Αφηρημένο

Ιστορικό

Η ανάπτυξη αποτελεσματικών εμβολίων κατά του καρκίνου εξακολουθεί να αποτελεί πρόκληση. Παρά τον σημαντικό ρόλο των πλασματοκυτταροειδή δενδριτικών κυττάρων (pDCs) στις απαντήσεις αντι-όγκου, το θεραπευτικό δυναμικό τους δεν έχει ακόμη εκπονηθεί. Ερευνήσαμε τη σημασία του HLA-A * 0201 συμφωνημένα αλλογενή pDCs ως φορείς για την ανοσοθεραπεία.

Μέθοδοι και Ευρήματα

Η διέγερση των PBMC από HLA-A * 0201

+ δότες από το HLA- Α * 0201 συμφωνημένα αλλογενή pDCs δόνηση με πεπτίδια που προέρχονται από όγκους προκάλεσε υψηλά επίπεδα λειτουργικών αποκρίσεων κυτταροτοξικών Τ κυττάρων ειδικών για το αντιγόνο και (έως και 98% τετραμερές

+ CD8 Τ κύτταρα). Το εμβόλιο pDC επέδειξε ισχυρή αντινεοπλασματική θεραπευτική αποτελεσματικότητα in vivo όπως φαίνεται από την αναστολή της ανάπτυξης όγκου σε ένα εξανθρωπισμένο μοντέλο ποντικού. Είναι προκάλεσε επίσης εξαιρετικά λειτουργική όγκου-ειδικά Τ κύτταρα ex-vivo από PBMC και TIL από ασθενείς I-IV μελάνωμα σταδίου. Αποκρίσεις έναντι Μελά, GP100, τυροσινάσης και MAGE-3 αντιγόνα φθάσει σε επίπεδα τετραμερούς έως 62%, 24%, 85% και 4,3% αντίστοιχα. pDC εμβόλιο-ενεργοποιημένα Τ-κύτταρα θανατώνονται ειδικά δικό αυτόλογα κύτταρα όγκου μελανώματος ασθενών. Αυτή η ημι-αλλογενή εμβόλιο pDC ήταν πιο αποτελεσματικό από τα συμβατικά εμβόλια μυελοειδή DC-based. Επιπλέον, ο σχεδιασμός του εμβολίου pDC την προικίζει με ένα ισχυρό δυναμικό για την κλινική εφαρμογή στη θεραπεία του καρκίνου.

Συμπεράσματα

Τα ευρήματα αυτά υπογραμμίζουν HLA-A * 0201 συμφωνημένα αλλογενή pDCs ως ισχυροί επαγωγείς της ασυλίας του όγκου και παρέχει μια πολλά υποσχόμενη ανοσοθεραπευτική στρατηγική για την καταπολέμηση του καρκίνου

Παράθεση:. Aspord C, Charles J, Leccia MT, Laurin D, Richard MJ, Chaperot L, et al. (2010) A Novel Καρκίνος Εμβόλιο στρατηγική που βασίζεται στην HLA-A * 0201 Συμφωνήθηκε αλλογενή πλασματοκυτταροειδή δενδριτικά. PLoS ONE 5 (5): e10458. doi: 10.1371 /journal.pone.0010458

Επιμέλεια: Graham Pockley, Πανεπιστήμιο του Σέφιλντ, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: τέταρτης Δεκεμβρίου του 2009? Αποδεκτές: 7η Απριλίου, 2010? Δημοσιεύθηκε: 4, Μαΐου 2010

Copyright: © 2010 Aspord et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Institut National du Cancer (ACI-63-04 και canceropole 2004-05) και Etablissement Français du Sang. J. Charles ήταν αποδέκτης των επιχορηγήσεων από την Εθνική Ακαδημία Ιατρικής και canceropole 2004-05. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η ανάπτυξη αποτελεσματικών εμβολίων για τη θεραπεία του καρκίνου αποτελεί ένα σημαντικό πρόβλημα δημόσιας υγείας [1]. Επειδή κυτταροτοξικά Τ λεμφοκύτταρα (CTL) μπορούν να αναγνωρίσουν και να λύσουν τα κακοήθη κύτταρα, πολλές θεραπευτικές δοκιμές έχουν σχεδιαστεί για να ενισχύσουν αποκρίσεις CTL. Μυελοειδή δενδριτικά κύτταρα (MDC) -με βάση εμβόλια πέτυχε στην επαγωγή ειδικών Τ κυττάρων σε ασθενείς, αλλά χωρίς επαρκή κλινική αποτελεσματικότητα [2], [3]. Η επίκτητη κυτταρική μεταφορά των αντι-καρκινικών δραστικά Τ κύτταρα ενισχύθηκε ex-vivo από TIL επαγόμενη αντικειμενική υποχώρηση του όγκου [4], [5], αλλά η πολυπλοκότητα αυτής της στρατηγικής παρεμπόδισε ευρεία ανάπτυξη. Ως εκ τούτου, υπάρχει μια ισχυρή ανάγκη για νέες ανοσοθεραπευτικές στρατηγικές για να ξεπεραστούν οι περιορισμοί της τρέχουσας πρωτοκόλλων.

Μέχρι σήμερα, η επαγωγή ειδικών αποκρίσεων των Τ κυττάρων τόσο για θετή και ενεργός ανοσοθεραπευτικές στρατηγικές έχει βασιστεί σε mDCs [6 ] – [8]. Πλασματοκυτταροειδή δενδριτικά κύτταρα (PDC) είναι, ωστόσο, βασικοί παράγοντες της ασυλίας [9], [10] με ένα ρόλο σε ανοσολογικές αποκρίσεις όγκου-ειδικά [11]. pDCs διαφέρουν από mDCs σε πολλές πτυχές, όπως η έκφραση TLR, το προφίλ της μετανάστευσης και ανοσολογικές αποκρίσεις ενεργοποίηση. pDC είναι επίσης ικανά σύλληψης αντιγόνου, επεξεργασία και παρουσίαση [12] – [15]. Antigen-παλμική pDC μπορούν να διεγείρουν συγκεκριμένες πρωτογενείς (Μελά) και μνήμης (Flu) αυτόλογα CD4 και CD8 Τ κυττάρων ανοσοαποκρίσεων in vitro [16] – [19] και ο κύριος λειτουργικές αποκρίσεις των Τ κυττάρων in vivo, όπως φαίνεται μετά από τον εμβολιασμό των ποντικών με CpG ή ιός ενεργοποιούμενη pDC [20] – [21]. pDC βρίσκονται εντός πολλών όγκων σε ανθρώπους [22] – [26], όπου πιστεύεται ότι είναι ανώριμα, ανεκτικογόνος ή σχετίζονται με την κακή πρόγνωση. Ωστόσο, σε μελάνωμα, pDC ενεργοποίηση από TLR-L θα μπορούσε να προκαλέσει ισχυρά αποτελέσματα κατά του όγκου. Σε ποντικούς, η εφαρμογή imiquimod (TLR7-L) [27] ή ενδοογκική ένεση CpG (TLR9-L) [28] αντιστραφεί η λειτουργική αναστολή της pDC, προωθώντας έτσι την υποχώρηση του όγκου. Επιπλέον τοπική χορήγηση CpG σε ασθενείς με μελάνωμα που επάγεται τη στρατολόγηση και ενεργοποίηση των PDC σε λεμφαδένα φρουρού [29] και την επακόλουθη όγκου-ειδικά CD8 Τ κύτταρα που συνδέονται με κλινικό όφελος [30]. Το δυναμικό των PDC σε δημιουργία αποτελεσματικής όγκο-ειδικές ανοσοαποκρίσεις έχει επίσης καταδειχθεί σε ένα μοντέλο ποντικού [31]. Συνεπώς, οι προσεγγίσεις που βασίζονται ράο- και αγωνιστές TLR [32] υποσχόμενη για τη θεραπεία του καρκίνου στον άνθρωπο.

αντιγόνα όγκου ενεργοποιούν συνήθως ασθενείς αποκρίσεις. Σε αντίθεση, αλλογενών αποκρίσεις κατευθύνονται εναντίον μη-εαυτού MHC είναι εξαιρετικά ισχυρός. Είναι ενδιαφέρον ότι η αλλογενή απόκριση που διαμεσολαβείται από MHC κατηγορίας ΙΙ-περιορισμένη CD4 + Τ κύτταρα προωθεί παριστάμενος ειδική επαγωγή των Τ κυττάρων [33], [34], όπως ήδη φαίνεται με ιικά πεπτίδια [35] και υποχώρηση του όγκου εξής αλλογενούς μοσχεύματος δέρματος [36]. Allogeneicity θα μπορούσε, επομένως, να αξιοποιηθεί για την προώθηση ανοσογονικότητα προς αντιγόνα όγκου [37] κατά την εξέταση μια μερική αγώνα HLA μεταξύ του εμβολίου και τον ασθενή, που αναφέρεται περαιτέρω ως HLA συνδυάζεται allogeneicity.

Επειδή pDCs διαδραματίζουν θεμελιώδη ρόλο στην ενεργοποίηση Τ κυττάρων απαντήσεις, η χρήση τους θα μπορούσε να είναι πολλά υποσχόμενη ως νέα ανοσοθεραπευτικές στρατηγικές. Ωστόσο, η χρήση των αυτόλογων pDC για ανοσοθεραπεία καρκίνου είναι δύσκολη λόγω της σπανιότητας των κυττάρων αυτών [38] και την πιθανή λειτουργική αλλοίωση των pDCs συλλέχθηκαν από ασθενείς που φέρουν όγκους. Συνεπώς διερευνηθεί το δυναμικό των HLA-A * 0201 συμφωνημένα αλλογενή pDC να επάγει HLA-A * 0201-περιορισμένο ανοσία κατά του όγκου. Χρησιμοποιήσαμε μια μοναδική ανθρώπινη κυτταρική γραμμή pDC (GEN), που συστάθηκε από λευχαιμικά HLA-A * 0201

+ pDC με φαινοτυπικά και λειτουργικά χαρακτηριστικά έκλεισε στις πρωτογενείς pDCs [39], [40], [41]. Η στρατηγική συνίστατο χρησιμοποιώντας τα φορτωμένα με πεπτίδιο να επάγει pDCs HLA-A * 0201-περιορισμένο αντιγόνο-ειδικά CTL. Έχουμε αποδείξει εδώ χρησιμοποιώντας όγκων και ιικών μοντέλο αντιγόνα του δυναμικού της ακτινοβολημένων πεπτιδίου-παλμική ανθρώπινο HLA-A * 0201 συμφωνημένα αλλογενή pDC γραμμή (GENiusVac) in vitro, η θεραπευτική αποτελεσματικότητα του in vivo σε εξανθρωπισμένα ποντίκια, και η κλινική συνάφεια ex-vivo με κύτταρα ασθενείς με μελάνωμα ». Τα ευρήματά μας υπογραμμίζουν HLA-A * 0201 συμφωνημένα αλλογενή pDCs ως ισχυροί επαγωγείς της ανοσίας κατά του όγκου και να προσφέρει μια πολλά υποσχόμενη νέα ανοσοθεραπευτική στρατηγική για την καταπολέμηση του καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές και αντιδραστήρια

οι καλλιέργειες διεξήχθησαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με Glutamax 1% μη απαραίτητα αμινοξέα, 1 mM πυροσταφυλικό νάτριο (Sigma), 100 μg /ml γενταμυκίνη και 10% FCS (όλα από την Invitrogen εκτός κοινοποιηθεί). γραμμή μελανώματος Me275 δόθηκε από Pr J-C Cerottini (Ludwig Institute for Cancer Research, Epalinges, Ελβετία). γραμμές Μελάνωμα COLO829 και Α375, Τ2 και γραμμές Κ562 αγοράσθηκαν από την ATCC (LGC Πρότυπα, Molsheim, France). γραμμή μελανώματος Mel89 παρήχθη στο εργαστήριο μας (Εικόνα S1). Αντι-ανθρώπινο CD45, CD3, CD8 Abs αγοράστηκαν από την Beckman Coulter. Anti-HLA-A2 Abs αγοράστηκαν από την BD Biosciences και αντι-ανθρώπινη Μελά από το Sigma.

Τα πεπτίδια και τετραμερή

Εμείς χρησιμοποιούνται οι ακόλουθες ιο- και όγκων που προέρχονται από HLA-A * 0201 περιορίζεται πεπτίδια (NeoMPS) και η αντίστοιχη itag HLA-A * 0201 τετραμερή (Beckman Immunomics): Μελά

26-35 (ELAGIGILTV), GP100

209-217 (IMDQVPFSV), τυροσινάσης

369-377 (YMDGTMSQV ), MAGE-3

271-279 (FLWGPRALV), FluM1

58-66 (GILGFVFTL), CMVpp65

495-503 (NLVPMVATV).

PBMC, pDC γραμμή, πρωτοβάθμια pDC απομόνωση και mDCs γενιάς

Ανθρώπινα PBMC αποκτήθηκαν από HLA-A * 0201

+ υγιείς δότες με φυγοκέντρηση βαθμίδωσης πυκνότητας Ficoll-Hypaque (Eurobio). Η ανθρώπινη pDC γραμμή GEN2.2 καλλιεργήθηκε όπως έχει περιγραφεί προηγουμένως [39]. Πρωτογενή pDC απομονώθηκαν από το αίμα των HLA-A * 0201

+ υγιείς δότες. ΑΧ για πρώτη φορά εμπλουτίζεται από την εξάντληση των ανεπιθύμητων κυττάρων χρησιμοποιώντας το κιτ προ-εμπλουτισμού Pan DC (StemCell). Τα ανακτημένα κύτταρα είτε υποβλήθηκαν σε επιλογή BDCA4 + (Miltenyi) ή επισημασμένα με ένα κοκτέιλ Lineage, CD123, HLA-DR και αντισώματα CD11c (BD) και ταξινομούνται σε ένα BD FACSAria βάσει του CD123 και HLA-DR έκφρασης και έλλειψη Lin και δείκτες CD11c. Η καθαρότητα των pDC μετά το είδος ήταν πάνω από 98%. mDCs διαφοροποιήθηκαν από τα μονοκύτταρα του αίματος χρησιμοποιώντας 500 U /ml GM-CSF και 10 ng /ml IL-4 (Tebu Prepotech, Γαλλία) για 6 ημέρες. Η μελέτη αυτή διεξήχθη στο πλαίσιο μιας διαδικασίας που έχουν εγκριθεί από το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review Γαλλικού Πρακτορείου αίματος. Όλοι οι δότες υπέγραψε ενημερωμένοι έντυπα συγκατάθεσης.

Το μελάνωμα δείγματα ασθενών

Τα δείγματα ελήφθησαν από το στάδιο Ι έως IV ασθενείς HLA-A * 0201 μελάνωμα που υπέγραψαν ενημερωμένοι μορφές συναίνεσης. Χρησιμοποιήσαμε επιπλέον υλικό που δεν απαιτούνται για τη διάγνωση ή την ανάλυση των ασθενών και δεν απαιτούνται συμπληρωματικές διαδικασίες. Ως εκ τούτου, σύμφωνα με τη γαλλική ρύθμιση, δεν ήταν αναγκαία η ηθική έγκριση, αλλά οι πληροφορίες και υπέγραψε συγκατάθεση των ασθενών. Οι κλινικές παράμετροι παρουσιάζονται στον Πίνακα S1. Δείγματα αίματος ελήφθησαν από 12 ασθενείς και τα PBMC καθαρίζεται με βαθμίδωση πυκνότητας. Φρέσκα δείγματα όγκου ελήφθησαν από 6 ασθενείς οι οποίοι υποβλήθηκαν σε χειρουργική επέμβαση για μετάσταση σε διαμετακόμιση. Τα δείγματα τεμαχισμένο και πέψη σε 2 mg /ml κολλαγενάση Α (Roche Diagnostics) 20 U /ml DNase (Sigma). Στη συνέχεια, τα καρκινικά κύτταρα απομονώθηκαν από το κυτταρικό εναιώρημα με προσκόλληση και TIL εμπλουτίζονται από το μη προσκολλημένα κλάσμα με κλίση πυκνότητας.

ειδικών Τ επαγωγή κυτταρικής απόκρισης in vitro

κύτταρα GEN φορτώθηκαν αρχικά με ένα ή περισσότερα πεπτίδιο (-α) που ενδιαφέρει. Εν συντομία, τα κύτταρα πλύθηκαν 3 φορές με RPMI ελεύθερο ορού και επαναιωρήθηκαν σε 1,10

6 κύτταρα /ml. Προστέθηκαν β2-μικροσφαιρίνη (0.1 μg /ml τελικό) (Sigma) και πεπτίδιο (-α) (1-10 μΜ τελικό) (NeoMPS). Μετά από 3 ώρες επώασης στους 37 ° C, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές, ακτινοβολημένα με 30Gy και επαναιωρήθηκαν σε 2,10

5 κύτταρα /ml σε RPMI με 10% FCS. Φορτωμένων με πεπτίδιο GEN κατόπιν συν-καλλιεργήθηκαν με ημι-αλλογενή HLA-A * 0201 PBMC σε μια αναλογία 1:10 σε RPMI + 10% FCS για τουλάχιστον 7 ημέρες. Οι καλλιέργειες επαναδιεγείρονται με εβδομαδιαία φορτωμένων με πεπτίδιο GEN και 200 ​​U /ml IL-2 (Proleukine? Chiron). Σε μερικά πειράματα, μη διεγερμένα πρωτογενή pDCs ή mDCs ωριμάσει με LPS (1 μg /ml) χρησιμοποιήθηκαν σύμφωνα με τις ίδιες συνθήκες. Σε μερικά πειράματα αποκλεισμού αντι-ΙΡΝα (50,000 U /ml) και αντι-ΙΡΝβ (25.000 U /ml) αντισωμάτων (PBL Medical Laboratories) ή IgG αίγας ελέγχου προστέθηκαν την ημέρα 0 και την ημέρα 2 της καλλιέργειας. Ειδικές αποκρίσεις CD8 Τ κυττάρων μετρήθηκαν με επισήμανση τετραμερές PBMC αρχικά και σε διαφορετικά στάδια της καλλιέργειας. Τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε HBSS με 2% FCS, χρωματίστηκαν με CD45 FITC, itag HLA-A * 0201 τετραμερές ΡΕ, CD3 PC7, αντισώματα CD8 APC και αναλύθηκαν με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής χρησιμοποιώντας ένα λογισμικό FACSCalibur και Cell Quest (Becton Dickinson). Για να προσδιοριστεί αρχικά επίπεδα τετραμερούς, τουλάχιστον 1 – 2,10

6 εκδηλώσεις αποκτήθηκαν.

In vitro λειτουργικές δοκιμασίες

ΙΡΝγ την έκκριση και την έκφραση CD107 από τετραμερούς + CD8 Τ κύτταρα.

Τ κύτταρα πρώτα επισημασμένα με itag HLA-A * 0201 τετραμερές ΡΕ για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, πλύθηκαν και επαναδιεγέρθηκαν με κύτταρα Τ2 εμφυτευμένα πεπτίδια (10:01 αναλογία) για 5 H30. Για ΙΡΝγ έκκριση, 1 μl /ml Brefeldin Α (BD Biosciences) προστέθηκε για το τελευταίο 3 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια επισημαίνονται επιφανειακά με αντι-CD3 PC7 και αντι-CD8 APC αντισώματα και υποβλήθηκαν σε ΙΡΝγ ενδοκυτταρική χρώση (BD Biosciences). Για την ανίχνευση CD107, αντι-CD107a και CD107b FITC αντισώματα (10 μΙ /1,10

6 κύτταρα) (BD Biosciences) προστέθηκαν στο μέσο στην αρχή της επαναδιέγερση παρουσία Golgi STOP (0,67 μΙ /ml) για την 4 τελευταία ώρα. Τα κύτταρα στη συνέχεια επισημάνθηκαν με αντι-CD3 PC7 και αντισώματα αντι-CD8 APC. ΙΡΝγ και χρώση CD107 αναλύθηκαν τετραμερούς

+ CD8 + Τ κύτταρα, τετραμερούς

-.. CD8 + Τ κύτταρα και CD4 + Τ κύτταρα

Δοκιμασία κυτταροτοξικότητας

αντιγόνο-ειδική κυτταροτοξική δραστικότητα μετρήθηκε εκτελώντας μια πρότυπη δοκιμασία απελευθέρωσης

51Cr. Δραστικά Τ κύτταρα ταξινομήθηκαν από την συν-καλλιέργεια χρησιμοποιώντας ένα κιτ εμπλουτισμού ανθρώπινου Τ κυττάρου EasySep (Stem Cell). Τα κύτταρα στόχοι (Τ2 κύτταρα εμφυτευμένα πεπτίδια, Κ562, αλλογενή ή αυτόλογα καρκινικά κύτταρα) επισημάνθηκαν με 50 μΟί για 1 ώρα στους 37 ° C, πλύθηκαν 3 φορές και επιστρώθηκαν με τελεστές Τ κύτταρα στην ενδεικνυόμενη αναλογία Ε: Τ σε στρογγυλό πυθμένα 96 -Καλά πλάκες. Μετά από 4 ώρες επώασης, η ραδιενέργεια μετρήθηκε σε 30 μΐ υπερκειμένων σε ένα μετρητή σπινθηρισμού μικροπλάκας Τορ Count ΝΧΤ (Perkin Elmer). Η μέση τριπλών μετρήσεων εκφράστηκε ως ποσοστό της ειδικής λύσης χρησιμοποιώντας τον τύπο:. (Απελευθέρωση δείγματος – αυθόρμητος απελευθέρωση) /(μέγιστη απελευθέρωση – αυθόρμητη απελευθέρωση) χ 100

In vivo λειτουργικές δοκιμασίες σε εξανθρωπισμένα ποντίκια

NOD-SCID β

2m

– /- ποντίκια με ανοσοανεπάρκεια (NOD.Cg-Prkdc

SCIDβ

2m

Tm1Unc /J) αγοράστηκαν από την Jackson ImmunoResearch Laboratories (Bar Harbor , USA) και εκτραφεί στην Plateforme de Haute Technologie Animale (PhtA, La Tronche, Γαλλία). Για πειράματα δραστική θεραπεία, HuPBL ποντικοί κατασκευάζονται με τη μεταμόσχευση ενδοπεριτοναϊκώς (ip) 50.10

6 PBMC από υγιείς δότες σε φονικά ακτινοβολημένων SCID NOD-β

2m

– /- ποντίκια (120-150 cGy). Τα ποντίκια περαιτέρω εμβολιάστηκαν με 5,10

6 ακτινοβολημένα πεπτίδιο-παλμική κυττάρων GEN από IP ή τις διαδρομές sc μία φορά την εβδομάδα. Απόκριση σε εμβολιασμό αναλύθηκε σε διαφορετικά χρονικά σημεία σε αίμα, περιτοναϊκή πλύση, σπλήνα και λεμφαδένες. Τα όργανα υποβλήθηκαν σε πέψη 30 λεπτά στους 37 ° C με 2 mg /ml κολλαγενάση Α (Roche Diagnostics). Τα προκύπτοντα εναιωρήματα κυττάρων πλύθηκαν με HBSS + 2% FCS, χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα αντι-ανθρώπινα αντισώματα (CD45 FITC, itag HLA-A * 0201 τετραμερές ΡΕ, CD3 PC7, CD8 APC) και υποβλήθηκαν σε ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Για την εκτίμηση της αποτελεσματικότητας θεραπευτικών, 1,10

6 ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα εμφυτεύθηκαν υποδορίως στο πλευρό των ποντικών εξανθρωπισμένου είτε 5 ημέρες μετά την (προφυλακτική) ή 4 ημέρες πριν (θεραπευτική) τον πρώτο εμβολιασμό. Ο εμβολιασμός επαναλήφθηκε κάθε εβδομάδα. Το μέγεθος του όγκου παρακολουθήθηκε κάθε 2-3 ημέρες και ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον τύπο: (σύντομη διάμετρος)

2 × μεγάλη διάμετρο /2. Για την ανάλυση ειδικών Τ κυττάρων στη θέση του όγκου και σε ϋίΝ, οι ιστοί υποβλήθηκαν σε πέψη όπως περιγράφεται προηγουμένως και τα κυτταρικά εναιωρήματα υποβλήθηκαν στο τετραμερές επισήμανση και ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Όλα τα πειράματα in-vivo έχουν εγκριθεί από την Περιφερειακή Επιτροπή για τη Ζωική ηθική Rhone-Alpes (CREEA) συνδεδεμένες με το CNRS.

Η στατιστική ανάλυση

Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση Mann-Whitney μη παραμετρική δοκιμή υ και ζευγαρωμένο t τεστ χρησιμοποιώντας λογισμικό Prism.

Αποτελέσματα

Ανθρώπινα HLA συμφωνημένα αλλογενή pDCs επάγουν αντιγονο-ειδικών αποκρίσεων των Τ κυττάρων από υγιή δότη PBMC με μια ισχυρή αποτελεσματικότητα in vitro

για να διερευνήσουν το δυναμικό του HLA συνδυάζεται αλλογενών pDC σε επαγωγή Τ κυττάρων αντιδράσεις αντιγόνου-ειδική, συγκρίναμε την ικανότητα του πεπτιδίου-φορτωμένο πρωτοβάθμια pDC ταξινομημένο από αίμα υγιών δοτών να προκαλέσουν συγκεκριμένες αντιδράσεις των Τ κυττάρων σε αυτόλογη και αλλογενή HLA-A * 0201-συμφωνημένα ρυθμίσεις. pDC οδήγησε σε σημαντικά υψηλότερη ειδική επαγωγή Τ κυττάρων σε HLA-A * 0201 συμφωνημένα αλλογενή ρυθμίσεις σε σύγκριση με αυτόλογα συνθήκες (ενίσχυση του απόλυτου αριθμού των Mela-ειδικών Τ κυττάρων σε 7 ημέρες: 35.6 ± 8.9 έναντι 17.9 ± 8.7, μέση ± SEM , ρ = 0,02) (Σχήμα 1Α και 1Β, τέσσερα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν με τρεις διαφορετικούς δότες). Όπως η σπανιότητα των πρωτογενών pDC αποτρέπει την ευρεία θεραπευτική χρήση τους, χρησιμοποιήσαμε την ανθρώπινη κυτταρική σειρά pDC (GEN), που συστάθηκε από λευχαιμικά HLA-A * 0201

+ pDC ως πηγή του HLA-A * 0201 συμφωνημένα αλλογενή pDCs. Για να εκτιμηθεί εάν η ακτινοβολημένα HLA-A * 0201

+ pDC γραμμή μπορεί να επάγει ειδικές αποκρίσεις Τ κυττάρων σαν πρωταρχικό PDC σε vitro, αλλογενή HLA-A * 0201

+ PBMC από υγιείς δότες διεγέρθηκαν με ακτινοβολημένο φορτωμένα με πεπτίδιο κυττάρων GEN. Τόσο για την όγκου (Μελά) και την ιογενή (Flu) προερχόμενο πεπτίδια, πήραμε μια μαζική ενίσχυση των ειδικών Τ κυττάρων μετά από μόλις 7 ημέρες καλλιέργειας όπως ανιχνεύεται με επισήμανση τετραμερές (Σχήμα 1C, Εικόνα S2). Αυτή η επαγωγή ενισχύθηκε περαιτέρω με αύξοντα διεγέρσεις κάθε 7 ημέρες με το πεπτίδιο-φορτωμένο pDC γραμμή, σε συνδυασμό με IL-2. Εμείς συνήθως λαμβάνονται 5-25% του τετραμερούς

+ CD8 Τ κυττάρων μετά από 7 ημέρες, 40-60% μετά από 15 ημέρες, και έως και 98% μετά από 40 ημέρες (Σχήμα 1 C). Τέτοιες υψηλές αποκρίσεις αναπαράγονται με κύτταρα από υγιείς δότες 14-20 και με διάφορα αντιγόνα που προέρχονται από όγκους μελανώματος όπως Mela, GP100, TYR, MAGE-3 (Σχήμα 1 D), καθώς και αντιγόνων του ιού που προέρχεται από (Εικόνα S2). Όγκου-ειδικά τετραμερούς

+ Τ κυτταρικές αποκρίσεις έφθασε κατά μέσο όρο 22% για Μελά (εύρος 2-60%), 0,3% για το GP100 (εύρος 0-3%), 1,2% για το Tyr (εύρος 0-8%) και 0,84% για MAGE-3 (εύρος 0-4%) σε 20 ημέρες. Multi-ειδικές αποκρίσεις επίσης επάγονται χρησιμοποιώντας κύτταρα GEN φορτωμένο με πολλά διαφορετικά πεπτίδια (δεν φαίνεται). Έτσι, HLA συνδυάζεται αλλογενή πρωτογενή pDCs ή η γραμμή pDC προκαλούν ισχυρές αποκρίσεις Τ κυττάρου πρωτογενούς και μνήμης αντιγόνου-ειδική in vitro από υγιείς δότες.

(Α, Β) αυτόλογη ή αλλογενής HLA-A * 0201

+ πρωτογενή pDC διαλέγεται από το αίμα υγιών δοτών δονήθηκαν με το πεπτίδιο Mela και χρησιμοποιείται για να διεγείρει HLA-A * 0201

+ PBMC. Η ειδική απόκριση Τ κυττάρων αναλύθηκε εις d7 με την επισήμανση τετραμερές. (Α) Ποσοστό Μελά ειδικά Τ κύτταρα (με περίφραξη σε CD8 + Τ κύτταρα). Ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα δείχνεται. (Β) Ενίσχυση του απόλυτου αριθμού των ειδικών Τ κυττάρων από d0 έως D7 (4 ανεξάρτητα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν με 3 διαφορετικούς δότες). (C, D) αλλογενή HLA-A * 0201

+ PBMC από υγιείς δότες διεγέρθηκαν με ακτινοβολημένο φορτωμένα με πεπτίδιο HLA-A * 0201

+ pDC γραμμή και εβδομαδιαία επαναδιεγέρθηκαν παρουσία IL2. Εξειδίκευση των Τ κυττάρων προσδιορίστηκε με την επισήμανση τετραμερές και ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. (C) Εκπρόσωπος dotplots περίφραξη σε CD8 + Τ κύτταρα (αριστερή πλευρά) και τα ποσοστά (δεξιά πλευρά) του Μελά τετραμερούς

+ Τ κύτταρα στην καλλιέργεια αρχικά και σε διαφορετικά χρονικά σημεία μετά από διέγερση με τη γραμμή pDC φορτωμένο με πεπτίδιο Μελά. Flu τετραμερές χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. (Δ) Εκπρόσωπος οικόπεδα dot περίφραξη σε CD8 + Τ κύτταρα (αριστερή πλευρά) και τα ποσοστά της τετραμερούς

+ CD8 + Τ κύτταρα που λαμβάνονται κατά τις ημέρες 7, 14 και 20 του πολιτισμού προς Μελά (n = 18), GP100 (n = 16 ), Tyr (n = 16) και MAGE-3 (n = 16) καρκινικά αντιγόνα.

η

Τα ειδικά Τ κυττάρων που επάγεται από ταιριαστού HLA αλλογενή pDC παρουσίασαν in vitro λειτουργικές HLA-περιορισμένα δραστηριότητα

Εξετάσαμε περαιτέρω τη λειτουργικότητα των ειδικών Τ κυττάρων που προκαλείται από το HLA-A * 0201 συμφωνημένα αλλογενή pDC γραμμή. Αναλύσαμε πρώτα την ικανότητα του όγκου-ειδικά Τ κύτταρα να εκκρίνουν ΙΡΝγ και εκφράζουν CD107 κατόπιν επαναδιέγερση. Όταν συν-καλλιεργήθηκαν με κύτταρα Τ2 φορτωμένα με πεπτίδιο, Mela-ειδικά Τ κύτταρα εκκρίνεται ΙΡΝγ και εκφράζονται CD107 παρουσία της σχετικής αλλά όχι έλεγχο πεπτίδιο (Εικόνα 2Α). Λάβαμε εντός όγκου-αντιδρώντα Τ κύτταρα μέσους όρους 25% ΙΡΝγ

+ τετραμερούς

+ CD8 Τ κυττάρων σε ειδικά επαναδιέγερση έναντι 5% υπό συνθήκες ελέγχου (ρ = 0.007), και 50% CD107

+ τετραμερές

+ CD8 Τ κυττάρων σε ειδικά επαναδιέγερση έναντι 24% κάτω από συνθήκες ελέγχου (ρ = 0.02) (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Στη συνέχεια εξετάσαμε την κυτταροτοξικότητα τους εκτελώντας προσδιορισμό απελευθέρωσης

51Cr χρησιμοποιώντας φορτωμένα με πεπτίδιο κύτταρα Τ2 και γραμμές όγκου μελανώματος ως στόχοι. Mela-ειδικά Τ κύτταρα εμφάνισαν μία ισχυρή κυτταροτοξική δραστικότητα έναντι κυττάρων Τ2 φορτωμένα με τη σχετική, αλλά όχι με το πεπτίδιο αναφοράς (Σχήμα 2Β). Έχουμε λάβει το 88% των ειδικών θανάτωσης έναντι 13% κάτω από συνθήκες ελέγχου (μέση τιμή από 8 πειράματα, ρ & lt? 0.001) (δεν φαίνεται). Επιπλέον, Μελά-ειδικά Τ κύτταρα ήταν σε θέση να λύσουν HLA-A * 0201

+ Μελά

+ (Me275) αλλά ούτε και HLA-A * 0201

+ Μελά

– (Α375), ούτε HLA -Α * 0201

-MelA

+ (COLO829) κύτταρα όγκου μελανώματος (Σχήμα 2Β, εικόνα S1) που αποδεικνύουν την HLA-A * 0201-περιορισμού και αντιγονική ειδικότητα αυτής της δραστηριότητας. Επιπλέον, αυτή η λύση ανεστάλη με ΕΟΤΑ-MgCl2 ή με εξάντληση των CD8 Τ κυττάρων (δεν φαίνεται), η οποία μαζί με την επιφανειακή έκφραση CD107 σε ειδικά επαναδιέγερση, προτείνει ένα μηχανισμό που περιλαμβάνει κυτταρολυτική εξωκυττάρωση κοκκίων από CD8 Τ κύτταρα. Τέτοιες λειτουργικές ικανότητες παρατηρήθηκαν με Τ κύτταρα που λαμβάνονται σε διαφορετικά χρονικά σημεία της καλλιέργειας 7-40 ημερών. Παρόμοια ανάλυση πραγματοποιήθηκε με ιό ειδικά Τ κύτταρα απέδειξαν την ικανότητα του Flu τετραμερούς

+ Τ κύτταρα να εκκρίνουν ΙΡΝγ και εκφράζουν CD107 κατόπιν ειδικού επαναδιέγερση, και κυτταροτοξικές ιδιότητες τους (Σχήματα S3A και S3b). Είναι σημαντικό, παρατηρήσαμε μόνο μια μικρή επαγωγή αλλογενούς απόκρισης όπως πιστοποιείται από την κακή ενεργοποίηση των μη-ειδικών τετραμερούς

– CD8 + Τ κύτταρα και CD4 + Τ κυττάρων προς κυττάρων GEN. Αυτό παρατηρήθηκε μετά από μία διέγερση (απόκριση Flu) (Σχήμα S3C και S3D), αλλά και μετά από επανειλημμένες διεγέρσεις με τη γραμμή pDC (απόκριση Μελά), μετρώντας ΙΡΝγ που εκκρίνουν (Σχήμα 2C) και CD107 που εκφράζουν τα Τ κύτταρα (Σχήμα 2D) κατόπιν επαναδιέγερση με Τ2 ή κύτταρα GEN. Παρατηρήσαμε επίσης την απουσία του τετραμερούς

δραστικότητα + Τ κυττάρων έναντι κυττάρων GEN φορτωμένο με ένα άσχετο πεπτίδιο. Έτσι, η γραμμή pDC αποσπά πλήρως λειτουργικό αντιγονο-ειδικών Τ κυττάρων με μικρές παρευρισκομένων αλλογενή αποκρίσεις.

(Α) Mela-ειδικών Τ κυττάρων που προκαλείται από την γραμμή pDC εκκρίνουν ΙΡΝγ και εκφράζουν CD107 στην επιφάνεια κατόπιν ειδικών επαναδιέγερση. Κύτταρα από την καλλιέργεια (14η ημέρα) υποβλήθηκαν σε επισήμανση τετραμερές και επαναδιεγέρθηκαν με κύτταρα Τ2 παλλόμενα με σχετικό ή ελέγχου πεπτίδιο. παραγωγή ΙΡΝγ αξιολογήθηκε με ενδοκυτταρική χρώση και έκφραση CD107 με την προσθήκη αντι-CD107a + b αντισώματα κατά τη διάρκεια της επαναδιέγερση. Οι Dotplots περίφραξη σε τετραμερή

+ CD8 + Τ κύτταρα. Εκπρόσωπος του 8 πειράματα που πραγματοποιήθηκαν με 3 χορηγούς την ημέρα 8-40 του πολιτισμού. (Β) Mela-ειδικών Τ κυττάρων που προκαλείται από την γραμμή pDC είναι κυτταροτοξικά. Τ κύτταρα που επιλέγονται από την καλλιέργεια και να υποβληθούν σε δοκιμασία απελευθέρωσης

51Cr χρησιμοποιώντας φορτωμένα με πεπτίδιο κύτταρα Τ2 και κύτταρα όγκου μελανώματος ως στόχους. Εκπρόσωπος του 8 πειράματα που πραγματοποιήθηκαν με 4 δότες σε d13-40 του πολιτισμού. (C, D) ΙΡΝγ έκκριση και CD107 έκφραση αξιολογήθηκαν όπως περιγράφεται στο (Α) μετά από τρεις διεγέρσεις των PBMC και αναλύθηκαν σχετικά με το τετραμερές

+ CD8 + Τ κύτταρα (λευκές ράβδοι) και με την μη ειδική τετραμερούς

– CD8 + Τ κύτταρα (γκρι ράβδοι) και CD4 + Τ κύτταρα (μαύρες ράβδοι) μετά επαναδιέγερση με εμφυτευμένα πεπτίδια Τ2 ή GEN κύτταρα (4 πειράματα για κάθε κατάσταση).

Η

Το πεπτίδιο-φορτωμένο HLA συμφωνημένα αλλογενή pDC γραμμή προκαλεί ισχυρή in vivo αποκρίσεις Τ κυττάρων ειδικών για το αντιγόνο σε ποντικούς εξανθρωπισμένο

Η χρήση του ταιριαστού HLA αλλογενή pDCs ως ένα εμβόλιο απαιτεί επαγωγή αντιγονο-ειδικών αποκρίσεων των Τ κυττάρων in vivo. Ως εκ τούτου, αξιολογήσαμε το δυναμικό εμβόλιο της γραμμής PDC σε ένα εξανθρωπισμένο μοντέλο ποντικού [42] κατασκευάστηκε με xenotransplanting ανθρώπινα PBMC σε ανοσοανεπαρκή NOD-SCIDβ

2m

– /- ποντίκια (HuPBL μοντέλο SCID). Είκοσι τέσσερις ώρες μετά από ενδοπεριτοναϊκή μεταφορά, την ανθρώπινη CD45

+ αιμοποιητικά κύτταρα βρέθηκαν στη θέση της ένεσης, αλλά και στην κυκλοφορία και λεμφοειδή όργανα (δεν φαίνονται). Μια ενιαία ενδο-περιτοναϊκή έγχυση του ακτινοβολημένων φορτωμένα με πεπτίδιο HLA-A * 0201 συμφωνημένα αλλογενή γραμμή pDC επάγεται ισχυρές αποκρίσεις Τ κυττάρου αντιγόνου-ειδικών προς ιικό (FluM1, CMVpp65) και όγκου (Mela) αντιγόνα σε HuPBL ποντικούς (Σχήμα 3Α). Ανθρώπινα τετραμερούς

+ CD8 Τ κύτταρα βρέθηκαν όχι μόνο στην περιοχή της ανοσοποίησης (περιτοναϊκή πλύση), αλλά και στην κυκλοφορία (του αίματος) και λεμφοειδή όργανα (σπλήνας, λεμφαδένες) (Σχήμα 3Α). Στη συνέχεια αξιολογήθηκε το εάν αρκετές εβδομαδιαίες ενέσεις του πεπτιδίου-παλμικά pDC γραμμή θα μπορούσε να ενισχύσει το επίπεδο της απόκρισης. Είναι ενδιαφέρον, ιικό αντιγόνο (Flu) προκάλεσε μια υψηλή απόκριση που κορυφώθηκε 7 ημέρες μετά το πρώτο εμβόλιο και στη συνέχεια μειώθηκαν, ενώ απόκριση σε αντιγόνο όγκου (Mela) συνέχισε να αυξάνεται κατά τη μετέπειτα επαναδιεγέρσεις (Σχήμα S4). Εντός όλα τα εμβολιασμένα ποντίκια HuPBL (n = 22, 18 και 38) που έχουν ανασυσταθεί με ανθρώπινα PBMC (επίπεδα βασικής γραμμής των CD8 + Τ κυττάρων τετραμερούς + ήταν 0,11% (FluM1), 0,12% (CMVpp65) και 0,01% (Mela) τετραμερές

+ T κύτταρα) τα επίπεδα των ειδικών Τ κυττάρων που ανακτήθηκαν στα διάφορα όργανα κυμαίνονταν από 0,7 μέχρι 1,9% για FluM1, 1,1 έως 5,9% για CMVpp65, και 0,2 έως 1% για Mela (Σχήμα 3Β). Έτσι, το πεπτίδιο-παλμική pDC γραμμή αποσπά ισχυρή και ευρεία αποκρίσεις Τ κυττάρου αντιγόνου-ειδική in vivo

(ΑΒ) με ανοσοανεπάρκεια NOD-SCIDβ

2m

-. /- Ποντίκια ανασυγκροτήθηκαν ενδοπεριτοναϊκά με 50,10

6 ανθρώπινο HLA-A * 0201

+ PBMC και εμβολιασμένα από την ίδια διαδρομή με 5,10

6 ακτινοβολημένα φορτωμένα με πεπτίδιο κύτταρα GEN υγιείς δότες ». Ειδικά επαγωγή κυττάρων Τ αναλύθηκε στο σημείο της ένεσης (πλύση), στην κυκλοφορία (του αίματος) και λεμφοειδή όργανα (σπλήνας, LN) με επισήμανση τετραμερές ανθρώπινων Τ κυττάρων σε κυτταρικά εναιωρήματα. (Α) Ο εμβολιασμός με φορτωμένα με πεπτίδιο κύτταρα GEN επάγεται ειδικές αποκρίσεις Τ κυττάρων in vivo. Αντιπροσωπευτικά διαγράμματα στιγμών επισημασμένου τετραμερούς Τ κυττάρων που επάγεται μετά από μία μόνο εμβολιασμό με φορτωμένα με πεπτίδιο κύτταρα GEN σε διάφορα όργανα κατά την ημέρα 8 για το εμβόλιο αντι-ιικά (Flu, CMV) και την ημέρα 10 για το εμβόλιο κατά του όγκου (Mela) (περίφραξη σε CD8

+ Τ κύτταρα). Μία ομάδα ποντικών ανά δείχνεται. Αρχικά επίπεδα συγκεκριμένων κυττάρων Τ εντός PBMC ήταν 0,04%, 0,14% και 0,003% αντίστοιχα. (Β) Επίπεδα ειδικών Τ κυττάρων πριν (ημέρα 0) και μετά τον εμβολιασμό με GEN φορτωμένο με FluM1 (n = 22 ποντίκια, 4 δότες, 1 εμβόλιο), CMVpp65 (n = 18 ποντίκια, 2 δότες, 1 εμβόλιο) και Mela ( n = 38 ποντίκια, 4 δότες, 2-3 εμβόλια) πεπτίδια στους χρόνους που υποδεικνύονται σε διαφορετικά όργανα. Κάθε τελεία αντιπροσωπεύει έναν εμβολιασμένα HuPBL ποντίκια (μπάρες στο μέσος).

Η

Εμβολιασμός με το πεπτίδιο-φορτωμένο HLA συμφωνημένα αλλογενή γραμμή pDC προστατεύουν εξανθρωπισμένα ποντίκια από την εξέλιξη του όγκου και στις δύο προφυλακτική και θεραπευτική ρυθμίσεις

στη συνέχεια ερευνήσαμε το θεραπευτικό δυναμικό αυτής της στρατηγικής σε εξανθρωπισμένα ποντίκια περαιτέρω εμφυτευμένα με ανθρώπινο όγκο. NOD-SCIDβ

2m

– /- ποντίκια ανασυγκροτήθηκαν ενδοπεριτοναϊκώς με ανθρώπινο HLA-A * 0201

+ PBMC και εβδομαδιαία εμβολιάστηκαν υποδορίως με ακτινοβολημένο πεπτίδιο παλμικά κύτταρα GEN πριν ή αφού έχει προκληθεί με όγκου μελανώματος κύτταρα. Σε ένα προφυλακτικό ρύθμιση, έγχυση HuPBL ποντικών με Mela-φορτωμένα κύτταρα GEN, σε σύγκριση με Flu-φορτωμένο κύτταρα GEN, ανέστειλε HLA-A * 0201

+ Mela

+ ανάπτυξη του όγκου (Me275) σε πέντε ανεξάρτητα πειράματα (όγκος μέγεθος κατά την ημέρα 27 = 12 έναντι 77 χιλιοστά

3, σ & lt? 0.0001) (Σχήμα 4Α και 4Γ). Αντίθετα, η αύξηση του HLA-A * 0201

-MelA

+ (COLO829) και HLA-A * 0201

+ Μελά

– (Α375) όγκους μελανώματος δεν επηρεάστηκε μετά την ένεση του Μελά ή Flu-φορτωμένο κύτταρα GEN σε τρία ανεξάρτητα πειράματα (Σχήμα 4C), αποδεικνύοντας την HLA-A * 0201-περιορισμού και αντιγόνου ειδικότητα της θεραπείας. Επιπλέον, το πεπτίδιο-φορτωμένο pDC προκαλούν επίσης προστατευτικές ανοσοαποκρίσεις έναντι ήδη καθιερωμένων όγκων. Ο εμβολιασμός των ποντικιών που φέρουν όγκο HuPBL με Mela-φορτωμένα κύτταρα GEN ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου σε σύγκριση με Flu-φορτωμένα κύτταρα GEN (μέγεθος όγκου την ημέρα 25 = 6 vs 36 χιλιοστά

3, ρ = 0,01) (Σχήμα 4D-4F). Αξιοσημείωτα, τετραμερούς

+ CD8 + Τ κύτταρα βρέθηκαν στη θέση του όγκου και στην αποστράγγιση LN (Σχήματα 4Β και 4F), υποδηλώνοντας ότι οι όγκο-αντιδρώντων Τ κυττάρων που επάγεται από το HLA συμφωνημένα αλλογενή pDC είχαν μεταναστεύσει στην τοποθεσία του αντιγόνου έκφραση και τα Τ κύτταρα ήταν ικανά θανάτωσης κυττάρων όγκου

(AC) με ανοσοανεπάρκεια NOD-SCID β

2m

-. /- ποντίκια ανασυσταθεί ενδοπεριτοναϊκά με ανθρώπινο HLA-A * 0201

+ PBMC (HuPBL ποντικοί) εβδομαδιαία εμβολιάστηκαν υποδορίως με ακτινοβολημένο Mela ή Flu-φορτωμένο κύτταρα GEN και προκλήθηκαν 5 ημέρες αργότερα με κύτταρα όγκου μελανώματος στο πλευρό. (Α) Παρακολούθηση της εξέλιξης του όγκου. αντιπροσωπευτικό Ένα πείραμα 5. (Β) τη σήμανση τετραμερές όγκου και αποστράγγιση κυτταρικά εναιωρήματα LN από HuPBL ποντικούς εμβολιασμένους με Mela-φορτωμένα κύτταρα GEN που δείχνει την παρουσία του Mela-ειδικών Τ κυττάρων (περίφραξη σε CD8 + Τ κύτταρα). (Γ) Τα θεραπευτικά αποτελέσματα του εμβολίου είναι HLA-A * 0201-περιορισμένο και αντιγόνου-ειδική. Συγκριτικό μέγεθος του όγκου 27 ημέρες μετά την εμφύτευση του Me275, COLO829 και κύτταρα μελανώματος Α375 σε HuPBL ποντίκια εμβολιασμένα με Mela ή Flu-φορτωμένα κύτταρα GEN (πισίνα 3 ανεξάρτητα πειράματα για κάθε τύπο του όγκου πραγματοποιήθηκε με 6 έως 14 ποντικοί ανά ομάδα). (DF) με ανοσοανεπάρκεια NOD-SCID β

2m

– /- ποντίκια ανασυσταθεί ενδοπεριτοναϊκά με ανθρώπινο HLA-A * 0201

+ PBMC (HuPBL ποντικοί) πρώτα προκλήθηκαν με κύτταρα όγκου μελανώματος Me275 στο πλευρό και στη συνέχεια εμβολιάστηκαν υποδορίως με ακτινοβολημένα Μελά ή γρίπη-φορτωμένο κύτταρα GEN εβδομαδιαία ξεκινώντας 4 ημέρες αργότερα. (Δ) Παρακολούθηση της εξέλιξης του όγκου. Ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα από 2. μέγεθος (Ε) Συγκριτική όγκου 25 ημέρες μετά την εμφύτευση του όγκου (ομάδα 2 ανεξάρτητα πειράματα, 8 ποντικοί /ομάδα). (F) επισήμανση τετραμερές όγκου και αποστράγγιση κυτταρικά εναιωρήματα LN από HuPBL ποντικούς εμβολιασμένους με Mela-φορτωμένα κύτταρα GEN που δείχνει την παρουσία του Mela-ειδικών Τ κυττάρων (περίφραξη σε CD8 + Τ κύτταρα).

Η

Το HLA συμφωνημένα αλλογενή pDC γραμμή φορτωμένο με μελάνωμα πεπτίδια προερχόμενα προκαλεί πολλαπλά ειδικά και άκρως λειτουργικές αποκρίσεις των κυττάρων Τ ex-vivo από το στάδιο I-IV ασθενείς με μελάνωμα

στη συνέχεια ερευνήσαμε τη σημασία της στρατηγικής αυτής σε ασθενείς με καρκίνο. Ελέγξαμε την ικανότητα του πεπτιδίου-παλμικά pDC γραμμή για να προκαλέσει ex-vivo ογκο-ειδικών αποκρίσεων από PBMC και λεμφοκύτταρα που διηθούν όγκο (ΤΙΤ) που απομονώθηκαν από το στάδιο IV HLA-A * 0201

+ ασθενείς με μελάνωμα (Πίνακες S1 και S2 ). Εβδομαδιαία διεγέρσεις του PBMC ασθενών με τη γραμμή pDC πάλλονται είτε με Mela, GP100, TYR ή MAGE-3 πεπτίδιο οδήγησε στην μαζική ενίσχυση συγκεκριμένων κυττάρων CD8 + Τ για τουλάχιστον 2 από τα 4 αντιγόνων μελανώματος (Σχήματα 5Α και 5Β). Ο όγκος ειδικά τετραμερούς

απαντήσεων + CD8 Τ κυττάρων έφθασε κατά μέσο όρο 23% για Μελά (εύρος 0,4 – 62%), 1,2% για το GP100 (εύρος 0,05 – 3,5%), 0,3% για το Tyr (εύρος 0,01 – 2,5% ) και 0,2% για τα CD8 + Τ κύτταρα MAGE-3 (εύρος 0,03 – 0,72%) μετά από 20 ημέρες (γραμμή βάσης τετραμερές + κυμαίνονταν από 0,02 σε 0,03% κατά D0). Ένας ασθενής εξαιρέθηκε από την ανάλυση λόγω της εξαιρετικά έντονη απόκριση (85% τετραμερές

+ Τ κύτταρα την ημέρα 14) προς Tyr (Εικόνα S5). Επιπλέον, επαναλαμβανόμενες διεγέρσεις του patients’TIL με τη γραμμή pDC πάλλονται με ένα μείγμα από τα 4 πεπτίδια μελανώματος οδήγησε στην μαζική ενίσχυση των ειδικών Τ κυττάρων για τουλάχιστον 3 αντιγόνα (Σχήματα 5C και 5D). Όγκου-ειδικά τετραμερούς

+ αποκρίσεις κυττάρων CD8 Τ έφθασε κατά μέσο όρο 39% για Μελά (εύρος 12-59%), 7,4% για το GP100 (εύρος 0,2 – 24%), 0,3% για το Tyr (εύρος 0,05 – 1,2%) και 1,1% για MAGE-3 (εύρος 0,1 – 4,3%) μετά από 20 ημέρες με αρχικά επίπεδα ημέρα format 0 1,7, 0,2, 0,05 και 0,3%, αντίστοιχα.