Abstract

Ο υποδοχέας οιστρογόνου (ER) παραλλαγή β ERβ2 εκφράζεται σε επιθετική ευνουχισμός ανθεκτικά καρκίνο του προστάτη και έχει δειχθεί ότι συσχετίζεται με μειωμένη συνολική επιβίωση. ανάλυση της έκφρασης του γονιδιώματος σε επίπεδο μετά την έκφραση ERβ2 στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη αποκάλυψε ότι η υποξία ήταν υπερεκπροσωπούνται θέμα. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι ERβ2 αλληλεπιδρά με και σταθεροποιεί HIF-1α πρωτεΐνη σε νορμοξία, διεγείροντας έτσι μία υποξική υπογραφή γονιδιακής έκφρασης. HIF-1α είναι γνωστό ότι διεγείρει τη μετάσταση αυξάνοντας την έκφραση του Twist1 και την αύξηση αγγείωση με την άμεση ενεργοποίηση της έκφρασης του VEGF. Βρήκαμε ότι ERβ2 αλληλεπιδρά με HIF-1α και κεκαλυμμένα με το στοιχείο απόκρισης HIF-1α υπάρχουν επί των εγγύς Twist1 και VEGF προαγωγούς. . Αυτά τα ευρήματα δείχνουν ότι τουλάχιστον ένα μέρος των ογκογόνο επιδράσεις της ERβ2 διαμεσολαβείται από HIF-1α και ότι η στόχευση του παρόντος ERβ2 – αλληλεπίδραση HIF-1α μπορεί να είναι μία στρατηγική για τη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη

Citation: Dey Ρ, Velazquez-Villegas LA, Faria Μ, Turner Α, Jonsson P, Webb P, et al. (2015) Οιστρογονικών Υποδοχέων β2 επάγει υποξία Υπογραφή έκφρασης γονιδίου από Σταθεροποιητικό HIF-1α στον καρκίνο του προστάτη. PLoS ONE 10 (5): e0128239. doi: 10.1371 /journal.pone.0128239

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Σόνια Rocha, Πανεπιστήμιο του Dundee, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 26 του Νοέμβρη, 2014? Αποδεκτές: 23 Απρίλη, 2015? Δημοσιεύθηκε: May 26, 2015

Copyright: © 2015 Dey et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα αρχεία μικροσυστοιχιών είναι διαθέσιμα από την έκφραση γονιδίων Omnibus βάση δεδομένων του NCBI (αριθμός ένταξης GSE35095)

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή υποστηρίχθηκε από την πρόληψη του Καρκίνου & amp? Ερευνητικό Ινστιτούτο του Τέξας (CPRIT) χορηγεί HIRP100680 και RP110444, οι αναδυόμενες Ταμείο Τεχνολογία του Τέξας στο πλαίσιο της συμφωνίας δεν. 300-9-1958, ο Robert A. Ίδρυμα Welch (Grant Ε-0004), οι δράσεις της Σουηδίας Ταμείου Καρκίνου και Marie Curie FP7-PEOPLE-2011-COFUND (GROWTH 291795), μέσω της κινητικότητας του προγράμματος VINNOVA για την ανάπτυξη (σε C.W.). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικές ενδιαφέρον

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του προστάτη είναι μια αργά εξελισσόμενη νόσος, αρχικά θεραπεύσιμη με ανδρογόνων θεραπεία στέρησης (ADT) [1], αλλά συνήθως επαναλαμβανόμενες σε μια πιο επιθετική μορφή η οποία είναι ανδρογονο ανεξάρτητος [2, 3]. Πιο επιθετικές καρκίνων του προστάτη εκφράζουν υψηλά επίπεδα του υποδοχέα ανδρογόνου (AR) και, επιπλέον, χρησιμοποιούν διάφορους μηχανισμούς για την ενεργοποίηση AR απουσία συνδέτη της. Για παράδειγμα, ο καρκίνος μπορεί να αποκτήσει την ικανότητα να συνθέτουν συνδετήρες AR, φωσφορυλιώνουν AR ή μέσω εναλλακτικού ματίσματος, δημιουργούν ένα ουσιαστικά δραστική AR [4]. Σε αντίθεση, η έκφραση του κύριου ισομορφής του β υποδοχέα οιστρογόνου (ΕΚβ /eSR2), ERβ1, μειώνεται κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη [5-8]. ERβ1 έχει δειχθεί ότι ρυθμίζουν προς τα κάτω την έκφραση του AR, έτσι την εξάντληση του ERβ1, η έκφραση του AR αυξάνεται σημαντικά [9]. Επιπλέον, ERβ1 έχει πρόσφατα δειχθεί ότι διεγείρει απόπτωση σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου του προστάτη με την ενεργοποίηση της οδού FOXO3a /PUMA [10]. ERβ1 έχει επίσης δειχθεί ότι αναστέλλει επιθηλιακά-to-μεσεγχυματικά μετάβασης (ΕΜΤ) με προς τα πάνω ρύθμιση προλυλ υδροξυλάσης τομέα 2 (PHD2 /EGLN1) και εν συνεχεία μειώνονται τα επίπεδα υποξία διεγέρσιμο 1α παράγοντας (HIF-1α /HIF1A) [11, 12]. Αντιθέτως, ΕΡβ παραλλαγή ματίσματος ERβ2 [13] εκφράζεται σε προχωρημένο στάδιο μεταστατικό καρκίνο του προστάτη και την έκφραση της πυρηνικής ERβ2 συσχετίζεται με μειωμένη συνολική επιβίωση [14]. ERβ2 περιέχει έναν τομέα κολοβωμένη δέσμευσης συνδέτη (LBD) και μία μοναδική αλληλουχία C-τερματικού αμινοξέος που κωδικοποιείται από ένα μοναδικό εναλλακτικό ERβ2-ειδικό εξόνιο ονομάζεται CX [13]. Αυτή η ισομορφή ΕΡβ δεν έχει την ικανότητα να συνδέει συνδετήρα, homodimerize και ενεργοποιούν μονοπάτια έκφραση κανονικών γονιδίων ERβ1, αλλά μπορεί να ετεροδιμερίζεται με ΕΚα αναστέλλοντας έτσι δραστηριότητα ΕΚα [13]. Πυρηνική ERβ2 αυξάνει διηθητικότητα των κυττάρων PC3 [14] και αυξήσεις κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την έκφραση του Twist1 (TWIST1) και c-Myc (MYC) τόσο PC3 και κυττάρων 22Rv1, υποδεικνύοντας πιθανές ογκογονικές ρόλους των ERβ2 στον καρκίνο του προστάτη [15].

Ένας όγκος πολλαπλασιαζόμενα εκτίθεται συχνά σε υποξικές συνθήκες, λόγω της υψηλότερης μεταβολικές ανάγκες και η έλλειψη των νεο-αγγείωση του να συμβαδίσει με τις απαιτήσεις της. Η υποξία προωθεί νευρο-ενδοκρινείς διαφοροποίηση του όγκου του προστάτη, η οποία αυξάνει την επιθετικότητα του [16]. Ο παράγοντας μεταγραφής HIF-1α είναι ένας κεντρικός παράγοντας στην απόκριση των κυττάρων στην υποξία. Σε κύτταρα με κανονικά επίπεδα οξυγόνου, ο HIF-1α υδροξυλιώνεται από προλυλ υδροξυλάσης, ένα ένζυμο που χρησιμοποιεί το οξυγόνο ως συμπαράγοντα και είναι ενεργή μόνο υπό ορθοξικές όρο [17]. Προλυλο υδροξυλίωση προκαλεί HIF-1α για να αλληλεπιδράσει με τον παράγοντα Von Hippel Lindau (VHL), οδηγώντας σε ουβικιτινίωση και την υποβάθμιση του HIF-1α από το σύμπλοκο πρωτεασώματος [18-21]. Πρόσφατα, αρκετές μελέτες έχουν βρει ότι πρωτεΐνη HIF-1α μπορεί να σταθεροποιηθεί χωρίς μια μείωση στην τάση οξυγόνου από παράγοντες παρεμβαίνουν με την αποδόμηση του HIF-1α οξυγόνου που εξαρτάται από [22-24]. Μετά τη σταθεροποίηση, ο HIF-1α μετατοπίζεται στον πυρήνα και ενεργοποιεί μεταγραφή γονιδίων που εμπλέκονται στην αγγειογένεση. Σε καρκίνους, HIF-1α αλλάζει την έκφραση των γονιδίων που οδηγεί σε αυξημένο μεταβολισμό και μετάσταση όγκου, δημιουργώντας ένα πολύ επιθετικό όγκο. Για παράδειγμα, ο HIF-1α-εξαρτώμενη ρύθμιση της έκφρασης Twist1 είναι ένα βασικό βήμα στη μετάσταση [25]. Από ERβ2 έχει μια προτεινόμενη ογκογόνο ρόλο στον καρκίνο του προστάτη, και την παραλλαγή ματίσματος του ERβ1 είναι ένα ογκοκατασταλτικό γνωστό ότι αναστέλλει την HIF-1α, εμείς εδώ διερευνήσαμε εάν ERβ2 μπορεί να αυξήσει HIF-1α σταθεροποίησης, και αν αυτό το μηχανισμό αποτελεί τη βάση της συσχέτισης των δύο παραγόντων με επιθετική, μετάσταση, καρκίνος του προστάτη.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια και κυτταρική καλλιέργεια

Οι κυτταρικές σειρές PC3 22Rv1 και λήφθηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC). 22Rv1 κύτταρα διατηρήθηκαν σε RPMI-1640 (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) (Sigma, St. Louis, ΜΟ), 25 mM HEPES ρυθμιστικό διάλυμα και 2 mM Ε-γλουταμίνη (Invitrogen Carlsbad, CA), ενώ τα κύτταρα PC3 διατηρήθηκαν σε RPMI-1640 (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA) μέσο συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS) (Sigma, St. Louis, ΜΟ). Όλα τα πειράματα χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα κάτω από το πέρασμα 30.

HIG2 έχουν λουσιφεράσης πλασμιδίου έχει περιγραφεί προηγουμένως [26], ρΧΡ2-Twist1-LUC και ρΧΡ2-mTwist1-LUC έχουν περιγραφεί [25].

Κατασκευή ενός επαγόμενου συστήματος ERβ2 και βιοτίνη λιγκάσης κύτταρα που εκφράζουν PC3 (PC3 ΒϊγΑ)

ένα σύστημα βασιζόμενο σε τρανσποζόνιο που μεσολαβούν δοξυκυκλίνη-ρυθμισμένη έκφραση του ERβ2 χρησιμοποιήθηκε για σταθερή διαμόλυνση 22Rv1 και PC3 κυττάρων καρκίνου του προστάτη. Αυτές οι κυτταρικές γραμμές που περιγράφονται αλλού [15]. Για την κατασκευή των κυττάρων PC3 που εκφράζουν βιοτίνη λιγκάσης, τα κύτταρα PC3 διαμολύνθηκαν με πλασμίδιο που εκφράζει pBirA

Escherichia coli

βιοτίνη ολοενζύμου συνθετάσης (ΒϊγΑ) από τον υποκινητή ακτίνης και επιλεγμένα με G418 στα 500 μg /ml. Μετά από δύο εβδομάδες κλώνοι απομονώθηκαν και προσδιορίστηκαν για δραστικότητα βιοτινυλίωση.

παρασκευή εκχυλίσματος πρωτεΐνης

Για την παρασκευή εκχυλισμάτων ολικού κυττάρου, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS, λύθηκαν σε 10 φορές συμπιεσμένου όγκου κυττάρων λύσης ρυθμιστικού [0,1% Nonidet Ρ-40, 250 mM ΚΟΙ, 5 mM Hepes, ρΗ 7,9, 10% (ο /ο) γλυκερόλη, 4 mM NaF, 4 mM ορθοβαναδικό νάτριο, 0,2 mM EDTA, 0,2 mM EGTA, 1 mM διθειοθρεϊτόλη, 1 mM φαινυλομεθυλοσουλφονυλοφθορίδιο, αναστολέα πρωτεάσης κοκτέιλ, PhosStop (Roche, Indianapolis, ΙΝ)] επί 15 λεπτά σε πάγο και στη συνέχεια φυγοκεντρείται στα 14.000 χ

g

για 10 λεπτά.

κηλίδωση Western

Είκοσι μικρογραμμάρια πρωτεΐνης φορτώθηκαν σε ένα SDS-PAGE 10% Bis-Tris γέλης με Tris ρυθμιστικό τρέξιμο και μεταφέρθηκαν σε μια μεμβράνη νιτροκυτταρίνης μετά ηλεκτροφορητικό διαχωρισμό. Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% άπαχο γάλα σε σκόνη σε 0.1% ρυθμιστικό TBST και ανιχνεύτηκαν με αντι-ERβ2 (που παράγεται στο εργαστήριο), Twist1 (sc-15393), και HIF-1α (sc-10790) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). Πρωτογενή αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν σε 1: 200-1000 αραιώσεις, και δευτερεύον αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε σε αραίωση 1:. 10000

εκχύλιση RNA και PCR πραγματικού χρόνου

εκχύλιση RNA πραγματοποιήθηκε με κιτ εκχύλισης Qiagen mRNA σύμφωνα με το πρότυπο πρωτόκολλο. cDNA συντέθηκε από 1 μα συνολικού RNA με πρώτο σύστημα Strand σύμφωνα με το πρότυπο πρωτόκολλο (Invitrogen Inc. ΝΥ). Real-time PCR πραγματοποιήθηκε με SYBR Green Ι βάψει κύριο μείγμα (Applied Biosystems Foster City, CA). Αστάρια (Integrated DNA Technologies, Inc. Coralville, ΙΑ) ήταν: 18s rRNA προς τα εμπρός (F), 5′-CCT GCG GCT ΤΑΑ ΤΤΤ GAC TCA-3 ‘και όπισθεν (R), 5′-AGC ΤΑΤ CAA TCT GTC ΑΑΤ ΚΔ GTC C-3? αφυδρογονάση 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης F, 5’-TGA CAA CTT TGG ΤΑΤ TGG AAG YCG G-3 ‘και R, 5′-ΑΟΟ CAG GGA TGA TGT TCT GGA GAG-3′ (γονίδια αναφοράς)? ERβ2 F, 5-ACT TGC TGA ACG CCG TGA CC-3 και R, 5’-CCA TCG TTG CTT CAG GCA Α-3 ‘? Twist1 F, 5’-GGA GTC ΚΕΔ AGT CTT ACG AG-3 ‘και R, 5′-TCT GGA GGA ΚΔ GGT AGA GG-3’. qPCR αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν με 7500 Fast PCR Πραγματικού χρόνου System (Applied Biosystems) χρησιμοποιώντας βελτιστοποιημένες συνθήκες για SYBR Green Ι βάψει συστήματος: 50 Ο για 2 λεπτά, 95 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 40-50 κύκλους στους 95 C για 15 δευτερόλεπτα και 60 ° C για 50 δευτερόλεπτα. Βέλτιστη συγκέντρωση εκκινητή προσδιορίστηκε σε προκαταρκτικά πειράματα, και η ειδικότητα της ενίσχυσης επιβεβαιώθηκε με ανάλυση καμπύλης διαχωρισμού.

Η in vitro μετάφραση και βακτηριακή έκφραση

HIF-1α και ERβ2 μεταφράστηκαν χρησιμοποιώντας το ΤΝΤ Quick συνδυασμό Μεταγραφή /Μετάφραση Systems (Promega Madison, WI). Εν συντομία, 0.2 μg του HIF-1α ή φορείς έκφρασης ERβ2 (υποκινητής Τ7) προστέθηκαν σε ένα κλάσμα του ΤΝΤ Quick κύριο μίγμα και επωάζονται σε έναν όγκο 50 μΐ για 60 λεπτά στους 30 ° C. Η in vitro σύνθεση πρωτεΐνης επαληθεύθηκε με SDS-PAGE. Για βακτηριακή έκφραση BL21-DE3 βακτηριακά κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για να εκφράσουν His-LBD-ΕΚα, His-LBD-ERβ1, His-LBD-ERβ2 και His-LBD-ERβ2ΔCX πλασμίδια έκφρασης.

Τραβήξτε κάτω από PC3 ή ΗΕΚ293 κύτταρα

PC3 κύτταρα επιμολύνθηκαν με 3 μg ΒϊγΑ (λιγκάση βιοτίνης) πλασμίδιο έκφρασης, 3 μg πλασμιδίου που περιέχει βιοτινυλίωση συναίνεση tagged υποδοχείς B7TEV-ΕΚα, B7TEV-ERβ1, B7TEV-ERβ2 και B7TEV-ERβ5 μαζί με 3 μg pcDNA3 HA-HIF-1α «Addgene πλασμίδιο 18949» ή pcDNA3 ΗΑ-HIF-1α P405 /A-P564 /A «Addgene πλασμίδιο 18955» ή pcDNA3 ΗΑ-HIF-1α Δ401-603 (pcDNA3 HA-HIF-1αΔODD) περιγράφεται από τον Kondo

et al

και Γιαν

et al

. [27, 28] σε 100 mm πλάκα καλλιέργειας ιστού. Για κύτταρα ΗΕΚ293 η βιοτίνη λιγκάσης παροδικά επιμολυσμένα. Μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα αποξέστηκαν, σφαιροποιήθηκαν και λύθηκαν σε 300 μΙ ΝΕΤΝ (20 mM Tris (ρΗ = 8,0), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% Nonidet Ρ-40), εν συντομία σε υπερήχους και φυγοκεντρήθηκαν για να απομακρυνθούν τα θραύσματα. 10μl στρεπταβιδίνη μαγνητικά σφαιρίδια (Pierce Rockford, IL) πλύθηκαν σε ΝΕΤΝ και επωάστηκαν με 300 μΙ κυτταρικού εκχυλίσματος για 2 ώρες στο ψυχρό δωμάτιο. Σφαιρίδια πλύθηκαν (περιστροφή 3 χ 10 λεπτά) με 300 μλ ΝΕΤΝ και έβρασε με 20 μΙ 2 χ ρυθμιστικού διαλύματος δείγματος [125 mM Tris HCl (ρΗ 6,8), με 4% SDS, 20% (ο /ο) γλυκερόλη, και 0,004 % κυανούν βρωμοφαινόλης] και υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης για στύπωμα Western. Το στύπωμα ανιχνεύθηκε με HIF-1α αντίσωμα (Santa Cruz Dallas, ΤΧ) αραίωση 1: 1000 και δευτερογενές αντίσωμα 1:. 10000 αραίωση

In-vitro κατεβάζει pull

2μΙ

σε vitro

μεταφραστεί HIF-1α πρωτεΐνη επωάστηκε με 25 μΐ βακτηριακού προϊόντος λύσης που περιέχει His-ERβ2 (LBD) όλη τη νύχτα, και συμπλέγματα προσροφήθηκαν πάνω σε σφαιρίδια αγαρόζης νικελίου για 2 ώρες. Τα σφαιρίδια πλύθηκαν τρεις φορές με παγωμένο ΝΕΤΝ (20 mM Tris (ρΗ = 8,0), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% Nonidet Ρ-40). Συγκροτήματα έβρασαν με 20 μΙ 2 χ ρυθμιστικού διαλύματος δείγματος, υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης για Western αναλύσεις. Το στύπωμα ανιχνεύθηκε με αντίσωμα αντι-HIF-1α (Santa Cruz). Πρωτογενή αντισώματα ήταν σε αραίωση 1: 1000, και δευτερεύον αντίσωμα σε 1:. 10000

θηλαστικών 2 υβρίδιο δοκιμασία

ERβ2 κλωνοποιήθηκε στο GAL4DBD εκφράζει πλασμίδιο ΡΜ2 εντός πλαισίου με την περιοχή GAL4DBD χρησιμοποιώντας BamHI και θέσεων περιορισμού HindIII κάνει PM2-ERβ2. Το πλασμίδιο pVP16 (Clontech) χρησιμοποιήθηκε για την κλωνοποίηση της Ν-τερματικής HIF-1α (αμινοξέα 1-401), τον τομέα αποσταθεροποίηση οξυγόνο (αμινοξέα 401 έως 603) και το Ο-τερματικό πεδίο (αμινοξέα 603-826) εντός πλαισίου με το πεδίο ενεργοποίησης νΡ16 χρησιμοποιώντας θέσεις περιορισμού BamHI και PstI. Για δοκιμασίες αλληλεπίδρασης σε κύτταρα PC3 ο Gal4 αποκρίνεται ρεπόρτερ FR-LUC 300 ng, ΡΜ2-ERβ2 500 ng και VP16 συντήκονται HIF-1α domains 200 ng επιμολύνθηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ΡΕΙ επιμόλυνσης όπως περιγράφεται από τους Longo et al. [29]

μικροσυστοιχιών και βιοπληροφορικής αναλύει

Η δίχρωμη συγκριτική ανάλυση μικροσυστοιχιών καλύπτει πλήρως γνωστή μεταγραφικό πρωτεΐνη-κωδικοποίησης των 39.600 μεταγραφές και οι παραλλαγές χρησιμοποιώντας συστοιχίες Ανθρωπίνων OpArray αγοράζονται από μικροσυστοιχίες Inc. ( Huntsville, AL). Η διάταξη αυτή συμπληρώθηκε με 133 ολιγονουκλεοτίδια ειδικά συντίθενται για λεπτομερή και εμπεριστατωμένη ανάλυση των πυρηνικών υποδοχέων, παραλλαγές ματίσματος, και coregulators. Η ανάλυση μικροσυστοιχιών εκτελέστηκε ουσιαστικά όπως στο Richter

κ.ά.

. [30]. Για κάθε σύνθεση cDNA, 20 μg ολικού RNA χρησιμοποιήθηκαν, και κάθε σύγκριση επαναλήφθηκε και βαφής εναλλάσσεται. Bioinformatic αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση GenePix, R, και το λογισμικό Pathway Studio (Elsevier, Philadelphia, ΡΑ). Διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια ορίστηκαν χρησιμοποιώντας μια ρ-τιμή αποκοπής του ρ = 0.005 σε συνδυασμό με ένα Μ-τιμή (log2 του πολλαπλής μεταβολής) αποκοπής του +/- 0,3. Εμπλουτισμός ανάλυση της γονιδιακής οντολογίας (GO) των βιολογικών διεργασιών έγινε με την ακριβή δοκιμασία του Fisher χρησιμοποιώντας γονιδιακή σύνολα του λογισμικού. εικόνες μονοπάτι σχεδιάστηκαν στην οδό Studio. δεδομένων των μικροσυστοιχιών είναι διαθέσιμα στη γονιδιακή έκφραση Omnibus NCBI του υπό τον αριθμό ένταξης GSE35095.

χρωματίνης Ανοσοκαθίζηση (chip) θα

Υπο-συρροή PC3 και τα κύτταρα 22Rv1 (90%) αναπτύχθηκαν σε ένα πιάτο τα 150 mm και πλύθηκε δύο φορές με ψυχρό PBS και στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν σε PFA (1%) για 10 λεπτά. Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με ψυχρό PBS αναστολέα πρωτεάσης +, ξύνεται με 150 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος επαναιώρησης και φυγοκεντρήθηκε (4000 rpm, 10 λεπτά). Τα ιζήματα επαναιωρήθηκαν σε 750 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος λύσης ChIP (HEPES 50 mM, NaCl 140 mM, Triton 1%, αναστολέας πρωτεάσης) και τα κύτταρα διατηρήθηκαν επί πάγου επί 30 λεπτά. Τα προϊόντα λύσης κυττάρου υποβλήθηκαν σε υπερήχους (60 παλμοί για 30 δευτερόλεπτα το καθένα) κατά 30 δευτερόλεπτα διάλειμμα στους 4 ° C. Μετά κατεργασία με υπερήχους, τα δείγματα 25 μΙ συλλέχθηκαν και αποθηκεύτηκαν στους -20 ° C (είσοδος). Το υπόλοιπο του 125 μλ κλάσμα κυτταρολύματος χρησιμοποιήθηκε για τα ακόλουθα βήματα. Τα δείγματα προ-απορροφήθηκε σε 20 μΐ συζευγμένο με G πρωτείνη FLAG ετικέτα μαγνητικά σφαιρίδια στους 4 ° C για 2 ώρες και το υπερκείμενο συλλέχθηκε. Τα δείγματα στη συνέχεια διαιρούνται σε δύο κλάσματα και τα αντισώματα έναντι FLAG (2,5 μg) ή IgGs (2,5 μg) προστέθηκαν και επωάστηκαν όλη τη νύκτα. Την επόμενη ημέρα, τα σφαιρίδια πλύθηκαν τρεις φορές με ρυθμιστικό ChIP λύσης, μία φορά με πλύση ChIP ρυθμιστικό υψηλού άλατος (HEPES 50 mM, NaCl 500 mM, Triton 1%), και τέλος μία φορά με ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης πλινθίου (Τρις 10 mM, LiCl 250 mM, ΝΡ40 0.5%, EDTA 0,1 mM). Τα σφαιρίδια επαναιωρήθηκαν σε 40 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος έκλουσης (Τρις 50 mM, SDS 1%, ΕϋΤΑ 10 mM) και επωάστηκε στους 65 ° C όλη τη νύχτα με μια μικρή οπή στο καπάκι. Η είσοδος συλλέχθηκε προηγουμένως τοποθετήθηκε επίσης στους 65 ° C. Την επόμενη ημέρα, τα δείγματα καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας κιτ καθαρισμού PCR (Qiagen) και χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση qPCR χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους εκκινητές. pHRE-Twist1 προαγωγό (Ρ) 5′-CGGGGGAGGGGGACTGGAAAGC-3 ‘? (R) 5’-AGGCCTCCTGGAAACGGTGCCG-3 ‘, VEGF υποκινητή: (F) 5′-ACAGACGTTCCTTAGTGCTGG-3′? (R) 5’-AGCTGAGAACGGGAAGCTGTG-3 ‘.

Στατιστικά

Οι τιμές εκφράζονται ως μέση τιμή με διαστήματα εμπιστοσύνης 95%. Μια δίπλευρη αταίριαστο

t-test

χρησιμοποιήθηκε για να συγκρίνει τις διαφορές μεταξύ των δύο ομάδων. Η σημασία παρουσιάζεται ως *

σ

& lt? 0,05, **

σ

& lt? 0.005, και ***

σ

& lt? 0.001, και μη σημαντικές διαφορές παρουσιάζονται ως NS.

Αποτελέσματα

μικροσυστοιχιών και βιοπληροφορική ανάλυση των κυττάρων του καρκίνου του προστάτη που εκφράζουν ERβ2 δείχνουν αυξημένη έκφραση των γονιδίων που εμπλέκονται στην υποξική απόκριση

Έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι ERβ2 αυξημένη έκφραση του ΕΜΤ-συνδέονται γονιδίων Twist1 και Slug (SNAI2) σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη [15]. Εδώ, πραγματοποιήσαμε μια transcriptomic μελέτη για να διερευνήσει τις επιπτώσεις της ERβ2 κατά τρόπο αμερόληπτο. Συγκρίναμε τα κύτταρα PC3 που εκφράζουν σταθερά ERβ2 με τα κύτταρα ελέγχου, και βρέθηκε 585 γονίδια που πρέπει να αλλάξει σημαντικά τη χρήση που ορίζεται μας cut-off. Είναι ενδιαφέρον, TGFB2, το οποίο είναι γνωστό ότι διεγείρονται από HIF-1α, ήταν μεταξύ των πιο υψηλώς ρυθμισμένη προς τα πάνω γονίδια (σχεδόν 9 φορές, σύμφωνα με μικροσυστοιχία). Αναλύοντας τον εμπλουτισμό των κατηγοριών γονιδίων οντολογίας μεταξύ των ρυθμιζόμενων γονιδίων, «

απάντηση στην υποξία

» ήταν το δεύτερο πιο υπερεκπροσωπούνται λειτουργία (p = 8.0e-6), το δεύτερο μόνο για να «γονιδιακή έκφραση» (Πίνακας 1). Η «

απόκρισης στην υποξία

« ομάδα περιλάμβανε 17 σημαντικά ρυθμιζόμενα γονίδια (TGFB2, EGLN1 (PHD2), EGLN3 (PHD3), Smad3, HSD11B2, CAT, CCL2, CDKN1B, ΜΜΡ13, PLOD2, IL1B, Plau, SCNN1G , CRYAB, IL18, ITPR1, SOD2, ADM). Επιπλέον, το εμπλουτισμένο υπο-δίκτυο, που ορίζεται ως τα γονίδια που είναι στόχος έκφραση του αντίστοιχου κόμβου, «γείτονες του HIF-1α» ήταν η πιο υπεραντιπροσωπεύονται μία (p = 1.5e-09) με 41 ρυθμιζόμενες μέλη (Πίνακας 2). Περαιτέρω, πολλές ERβ2 επαγόμενη γονίδια βρέθηκαν να εμπλέκονται σε αγγειογένεση (Πίνακας 2), το οποίο ήταν επίσης ένα θέμα υπεραντιπροσωπεύονται (ρ & lt? 0,05). Από αυτά τα γονίδια, SOD2, SCNN1G, CD24, HIG2, IGF2 και ΤΟΡ-β2 είναι όλα διεγείρονται από HIF-1α [26]. Επίσης, «

διαδικασία του μεταβολισμού της γλυκόζης»

οποίων HIF-1α είναι γνωστό ότι ρυθμίζει, υπερεκπροσωπήθηκε (p & lt? 0.007), συμπεριλαμβανομένων των 9 γονιδίων (PFKP, ΑΚΤ1, IGF2, GOT2, PGM5, CRYAB, GBE1, UGP2, FABP5). Έτσι, η ανάλυση μικροσυστοιχιών αναφέρεται σαφώς η υποξία και η λειτουργία του HIF-1α ως μείζονα θέματα της λειτουργίας ERβ2 (Δείτε S1 σχήμα για επικυρωμένες γονίδια).

Η

Για την επικύρωση των στοιχείων αυτών, αναλύσαμε την έκφραση της HIF-1α σε PC3 και ένα άλλο προστάτη καρκινική κυτταρική γραμμή-22Rv1, οι οποίες είναι και οι δύο υπερεκφράζουν ERβ2. Παρατηρήσαμε μια αύξηση σε επίπεδο πρωτεΐνης HIF-1α σε ERβ2 εκφράζουν έναντι κύτταρα ελέγχου, αλλά καμία αλλαγή σε αντίστοιχο επίπεδο mRNA (Σχήμα 1Α-1ϋ). Αυτό συμφωνεί με τα αποτελέσματα microarray μας, η οποία δεν ανιχνεύουν μεταβολή των επιπέδων μεταγραφής HIF-1α, αλλά έδειξε μια αλλαγή σε HIF-1α λειτουργίες (με βάση την εμπλουτισμένο οδών). Περαιτέρω, ERβ2-εξαρτώμενη αύξηση σε HIF-1α επίπεδα πρωτεΐνης επιβεβαιώθηκε να συνοδεύεται από ERβ2 εξαρτώμενη αύξηση στη δραστικότητα HIF-1α. Η δραστικότητα λουσιφεράσης του ρεπόρτερ οδηγείται από τον HIF-1α-εξαρτώμενη υποξία επαγώγιμο γονίδιο 2 (HIG2 /HILPDA) προαγωγό (HIG2-Α-Luc) [26] αυξήθηκε με την παρουσία των επιμολυσμένων φορέα έκφρασης ERβ2 (Σχήμα 2Α-2C). Σε προηγούμενη μελέτη, δείξαμε ότι ERβ2 κύτταρα που εκφράζουν PC3 έχουν αυξημένο επίπεδο Twist1 [15]. Εδώ, δείχνουμε ότι ERβ2 αυξήθηκε επίσης δραστικότητα μιας λουσιφεράσης που κινείται από τον HIF-1α-εξαρτώμενη Twist1 προαγωγού σε LNCaP κυττάρων καρκίνου του προστάτη και ότι το αποτέλεσμα αυτό εξαρτιόταν από την στοιχείο απόκρισης HIF-1α (Σχήμα 3Α-3C). Αυτό αποδεικνύει ότι η δράση του HIF-1α σε γενικές γραμμές είναι αυξημένη στα κύτταρα του προστάτη που εκφράζουν ERβ2.

Α. Western blot των εκχυλισμάτων από τον έλεγχο και των δύο διαφορετικών κλώνων 22Rv1 και PC3 εκφράζουν ERβ2 προσδιορίστηκαν με HIF-1α αντίσωμα. B. έκφραση Σχετική mRNA του ERβ2 και HIF-1α στα ERβ2clones της κυτταρικής γραμμής 22Rv1. Το γράφημα δείχνει τα δεδομένα ως αλλαγή φορές σε σύγκριση με τον έλεγχο (μέση τιμή των τριών ξεχωριστών πειραμάτων (± s.e.m.) Υπολογίζεται με τη χρήση

t-test

, * p≤0.016 του Student). C. Σχετική mRNA έκφραση του HIF-1α στο ERβ2 # 2 κλώνο της κυτταρικής γραμμής 22Rv1. Το γράφημα δείχνει τα δεδομένα ως φορές μεταβολής σε σύγκριση με τον έλεγχο (μέση τιμή των τριών ξεχωριστών πειραμάτων (± SEM) υπολογίζεται χρησιμοποιώντας

t-test

, ** p≤0.006 του Student).

Η

Α. Σχηματική σκιαγράφηση της κατασκευής HIG2 υποκινητή όπου (Χ) αντιπροσωπεύει αλληλουχία στοιχείων απόκρισης HIF-1α (HRE). Β αυξανόμενη ποσότητα παροδικής επιμολυσμένα πλασμιδίου έκφρασης ERβ2 σε κύτταρα PC3 διαδοχικά ενεργοποιεί τον παροδικά επιμολυσμένα υποκινητή HIG2 όπως φαίνεται από λουσιφεράσης δοκιμασία HIG2-Α-LUC. Το γράφημα δείχνει τα δεδομένα ως αύξηση στην φωταύγεια των κυττάρων επιμολυσμένα με αυξημένη συγκέντρωση ERβ2 (μέσος όρος τριών ξεχωριστών πειραμάτων (± s.e.m.) Υπολογίζεται με τη χρήση

t-test

, *** p≤0.0002 του Student). Σύγκριση των συγκεντρώσεων-0μg έως 1000 μg. C. Η προσθήκη του πλασμιδίου έκφρασης για HIF-1α ενεργοποιεί προαγωγέα HIG2 σε PC3 κυτταρικές σειρές. Το γράφημα δείχνει τα δεδομένα ως αύξηση φωταύγεια των κυττάρων που επιμολύνθηκαν με HIF-1α (μέση τιμή τριών χωριστών πειραμάτων (± SEM) υπολογίζεται χρησιμοποιώντας του Student

t-test

, **** p≤0.0001).

Α. Περιγραφή των κατασκευασμάτων υποκινητή Twist1 χρησιμοποιείται. κύτταρα Β LNCaP επιμολυσμένα με ανταποκριτή Twist1-υποκινητή-λουσιφεράση και αυξανόμενη συγκέντρωση πλασμιδίου έκφρασης ERβ2. Το γράφημα δείχνει τα δεδομένα ως αύξηση φωτοβολία του κύτταρα επιμολυσμένα με αυξημένη συγκέντρωση ERβ2 (μέση τιμή τριών χωριστών πειραμάτων (± s.e.m.) Υπολογίζεται με τη χρήση

t-test

, ** p≤0.0034 Student). C. Επιμόλυνση Twist1-υποκινητή-λουσιφεράσης ανταποκριτής με (Twist) ή μεταλλαγμένου στοιχείου (mTwist) απόκριση HIF-1α σε συνδυασμό με πλασμίδια έκφρασης για HIF-1α ή ERβ2 σε κύτταρα LNCaP. Το γράφημα δείχνει τα δεδομένα ως αύξηση στην φωταύγεια των κυττάρων επιμολυσμένα με αυξημένη συγκέντρωση ERβ2 (μέσος όρος τριών ξεχωριστών πειραμάτων (± SEM) υπολογίζεται χρησιμοποιώντας

t-test

, **** p≤0.0001 μαθητή, # ## p≤0.002).

η

ERβ2 αλληλεπιδρά άμεσα με τον HIF-1α προκαλώντας

σταθεροποίηση

από ERβ2 αυξάνει την έκφραση του HIF-1α πρωτεΐνη, αλλά δεν mRNA, που πιθανολογείται ότι HIF-1α σταθεροποίηση λαμβάνει χώρα μέσω αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-πρωτεΐνης μεταξύ ERβ2 και HIF-1α. Για να ελέγξει την υπόθεση αυτή, δώσαμε βακτηριακά εξέφρασε LBDs της Ετα, ΕΚβ και ERβ2 σε ένα στερεό υπόστρωμα και προσδιορίζεται αλληλεπιδράσεις με

in vitro

μεταφραστεί HIF-1α. HIF-1α έντονα συνδεδεμένο με ERβ2, αλλά όχι σε ισοδύναμες ποσότητες άγριου τύπου Ετα ή Ετβ LBDs. Αυτή η αλληλεπίδραση ήταν ανεξάρτητη ειδικών αλληλουχιών ERβ2 επειδή κολόβωση των αμινοξέων που κωδικοποιούνται από το ERβ2-ειδικό εξόνιο δεν εξάλειψε δέσμευσης (ERβ2ΔCX) (Σχ 4Α) HIF-1α. Pull-down βιοτίνης-tagged ΒΑ εκφράζεται σε κύτταρα PC3 αποκάλυψε ειδική αλληλεπίδραση των επιμολυσμένων HIF-1α με ERβ2 και ERβ2ΔCX και μόνο μέτρια αλληλεπίδραση με ERβ1 (Σχήμα 4Β). Από ERβ5 έχει την ίδια αλληλουχία αμινοξέων και περικόπτεται κατά το ίδιο αμινοξύ ως ERβ2, δηλ μόνο οι μικρές Ο-τερματικά πεπτίδια που διαφέρει μεταξύ των δύο παραλλαγών, αποφασίσαμε να δοκιμάσουν αυτή την παραλλαγή και να διερευνήσουν την αλληλεπίδρασή του με HIF-1α. Όπως φαίνεται στο Σχ 4Β, ERβ5 αλληλεπιδρά ισχυρά με HIF-1α.

A. His-tagged LBD-ERβ2 τραβήξει προς τα κάτω με σφαιρίδια αγαρόζης νικελίου

in vitro

μεταφρασμένο HIF-1α σε σύγκριση με His-tagged LBD-ΕΚα, His-tagged LBD-ERβ1, His-tagged LBD-ERβ2 και His- ετικέτα ERβ2ΔCX TNT είναι λωρίδα μόνο με συνδυασμό λύμα δικτυοερυθροκυττάρων. B. Η έκφραση της βιοτίνης λιγκάσης ΒϊγΑ, HA-HIF-1α, και τον υποδοχέα Ν-τερματική βιοτίνη συναινετικό πεπτίδιο συντηγμένο κατασκευάσματα B7TEV-ΕΚα, B7TEV-ERβ1, B7TEV-ERβ2, B7TEV-ERβ5, και B7TEV-ERβΔCX σε κύτταρα PC3. Τα κυτταρικά εκχυλίσματα στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε αναπτυσσόμενο με στρεπταβιδίνη μαγνητικά σφαιρίδια και οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE ακολουθούμενη από ανίχνευση με αντίσωμα HIF-1α.

Η

Η αποσταθεροποίηση οξυγόνο τομέα (ODD) του HIF1α δεν απαιτείται για την αλληλεπίδραση με ERβ2 και ERβ5

για να διερευνηθεί, εάν η αποσταθεροποίηση του τομέα του HIF-1α του οξυγόνου που απαιτείται για την αλληλεπίδραση με ERβ2 κατασκευάσαμε ένα πλασμίδιο έκφρασης του HIF-1α με αμινοξέα 401-603 διαγραφούν όπως περιγράφεται παραπάνω [31] . Εμείς στη συνέχεια συν-ανοσοκατακρημνίστηκαν αυτό το πεδίο διαγράφεται HIF-1α με βιοτινυλιωμένο ERβ2 και ERβ5. Όπως μπορεί να φανεί στο σχήμα 5Α η HIF-1α με διαγράφεται ODD (Δ401-603) αλληλεπιδρά τόσο ισχυρά όσο το αγρίου τύπου που υποδεικνύει ότι ο τομέας ODD είναι περιττή για την αλληλεπίδραση. Για τη χαρτογράφηση της αλληλεπίδρασης περαιτέρω χρησιμοποιήσαμε θηλαστικού δύο-υβριδίων προσδιορισμός όπου το Ν-τελικό άκρο, ODD τομέα και Ο-άκρο του HIF-1α συντήχθηκαν με VP16 και διαμολύνθηκε σε κύτταρα PC3 μαζί με GAL4DBD συγχωνευμένο ERβ2 και ρεπόρτερ με Gal4 θέσεις δέσμευσης σε μπροστά από λουσιφεράσης. Όπως μπορεί να φανεί στο σχήμα 5Β η αλληλεπίδραση λαμβάνει χώρα κατά προτίμηση με το Ν-άκρο του HIF-1α.

A. PC3 κύτταρα επιμολυσμένα με πλασμίδια που εκφράζουν GFP, HIF-1α, HIF-1α ΔODD, ΒϊγΑ (βιοτίνη λιγκάση), ERβ2 και ERβ5 με Ν-τερματικό βιοτινυλίωση συναίνεση. Συμπλέγματα κατεδαφίστηκαν με στρεπταβιδίνη μαγνητικά σφαιρίδια. Τραβηχτεί προς τα κάτω HIF-1α και HIF-1α ΔODD ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας αντίσωμα αντι-HIF-1α. B. Η επιμόλυνση των 200 ng μόνος FR-λουσιφεράσης, με 500ng ΡΜ2-ERβ2 και 300ng του είτε VP16-Ν-όρος HIF-1α (αμινοξέα 1-401), VP16- ODD HIF-1α (αμινοξέα 401-603) ή VP16-C-term HIF-1α (αμινοξέα 603 έως 826). Μέτρηση της δραστικότητας λουσιφεράσης 24 ώρες μετά την επιμόλυνση.

Η

Είναι γνωστό ότι οι προλίνες 405 και 564 του HIF-1α υπό φυσιολογική οξυγόνωση υδροξυλιώνεται με υδροξυλάσες προλίνη (PHD) και, στη συνέχεια, που αναγνωρίζεται από τον παράγοντα και εν συνεχεία VHL στόχο για την υποβάθμιση [32]. Θέλαμε να μάθετε αν ERβ2 και ERβ5 αλληλεπίδραση με HIF-1α εξαρτάται από την υδροξυλίωση αυτών προλίνες, έτσι ώστε η αλληλεπίδραση θα συμβεί ακόμη και κατά τη διάρκεια ορθοξικές συνθήκες. Στο Σχήμα 6, δείξαμε ότι WT και P405 /A-P564 /Α μεταλλαγμένη HIF-1α αλληλεπιδρούν ισχυρά με ERβ2 ανεξάρτητα από την καταστροφή των τόπων υδροξυλίωση προλίνης που υποδηλώνει ότι η αλληλεπίδραση συμβαίνει τόσο κατά τη διάρκεια νορμοξία και υποξία.

PC3 κύτταρα επιμολυσμένα με GFP, HIF-1α, HIF-1α P405 /A-P564 /A, ΒϊγΑ (βιοτίνη λιγκάση), ERβ2 και ERβ5 με Ν-τερματικό βιοτινυλίωση συναίνεση. Συμπλέγματα κατεδαφίστηκαν με στρεπταβιδίνη μαγνητικά σφαιρίδια.

Η

ERβ2 προσλαμβάνεται με στοιχεία απόκρισης HIF-1α του Twist1 και υποστηρικτές του VEGF

Τέλος, διερευνήσαμε αν ERβ2 μπορεί να συνδεθεί με τον HIF στοιχεία -1α απάντηση χρησιμοποιώντας τσιπ qPCR. Διαπιστώσαμε αυξημένα επίπεδα ERβ2 προσλαμβάνονται στα στοιχεία απόκρισης HIF-1α στις HIF-1α εξαρτάται Twist1 και VEGF υποστηρικτές τόσο PC3 και τα κύτταρα 22Rv1. Ωστόσο, ERβ2 δεν δεσμεύεται με τους υποστηρικτές της κλασικής στοιχείο απόκρισης οιστρογόνου στο γονίδιο pS2 (Σχήμα 7Α και 7Β).

Σε κύτταρα PC3 (Α) και τα κύτταρα 22Rv1 (Β) που εκφράζουν δοξυκυκλίνη-ρυθμιζόμενη έκφραση ERβ2 , αυτή η ισομορφή ΕΡβ δεσμεύεται με (στοιχείο απόκρισης HIF-1α σε Twist1 προαγωγός) HRE και VEGF προαγωγό (HIF-1α στοιχείο απόκρισης σε προαγωγού VEGF), αλλά όχι να pS2 (ERE) υποκινητή. Τα αποτελέσματα τσιπ qPCR δείχνεται με ένα μη ειδικό IgG και ένα ειδικό ανοσοκαταβύθιση αντίσωμα αντι-Μ2-FLAG. ERβ2 δέσμευση είναι εμπλουτισμένο μόνο σε στοιχείο απόκρισης HIF-1α περιέχει Twist1 και υποκινητές VEGF αλλά όχι στον υποκινητή pS2 λείπει στοιχείο απόκρισης HIF-1α. Το γράφημα δείχνει τα δεδομένα ως αύξηση της δέσμευσης της σημαίας στο Twist1 (pHRE) και υποστηρικτής του VEGF (μέσος όρος τριών ξεχωριστών πειραμάτων (± SEM) υπολογίζεται με χρήση του Student

t-test

, * p≤0.028, # # p≤0.041 (κύτταρα PC3) και ** p≤0.0049, ## p≤0.0481 (22Rv1 κύτταρα).

η

Εν κατακλείδι, τα ευρήματά μας δείχνουν ότι ERβ2 συνδέεται και σταθεροποιεί τον HIF-1α και Επιπλέον, είναι συν-προσληφθεί σε βασικά HIF-1α στοιχεία HIF-1α γονιδίων που ρυθμίζονται ενισχύοντας έτσι τη δράση του HIF-1α κατά τη διάρκεια ορθοξικές συνθήκες στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη.

Συζήτηση

Απόκριση της κανονικής ιστών στην υποξία είναι ζωτικής σημασίας για τη σωστή αγγείωση και για την επακόλουθη παροχή αίματος για την οξυγόνωση και την παροχή θρεπτικών ουσιών στους ιστούς. ένας αυξανόμενος όγκος γίνεται υποξική φτάνοντας πιο ότι 1 χιλιοστό σε μέγεθος [33]. Η άμεση απάντηση στην υποξία είναι μια μειωμένη προλυλ-υδροξυλίωση της HIF-1α που οδηγεί σε αυξημένη σταθεροποίηση αυτής της πρωτεΐνης. Αυτό συμβαίνει επειδή VHL, η οποία επάγει ubiquitinylation και επακόλουθη υποβάθμιση του HIF-1α υπό νορμοξικές συνθήκες, δεν μπορεί να συνδεθεί με HIF-1α απουσία προλυλ-υδροξυλίωση. Σταθεροποίηση του HIF-1α επιτρέπει τη ρύθμιση των γονιδίων που εμπλέκονται στην αγγειογένεση, όπως ο VEGF, η οποία εκκρίνεται από τον όγκο, προσελκύοντας ενδοθηλιακά κύτταρα με σύνδεση προς τους υποδοχείς VEGF επιφάνειά τους επιτρέποντας έτσι αυξημένη αγγείωση του όγκου και την ανάπτυξη. HIF-1α αυξάνει επίσης την έκφραση των γονιδίων που εμπλέκονται στη γλυκόλυση, για την προσαρμογή του όγκου για να επιβιώσει υπό συνθήκες χαμηλού οξυγόνου [34], και γονίδια που εμπλέκονται στην εισβολή και τη μετάσταση όπως Twist1 [25].

Έκφραση ERβ2 συσχετίζεται με χειρότερη πρόγνωση στον καρκίνο του προστάτη [14] και του καρκίνου του ΕΡα αρνητικών μαστού [35], αλλά είναι δυνατόν ογκογόνο δράση των ERβ2 δεν είναι κατανοητά. Δείχνουμε εδώ ότι υπάρχει ισχυρή συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης ERβ2 και επίπεδο πρωτεΐνης HIF-1α, αλλά όχι το επίπεδο mRNA στο καρκίνου του προστάτη κυτταρικές γραμμές PC3 και 22Rv1. ERβ2 ενισχύει την δραστικότητα των εξαρτώμενων προαγωγών HIF-1α και στρατολογείται στους Twist1 και VEGF υποκινητές, πιθανόν με πρόσδεση σε HIF-1α. Μαζί, τα ευρήματα που περιγράφονται παραπάνω δείχνουν ότι HIF-1α μεσολαβεί στην ογκογόνο δράση του ERβ2 μέσω μιας μη-κλασικής οδού σηματοδότησης στην οποία ERβ2 δεσμεύεται με, και σταθεροποιεί HIF-1α κάτω από νορμοξικές συνθήκες. Αυτό είναι σύμφωνη με άλλες μελέτες που δείχνουν ότι HIF-1α πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν με τη σταθεροποίηση των HIF-1α μπλοκάροντας την υποβάθμιση του [22-24].

Παραδόξως, αν και βρήκαμε ότι ERβ1 δεν αλληλεπιδρά αποτελεσματικά με HIF-1α, συσχετίζοντας με την αδυναμία του να επάγει HIF-1α αποκρίνονται γονίδια, η μοναδική τελευταίο εξόνιο του ERβ2 δεν απαιτείται για σύνδεση HIF-1α. Προφανώς, κολόβωση της ERβ1 C-άκρο εκθέτει μια νέα πρωτεΐνη επιφάνεια μεσολαβεί αλληλεπίδραση με HIF-1α.

Απομένει να δειχθεί αν η έκφραση ERβ2 συσχετίζεται με τα επίπεδα του Twist 1 ή άλλων γονιδίων στόχων HIF-1α σε κλινικές δείγματα. Μια πρόσφατη μελέτη από Ragnum et al. [36] δείχνει ότι η θεραπεία στέρησης ανδρογόνων (ADT) προκαλεί μια μειωμένη έκφραση πολλών γονιδίων που συνδέονται με την υποξία. Προτείνουμε ότι η έκφραση του ERβ2 ή ERβ5 θα μπορούσε να εξουδετερώσει την επίδραση της ADT σε γονίδια υποξία-συνδεδεμένο σε έναν όγκο του προστάτη και να προκαλέσουν έτσι την αντίσταση ευνουχισμό με αποτέλεσμα μια φτωχότερη έκβαση. Πράγματι, τα ευρήματά μας μη υποξικής σταθεροποίηση του HIF-1α υποδηλώνουν ότι μπορεί να είναι δυνατόν να αναπτυχθεί ένα μικρό μόριο παρεμβαίνει στην ERβ2 και ERβ5 επαγόμενη HIF-1α σταθεροποίηση για χρήση στη θεραπεία ορισμένων επιθετικών μορφών του καρκίνου του προστάτη. Μια επισκόπηση των ευρημάτων παρουσιάζεται στο Σχήμα 8.

προτεινόμενο μοντέλο για το πώς ERβ2 σταθεροποιεί τον HIF-1α και έχει προσληφθεί για να VEGF και Twist1 υποστηρικτές.

Η

Εν κατακλείδι, η έκφραση της ο Ετβ παραλλαγές ERβ2 και ERβ5 έχει προηγουμένως δειχθεί ότι συσχετίζεται με επιθετικό καρκίνο του προστάτη.