση του καρκίνου του πνεύμονα σε πρώιμα στάδια θα μπορούσε, επομένως, να συμπληρώσει διαλογής LDCT και τη βελτίωση της διαχείρισης της θεραπείας. Έχουμε αναπτύξει ένα πάνελ 24 miRNAs πλάσμα ικανό να διακρίνει τις περιπτώσεις πρώιμο στάδιο NSCLC από ελέγχους με υψηλό AUC του 0,92 μετά από εξέταση 754 miRNAs σε 100 ασθενείς με NSCLC και 100 άτομα χωρίς καρκίνο. Αυτό το σύνολο των miRNAs ταυτίστηκε με πολύ αυστηρές στατιστικών μεθόδων. Για τις γνώσεις μας, αυτό είναι επίσης ένα από τα μεγαλύτερα διερευνητικών μελετών του miRNA στο πλάσμα. Δοκιμές όπως αυτές αποδεικνύουν αρκετά πλεονεκτήματα σε κλινικό περιβάλλον, συμπεριλαμβανομένων χωρίς την απαίτηση για τη συλλογή επεμβατικές δείγματος ( «υγρή βιοψία»), το χαμηλό κόστος σε σύγκριση με τις τεχνικές απεικόνισης, απλές εργαστηριακές διαδικασίες και την ένταξη ενός πάνελ βιοδεικτών, αντί ενός ενιαίου miRNA.

Μέχρι σήμερα, αρκετές μελέτες έχουν αναφέρει προφίλ miRNA στο πλάσμα και ορό που αναπτύχθηκε για τη διάγνωση της NSCLCs [9-11,13-16]. Παρά την πολύ ελπιδοφόρα αποτελέσματα αυτές οι μελέτες έχουν δείξει μια μάλλον μικρή επικάλυψη μεταξύ εντοπίζονται υπογραφές miRNA, και βασίστηκαν σε περιορισμένο μέγεθος του δείγματος /πισίνες των δειγμάτων που δεν επιτρέπουν την αξιολόγηση της συμβολής από έναν ασθενή με τη γενετική πισίνα, ή να χρησιμοποιηθεί ένα υποψήφιο προσέγγιση miRNA για την ανακάλυψη του πίνακα miRNA. Η διακύμανση σε προ-αναλυτική παράγοντες, όπως είναι οι διαδικασίες προετοιμασίας του δείγματος, και διαφορετικές στρατηγικές ομαλοποίηση κάνει σύγκριση μεταξύ των μελετών δύσκολη. Επίσης, οι διαφορές στα προφίλ miRNA μεταξύ του ορού και του πλάσματος [14] μπορεί να ευθύνεται για ορισμένες από την έλλειψη συσχετισμού των επιπέδων έκφρασης miRNA μεταξύ προηγούμενες μελέτες. Τέλος, οι περιγραφόμενες υπογραφές μπορεί να διαφέρει λόγω της εγγενούς πλήθος των στόχων miRNA και του δυναμικού πλεονασμού τους. Δεδομένου ότι η μελέτη μας αξιολόγησε τον υψηλότερο αριθμό των προφίλ miRNA, ήμασταν σε θέση να αξιολογήσει την προγνωστική αξία έχουν αναφερθεί στο παρελθόν υπογραφές miRNA στα δεδομένα μας. Είναι ενδιαφέρον ότι, παρά τη μικρή επικάλυψη των miRNAs μεταξύ προγνωστικών, διαφορετικό πληθυσμό ασθενών, επεξεργασία του δείγματος, πρωτόκολλα εκχύλισης και τις διαδικασίες κανονικοποίησης που χρησιμοποιείται σε σύγκριση με προηγούμενες μελέτες [9,10,13], μια σχετικά υψηλή προγνωστική αξία (AUC: 0,68 – 0,78) του Οι πινακίδες αυτές miRNA παρατηρήθηκε στη μελέτη μας (S1-S4 πίνακες, S4 σχήμα), αναδεικνύοντας έτσι το δυναμικό των κυκλοφορούντων miRNAs ως βιοδείκτες για την ανίχνευση του καρκίνου του πνεύμονα. Στα δεδομένα μας, η καλύτερη διάκριση μεταξύ των περιπτώσεων NSCLC και τους ελέγχους διαπιστώθηκε για την υπογραφή 34-miRNA που αναφέρθηκαν από Bianchi και οι συνεργάτες του [9] δείχνει ένα AUC 0,78 (95% CI: 0,72 – 0,84). Κάτω προγνωστική αξία παρατηρήθηκε κατά τη χρήση της υπογραφής του κινδύνου (που αναπτύχθηκε σε προ-διαγνωστικά δείγματα) και στη διάγνωση (αναπτύσσονται στη μελέτη ασθενών-μαρτύρων) που περιγράφεται από Boeri και οι συνεργάτες του [10] και πρόσφατα επικυρωθεί από την ίδια ομάδα [11] δείχνει ένα AUC 0,71 (95% CI: 0,65 – 0,78) και AUC 0,70 (95% CI: 0,63 – 0,76), αντίστοιχα. Τέλος, ο πίνακας 10-miRNA που ορίζεται από τον Chen και οι συνεργάτες του έδωσαν μια AUC 0,68 (95% CI: 0,61 – 0,74). Όταν τοποθετηθεί χρησιμοποιώντας τα δεδομένα μας [13]

Οι προηγούμενες εκθέσεις έθεσε το ερώτημα αν miRNAs βρίσκονται σε κυκλοφορία προέρχονται από όγκους. Στη θεωρία, miRNA στο πλάσμα ή στον ορό μπορεί να προέρχονται από τον όγκο ή από φλεγμονώδεις αποκρίσεις του ξενιστή. Ελλείψει στοιχείων miRNA από τον ιστό του όγκου σε σειρά μας των δειγμάτων μας σε σύγκριση με μια ομάδα 24 miRNAs στο προγνωστικό μας να εκφράζονται διαφορικά miRNA από την AC και SCC του πνεύμονα που λαμβάνεται μέσω της ανάλυσης των δεδομένων αλληλουχίας Atlas (TCGA) miRNA Cancer Genome ( https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/). Δώδεκα του miRNA που περιλαμβάνονται στο προγνωστικό μας επίσης μεταβάλλονται σε δεδομένα TCGA σε οποιαδήποτε ιστολογία. Ωστόσο, η κατεύθυνση της ένωσης ήταν συνεπής μόνο για let-7c και miR-218. Αυτό υποδηλώνει ότι η προγνωστική ρόλος των miRNAs πλάσματος είναι ανεξάρτητη από τον ιστό σύμφωνα με τα προηγούμενα ευρήματα του Boeri και οι συνεργάτες του [10].

Πρόσφατες μελέτες έχουν επίσης δείξει ότι οι σημαντικές διακυμάνσεις στην αφθονία των microRNA βιοδείκτες που αναφέρονται στη βιβλιογραφία θα μπορούσε είναι αποτέλεσμα της ένταξης της αιμολυμένου δειγμάτων [17-19]. Για να ελαχιστοποιηθεί η επίδραση της αιμόλυσης, τα δείγματα που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη μας ακολούθησε τυποποιημένα πρωτόκολλα και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία εντός 2 ωρών από την ώρα της συλλογής αίματος. Επιπλέον, ένα βήμα QC εφαρμόστηκε για την εκτίμηση πιθανών αιμόλυση από την αξιολόγηση των επιπέδων έκφρασης των 10 προηγουμένως αναφερθεί αιμόλυση που σχετίζονται με miRNA, συμπεριλαμβανομένων των miR-451, miRNA miR-16, miR-15b, miR-486-3p, miR-532- 3ρ, miR-886-5p, miR-636, miR-1255B, RNU48 και miR-92a [17,19] μεταξύ όλων των miRNAs ανιχνεύθηκε στη μελέτη μας. Εμείς δεν παρατηρούμε σημαντικές διαφορές ως προς την αιμόλυση που σχετίζονται με miRNA μεταξύ των περιπτώσεων και ελέγχων καρκίνου του πνεύμονα σε σειρά μας εκτός από miR-15b (p-value = 0,024) (S5 Πίνακας). Ωστόσο, οι μεταβολές του miR-15b έχουν προηγουμένως αναφερθεί σε ιστούς όγκων [20,21] και miR-15b έχει προταθεί ως βιοδείκτη ορού για την ανίχνευση του NSCLC [22]. Επιπλέον, κανένα από τα miRNAs αιμόλυση που σχετίζονται ήταν παρόντες σε 24-miRNA προγνωστικός μας

Η μελέτη μας έχει πολλά αξιόλογα πλεονεκτήματα, όπως:. Προσεκτική επιλογή των ασθενών με όλες τις διαθέσιμες, τυποποιημένη και ενιαία επεξεργασία των δειγμάτων αίματος κλινικά δεδομένα μέσα σε 2 ώρες από τη συλλογή του αίματος, βήμα υπερφυγοκέντρησης παρακάτω απόψυξη για να αφαιρέσετε cryoprecipitates και τα συντρίμμια των κυττάρων, το μεγάλο μέγεθος του δείγματος, μεγάλος αριθμός των miRNAs αναλύονται και πολύ αυστηρή στατιστική αξιολόγηση της προγνωστικό miRNA. Γνωστή προγνωστικοί παράγοντες του καρκίνου του πνεύμονα αναγκάστηκαν σε μοντέλα στη μελέτη, ανεξάρτητα από στατιστικής σημαντικότητας να δοκιμάσει πραγματικά την προστιθέμενη αξία των στοιχειωδών 24-miRNA πάνελ μας (Σχήμα 3).

Ένας περιορισμός είναι ότι, λόγω της περίπτωση- σχεδιασμός έλεγχος της μελέτης μας, τα δείγματα αίματος συλλέχθηκαν κατά τη στιγμή της διάγνωσης. Για την αντιμετώπιση εν μέρει αυτόν τον περιορισμό κάναμε περιορίζουν την ανάλυσή μας για την πρόωρη NSCLC στάδιο. Επίσης, η μελέτη μας δεν διαθέτει μια εξωτερική σειρά επικύρωσης. Για την αντιμετώπιση αυτού του προβλήματος εκτελέσαμε εσωτερικής επικύρωσης χρησιμοποιώντας μια μέθοδο bootstrapping η οποία έδειξε ότι η προγνωστική αξία του πίνακα θα παραμείνει σε υψηλά επίπεδα, όταν εφαρμόζεται σε μια ανεξάρτητη σειρά δειγμάτων.

Το μικρό μέγεθος των ώριμων miRNAs και ομολογία αλληλουχίας τους σε πρόδρομα miRNA απαιτεί ευαίσθητες μεθόδους για την ποσοτική ανάλυση. Χρησιμοποιήσαμε την τρέχουσα μέθοδο «χρυσό πρότυπο» για τη μέτρηση των κυκλοφορούντων miRNAs. TaqMan miRNA κάρτες χρησιμοποιούν ένα στόχο-ειδικό, στέλεχος-βρόχο αστάρι αντίστροφης μεταγραφής για να αντιμετωπίσει την πρόκληση της μικρού μήκους [23]. Παρά την υψηλή ακρίβεια και ειδικότητα της τεχνικής qRT-PCR, το καθένα miRNA επίπεδο έκφρασης μετράται μπορεί να επηρεαστεί και από τις δύο συστηματικές πειραματικές προκατάληψη και τεχνικές παραλλαγές συμπεριλαμβανομένων των διαφορών στις προμήθειες δείγμα, σταθεροποίηση, εκχύλιση RNA, και το δείγμα διαφορές. Ως αποτέλεσμα, η κανονικοποίηση των δεδομένων είναι κρίσιμη για την ελαχιστοποίηση «θόρυβος» και τη λήψη βιολογικώς σημαντικών δεδομένων και να αναπτυχθούν βιοδείκτες miRNA με βάση. Σε περίπτωση που δεν εκφράζονται σταθερά ενδογενούς κυκλοφορούν miRNAs να λειτουργήσουν ως μάρτυρες εξομάλυνση, και να ελέγχει την ευαισθησία των αποτελεσμάτων μας διάφορες στρατηγικές εξομάλυνσης εξετάστηκαν στη μελέτη μας, συμπεριλαμβανομένων ποσοστημόριο κανονικοποίηση, το βαθμό εξομάλυνσης, γεωμετρικά σημαίνει κανονικοποίηση, κανονικοποίηση σε ενδογενείς έλεγχο U6snRNA και να το ATH-miR-159a ακίδα-in εξωγενή έλεγχο. Με βάση την διερευνητική οικόπεδα ανάλυση δεδομένων, η αστάθεια του ενδογενούς ελέγχου, διαφορά σε αφθονία από ακίδα-in vs δείγμα miRNA, αποφασίσαμε να ποσοστημόριο ομαλοποίηση επιλέχθηκε για την ανάλυση. Επιπλέον, για να μειωθεί συγχητικές από τεχνική παραλλαγή όπως πλάκα σε πλάκα παραλλαγή και μεταβολή λόγω καθαρισμού, έχουμε διανέμονται τα δείγματα έτσι ώστε διαγνωστικές μεταβλητές ήταν ισορροπημένες σε σχέση με την ημέρα της ανάλυσης ή της πινακίδας και τυχαιοποιήθηκαν σε κάθε ημέρα και την πλάκα.

Εν κατακλείδι, η μελέτη μας δείχνει ότι ο πίνακας 24-miRNA είναι σημαντικά και ανεξάρτητα σχετίζονται με τον καρκίνο του πνεύμονα μετά από ανάλυση ενός υγρού βιοψία και προσθέτει με την πρόβλεψη του καρκίνου του πνεύμονα πέρα ​​από αυτό εισφέρει εδραιωμένων παραγόντων κινδύνου. Η μελέτη μας θα πρέπει επομένως να θεωρηθεί ως μια διερευνητική μελέτη παρέχει ένα ισχυρό και άκρως προγνωστική πίνακα miRNA εντοπίζονται μέσω της αυστηρής στατιστικές προσεγγίσεις για περαιτέρω επικύρωση σε καλά σχεδιασμένη μεγάλη προοπτική ομάδες και οι δοκιμές διαλογής. Εάν τα τρέχοντα ευρήματα επικυρωθεί, αναμένεται να συμβάλει σημαντικά στην πρακτική των κλινικών και τη δημόσια υγεία και μπορεί να οδηγήσει σε πιο αποτελεσματικές προσυμπτωματικό έλεγχο του καρκίνου του πνεύμονα με τη βελτίωση των κριτηρίων εγγραφής για τον εντοπισμό εκείνων που θα επωφεληθούν από την περαιτέρω εξέταση.

Οι ασθενείς και οι μέθοδοι

πληθυσμός μελέτη

ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα και οι έλεγχοι είχαν προσληφθεί μέσω μιας μελέτης ασθενών-μαρτύρων IARC συντονίζονται στη Μόσχα από το 2006 έως το 2012. οι περιπτώσεις ήταν ασθενείς με καρκίνο περιστατικό που συλλέγονται από τη Ρωσική NNBlokhin Cancer Research Κέντρο και Μόσχα Κλινικής Ογκολογίας ιατρείο που εξυπηρετούν τη Μόσχα και τις γύρω περιοχές. Έλεγχοι είχαν προσληφθεί από άτομα που επισκέπτονται δύο Μόσχας γενικά νοσοκομεία για τις διαταραχές που δεν σχετίζονται με τον καρκίνο του πνεύμονα και σε σχετιζόμενους παράγοντες κινδύνου. Όλοι οι συμμετέχοντες στη μελέτη με την προϋπόθεση γραπτή συγκατάθεση και ερωτήθηκαν.

περιφερικό αίμα συλλέχθηκε σε σωληνάρια EDTA κατά το χρόνο της συνέντευξης και επεξεργασία όσο το δυνατόν ταχύτερα (γενικά μέσα σε 2 ώρες). Για τις περιπτώσεις, ισοπαλία αίμα διεξήχθη πριν από την επέμβαση και κάθε επικουρική θεραπεία. Δείγματα πλάσματος απομονώθηκαν με φυγοκέντρηση του ολικού αίματος σε 2000xg για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα δείγματα αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C. Όλα τα δείγματα που λαμβάνονται σύμφωνα με τη δήλωση των κατευθυντήριων γραμμών του Ελσίνκι και εγκρίθηκαν από το τοπικό συμβούλιο Institutional Review και στην επιτροπή δεοντολογίας IARC. Ένα σύνολο 100 περιπτώσεων καρκίνου του πνεύμονα και 100 μάρτυρες συμπεριλήφθηκαν (Πίνακας 1).

απομόνωση RNA

Μετά την απόψυξη, τα δείγματα πλάσματος φυγοκεντρήθηκαν στα 16000 xg για 5 λεπτά για να απομακρυνθεί cryoprecipitates και των κυτταρικών υπολειμμάτων . Ολικό RNA απομονώθηκε από 300 μικρόλιτρα του πλάσματος χρησιμοποιώντας κιτ NucleoSpin miRNA Plasma (Macherey-Nagel, Düren, Germany) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή με πρωτεϊνάση Κ πέψης, η προσθήκη 2 μg του φορέως γλυκογόνου και ϋΝΑση χωνέψει βήματα. Όλα τα δείγματα εμπλουτίστηκαν-in με 10 pmol του

Arabidopsis thaliana

συνθετικό miR-159α (που συντέθηκε με Eurofins MWG Operon, Ebersberg, Γερμανία) για τον έλεγχο για τις διακυμάνσεις στο στάδιο παρασκευής RNA. Καθαρισμένο RNA διατηρήθηκε στους -80 ° C πριν χρησιμοποιηθούν για την αντίστροφη μεταγραφή.

Profiling από TaqMan Ανθρωπίνων microRNA Πίνακες

Τα επίπεδα έκφρασης των miRNAs 754 (Sanger miRBase v14) έχουν ποσοτικοποιηθεί χρησιμοποιώντας το TaqMan Ανθρωπίνων microRNA Array Α + Β Κάρτα Σετ v3.0 (Applied Biosystems, Foster City, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (συμπεριλαμβανομένης της προ-ενίσχυση) (S1 Μέθοδοι). Ποσοτικά miRNAs δεδομένα έκφρασης αποκτήθηκαν από την ABI 7900HT SDS v2.4 λογισμικού. κατώφλι κύκλου (Ct, τον κύκλο στον οποίο υπάρχει η πρώτη ανιχνεύσιμη σημαντική αύξηση του φθορισμού) τιμές καθορίστηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό ExpressionSuite (Applied Biosystems) για τα πρώτα 60 δείγματα (αυτόματη έναρξη και κατώφλι) και τα όρια αυτά για Ct χρησιμοποιήθηκαν για το υπόλοιπο της σειράς . Τα πειράματα Array TaqMan Ανθρωπίνων microRNA είναι MIAME συμβατό και έχουν κατατεθεί στο Expression NCBI Gene Omnibus (GEO) βάση δεδομένων (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) υπό ένταξη GSE64591.

η στατιστική ανάλυση

Περιγραφική συγκρίσεις των μεταβλητών της μελέτης μεταξύ των περιπτώσεων και ελέγχων που χρησιμοποιείται στη δοκιμασία Chi-τετράγωνο για κατηγορικά δεδομένα, και t-test του Student για συνεχή δεδομένα. Τα δεδομένα αναλύθηκαν σε πακέτο HTqPCR [24] χρησιμοποιώντας R Bioconductor [25]. miRNAs με απροσδιόριστες τιμές Ct σε περισσότερα από 120 δείγματα φιλτράρονται. Τα δεδομένα ποσοστημόριο ομαλοποιηθεί. Μετά την ομαλοποίηση τιμές Ct με διατεταρτημοριακό εύρος (IQR) μικρότερη από 1,5 και ενδογενών μάρτυρες αφαιρέθηκαν από μετέπειτα ανάλυση, και η ανάλυση limma διεξήχθη για να προσδιορίσει διαφορικά ρυθμίζονται miRNA μεταξύ ασθενών και μαρτύρων. Με limma, ένα one-παραγοντικό γραμμικό μοντέλο είναι εξοπλισμένο για κάθε miRNA και τα τυπικά σφάλματα (SE) εποπτεύονται χρησιμοποιώντας ένα εμπειρικό μοντέλο Bayes με αποτέλεσμα να μετριαστεί

t

-statistics για κάθε miRNA [26]. Ρ-τιμές μικρότερες από 0.05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές. Αναφέρουμε επίσης προσαρμοσμένη p-τιμές διορθώθηκαν για πολλαπλές δοκιμές με τη μέθοδο Benjamini-Holm για τον έλεγχο για την ψεύτικη θετική ποσοστό σφάλματος. Λογιστικής παλινδρόμησης με ένα λάσο ποινή (με ρύθμιση παραμέτρων ποινή που διεξήχθη από 20 φορές διασταυρωμένης επικύρωσης) χρησιμοποιήθηκε για να επιλέξετε ένα πάνελ των miRNAs για τη διάκριση μεταξύ των περιπτώσεων και των ελέγχων. Μοντέλα λογιστικής παλινδρόμησης χρησιμοποιήθηκαν για να αξιολογηθεί κατά πόσον η οθόνη 24-miRNA συνδέθηκε με καρκίνο του πνεύμονα μετά από προσαρμογή για γνωστούς παράγοντες κινδύνου για καρκίνο του πνεύμονα (ηλικία, το φύλο και την κατάσταση καπνίσματος). Η περιοχή κάτω από το λειτουργικό δέκτη χαρακτηριστική καμπύλη (AUC) υπολογίστηκε για την εκτίμηση της διακριτική εξουσία του μοντέλου. Η επικύρωση του εσωτερικού του επιλεγμένου μοντέλου έγινε από τον υπολογισμό της εκκίνησης αισιοδοξία διορθωμένη AUC. Η διόρθωση αυτή αντιπροσωπεύει υπερπροσαρμογής των παραμέτρων του μοντέλου για το επιλεγμένο μοντέλο. Επιπλέον, μια αισιοδοξία-σωστή AUC υπολογίστηκε βάσει κάνουν εκκίνηση της όλης διαδικασίας επιλογής μοντέλου. Αυτό εξηγεί overfitting τόσο επιλογή μοντέλου και εκτίμηση των παραμέτρων. Όλες οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση STATA V11 (STATA, College Station, TX) και R [25]. Όλα παρουσιάζονται p-τιμές είναι δύο όψεων.

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 Εικ. Ιεραρχική κατάταξη των 61 σημαντικών διαφορικά εκφρασμένων microRNAs (τιμή p & lt? 0,05) σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου

οι υποθέσεις NSCLC επισημαίνονται με κόκκινο χρώμα

doi: 10.1371 /journal.pone.0125026.s001

(ΔΕΘ)

S2 Εικ. Βέλτιστη τιμή λάμδα και σταυρό επικυρωθεί οικόπεδο σφάλματος για το Lasso ανάλυση λογιστικής παλινδρόμησης

doi:. 10.1371 /journal.pone.0125026.s002

(ΔΕΘ)

S3 Εικ. Κουτί οικόπεδα των 24 miRNAs πλάσμα που περιλαμβάνονται στον πίνακα σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα και των ελέγχων στη μελέτη IARC-μαρτύρων (2006-2012).

Η μέση βαθμολογία είναι η γραμμή στη μέση του κουτιού και το 25

ου και 75

ου εκατοστημόριο είναι η άνω και κάτω μέρος του κουτιού. Τα μουστάκια επεκταθεί στο πιο ακραίο σημείο όχι περισσότερο από 1,5 φορές το διατεταρτημοριακό διάστημα μακριά από το παράθυρο. Οι ακραίες τιμές δίνονται ως κουκκίδες

doi:. 10.1371 /journal.pone.0125026.s003

(ΔΕΘ)

S4 Εικ. Αξιολόγηση της προγνωστικής αξίας περιγράφηκε προηγουμένως multi-miRNA υπογραφές για την έγκαιρη ανίχνευση των ασθενών με NSCLC στο σύνολο δεδομένων IARC μελέτη ασθενών-μαρτύρων (2006-2012)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0125026.s004

(ΔΕΘ)

S1 Μέθοδοι. Συμπληρωματικές μέθοδοι

doi:. 10.1371 /journal.pone.0125026.s005

(DOCX)

S1 πίνακα. Logistic μοντέλο πρόβλεψης παλινδρόμησης με τον πίνακα microRNA που αναφέρθηκαν από Bianchi F

et al

(2011) [9] αξιολογήθηκε στη μελέτη IARC-μαρτύρων (2006-2012)

doi:. 10.1371 /journal.pone .0125026.s006

(DOCX)

S2 πίνακα. Logistic μοντέλο πρόβλεψης παλινδρόμησης με τον πίνακα microRNA που αναφέρθηκαν από τον Chen X

et al

(2012) [13] αξιολογήθηκε στη μελέτη IARC-μαρτύρων (2006-2012)

doi:. 10.1371 /journal.pone .0125026.s007

(DOCX)

S3 πίνακα. Logistic μοντέλο πρόβλεψης παλινδρόμησης με την αναλογία υπογραφή 16-microRNA των κινδύνων που αναφέρθηκαν από Boeri Μ

et al

(2011) [10] αξιολογήθηκαν στη μελέτη IARC-μαρτύρων (2006-2012)

doi.: 10.1371 /journal.pone.0125026.s008

(DOCX)

S4 πίνακα. Logistic μοντέλο πρόβλεψης παλινδρόμησης με την αναλογία υπογραφή 16-microRNA της διάγνωσης που αναφέρθηκαν από Boeri Μ

et al

(2011) [10] αξιολογήθηκαν στη μελέτη IARC-μαρτύρων (2006-2012)

doi.: 10.1371 /journal.pone.0125026.s009

(DOCX)

S5 πίνακα. Αξιολόγηση των miRNAs αιμόλυση που σχετίζονται σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα σε σχέση με τους ελέγχους στη μελέτη IARC-μαρτύρων (2006-2012)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0125026.s010

(DOCX)

Ευχαριστίες

θα θέλαμε να ευχαριστήσουμε την IARC Genetic Services Platform για την παροχή εργαστηριακού εξοπλισμού. Είμαστε υπόχρεοι στην κ Priscilia Chopard για την τεχνική βοήθεια, Dr Patrick van Uden για τις χρήσιμες παρατηρήσεις σχετικά με το χειρόγραφο και θα θέλαμε να ευχαριστήσουμε όλους τους ασθενείς για τη συμμετοχή τους. Είμαστε επίσης ευγνώμονες για το προσωπικό των νοσοκομείων, οι ερευνητές, οι διαχειριστές των δεδομένων, τμήματα παθολογίας, και τα κέντρα πρωτοβάθμιας φροντίδας που στήριξαν αυτή τη μελέτη. Η περίληψη παρουσιάστηκε στην Ετήσια Συνάντηση της Αμερικανικής Ένωσης για την Έρευνα του Καρκίνου 2014.