Αφηρημένο

Ο καλύτερος τρόπος για να αυξήσει το ποσοστό επιβίωσης των ασθενών είναι να προσδιοριστούν οι ασθενείς που είναι πιθανό να εξελιχθεί σε muscle- επεμβατικές ή μεταστατική νόσο εκ των προτέρων και να τα επεξεργάζονται πιο επιθετικά. Η HCV29 ανθρώπινες κυτταρικές σειρές (κανονικό επιθήλιο της ουροδόχου κύστης), KK47 (χαμηλής ποιότητας nonmuscle διηθητικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης, NMIBC), και YTS1 (μεταστατικός καρκίνος ουροδόχου κύστης) έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως σε μελέτες μοριακών μηχανισμών και σηματοδότηση κυττάρων κατά τη διάρκεια του καρκίνου της ουροδόχου κύστης (BC) εξέλιξης. Ωστόσο, έχει δοθεί λίγη προσοχή στην παγκόσμια ποσοτική ανάλυση πρωτεώματος από αυτές τις τρεις κυτταρικές σειρές. Εμείς επισημασμένα HCV29, κύτταρα KK47, και YTS1 με τη μέθοδο SILAC χρήση τριών σταθερών ισοτόπων καθένα από αργινίνη και λυσίνη. Σημασμένες πρωτεΐνες αναλύθηκαν με 2D υπερυψηλής ανάλυσης υγρής χρωματογραφίας LTQ Orbitrap φασματομετρία μάζας. Μεταξύ 3721 μοναδικές εντοπιστεί και σχολιασμένο πρωτεϊνών στα κύτταρα KK47 και YTS1, 36 ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω και 74 ήταν σημαντικά μειωτικά με & gt? Εμπιστοσύνης 95%. Διαφορική έκφραση αυτών των πρωτεϊνών επιβεβαιώθηκε με στύπωση western, ποσοτική RT-PCR, και χρώση των κυττάρων με ειδικά αντισώματα. Gene οντολογία (GO) όρος και η ανάλυση μονοπατιού έδειξε ότι τα διαφορικά ρυθμίζονται πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην αντιγραφή του DNA και μοριακή μεταφορά, την κυτταρική ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό, κυτταρική κίνηση, η κυκλοφορία του ανοσοποιητικού κυττάρου και του κυτταρικού θανάτου και επιβίωσης. Αυτές οι πρωτεΐνες και οι προηγμένες τεχνικές proteome που περιγράφονται εδώ θα είναι χρήσιμη για την περαιτέρω διαλεύκανση των μοριακών μηχανισμών σε π.Χ. και σε άλλες μορφές καρκίνου

Παράθεση:. Yang G, Xu Z, Lu W, Λι Χ, Sun C, Guo J, et al. (2015) Ποσοτική Ανάλυση Διαφορικές Proteome έκφρασης για τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης εναντίον Κανονική κυττάρων κύστης Χρησιμοποιώντας τη μέθοδο SILAC. PLoS ONE 10 (7): e0134727. doi: 10.1371 /journal.pone.0134727

Επιμέλεια: Jon M. Jacobs, Pacific Northwest National Laboratory, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 20 του Γενάρη 2015? Αποδεκτές: 13 Ιουλίου του 2015? Δημοσιεύθηκε: 31 Ιουλίου 2015

Copyright: © 2015 Yang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι μέσα στα αρχεία του χαρτιού και συνοδευτικά αρχεία πληροφοριών της

Χρηματοδότηση:. το ερευνητικό έργο χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Επιστημών για νέους επιστήμονες της Κίνας (Νο 81402115, 81201572), το Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της επαρχίας Jiangsu, Κίνα (Αρ BK20140172) και το 111 Έργο της Κίνας (No.111-2-06). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνου της ουροδόχου κύστης (π.Χ.) είναι η πέμπτη πιο κοινός τύπος καρκίνου στον άνθρωπο. υπήρχαν περίπου 74.690 νέα κρούσματα και 15.580 θάνατοι από αυτή την ασθένεια στις Ηνωμένες Πολιτείες το 2013 [1]. Από το σύνολο των ασθενών π.Χ., & gt? 70% έχουν nonmuscle-διεισδυτικής νόσου και ~ 25% παρούσας αρχικά με μυϊκή εισβολή. Οι ασθενείς με το μυ-επεμβατική μορφή έχουν κίνδυνο 50% των απομακρυσμένων μεταστάσεων και μια φτωχή πρόγνωση [2]. Η επανεμφάνιση των επιφανειακών όγκων της ουροδόχου κύστης είναι ένας σημαντικός λόγος για την παγκόσμια επικράτηση της BC [3]. Η πλειοψηφία (90%) του BCS έχουν ταξινομηθεί ιστολογικά ως ουροθηλιακά καρκινώματα (UCS), που προέρχεται από το ουροθήλιο της ουροδόχου κύστης [4]. Της ουροδόχου κύστης επιθηλιακών ιστών έχουν μια σαφή ιεραρχική οργάνωση που αποτελείται από τρεις μορφολογικά διαφορετικούς τύπους κυττάρων: βασική, ενδιάμεση, και τα κύτταρα ομπρέλα, που αντιστοιχούν σε πρώιμη, μέση και αργά διαφοροποίηση μελών [5]. Κακοήθη μετασχηματισμό μπορεί να συμβεί σε κάθε έναν από αυτούς τους τύπους κυττάρων, με αποτέλεσμα την ποικιλία των φαινοτύπων του όγκου [6]. Σύμφωνα με την τελευταία έκθεση της American Cancer Society, το σχετικό ποσοστό επιβίωσης 5 ετών για την BC με την έγκαιρη ανίχνευση (στάδιο Ι, (Τ1, N0, M0)) είναι ~ 88% [7]. Ως εκ τούτου, ταυτοποίηση νέων μοριακών δεικτών σε πρώιμο στάδιο είναι επιθυμητή για βελτιωμένη διαστρωμάτωση του κινδύνου.

Υποψήφιος βιοδεικτών για την ανίχνευση π.Χ. αξιολογούνται μέχρι σήμερα περιλαμβάνουν την τελομεράση, το αντιγόνο του όγκου της ουροδόχου κύστης (BTA), πρωτεΐνες πυρηνικής μήτρας 22 (NMP-22) και προϊόν αποδόμησης του ινώδους (FDP). Η αξιοπιστία των δοκιμών που βασίζονται σε αυτές βιοδείκτες είναι κακή λόγω της χαμηλής ευαισθησίας και υψηλής ψευδώς θετικά ποσοστά [8-11]. Οι πρωτεΐνες μπορούν δυνητικά να ταυτοποιηθούν ειδικά για επιθετικές ή nonaggressive τύπους καρκίνου. ανάλυση πρωτεώματος είναι δύσκολη λόγω της περιορισμένης ποσότητας των διαθέσιμων κλινικών δειγμάτων [12]. Παρακολούθηση της proteome των κυττάρων BC θα μπορούσε να παράσχει πρόσθετες πληροφορίες για τις κλινικές διαγνωστικούς σκοπούς.

Οι πρόσφατες εξελίξεις στην φασματομετρία μάζας (MS) για την ταυτοποίηση των πρωτεϊνών και ποσοτικοποίηση διευκολύνει την σε βάθος ανάλυση του μεγάλου αριθμού των πρωτεϊνών, και έχουν χρησιμοποιηθεί για εξέταση του συνόλου πρωτεώματος σε αρκετά συστήματα. Τέτοιες μέθοδοι περιλαμβάνουν την ηλεκτροφόρηση γέλης 2D διαφορά (2D ΨΗΦΟ), το παρόμοιο iTRAQ (ισοβαρή ετικέτα για σχετική και απόλυτη ποσοτικοποίηση), ισότοπο κωδικοποιημένες ετικέτες συγγένειας (ICAT), και σταθερή επισήμανση ισότοπο από τα αμινοξέα σε καλλιέργεια κυττάρων (SILAC) [13- 15]. Σε σύγκριση με μεθόδους απόλυτη ποσοτικοποίηση με βάση πεπτίδιο, SILAC έχει τα πλεονεκτήματα της ανάμειξης δειγμάτων στην αρχή, και μειωμένη δείγμα προς δείγμα μεταβλητότητα. Μεταβολική επισήμανση με σταθερά ισότοπα έχει περιγραφεί ως ο «χρυσός κανόνας» σε πρωτεΐνες ποσοτικοποίηση [16]. Αργινίνη (Arg) και λυσίνη (Lys) είναι οι σταθερές ραδιοεπισημασμένες αμινοξέα που χρησιμοποιούνται πιο συχνά στις μελέτες SILAC που βασίζεται, επειδή επακόλουθη πέψη με θρυψίνη των απομονωμένων πρωτεϊνών (το οποίο διασπά σε βασικά κατάλοιπα) για ανάλυση MS παράγει πεπτίδια με ένα μόνο σημασμένο αμινο οξύ, απλοποιώντας την ανάλυση και ποσοτικοποίηση [17]. Στην παρούσα μελέτη, τρία σταθερά ισότοπα καθένα από Arg (R0, R6, R10) και Lys (K0, Κ4, Κ8) σε τρεις ξεχωριστές καλλιέργειες ( «ελαφρά» (L), «μέσο» (Μ), και «βαριά» (H)) χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση των διαφορών πρωτεώματος σε διάφορα στάδια της BC. Διακριτός L, M, και H μορφές του κάθε πεπτιδίου όπως ανιχνεύεται με MS αντανακλάται σχετικές ποσότητες της αντίστοιχης πρωτεΐνης σε τρία στάδια ισοτοπικά κωδικοποιημένο BC κύτταρο

Τρεις ανθρώπινες κυτταρικές σειρές μελετήθηκαν:. Φυσιολογικά επιθηλιακά κύστη HCV29, χαμηλής ποιότητας nonmuscle διηθητικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης (NMIBC) KK47, και μεταστατικό μυών επεμβατική κύστης YTS1 καρκίνο. Κάθε μία από τις τρεις κυτταρικές γραμμές καλλιεργήθηκαν σε μέσο προστίθεται με τρεις συνδυασμούς μη επισημασμένου Lys και Arg ( «ελαφρά»), D

4-Lys και

13C

6-Arg ( «μέσο»), και

13C

6

15N

2-Lys και

13C

6

15N

4-Arg ( «βαρύ»). Πρωτεΐνες με & gt? 98% ενσωμάτωση ετικέτα αναλύθηκαν και ποσοτικά με 2D-HPLC-LTQ Orbitrap MS (Σχήμα 1). Διαφορική έκφραση των ταυτοποιημένων πρωτεϊνών, οι οποίες προφανώς σχετίζονται με την ανάπτυξη π.Χ., επιβεβαιώθηκε με κηλίδωση Western, ποσοτική RT-PCR, και χρώση των κυττάρων με ειδικά αντισώματα.

Η

Υλικό και Μέθοδοι

καλλιέργειας κυττάρων

HCV29, κύτταρα KK47 και YTS1 δημιουργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18-20] και ευγενική δωρεά από τον Dr. Sen-itiroh Hakomori (The Institute Biomembrane? Seattle, WA, USA). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% FBS και 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη στους 37 ° C σε 5% CO

2 ατμόσφαιρα. Για την επισήμανση SILAC, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε SILAC επισημασμένο RPMI 1640 με 10% διαλυμένο FBS και 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη που περιέχει «ελαφρά» (K0R0), «μέσο» (K4R6), ή «βαριά» (K8R10) Lys και Arg. Για την πρόληψη Arg-to-Pro μετατροπή, L-Pro (200 mg /L) προστέθηκε στο μέσον όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21]. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για τουλάχιστον 5 περάσματα για την εξάλειψη των μη επισημασμένου Lys και Arg.

Η λύση των κυττάρων και πρωτεϊνών εκχύλιση

Σύνολο πρωτεΐνες από τις τρεις κυτταρικές σειρές λύθηκαν και εκχυλίστηκαν χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο T-PER (Thermo Επιστημονική? San Jose, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα (~ 1 χ 10

7) αποκολλήθηκαν με θρυψίνη, πλύθηκαν δύο φορές με παγωμένο 1 × PBS (0,01 Μ φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει 0,15 Μ NaCl, ρΗ 7,4), λύθηκαν με 1 ml αντιδραστηρίου T-PER που περιέχει αναστολείς πρωτεάσης (1 mM PMSF και 0,1% απρωτινίνη), επωάστηκαν για 30 λεπτά σε πάγο, ομογενοποιήθηκε και φυγοκεντρήθηκε στις 12.000 rpm για 15 λεπτά. Το υπερκείμενο συλλέχθηκε και αποθηκεύτηκε στους -80 ° C. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με δοκιμασία BCA. (Beyotime? Haimen, Κίνα)

SDS-PAGE και

σε γέλη

πέψη

Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με 10% SDS-PAGE , ορατές με χρώση Coomassie για 2 ώρες, και αποχρωματίζονται για όλη τη νύχτα. Αποκομμένα φέτες πηκτής πλύθηκαν με 25 mM διττανθρακικού αμμωνίου /50% ακετονιτρίλιο (ACN). Αποξηραμένα τεμάχια επωάστηκαν με 20 μι 10 mM διθειοθρεϊτόλης (DTT) στους 56 ° C για 1 ώρα και στη συνέχεια με έναν ίσο όγκο 20 mM ιωδοακεταμιδίου (ΙΑΜ) σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι. φέτες Gel πλύθηκαν και επεξεργασία με θρυψίνη με 20 μι (10 ng /μL) θρυψίνη (Promega? Madison, WI, USA) για 30 λεπτά στους 4 ° C. Η περίσσεια του διαλύματος θρυψίνης αφαιρέθηκε, 20 μL από 25 mM ΝΗ

4HCO προστέθηκε

3, και το μίγμα επωάστηκε όλη τη νύχτα στους 37 ° C. Εκχυλίσματα προϊόντα ξηραίνονται με συμπυκνωτή SpeedVac (Centrivap ψυχρή παγίδα, Labconco? Kansas, ΜΟ, USA). [22]

MALDI-TOF /TOF-MS

Αποξηραμένα δείγματα διαλύθηκαν με 0,1 % τριφθοροοξικό οξύ (TFA), κηλίδα επί ενός στόχου δείγμα ΜΤΡ AnchorChip, και ξηραίνεται στον αέρα. Τα πεπτίδια ανακρυσταλλώθηκαν με μήτρα α-cyanohydroxycinnamic οξύ (CHCA? 1 μι 10 mg /mL) και χαρακτηρίζεται από MALDI-TOF /TOF-MS (UltrafleXtreme, Bruker Daltonics? Bremen, Germany). Ιονισμού επιτεύχθηκε με ακτινοβολία με ένα λέιζερ αζώτου (λ = 337 nm) που λειτουργεί σε 20 Hz. Τα φάσματα μάζας αποκτήθηκαν με τη χρήση των προγραμμάτων λογισμικού FlexControl και FlexAnalysis

Σε διάλυμα πέψης

Πρωτεΐνες από τρεις τύπους σταθερές ραδιοεπισημασμένες κύτταρα αναμίχθηκαν σε αναλογία 1:. 1: 1, μειώνεται, και αλκυλιώνεται με επώαση με ίσες ποσότητες 10 mM DTT και 20 mM ΙΑΜ. Αλκυλιωμένα πρωτεΐνες υπέστησαν πέψη με θρυψίνη προστίθεται σε αναλογία 1:50 (β /β) και επωάζεται όλη τη νύκτα στους 37 ° C [23]. Σύνολο πεπτιδίων συμπυκνώθηκαν και αφαλατώθηκαν χρησιμοποιώντας μια μονάδα 10kD αποκλεισμού μεγέθους σπιν υπερδιήθηση και ξηραίνεται χρησιμοποιώντας συμπυκνωτή SpeedVac.

LC-MS /MS ανάλυση

2D-LC-MS εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας LTQ Orbitrap MS (Thermo Fisher Scientific? Waltham, ΜΑ, USA) όπως περιγράφεται προηγουμένως [24]. Το χωνευμένο πεπτίδια (100 μg) ενέθηκαν σε ένα διφασικό τριχοειδή στήλη (id 200 μm) συσκευάζεται με C

18 ρητίνη (ReproSil-Pur, 5 μm, Dr. Maisch GmbH) και ισχυρή ρητίνη ανταλλαγής κατιόντων (Luna 5 μm SCX 100A, Phenomenex). λύματα πεπτιδίου από τη διφασική στήλη σε κάθε βαθμίδα κατευθύνθηκαν σε 15 cm C

18 αναλυτική στήλη (i.d. 75 μm, ReproSil-Pur, 3 μm) σε ρυθμό ροής 500 nl /min. Νανο-ESI διεξήχθη με τάση ψεκασμού 2,0 kV και θερμοκρασία θερμαινόμενου τριχοειδούς 200 ° C. Ένα πλήρες MS σάρωσης (300-1800) στην Orbitrap ακολουθήθηκε από πέντε MS /MS σαρώσεις των πέντε πιο έντονη ιόντα επιλέγονται από το φάσμα MS στη LTQ. Χρεώνουν διαλογής κατάσταση ήταν ενεργοποιημένο για 2, 3, 4, και πάνω απ ‘[25].

Η ανάλυση των δεδομένων

Δεδομένα πρωτογενών MS αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα λογισμικού MaxQuant (V. 1.2. 2.5) [26,27]. όφειλαν Ένα ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη (FDR) 0.01 για πρωτεΐνες και πεπτίδια και ένα ελάχιστο μήκος πεπτιδίου 6 αμινοξέων. MS /MS φάσματα αναζήτηση από την Ανδρομέδα [28] κατά της ανθρώπινης βάσης δεδομένων IPI (Β 3.85). Το πρόγραμμα MaxQuant προσδιοριστεί η κατάσταση SILAC των πεπτιδίων από τη μαζική διαφορές μεταξύ των ζευγαριών πεπτίδιο SILAC, και η πληροφορία αυτή χρησιμοποιείται για την εκτέλεση αναζητήσεων με σταθερές Arg6 και Lys4 ή Arg10 και Lys8 τροποποιήσεις, ανάλογα με την περίπτωση. Η ποσοτικοποίηση σε MaxQuant διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26].

Διαφορικό ρύθμιση σε κάθε πειραματική M /L ( «μέσο /φως») λόγος και H /L ( «βαρύ /ελαφρύ») αναλογία των ταυτοποιημένων πρωτεϊνών ομαλοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ανάλυση z-score, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [29,30]. Εν συντομία, M /L και οι αναλογίες H /L μετατράπηκαν σε διάστημα log2, και η μέση αναλογίες και SD (τυπικές αποκλίσεις) υπολογίστηκαν για κάθε σύνολο δεδομένων. Η log2 M /L και Η αναλογία /L κάθε πρωτεΐνης μετατράπηκαν σε βαθμολογία-z, χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο: όπου b κρίθηκαν ως μία απλή πρωτείνη σε ένα σύνολο δεδομένων πληθυσμό (α … .Ν). Το z-σκορ ήταν ένα μέτρο του πόσες μονάδες SD (σ) του log2 M /L ή H αναλογία /L της πρωτεΐνης ήταν μακριά από τη μέση τιμή του πληθυσμού. Ένα z-score ≥1.960σ εκπροσωπείται ότι η διαφορική έκφραση της πρωτεΐνης ψέματα έξω από το διάστημα εμπιστοσύνης 95%, ένα σκορ ≥2.576σ εκπροσωπούνται έκφραση έξω από το διάστημα εμπιστοσύνης 99%, και ένα σκορ ≥3.291σ αντιπροσώπευαν το 99,9% εμπιστοσύνης. Z-score ≥1.960σ θεωρήθηκαν ότι είναι σημαντικές [29].

Λειτουργική σχολιασμό και την εφευρετικότητα Μονοπάτια Ανάλυση

Αναγνωρισμένες πρωτεΐνες αναλύθηκαν περαιτέρω με τη χρήση της βάσης δεδομένων SWISS-PROT να ταξινομήσει βιολογική διαδικασία τους, κυτταρικό συστατικό, και μοριακή λειτουργία [31]. Σημαντικές υπερεκπροσωπούνται γονίδιο οντολογία (GO) όροι προσδιορίστηκαν με τη χρήση της βάσης δεδομένων για το σχολιασμό, την απεικόνιση και την Ολοκληρωμένη Discovery (David) γονίδιο βιοπληροφορικής πόρους [32, 33]. Πρωτεΐνες αποφασισμένοι να ρυθμίζονται διαφορετικά, όπως περιγράφεται στην προηγούμενη ενότητα συνοψίζονται στο Excel και το Διεθνές Πρωτεΐνη Δείκτης του αριθμού τους (IPI) έχουν φορτωθεί σε DAVID (https://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp) για τη λειτουργική ανάλυση σχολιασμό . σύνολα δεδομένων που περιέχουν αναγνωριστικά γονιδίου και αντίστοιχες τιμές έκφρασης στη συνέχεια αποστέλλονται στην εφαρμογή Ingenuity Συστημάτων. Κάθε αριθμός IPI χαρτογραφήθηκε στο αντίστοιχο αντικείμενο γονίδιο της στην Ingenuity Pathways Γνωσιακής Βάσης. Δίκτυα των πρωτεϊνών που παράγονται αλγοριθμικά με βάση την συνδεσιμότητα τους. ακριβής δοκιμασία του Fisher χρησιμοποιήθηκε για να υπολογιστεί μια τιμή ρ υποδεικνύει την πιθανότητα ότι ένα συγκεκριμένο βιολογική λειτουργία ή /και ασθένεια εκχωρηθεί σε αυτό το δίκτυο οφειλόταν στην τύχη και μόνο. ​​

κηλίδωση Western

κηλίδωση Western ήταν πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [34]. Εν συντομία, οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν σε 10% γέλη SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF, και η μεμβράνη μπλοκαρίστηκε χρησιμοποιώντας 5% άπαχο γάλα σε TBST και ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ειδικά αντισώματα. Τα πρωτογενή αντισώματα ήταν κουνελιού αντι-ινσουλίνη αυξητικός παράγοντας 2 mRNA δέσμευσης πρωτεΐνης 1 (IGF2BP1) (# AP10466b, Abgent? San Diego, CA, USA), αντι-μελάνωμα αντιγόνου 4 (MAGEA4) (# AP6166a, Abgent), αντι-Thy-1 γλυκοπρωτεΐνη μεμβράνης κουνελιών (thy1) (# AP2050a, Abgent), πρωτεΐνη 14-3-3 σίγμα (SFN) (# SC-365539, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), αντι-κουνελιού -fibronectin (FN1) (# F3648, Sigma-Aldrich), αντι-βιμεντίνη ποντίκι (VIM) (# V5255, Sigma-Aldrich), το αντιγόνο CD70 (CD70) (# sc-7681, Santa Cruz Biotechnology), και αντι-ποντικιού β-κατενίνης (CTNNB1) (# 610153, BD Biosciences? San Jose, CA, USA). Τα δευτερεύοντα αντισώματα ήταν κατάλληλη υπεροξειδάση (HRP), συζευγμένης κουνελιού αντι-ποντικού ή κατσίκας αντι-κουνελιού (# A0216 και # A0208, Beyotime). Οι ζώνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα κιτ ανίχνευσης ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (Westar Nova, Cyanagen? Μπολόνια, Ιταλία).

Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου

Κύτταρα (1 χ 10

5 ανά φρεάτιο σε ένα πλάκα 6 φρεατίων) καλλιεργήθηκαν και κατεργάστηκαν όπως περιγράφηκε παραπάνω. Ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας ένα RNApure Tissue Kit (CWBiotech? Beijing, China) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι εκκινητές σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα DNAMAN (V. 6.0.3? Lynnon Biosoft, Canada). Πρώτου κλώνου cDNA συντέθηκε από ολικό RNA χρησιμοποιώντας ReverTra Ace-α (Toyobo? Osaka, Japan). Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου πραγματοποιήθηκε με LightCycler που βασίζεται SYBR Green Ι χρωστική ανίχνευσης με UltraSYBR Μείγμα (CWBiotech). Η γονιδιακή έκφραση ποσοτικοποιήθηκε από το 2

-ΔΔCT μέθοδο [35].

χρώση κυττάρων

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν επί αποστειρώνονται καλυπτρίδων σε πλάκες 24 φρεατίων μέχρι 70-80% συρροή, πλύθηκαν , ακινητοποιημένο, διαπερατά με 0,2% Triton Χ-100 για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, και αποκλείστηκαν με 5% άπαχο γάλα για όλη τη νύχτα στους 4 ° C. Σταθερή κύτταρα επωάστηκαν με αραιωμένο πρωτογενή αντισώματα για 12 ώρες, επωάστηκαν με FITC-επισημασμένο δευτερογενή αντισώματα στους 4 ° C για 6 ώρες στο σκοτάδι, πλύθηκαν, χρωματίστηκαν με 4 μg /mL ϋΑΡΙ σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά, πλύθηκαν με 1 χ PBS, και φωτογραφήθηκαν με ένα μικροσκόπιο φθορισμού (Eclipse E600, Nikon? Τόκιο, Ιαπωνία).

Αποτελέσματα

Προσδιορισμός των ισοτόπων

αποτελεσματικότητα ενσωμάτωσης

Για να αναλύσει δυναμικές αλλαγές στη π.Χ. ογκογένεση στο επίπεδο πρωτέωμα, η μέθοδος SILAC εφαρμόστηκε σε τρεις κυτταρικές σειρές της κύστης για να ληφθεί επισημασμένο κυτταρικών πληθυσμών. Επαρκή επισήμανση αποτελεί προϋπόθεση για την αξιόπιστη ποσοτικοποίηση χρήση αυτής της μεθόδου. Στην περίπτωση ατελούς επισήμανση των πρωτεϊνών, ιδιαίτερα για αποτελεσματικότητα επισήμανσης & lt? 95%, ποσοτικοποίηση πρωτεϊνών χαμηλής αφθονίας θα καλυφθούν από τα μολυσμένα «φως» πεπτίδια. Για τον προσδιορισμό της αποτελεσματικότητας ενσωμάτωσης σημασμένων Lys και Arg, «ελαφρά» (HCV29), «μέσο» (KK47), και «βαριά» πρωτεΐνες (YTS1) διαχωρίστηκαν, και η πρωτεΐνη υψηλής αφθονία ήταν

σε-gel

πέψη. MALDI-TOF /TOF-MS αποτέλεσμα για το πεπτίδιο GVVDSEDLPLNISR σε πρωτεΐνες θερμικού σοκ 90 (P08238) έδειξε ότι η πλήρης ενσωμάτωση των σημασμένο με ισότοπα Arg και Lys επιτεύχθηκε σε KK47 και YTS1, και δεν έγινε καμία Arg-to-Pro μετατροπής (Σχήμα 2Α). LC-ESI-MS /MS ανάλυση του διπλά φορτισμένο πεπτίδιο VNQIGSVTESLQACK αλφα-ενολάσης (P06733) και GGPEVQQVPAGER του συνθάσης λιπαρού οξέος (P49327) έδειξε ότι αυτές οι δυάδες των πραγματικών συστάδων κορυφής ήταν από HCV29, KK47 και κύτταρα YTS1, αντίστοιχα ( Σχήμα 2Β).

(Α) Προσδιορισμός της αποτελεσματικότητας ενσωμάτωσης με MALDI-TOF /TOF-MS. Κορυφές περιγράφονται ως R0 (αριστερά), R6 (μέση), και R10 (δεξιά) είναι πεπτίδιο GVVDSEDLPLNISR των πρωτεϊνών θερμικού σοκ 90 από HCV29, KK47, και τα κύτταρα YTS1. (Β) Ταυτοποίηση και ποσοτικός προσδιορισμός των proteome στα κύτταρα π.Χ. από 2D-HPLC LTQ Orbitrap MS. Κορυφές περιγράφονται ως K0, Κ4 και Κ8 (αριστερά) και R0, R6, και R10 (δεξιά) διπλά φορτισμένο πεπτίδιο VNQIGSVTESLQACK άλφα ενολάση και GGPEVQQVPAGER της συνθάσης των λιπαρών οξέων.

Η μοντέλου

SILAC κυττάρων για ποσοτικοποίηση των πρωτεώματος π.Χ. εξέλιξης

οι πρωτεΐνες που απομονώθηκαν από τις τρεις κυτταρικές σειρές αναμίχθηκαν (1: 1: 1) και υποβλήθηκε σε πέψη χρησιμοποιώντας ένα φίλτρο 10 KD (Millipore? Billerica, ΜΑ, USA). Πεπτίδια αναλύθηκαν από υπερυψηλής ευκρίνειας υγρής χρωματογραφίας-tandem MS (NLC-ESI-MS /MS) για ένα υβριδικό γραμμική παγίδα ιόντων LTQ Orbitrap οργάνου. Ένα σύνολο 3721 μοναδικές πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν σε δύο ανεξάρτητα πειράματα πανομοιότυπες (σχήμα 3Α και S1 πίνακα). Από αυτούς, 1.766 πρωτεΐνες (47,5% του συνόλου) που εντοπίστηκαν και στα δύο πειράματα και πληρούσαν τα κριτήρια που καθορίζονται για πρωτεΐνη ποσοτικοποίηση υποβλήθηκαν σε περαιτέρω βιοπληροφορική ανάλυση. Τα ιστογράμματα κατανομής των λόγων καταγραφής τόσο για M /L και H /L χωρέσει ένα Gaussian κατανομή. Οι περισσότερες από τις ταυτοποιημένες πρωτεΐνες ήταν εντός του ± 1 εύρος των αναλογιών log (Σχ 3C και 3D). Χρησιμοποιώντας 1 ως ο λόγος log κατώφλι, η έκφραση των πρωτεϊνών 255 ήταν υψηλότερη σε αμφότερα KK47 και HCV29, και έκφραση πρωτεϊνών 434 ήταν χαμηλότερη και στις δύο KK47 και HCV29 (Σχήμα 3Β). διανομής με βάση τον πληθυσμό z-score επιτρέπεται άμεση σύγκριση των πρωτεϊνών από διαφορετικά πειράματα. Διαφορετικές τιμές αποκοπής επίπεδο εμπιστοσύνης εφαρμόστηκαν στα δεδομένα από την ανάλυση z-score για να καθορίσει ποιες πρωτεΐνες ήταν σημαντικά διαφορικά ρυθμίζεται. Οι αποκοπές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν 95%, 99% και 99,9%, που αντιστοιχεί σε z-score του ± 1.960, ± 2.576 και 3.291 ±, αντίστοιχα. Χρησιμοποιώντας μια αποκοπής 95%, σημαντική διαφορά ρύθμιση παρατηρήθηκε για 110 πρωτεΐνες σε KK47 εναντίον HCV29 (36 ρυθμίζεται προς τα πάνω, 74 μειωτικά) και για 87 πρωτεϊνών σε YTS1 εναντίον HCV29 (17 έως 70 κάτω). Διαφορική ρύθμιση παρατηρήθηκε για 35 πρωτεΐνες στις δύο γραμμές BC εναντίον HCV29 χρησιμοποιώντας αποκοπής 99% (2 επάνω, 33 κάτω), αλλά μόνο για πέντε από αυτές τις πρωτεΐνες χρησιμοποιώντας αποκοπής 99,9% (2 επάνω, 3 κάτω) (Πίνακας 1 ). Οι πίνακες 2 και 3 κατάλογος των απορυθμίζεται και μειωτικά πρωτεΐνες προσδιορίζεται στα δύο πειράματα, με μέση αναλογίες SILAC τους και z-score. Όλες οι πρωτεΐνες διαφορικά ρυθμίζονται με & gt? Εμπιστοσύνης 95% είχε ένα & gt? 5-φορές μεταβολή των αναλογιών SILAC και περισσότερες πρωτεΐνες διαφορικά ρυθμίζονται με & gt? 99% εμπιστοσύνη είχε & gt?. 10 φορές αλλοίωση των αναλογιών SILAC

(Α) διαγράμματα Venn των αριθμών των αναγνωρισμένων πρωτεϊνών από επιμέρους πειράματα. (Β) Αριθμοδείκτες του KK47 /HCV29 (M /L) και YTS1 /HCV29 (H /L) για το σύνολο των 1766 πρωτεϊνών. log2 του λόγου SILAC για κάθε πρωτεΐνη (n = 2) αντανακλά διαφορές στην σχετική έκφραση μεταξύ KK47, YTS1, και τα κύτταρα HCV29. (Γ) Κατανομή των αναλογιών SILAC M /L. (D) Κατανομή των αναλογιών SILAC H /L. (Ε) γράφημα Cluster ( «χάρτη θερμότητας») που παράγεται από ιεραρχική ομαδοποίηση των σημαντικών ρυθμιζόμενων πρωτεϊνών μετά από κατά μέσο όρο z-score χρησιμοποιώντας αποκοπής 95%.

Η

Η

Ιεραρχική ομαδοποίηση ανάλυση των δειγμάτων εκτελέστηκε για να εξετάσει συσχετίσεις των προτύπων πρωτεώματος μεταξύ των τριών κυτταρικών γραμμών. Το γράφημα Cluster ( «χάρτη θερμότητας») δείχνει ότι τα δείγματα του ίδιου συμπλέγματος κυτταρική σειρά μαζί (Σχήμα 3Ε). Μερικές των πρωτεϊνών ήταν χαρακτηριστική ανάμεσα στις τρεις κυτταρικές σειρές που βασίζονται σε σημαντικές αλλαγές στο μεταστατικό έναντι χαμηλής ποιότητας nonmuscle επεμβατική, ενώ άλλα των πρωτεϊνών ήταν μέτρια και συνεπής. Πρωτεΐνες στην πρώην ομάδα μπορεί να εμπλέκονται στην ανάπτυξη. Π.Χ.

Λειτουργική ταξινόμηση και την ανάλυση οδό εντοπίστηκαν πρωτεϊνών

Λειτουργική ερμηνεία είναι ένα κρίσιμο βήμα για την ανάλυση των δεδομένων, όταν εκτεταμένη λειτουργική σχολιασμό των συνόλων δεδομένων που είναι μη διαθέσιμος. Λαμβάνοντας υπόψη αποκλειστική εντόπιση τους στο GO, οι προσδιορίζονται πρωτεΐνες που συνδέονται με τουλάχιστον έναν όρο σχολιασμό κάθε εντός της μοριακής λειτουργίας GO, βιολογική διαδικασία, και τις κατηγορίες μοριακό συστατικό. Οι πιο συχνές μοριακές λειτουργίες είχαν δεσμευτικό (47,2%), και καταλυτική δραστικότητα (30,9%) (Σχ 4Α). Οι κύριες βιολογικές κατηγορίες διαδικασίας ήταν κυτταρικής (16,3%), και μόνο-οργανισμό (14,2%), και μεταβολικές (13,8%) (Εικόνα 4Β). Οι κύριες κατηγορίες κυτταρικό συστατικό ήταν κυττάρων (17,6%), μέρος των κυττάρων (17,6%), και οργανιδίων (15,8%) (σχήμα 4Γ).

πρωτεϊνών δείχνονται συνδέθηκαν με τουλάχιστον έναν όρο σχολιασμό εντός του μοριακού GO λειτουργία (A), βιολογική διαδικασία (Β), και κυτταρικό συστατικό (C) κατηγορίες.

η

Για να προσδιορίσετε τον εμπλουτισμό τους όρους που συνδέονται με τις ρυθμίζεται προς τα πάνω και προς τα κάτω ρυθμισμένη ομάδες των πρωτεϊνών μετά από κατά μέσο όρο των z-scores τη χρήση του 95 % αποκοπής, οι κατάλογοι των πρωτεϊνών ανεβάσει στο δικτυακό τόπο του DAVID χρησιμοποιώντας την πλήρη ανθρώπινη proteome ως φόντο. Για να βοηθήσει να διευκρινίσει ποια μοριακή λειτουργίες και βιολογικών διεργασιών επλήγησαν περισσότερο κατά τη διάρκεια π.Χ. ωρίμανσης, υπερεκπροσωπούνται όρους GO προσδιορίστηκαν με βάση την καταμέτρηση κατώφλι ≥ 2 και Ανάλυση έκφρασης Συστηματική Explorer (ΕΑΣΕ) & lt? 0.1. Οι υπερ-αντιπροσωπεύονται μοριακής λειτουργίες, βιολογικές διεργασίες, και κυτταρικά συστατικά σε σημαντικές εμπλουτισμένο όρους GO του ρυθμίζεται αυξητικά πρωτεΐνες αναλύθηκαν. Η πιο υψηλή θέση μοριακή λειτουργία ήταν ουδέτερη δραστηριότητα διαμεμβρανικό μεταφορέα αμινοξέων (2 πρωτείνες). Οι πιο υψηλή θέση βιολογικών διεργασιών ήταν κυτταρικό παράγωγο αμινοξέος μεταβολική διαδικασία (4 πρωτεϊνών), ριβονουκλεοπρωτεϊνικού συγκρότημα βιογένεση (4 πρωτεϊνών), απόκριση σε εξωκυτταρικό ερέθισμα (4 πρωτεΐνες), και η διαδικασία βιοσύνθεσης ένωση του αζώτου (4 πρωτεϊνών). Οι πιο υψηλή θέση κυτταρικά συστατικά ήταν ενδοκυτταρικό οργανίδιο μη-μεμβράνης-οριοθετούνται (14 πρωτεΐνες) και μη-μεμβράνης-οριοθετούνται οργανίδιο (14 πρωτεΐνες).

Στη συνέχεια, υπερεκπροσωπούνται μοριακής λειτουργίες, βιολογικές διεργασίες, και κυτταρικά συστατικά στα σημαντικά εμπλουτισμένη όρους GO των μειωτικά πρωτεΐνες αναλύθηκαν. Οι πιο υψηλή θέση μοριακό λειτουργίες ήταν ιόντων ασβεστίου δεσμευτική (16 πρωτεΐνες), δραστηριότητα δομικό μόριο (11 πρωτεΐνες), και όμοια σύνδεση με τις πρωτεΐνες (10 πρωτεΐνες). Οι πιο υψηλή θέση βιολογικών διεργασιών ήταν κυτταρικής προσκόλλησης (14 πρωτεΐνες), βιολογική πρόσφυση (14 πρωτεΐνες), απόκριση σε τραυματισμό (13 πρωτεΐνες), και η ανοσολογική απόκριση (13 πρωτεΐνες). Οι πιο υψηλή θέση κυτταρικά συστατικά ήταν πλασματική μεμβράνη (40 πρωτεΐνες), μέρος της μεμβράνης πλάσματος (30 πρωτεΐνες), και μη-μεμβράνη που οριοθετείται οργανίδιο (24 πρωτεΐνες) (S2 Πίνακας).

Οι πρωτεΐνες αναλύθηκαν περαιτέρω, και πρωτεΐνες μεταβολικές και κανονικών μονοπατιών και διασύνδεση παρήχθησαν, χρησιμοποιώντας Ingenuity Pathways Ανάλυση (IngenuityH Systems, www.ingenuity.com). Οι κορυφαίες λειτουργίες δικτύου που προσδιορίζονται ως αυξητικά πρωτεϊνών σε κύτταρα BC συμμετείχαν στην αντιγραφή του DNA, το μεταβολισμό αμινοξέων, μοριακό μεταφοράς (52 πρωτεΐνες? Σχήμα 5Α), η γονιδιακή έκφραση και κληρονομικές διαταραχές (33 πρωτεΐνες), κυτταρική ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό (20 πρωτεΐνες? Εικ 5Β), και μετα-μεταφραστική τροποποίηση και τον καρκίνο (4 πρωτεΐνες). Οι κορυφαίες λειτουργίες δικτύου που προσδιορίζονται ως μειωτικά πρωτεϊνών σε κύτταρα BC ήταν κυτταρική κίνηση και η κυκλοφορία του ανοσοποιητικού κυττάρου (97 πρωτεΐνες? Σχήμα 5C), του μεταβολισμού των λιπιδίων (31 πρωτεΐνες? Σχήμα 5D), κυτταρική ανάπτυξη, την ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό, και θάνατο των κυττάρων και την επιβίωση (6 πρωτεΐνες). Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι των πρωτεϊνών των κυττάρων BC συνεχώς μετατοπίζεται ανάλογα με το στάδιο του κυτταρικού μετάστασης.

(Α και Β) Κορυφή λειτουργιών δικτύου της αντιγραφής του DNA, μοριακή μεταφορά, την κυτταρική ανάπτυξη, και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων για ρυθμισμένη προς τα πάνω πρωτεΐνες. (Γ και Δ) λειτουργεί Κορυφή δίκτυο της κυτταρικής κίνησης, η κυκλοφορία του ανοσοποιητικού κυττάρου και του μεταβολισμού των λιπιδίων. Στερεά γραμμές: άμεση γνωστές αλληλεπιδράσεις. Διακεκομμένες γραμμές: υπόνοια ή έμμεσες αλληλεπιδράσεις. Λευκό: πρωτεΐνες είναι γνωστό ότι είναι στο δίκτυο, αλλά δεν προσδιορίζονται στη μελέτη μας

Η

Επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων MS με western αποτύπωση

Παραλλαγές των διαφορικών πρωτεϊνών που περιγράφονται παραπάνω επιβεβαιώθηκαν από western αποτύπωση. . Thy1, MAGEA4, IGF2BP1 και SFN ανιχνεύθηκαν σε υψηλότερα επίπεδα σε κύτταρα π.Χ. KK47 και YTS1 σε σχέση με τα φυσιολογικά κύτταρα HCV29 επιθηλιακά της ουροδόχου κύστης, ενώ VIM, CTNNB1, FN1 και CD70 ανιχνεύθηκε σε χαμηλότερα επίπεδα σε KK47 και YTS1 από ό, τι στο HCV29 (Σχ 6Β και 6C). Σε γενικές γραμμές, τα western αποτύπωση αποτελέσματα ήταν σύμφωνα με τις μεταβλητές από το MS ανάλυση (Σχήμα 6Α? S1 πίνακα και S1 σχήμα)

(Α) SILAC L:. Μ: Η μέση αναλογίες για έξι επιλεγμένες πρωτεΐνες. (Β) Κηλίδωση Western ανάλυση των επιλεγμένων πρωτεϊνών. Οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μια μεμβράνη PVDF, ανιχνεύθηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα τους, και επωάστηκαν με δευτερεύοντα αντισώματα αντι-κουνελιού συζευγμένο με HRP κουνελιού αντι-ποντικού ή κατσίκας. (Γ) Η πυκνομετρική ποσοτικοποίηση των επιπέδων πρωτεΐνης. Η πρωτεΐνη ομαλοποιήθηκε η tublin, και στη συνέχεια σε σύγκριση με HCV29, τα οποία αυθαίρετα ορίζεται σε 1,0. έκφραση (D) Gene για τις πρωτείνες αναλύθηκε με qRT-PCR. Σχετική έκφραση σε σύγκριση με τον έλεγχο των δειγμάτων αναλύθηκε με τη μέθοδο 2

-ΔΔCt και εκπροσωπήθηκαν ως Log

2. Έκφραση των γονιδίων παραπάνω Σύνδεση

2 (2) ή κάτω Σύνδεση

2 (1/2) ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω ή προς τα κάτω ρυθμισμένη, αντίστοιχα.

Η

Επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων SILAC από qRT-PCR

Η έκφραση των έξι ανταποκρίνεται γονιδίων στο μεταγραφικό επίπεδο αξιολογήθηκε με qRT-PCR. Π.Χ. KK47 και YTS1 κυττάρων, έκφραση του

MAGEA4

,

thy1

, και

IGF2BP1

αυξήθηκε σημαντικά, ενώ εκείνη του

VIM

,

CTNNB1

, και

FN1

μειώθηκε σημαντικά (Σχήμα 6D). Αυτά τα ευρήματα είναι συνεπή με τα αποτελέσματα SILAC.

Επιβεβαίωση SILAC και western αποτύπωση αποτελέσματα από χρώση των κυττάρων με αντισώματα

Τα αντισώματα που αναγνωρίζουν MAGEA4, thy1, IGF2BP1, VIM, CTNNB1 και FN1 πρωτεϊνών, των οποίων η έκφραση διέφερε σημαντικά π.Χ. κύτταρα εναντίον κυττάρων HCV29, χρησιμοποιήθηκαν για να επιβεβαιώσουν τα αποτελέσματα των προηγούμενων αναλύσεων και για την αξιολόγηση διανομές πρωτεΐνη. εντάσεις σήματος φθορισμού στις δύο κυτταρικές σειρές π.Χ. ήταν σημαντικά υψηλότερες για MAGEA4, thy1 και IGF2BP1 και σημαντικά χαμηλότερο για VIM, CTNNB1, και FN1, σε συμφωνία με SILAC, κηλίδωση Western, και τα αποτελέσματα RT-PCR. Προνομιακή εντοπισμός παρατηρήθηκε για MAGEA4 στην κεντρική κυτταρόπλασμα (συμπεριλαμβανομένων και των μιτοχονδρίων και κεντροσωμάτων) και το πυρηνικό περιοχή, για thy1 και VIM στην κυτταροπλασματική μεμβράνη και κυτόπλασμα, για IGF2BP1 στην πυρηνική περιοχή και κυτταρόπλασμα, και για CTNNB1 και FN1 στην κυτταροπλασματική μεμβράνη (Εικόνα 7 )

HCV29, κύτταρα KK47 και YTS1 καλλιεργήθηκαν και βάφονται με έξι αντισώματα που κατευθύνονται προς προσδιορίζονται πρωτεΐνες (MAGEA4, thy1, IGF2BP1, VIM, CTNNB1, FN1) επισημασμένο με Cy3 όπως περιγράφεται στο Μ & amp?. Μ. Οι εικόνες εμφανίζονται εικόνες συγχώνευση των Cy3 συζευγμένα με αντισώματα και DAPI χρώση των πυρήνων (αντικειμενική μεγέθυνση 60 ×). Ράβδοι κλίμακας: 70 μm

Η

Συζήτηση

ουροθηλιακά καρκίνωμα της ουροδόχου κύστης είναι η μοναδική μεταξύ των επιθηλιακών καρκινωμάτων σε αποκλίνουσες πορείες της ογκογένεσης.. Κατά τη στιγμή της διάγνωσης για τις μεταβατικές κυττάρων π.Χ., ~ 80% των ασθενών που βρίσκονται σε χαμηλού βαθμού (βαθμός 1-2) μη επεμβατικές μυών (CTA ή CT1) στάδιο. Σε ασθενείς με χαμηλής ποιότητας νόσο Ta, το 15-year επιβίωση χωρίς εξέλιξη είναι 95% χωρίς ειδική θνησιμότητα λόγω καρκίνου [36]. Ως εκ τούτου, οι βιοδείκτες που απαιτούνται για την πρόβλεψη κίνδυνο εξέλιξης στάδιο από μη επεμβατικές σε επεμβατικές ή μη μεταστατικό σε μεταστατική και την πρόβλεψη της ανταπόκρισης σε συστηματικές θεραπείες. Η HCV29 ανθρώπινες κυτταρικές σειρές (κανονικό επιθήλιο της ουροδόχου κύστης), KK47 (χαμηλής ποιότητας nonmuscle διηθητικός καρκίνος της ουροδόχου κύστης), και YTS1 (μεταστατικός καρκίνος ουροδόχου κύστης) έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως σε μελέτες μοριακών μηχανισμών και σηματοδότηση κυττάρων κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου της ουροδόχου κύστης σε μυς ή μεταστατικό μελών [37]. Ωστόσο, έχει δοθεί λίγη προσοχή στην παγκόσμια ποσοτική ανάλυση πρωτεώματος από αυτές τις τρεις κυτταρικές σειρές.

Η ποσοτική ανάλυση των πρωτεϊνών σε διάφορα στάδια της εξέλιξης π.Χ. είναι ένα δύσκολο αλλά σημαντικό έργο για την κατανόηση των μηχανισμών της νόσου. SILAC, μια στρατηγική επισήμανσης ισότοπο απόκλιση που περιλαμβάνει την επισήμανση του μεταβολισμού των πρωτεϊνών

in vivo

, έχει εφαρμοστεί ευρέως σε κυτταρική βιολογία και τις μελέτες των πρότυπων οργανισμών όπως οι ζυμομύκητες, βακτήρια, νηματώδη, τα φυτά και ποντικούς [38, 39 ]. Σε SILAC, οι φυσικές «φως» ισότοπα του άνθρακα, άζωτο, και υδρογόνο σε αμινοξέα που ενσωματώνονται κατά την μετάφραση πρωτεΐνης υποκατεστημένο με «βαριά» ισότοπα όπως

13C,

15Ν, και

2Η. Καμία μελέτη μέχρι σήμερα δεν έχει ποσοτικοποιηθεί διαφορές σε πρωτεΐνες αφθονία σε διάφορα στάδια της BC. Προηγούμενες μελέτες έχουν επικεντρωθεί σε συγκριτικά επίπεδα πρωτεΐνης σε ασθενείς π.Χ. vs. ομάδα ελέγχου, αλλά όχι σε μεταβολές των επιπέδων της πρωτεΐνης κατά τη διάρκεια της εξέλιξης BC [8,9].

Ταυτοποίηση και χαρακτηρισμός των επιπέδων της πρωτεΐνης σε διάφορα στάδια της διαφοροποίησης είναι απαραίτητα για την κατανόηση της φυσιολογικής ανάπτυξης ιστού και κακοήθη μετασχηματισμό. Στην παρούσα μελέτη, εφαρμόσαμε τη μέθοδο SILAC την ανάλυση των HCV29, KK47 και YTS1. Η στρατηγική αυτή παρέχονται πληροφορίες πρωτεΐνης και για τις τρεις κυτταρικές σειρές κατά τη διάρκεια ενός πειράματος MS. Μετά από κανονικοποίηση με την μέθοδο z-score, διαφορική ρύθμιση παρατηρήθηκε για 110 πρωτεΐνες σε KK47 εναντίον HCV29 και για 87 πρωτεϊνών σε YTS1 εναντίον HCV29. Αυτές διαφορικά ρυθμιζόμενες πρωτεΐνες, οι οποίες μπορεί να παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη π.Χ., περιλαμβάνουν SFN (14-3-3 πρωτεΐνη σίγμα), SELENBP1 (πρωτεΐνη σελήνιο δεσμεύσεως 1), COL6A3 (α3 κολλαγόνο (VI) αλυσίδα), και CD70.