Αφηρημένο

γλοιώματα Υψηλής ποιότητας (Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας βαθμού III αναπλαστικό αστροκύτωμα και βαθμού IV πολύμορφο γλοιοβλάστωμα), οι πιο διαδεδομένες πρωτογενείς κακοήθεις όγκους του εγκεφάλου, εμφανίζουν μια κυτταρική ιεραρχία με την αυτο-ανανέωση, ογκογόνων καρκινικών βλαστικών κυττάρων (ΚΕΠ) στην κορυφή. Ενώ η υπόθεση CSC έχει ένα ελκυστικό μοντέλο για να περιγράψει πολλές πτυχές της συμπεριφοράς του όγκου, παραμένει αμφιλεγόμενη, λόγω ανεπίλυτων ζητημάτων, συμπεριλαμβανομένης της χρήσης του

ex vivo

αναλύσεις με όρους διαφορά ανάπτυξης. Ένας πληθυσμός CSC έχει επιβεβαιωθεί σε κακοήθη γλοιώματα από προτιμησιακό σχηματισμό όγκου από κύτταρα που απομονώθηκαν άμεσα από τα δείγματα βιοψίας ασθενούς. Ωστόσο, η άμεση σύγκριση των πολλαπλών καρκινικών κυτταρικών πληθυσμών με ανάλυση των προκυπτόντων φαινοτύπων του κάθε πληθυσμού μέσα σε ένα αντιπροσωπευτικό περιβάλλον του όγκου δεν έχει περιγραφεί με σαφήνεια. Για να εξεταστεί άμεσα η σχετική ογκογόνο δυναμικό των ΚΕΠ και καρκινικά κύτταρα μη-βλαστικών στο ίδιο μικροπεριβάλλον, εμείς ανακρίνεται συμφωνημένα πληθυσμούς καρκινικών καθαριστεί από πρωτογενή ανθρώπινα καρκινικά μεταμοσχευθούν σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού και παρακολουθείται ανταγωνιστική

in vivo

ανάπτυξη του όγκου μελέτες που χρησιμοποιούν σειριακή

in vivo

έμβια μικροσκοπία. Ενώ ΚΕΠ ήταν μια μικρή μειοψηφία του αρχικού μεταμοσχευμένων πληθυσμό καρκινικών κυττάρων, η ΚΕΠ, δεν τα καρκινικά κύτταρα μη-στέλεχος, οδήγησε σχηματισμό όγκων και απέδωσε όγκοι εμφανίζουν ένα κινητό ιεραρχία. Στην προκύπτουσα όγκους, ένα κλάσμα των αρχικών μεταμοσχευμένων ΚΕΠ διατηρείται έκφραση των βλαστικών κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό των δεικτών, η οποία ήταν σημαντικά υψηλότερη σε σύγκριση με τον πληθυσμό μη βλαστικών κυττάρων όγκου και απέδειξαν ότι ΚΕΠ δημιουργείται κυτταρική ετερογένεια εντός του όγκου. Αυτές οι συγκρίσεις head-to-head μεταξύ συμφωνημένα ΚΕΠ και τα καρκινικά κύτταρα μη βλαστικών παρέχουν την πρώτη λειτουργική αποδείξεις χρησιμοποιώντας ζωντανή απεικόνιση που στο ίδιο μικροπεριβάλλον, ΚΕΠ περισσότερα από τα καρκινικά κύτταρα μη-βλαστικών είναι υπεύθυνα για τον πολλαπλασιασμό του όγκου, επιβεβαιώνοντας τη λειτουργική ορισμό του CSC

Παράθεση:. Lathia JD, Gallagher J, Myers JT, Λι Μ, Vasanji Α, McLendon RE, et al. (2011) Άμεση

In Vivo

Αποδεικτικά στοιχεία για Tumor Πολλαπλασιασμός με Καρκίνο γλοιοβλάστωμα βλαστικά κύτταρα. PLoS ONE 6 (9): e24807. doi: 10.1371 /journal.pone.0024807

Επιμέλεια: Ilya Ulasov, University of Chicago, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 17 του Ιουνίου 2011? Αποδεκτές: 22 του Αυγούστου 2011? Δημοσιεύθηκε: 22 Σεπ 2011

Copyright: © 2011 Lathia, et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Εργασία σε το Rich εργαστήριο υποστηρίζεται από το Ίδρυμα Runyon Damon Cancer Research, Κοινωνία των όγκων του εγκεφάλου Εθνική, Goldhirsh Ιδρύματος, Τζέιμς Ίδρυμα S. McDonnell, και ΝΙΗ επιχορηγήσεις CA112958 (Jnr), CA116659 (Jnr), CA154130 (Jnr), CA151522 (ABH), 5P50-NS-20023-26 (REM) και Εθνική Υπηρεσία Έρευνας Βραβείο CA142159 (JDL). REM υποστηρίζεται από το Ίδρυμα όγκου Παιδιατρική εγκεφάλου. Jnr είναι ένα Damon Runyon-Lilly κλινικός ερευνητής που υποστηρίζονται από το Ίδρυμα Έρευνας Damon Runyon Καρκίνου. ABH υποστηρίζεται από το Tumor Society National εγκεφάλου. AYH υποστηρίζεται από το Ίδρυμα του Αγίου Baldrick του, το Ίδρυμα Dana, Cancer Research Institute, και Ίδρυμα Αγγέλου της Gabrielle του. JDL υποστηρίζεται από έναν Αμερικανό Brain Tumor Association Fellowship (που χρηματοδοτείται από το Ταμείο Joelle Syverson). AYH και JDL αναγνωρίζουν κεφάλαια πιλοτικά επιχορήγηση από την υπόθεση Περιεκτική Κέντρο Καρκίνου (RES50-5509). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Οι ανθρώπινοι όγκοι εμφανίζουν συνήθως μια ετερογένεια μέσα νεοπλασματική χώρο τους, που μπορεί να προέρχεται από ένα συνδυασμό των στοχαστικών αριθμό γενετικό αντίγραφο αλλαγές και μια επιγενετική ιεραρχία που συν-εξελίσσονται με την πάροδο του χρόνου [1]. Η ενσωμάτωση της έννοιας ότι οι όγκοι μπορεί να περιέχει ένα κύτταρο-σαν πληθυσμός βλαστικών υπεύθυνος για τη συντήρηση και τον πολλαπλασιασμό τους μπορούν να είναι κατατοπιστική τόσο για καρκίνο και βλαστικών κυττάρων πεδία [2]. Η υπόθεση CSC μπορεί να παρέχει γνώσεις σχετικά με θεραπευτικές αντίστασης και του όγκου υποτροπής και υπογραμμίζουν την πολυπλοκότητα του καρκίνου. Ο ενθουσιασμός γύρω από την υπόθεση CSC μετριάζεται από τη διαμάχη σχετικά με το προσήκον πειραματικά συστήματα μοντέλο για να καθορίσουν λειτουργικά ΚΕΠ, η συχνότητα CSC, και καθολικά ενημερωτικό ανοσοφαινότυπους [3]. Τα φυσιολογικά και νεοπλασματικά βλαστικά κύτταρα που ορίζεται σήμερα από λειτουργικές δοκιμασίες της αυτο-ανανέωσης και της διαφοροποίησης, με την πιο ακριβή δοκιμασία μέχρι σήμερα για τα ΚΕΠ είναι πολλαπλασιασμού των όγκων. μοντέλα ξενομεταμόσχευση έχουν επιβεβαιώσει την ενισχυμένη ικανότητα σχηματισμού όγκου των CSC-εμπλουτισμένα κλάσματα σε μία ποικιλία ανθρώπινων όγκων και έχουν χρησιμοποιηθεί για να εκτιμηθεί η συχνότητα των κυττάρων του όγκου πολλαπλασιαστικού [4], η οποία είναι αρκετά υψηλή για μερικές [3] κακοήθειες. Δεδομένου ότι η θέση στην οποία τόσο φυσιολογικών και νεοπλασματικών βλαστοκύτταρα διαμένουν αναθέτει αυτο-ανανέωση και συντήρηση, ζώντα ζώα σε απεικονιστικές τεχνικές vivo έχουν εφαρμοστεί σε κάποιες βλαστικών κυτταρικών πληθυσμών – ιδίως αιμοποιητικών και των λευχαιμικών βλαστικών κυττάρων – να καθορίσει πρότυπα ανάπτυξης στην φυσική μικροπεριβάλλον [ ,,,0],5], [6], [7], αλλά η εφαρμογή σε στερεούς ιστούς ήταν περιορισμένη. Οι Solid ΚΕΠ όγκων έχουν χαρακτηριστεί σε ex vivo δοκιμασίες ή ως διαχωρισμένες πληθυσμούς, οι οποίες έχουν πληροφοριακό στον προσδιορισμό διαφορικά ρυθμιζόμενα μονοπάτια αλλά έχουν εμποδίσει την άμεση ανάλυση των πιθανών πολλαπλασιασμού όγκου μεταξύ διαφορετικών κλασμάτων κυττάρου του όγκου. Για την αξιολόγηση του δυναμικού των ΚΕΠ σε άμεση σύγκριση προς κύτταρα όγκου μη στέλεχος σε μια αντιπροσωπευτική μικροπεριβάλλον, εμείς διαφορικά σημασμένα κυτταρικά κλάσματα GBM προέρχεται από ένα ανθρώπινο όγκο και παρακολουθείται η συμπεριφορά όγκου σε ένα μοντέλο ξενομεταμόσχευσης συναρτήσει του χρόνου χρησιμοποιώντας έμβια μικροσκοπία. Παρά το μικρό αριθμό των ΚΕΠ σε μεταμόσχευση, πολλαπλασιασμός καρκινικών οδηγήθηκε από ΚΕΠ και τους απογόνους τους, αποδεικνύοντας την ικανότητα για ΚΕΠ, αλλά τα καρκινικά κύτταρα όχι μη-στέλεχος, για να οδηγήσει τον σχηματισμό όγκων και να διαδίδει την κυτταρική ετερογένεια.

Υλικά και Μέθοδοι

Η μεταμόσχευση των κυττάρων γλοιώματος

τα ανθρώπινα κύτταρα γλοιώματος προήλθαν με τη γραπτή συγκατάθεση και στο πλαίσιο εγκεκριμένων IRB πρωτόκολλα από Cleveland Clinic (πρωτόκολλο 2559) και το Πανεπιστήμιο Duke (πρωτόκολλο 7409). κύτταρα γλοιώματος είχαν παροδικά περάστηκαν ως ξενομοσχεύματα σε γυμνά ποντίκια στο πλαίσιο εγκεκριμένων Cleveland Clinic IACUC ARC πρωτοκόλλου 8699 και in vivo απεικόνιση διεξήχθη κάτω Πανεπιστημίου Case Western Reserve πρωτόκολλο 2009-0109). Για αρχικές μελέτες σχηματισμό όγκων CSC, το δείγμα του όγκου που χρησιμοποιούνται (T4302) ήταν ένα πρόσφατα διαγνωστεί βαθμού ΙΙΙ αναπλαστικό αστροκύτωμα σε ένα παλιό Άντρας 40 ετών, η οποία είχε αφαιρεθεί χειρουργικά στο Πανεπιστήμιο Duke. Κατά τη στιγμή της αφαίρεσης, το δείγμα χαρακτηρίζεται να έχει πολυσωμία EGFR (EGFRvIII αρνητική), MGMT αρνητική, άθικτο PTEN και πολυσωμία των χρωμοσωμάτων 7 και 10. Για τις μελέτες των κυττάρων ανάμιξης (δηλαδή δοκιμασία ανταγωνισμό), το δείγμα του όγκου που χρησιμοποιούνται (T4121) ήταν ένα επαναλαμβανόμενο πολύμορφο γλοιοβλάστωμα (GBM) διαγιγνώσκονται σε ένα παλιό Άντρας 26 ετών, η οποία είχε αφαιρεθεί χειρουργικά στο Πανεπιστήμιο Duke. Κατά τη στιγμή της αφαίρεσης, το δείγμα χαρακτηρίζεται να έχει ενισχυμένο EGFR (αλλά ΕΟΡΡνΙΙΙ αρνητική), MGMT θετικό, απώλεια PTEN, η απώλεια του χρωμοσώματος 9p21, και πολυσωμία των χρωμοσωμάτων 1ρ36, 1p32 και 19q13. Για τις πειραματικές μελέτες, κύτταρα όγκου αφαιρέθηκαν από ξενομοσχεύματα και ΚΕΠ εμπλουτίστηκαν με βάση την έκφραση CD133 με κυτταρομετρία ροής (χρήση ενός /2-APC αντίσωμα CD133, Miltenyi) και στη συνέχεια λειτουργικώς δοκιμάστηκαν για αυτοανανέωσης, διαφοροποίηση multi-γενεαλογία, βλαστικά έκφρασης δείκτη κυττάρου και διάδοση όγκου όπως περιγράφηκε προηγουμένως [8]. Υποθετικό ΚΕΠ από GBM δείγματος T4302 μετήχθησαν με ένα φακοϊό να εκφράσει πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP). Για όγκου δείγματος T4121, υποθετικές ΚΕΠ σημάνθηκαν με κίτρινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (YFP) ή και τα καρκινικά κύτταρα μη-βλαστικών σημάνθηκαν με μια φθορίζουσα πρωτεΐνη κυανού (ΚΑΠ, δείγμα όγκου T4121) με φακοϊό (Sigma). Επισημασμένα ΚΕΠ και τα κύτταρα μη-βλαστικών όγκων (που προέρχεται από T4121) αναμίχθηκαν σε 10%: 90% [ή 1:09] (CSC: κύτταρο όγκου μη-στέλεχος) αναλογία και μεταμοσχεύονται στο φλοιό ενός γυμνού ποντικού σε βάθος από 1,5 – 2 mm,. εγκαταστάθηκαν κρανιακή παράθυρα όπως περιγράφηκε προηγουμένως [9]. απεικονιστικές μελέτες χρησιμοποιήθηκαν 25.000 μεταμοσχευμένα κύτταρα. Όλες οι χειρουργικές διαδικασίες έγιναν κάτω από ένα εγκεκριμένο πρωτόκολλο Cleveland Clinic IACUC.

απεικόνισης πολυφωτονικών

έμβια μικροσκοπία διεξήχθη χρησιμοποιώντας απεικόνιση πολυφωτονικών όπως περιγράφηκε προηγουμένως [10] χρησιμοποιώντας ένα σύστημα απεικόνισης SP5 Leica με φεμτο 16W -Δεύτερον λέιζερ συντονισμένοι για να 840-860 nm και εστιάζεται μέσω ενός 20Χ φακό βύθιση στο νερό (αριθμητικό διάφραγμα 1.0). Πριν από την απεικόνιση, τα ποντίκια αναισθητοποιήθηκαν και ενδοφλέβια ένεση με υψηλού μοριακού βάρους φθορίζουσες δεξτράνη (& gt? 150 kD) να αναδείξει αγγείωση. Εικόνες αποκτήθηκαν σε ένα εύρος από 200 μm σε 2 μm z-στοίβες. Μέγιστη προβλέψεις ένταση, που αντιπροσωπεύουν 200 μm σε βάθος, ήταν ομοιόμορφα προσαρμοστεί στο Photoshop (Adobe) πριν από την εμφάνιση. Όσον αφορά τα τρισδιάστατα αναπαραστάσεις, τα δεδομένα εισήχθησαν στο λογισμικό Imaris (BitPlane) για τα επιφανειακά απόδοση και όγκο ήταν ποσοτικά για κάθε κυτταρικό πληθυσμό.

Ανοσοβαφή και στατιστική ανάλυση

Τα κατεψυγμένα τμήματα κόπηκαν χρησιμοποιώντας κρυοστάτη (Leica) και ανοσοκηλίδωση πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [11] με αντισώματα έναντι Tra1-85 (R &? D Systems, 1:500), Sox 2 (R &? D Systems, 1:200), φωσφορυλιωμένη ιστόνη Η3 (ΡΗ3, Millipore , 1:500) και CD31 (Dako, 1:200). Οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με DRAQ5 (Biostatus περιορισμένη, 1:5000). Οι εικόνες ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ένα Leica SP5 συνεστιακό μικροσκόπιο όπως περιγράφηκε προηγουμένως [11]. Ανάλυση του συνόλου του όγκου έγινε για 3 ανατομικές βάθη σε 3 αντιπροσωπευτικές ποντικούς, ύψους & lt? 400,000 κύτταρα. Η ανοσοφαινοτυπική των μεταμοσχευμένων κυτταρικών πληθυσμών επιβεβαιώθηκε με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας έκφρασης CD133 (CD133 /2-APC αντίσωμα, Miltenyi) κάθε κυτταρικού πληθυσμού, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [8]. Η ανοσοχρώση σε κάθε κυτταρικού πληθυσμού in vitro έγινε χρησιμοποιώντας αντισώματα που περιγράφονται παραπάνω και ποσοτικοποιούνται με βάση ένα ελάχιστο 150 κυττάρων από 10 πεδία. Η στατιστική σημαντικότητα υπολογίστηκε με χρήση μονόδρομης ANOVA

Αυτοματοποιημένη ανάλυση εικόνας

Μεγάλες (FOV) εικόνες του όγκου διατομών αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας μια Leica DM4000, μια αντικειμενική 40Χ. Πεδίου-of-view , ένα CCD Q-απεικόνισης, ένας Πριν από 8-slide μηχανοκίνητα στάδιο, Image-Pro 6.2, και YFP, ΚΑΠ, CY5 (DRAQ5 επισημανθεί πυρήνες), και Texas Red (Sox2, Tra-1-85, ή ΡΗ3) κύβους φίλτρο. Μεγάλες εικόνες FOV (-500 MB /κανάλι) εισήχθησαν Image-Pro για ανάλυση χρησιμοποιώντας προσαρμοσμένες μακροεντολές. Για κάθε διατομή, το κανάλι DRAQ5 εισήχθη και φασματικά ενισχυθεί για να εξισώσει την εμφάνιση του κάθε πυρήνα. Οι πυρήνες στη συνέχεια κατά διαστήματα, μορφολογικά «διαστολή» να επεκτείνουν τα όριά τους στο κυτταρόπλασμα, και το «καμπή» διηθείται για το διαχωρισμό των κυττάρων. Μια περιοχή ενδιαφέροντος (ROI) συντάχθηκε γύρω από το μεγαλύτερο μέρος του όγκου και της Κοινής Αλιευτικής Πολιτικής, YFP, και Texas Red κανάλια φορτώθηκαν διαδοχικά. Κάθε κανάλι έχει φασματικά διηθείται και «πολλαπλασιαζόμενο» από τη μάσκα κυττάρου που περιγράφεται παραπάνω. Τμηματοποίηση μέσω μορφομετρικών και την ένταση προφίλ ειδικών για κάθε δείκτη /λεκέ που ακολουθείται από λογικές πράξεις εικόνα που παρέχεται YFP, ΚΑΠ, και θετικές μετρήσεις κυττάρων αντισώματος. Για ανοσοφαινότυπου του μεταμοσχευμένου πληθυσμού, η προκύπτουσα δυαδική μάσκα πυρηνική ήταν «πολλαπλασιάζεται» με το αντίστοιχο ΡΗ3 /Sox2 κανάλι. Θετικότητα αντιστοιχίζεται αυτόματα με βάση την μέση πυρηνική ένταση της ΡΗ3 ή Sox2 πάνω από ένα προκαθορισμένο όριο.

Αποτελέσματα

Τα κακοήθη γλοιώματα είναι στερεά καρκίνων για τους οποίους κυτταρική ιεραρχίες έχουν επαναλήψιμα ορίζεται, επιτρέποντας την ανάκριση των κυττάρων ότι μπορεί να εμπλουτιστεί μελλοντικά για χαρακτηριστικά CSC, συμπεριλαμβανομένων αυτοανανέωσης, το δυναμικό διαφοροποίησης, τα βλαστικά έκφρασης δείκτη κυττάρων, και in vivo πολλαπλασιασμό του όγκου. Για την αντιμετώπιση απόκλιση ικανότητα in vivo πολλαπλασιασμό όγκου, χρησιμοποιήσαμε μοντέλα στα οποία είχαμε προηγουμένως αποδείξει την ικανότητα να εμπλουτίσει λειτουργικά ή καταστρέφουν για τα χαρακτηριστικά CSC σε ex vivo δοκιμασίες χρησιμοποιώντας επισήμανση φθορίζοντα δείκτη επιφανείας κυττάρου [8], [11]. Ενώ υπάρχει διαμάχη γύρω CD133 ως δείκτη CSC, πολλές προτεινόμενες γλοίωμα δείκτες CSC (συμπεριλαμβανομένων L1CAM [12], Α2Β5 [13], και ιντεγκρίνης άλφα 6 [11]) επικάλυψη με CD133. Βρίσκουμε ότι CD133 εμπλουτίζει για CSCs στα δείγματα GBM χρησιμοποιηθεί για τη μελέτη και διαχωρίζει για tumorsphere αποδοτικότητα σχηματισμού σε σύγκριση με ιντεγκρίνης άλφα 6 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιπλέον, τα κλάσματα CD133 διαδίδονται αποτελεσματικά δευτερογενείς όγκους και CD133 εμπλουτισμό των ΚΕΠ από αυτούς τους όγκους έχει πρόσφατα χρησιμοποιηθεί για την επικύρωση μιας CSC-ειδική κινάση τυροσίνης μη υποδοχέα και μονοξειδίου του αζώτου της συνθάσης ισομορφή [14], [15]. έκφραση CD133 εκτιμήθηκε μετά από σήμανση με κυτταρομετρία ροής με 11% των κυττάρων YFP (CSC προέρχεται) και 1% των κυττάρων ΚΑΠ (μη στέλεχος που προέρχεται) να είναι CD133 θετικά (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η διαδικασία ιικής επισήμανση δεν μετέβαλε ιδιότητες ανάπτυξης (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

In vivo

παρατήρηση της ανάπτυξης των καρκινικών βλαστικών κυττάρων σε έναν όγκο

Μέχρι σήμερα, η αύξηση του στερεά ΚΕΠ όγκος δεν έχει αξιολογηθεί σε ανάλυση απλού κυττάρου σε μια χρονική στιγμή φυσικά in vivo. Για να παρατηρήσουμε το δυναμικό για πολλαπλασιασμό του όγκου και μόνο από ΚΕΠ, χρησιμοποιήσαμε έμβια μικροσκοπία σε ένα ορθοτοπικό μοντέλο ποντικού ξενομεταμόσχευση να εντοπίσει και να εντοπίζουν την ανάπτυξη των μικρών αριθμών ΚΕΠ εντός ενός όγκου συναρτήσει του χρόνου (Σχ. 1Α). Νωρίς στην περίοδο παρατήρησης όταν περιορισμένες ποσότητες ΚΕΠ ήταν παρόντες (T4302, ημέρα 3 έως 13), ΚΕΠ συσχετίστηκαν με τα αιμοφόρα αγγεία στην περιαγγειακή κόγχη (Εικ. 1 Β, C) όπως περιγράφεται από Gilbertson και τους συνεργάτες του [16] και μεγάλωσε σε εγγύτητα με αιμοφόρα αγγεία (Εικ. 1 D, Ε). Την πάροδο του χρόνου (από την ημέρα 13 έως 20), ένα οζίδιο όγκου γρήγορα σχηματίζονται και τα καρκινικά κύτταρα παρατηρήθηκαν να διεισδύσει τις περιφερειακές περιοχές (μπλε βέλη), ένα κοινό ιστολογική σφραγίδα της κακοήθη γλοιώματα. Τα αποτελέσματα παρέχουν την πρώτη ανάπτυξη του όγκου χρονική στιγμή πορεία της ΚΕΠ από ζωντανή απεικόνιση και επιβεβαιώνουν την ογκογόνο δυναμικό των μεταμοσχευμένων ΚΕΠ.

σχηματισμός όγκου σε ένα μοντέλο ξενομεταμόσχευσης παρατηρήθηκε από GFP-επισημασμένο ΚΕΠ πάροδο του χρόνου, όπως φαίνεται στο πειραματικό σχεδιάζουμε σχηματική (Α). μικρογραφίες προβολή (BD) καταδεικνύουν το σχηματισμό όγκων πάροδο του χρόνου και τρισδιάστατες αναπαραστάσεις που απεικονίζονται σε μικρογραφίες (Ε, Ε ‘) αποκάλυψε καρκινικά κύτταρα ήταν στενά συνδεδεμένοι με τα αιμοφόρα αγγεία (Ε’, εμφανίζεται με λευκά βέλη στο D, E) και σε περιφερειακές περιοχές (D, Ε, φαίνεται στο μπλε βέλη). Φθορισμού δεξτράνη (φαίνεται σε κόκκινο) εγχύθηκε στην κυκλοφορία για να φωτίζει τα αιμοφόρα αγγεία πριν την απεικόνιση. μπαρ κλίμακας αντιπροσωπεύει 50 μm.

Η

Καρκίνος βλαστικά κύτταρα ξεπεράσει τα καρκινικά κύτταρα μη-βλαστικών

in vivo

Η

Πολυάριθμες μελέτες έχουν δείξει διαφορική ικανότητα σχηματισμού όγκων μεταξύ ΚΕΠ και μη -stem κύτταρα όγκου [8], [15], [17], [18], ωστόσο, μια σύγκριση κεφαλής προς κεφαλή μεταξύ των δύο πληθυσμών σε υψηλή ανάλυση ή σε ένα χρόνο εξαρτώμενο τρόπο δεν έχει εκτελεστεί. Η εν λόγω αξιολόγηση είναι κρίσιμη καθώς ένα κακόηθες γλοίωμα αποτελείται από πολλαπλούς πληθυσμούς κυττάρων, υπάρχει cross-talk μεταξύ των πληθυσμών, και πώς οι κυτταρικοί πληθυσμοί αλληλεπιδρούν είναι πιθανό να είναι κατατοπιστική σε σχέση με ογκογόνο διεργασίες. Για να αξιολογηθεί η συμπεριφορά των ΚΕΠ και κυττάρων όγκου μη βλαστικά σε πανομοιότυπη μικροπεριβάλλον, εμείς μεταμοσχεύονται διαφορικά σημασμένα ανθρώπινα ΚΕΠ και καρκινικά κύτταρα μη-βλαστικών προέρχονται από την ίδια τη γονική όγκου μέσα στον ίδιο αποδέκτη ποντικό και παρακολουθείται η συμπεριφορά in vivo την πάροδο του χρόνου με τη χρήση έμβια μικροσκοπία (Εικ. 2Α). Διαδοχική in vivo εκτίμηση του ίδιου ξενιστή που φέρει ένα αρχικό μίγμα της CSC (10%, YFP επισημασμένα) και καρκινικά κύτταρα μη-βλαστικών (90%, CFP επισημασμένο) απέδειξαν ότι ΚΕΠ outgrew μη βλαστικά κύτταρα του όγκου, με 51,9 φορές αύξηση όγκου για τα ΚΕΠ και ένα φορές αύξηση 0.92 για τα κύτταρα του όγκου μη-βλαστικών (Εικ. 2Β) και εκεί ήταν περιορισμένη intermingled ανάπτυξη μεταξύ των πληθυσμών (Σχ. 2C, D). Χρήση πολλαπλών κυτταρικών πληθυσμών από τον ίδιο όγκο, αυτά τα αποτελέσματα απεικόνισης παρέχει την πρώτη απόδειξη για την ικανότητα σχηματισμού διαφορική όγκου μεταξύ των ΚΕΠ και των καρκινικών κυττάρων μη βλαστικών in vivo χρησιμοποιώντας διαδοχική απεικόνιση υψηλής ανάλυσης.

Κλασματωμένο ΚΕΠ και μη βλαστικών όγκου κύτταρα σημάνθηκαν με διαφορετικές φθορίζουσες πρωτεΐνες και μεταμοσχεύθηκαν σε ποντικούς σε καρκίνο βλαστικών κυττάρων 10% (YFP) αναλογία 90% μη-βλαστικών κυττάρων όγκου (ΚΑΠ) ως φαίνεται στο πειραματικό σχεδιασμό σχηματικό (Α). ΚΕΠ ξεπέρασε μη CSCs in vivo, όπως φαίνεται στο διάγραμμα περίληψη (Β), η οποία υπολογίζεται με βάση την τρισδιάστατη αναπαραστάσεις micrographs προεξοχής (Β, C). Επιπλέον, οι πληθυσμοί των όγκων δεν μπερδεύονται in vivo (πληθυσμός όγκου μη-στέλεχος που υποδεικνύεται από κίτρινο οβάλ). Φθορισμού δεξτράνη (που φαίνεται στο μωβ) εγχύθηκε στην κυκλοφορία για να φωτίζει τα αιμοφόρα αγγεία πριν την απεικόνιση. μπαρ κλίμακας αντιπροσωπεύει 100 μm.

Η

Με αποτέλεσμα οι όγκοι περιείχαν καρκινικά βλαστικά κύτταρα και τους απογόνους τους

Οι δευτερογενείς όγκους που σχηματίζονται από μεταμοσχευμένα ΚΕΠ περιέχουν πολλαπλούς πληθυσμούς κυττάρων, ωστόσο προηγούμενες μελέτες έχουν επικεντρωθεί σε μεγάλο βαθμό από το ιστολογία των δευτερογενών όγκων ή έκφραση των καρκινικών δεικτών, αλλά υπήρξε περιορισμένες πληροφορίες όσον αφορά το βαθμό ετερογένειας, καθώς και η συμβολή των πολλαπλών κυτταρικών τύπων για την ανάπτυξη της ετερογένειας. Μετά τα ποντίκια ανέπτυξαν νευρολογικά συμπτώματα (που κυμαίνεται από 37 έως 42 ημέρες μετά τη μεταμόσχευση), χρησιμοποιήσαμε ιστολογική εξέταση για να επιβεβαιωθεί το φαινότυπο των μεταμοσχευμένων κυττάρων στα προκύπτοντα όγκους. Για να οριοθετηθούν τα όρια των όγκων, οι ιστοί βάφηκαν για ένα ανθρώπινο ειδικό αντιγόνο, Tra-1-85. Βρήκαμε ότι, ενώ τόσο YFP θετικό (CSC προέρχεται) και θετική ΚΑΠ (μη-στέλεχος που προέρχεται) ήταν ανιχνεύσιμα, η συντριπτική πλειοψηφία των καρκινικών κυττάρων προήλθαν από τα ΚΕΠ? 94,5 τοις εκατό του TRA-1-85 θετικά κύτταρα εντός του όγκου ήταν θετικό YFP (CSC προέρχεται) έναντι 0,2 τοις εκατό που ήταν ΚΑΠ θετικά (μη-βλαστικών προέρχονται, Σχ. 3Α, Β).

Οι όγκοι από το κύτταρο πειράματα αναμίξεως (n = 3) αξιολογήθηκαν για να προσδιοριστεί η σύνθεσή τους. Περαιτέρω αξιολόγηση της προκύπτοντες όγκοι αποδεικνύει ότι η πλειονότητα των κυττάρων εντός της μάζας του όγκου ήταν ανθρώπινης προέλευσης και προέρχονται από CSC όπως επιβεβαιώθηκε από Tra-1-85 χρώση και έκφραση YFP, δείχνεται στα αντιπροσωπευτικά μικρογραφήματα (Α) και ραβδογράφημα (Β) . Περιφερική μεταμοσχευμένα καρκινικά κύτταρα (YFP θετική ΚΕΠ και τους απογόνους τους) παρατηρήθηκαν να έχουν σχέση με τα αιμοφόρα αγγεία. Μικρογραφία από πολυφωτονική απεικόνιση και τρισδιάστατη ανακατασκευή (C) απεικονίζουν στενή σύνδεση των κυττάρων του όγκου (πράσινο) με παρακείμενες αιμοφόρο αγγείο (μωβ, φωτίζεται από φθορίζοντα ένεση δεξτράνης στην κυκλοφορία πριν από την απεικόνιση). Η ιστολογική εξέταση των όγκων που προκύπτουν επιβεβαιώνει στενή σύνδεση των περιφερικών κυττάρων του όγκου στο αγγειακό σύστημα χρησιμοποιώντας CD31 ανοσοχρώση (D? CD31 σε κόκκινο, τα καρκινικά κύτταρα με πράσινο, πυρήνες σε μωβ). μπαρ κλίμακας αντιπροσωπεύει 50 μm. Τα δεδομένα εμφανίζονται σαν μέσες τιμές +/- S.E.M. *** P & lt? 0.001, όπως εκτιμάται από μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA)

Η

Σύνδεσης μεταξύ των αιμοφόρων αγγείων και του καρκίνου βλαστικών κυττάρων και των απογόνων τους

Η δυνατότητα για όγκο. κύτταρα να αναπτυχθούν κατά μήκος των αιμοφόρων αγγείων είναι ένα φαινότυπο που συχνά εντοπίζονται σε χειρουργικά δείγματα ανθρώπινου γλοιώματος. Για να αξιολογηθεί εάν αυτό φαινότυπος ανακεφαλαιώνονται σε όγκους που προκύπτουν από συν-μεταμόσχευση ΚΕΠ και συμφωνημένα καρκινικά κύτταρα μη-βλαστικών, αξιολογήσαμε αγγειακού συστήματος του όγκου χρησιμοποιώντας πολυφωτονικών μικροσκοπία και η ιστολογική εξέταση των όγκων που προκύπτουν (Σχ. 3C, D). Κατά την ημέρα 38 (φαίνεται στο Σχ. 2Β), ήμασταν σε θέση να προσδιορίσει μια ομάδα των καρκινικών κυττάρων στην περιφέρεια του όγκου και τρισδιάστατη ανάλυση απέδειξε ότι οι ΚΕΠ και τους απογόνους τους (κύτταρα YFP) ήταν σε άμεση γειτνίαση με το αγγειακό σύστημα (Σχ. 3C). Η ιστολογική εξέταση της προκύπτουσας όγκου χρησιμοποιώντας αντίσωμα εναντίον CD31 για να σηματοδοτήσει αιμοφόρα αγγεία επιβεβαίωσε επίσης ότι ΚΕΠ και τους απογόνους τους (κύτταρα YFP +) ήταν πράγματι κοντά στην αγγείωση σε περιοχές διαχωρίζεται από το χύδην μάζα του όγκου, ένα φαινόμενο που παρατηρείται επίσης σε ασθενείς GBM (Σχ. 3D).

Καρκίνος βλαστικά κύτταρα διαδίδονται ετερογένεια

in vivo

η

Για να καθοριστεί εάν τα μεταμοσχευμένα καρκινικά κύτταρα περιείχαν βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν, αξιολογήσαμε την έκφραση του δείκτη CSC, Sox2 [19], και διαπίστωσε ότι 25,9 τοις εκατό των μεταμοσχευμένων ΚΕΠ και των απογόνων τους (κύτταρα YFP) ήταν Sox2 θετικά σε σύγκριση με το 0,1 τοις εκατό των κυττάρων μη-στέλεχος του όγκου και των απογόνων τους (κύτταρα ΚΑΠ, Σχ. 4Α, Β). Έχουμε αξιολόγησε επίσης τον πολλαπλασιασμό με τη χρήση του δείκτη Μ-φάσης φωσφορυλιωμένη-ιστόνης Η3 (ΡΗ3) και διαπίστωσε ότι 1,7 τοις εκατό των ΚΕΠ και των απογόνων τους (κύτταρα YFP) ήταν ενεργά στην Μ φάση, σε σύγκριση με λιγότερο από 0,01 τοις εκατό των καρκινικών κυττάρων μη βλαστικών και των απογόνων τους (κύτταρα ΚΑΠ, Σχ. 4C, D). Αυτές οι διαφορές στον πολλαπλασιασμό φαίνεται στο μοντέλο υποστήριξη κλινικές αναφορές μας που δείχνουν πολλαπλασιαζόμενα ΚΕΠ (με βάση CD133-θετική κατάσταση) χαρακτηρίζουν μια επιθετική τάξη των όγκων GBM [20].

Η ιστολογική εξέταση διεξήχθη από όγκοι που προκύπτουν στο κύτταρο πειράματα ανάμιξης (n = 3) για να προσδιοριστεί το κλάσμα των βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν όπως αξιολογείται με Sox2 έκφραση και την παρουσία πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων, όπως επιβεβαιώθηκε από την M-φάση δείκτη φωσφορυλιωμένη ιστόνη 3 (ΡΗ3). Εκπρόσωπος μικρογραφίες (Α) και γράφημα ράβδων (Β) αποδεικνύουν την έκφραση Sox2 (κόκκινο) συνδέεται με τον καρκίνο βλαστικών κυττάρων και των απογόνων τους (πράσινο), αλλά όχι με καρκινικά κύτταρα μη-στελέχους και των απογόνων τους (μπλε). Εκπρόσωπος μικρογραφίες (C) και γράφημα ράβδων (D) καταδεικνύουν έκφραση PH3 (κόκκινο) συνδέεται με τον καρκίνο βλαστικών κυττάρων και των απογόνων τους (πράσινο), αλλά όχι με καρκινικά κύτταρα μη-στελέχους και των απογόνων τους (μπλε). μπαρ κλίμακας αντιπροσωπεύει 50 μm. Τα δεδομένα εμφανίζονται σαν μέσες τιμές +/- S.E.M. *** P & lt?. 0.001, όπως εκτιμάται από μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA), πυρήνες αντίθετα με DRAQ5 (μωβ)

Η

Για να αποκτήσετε μια εκτίμηση για το βαθμό ετερογένειας ιδρύθηκε από τον μεταμοσχευμένο ΚΕΠ (YFP θετικά κύτταρα), αξιολογήσαμε τον φαινότυπο των κυττάρων πριν από τη μεταμόσχευση. Οι καλλιέργειες περιείχαν CSC 74,8 τοις εκατό Sox2 θετικά κύτταρα (δηλαδή in vitro), σε σύγκριση με 24,9 τοις εκατό των θετικών κυττάρων Sox2 YFP (CSC προέρχεται) εντός του όγκου (δηλαδή in vivo, το Σχ. 5Α-C). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η in vivo περιβάλλον παρέχει διδακτική συνθήματα για να αναδημιουργήσει ένα ισορροπίας κατάστασης διαφοροποίησης και επομένως κυτταρική ετερογένεια. Μια παρόμοια μείωση παρατηρήθηκε σε Sox2 θετικά καρκινικά κύτταρα μη-βλαστικών (κύτταρα ΚΑΠ) από ένα αρχικό πληθυσμό 7,1 τοις εκατό σε καλλιέργεια έως 0,1 τοις εκατό στον όγκο (Σχ. 5Α-C). Οι διαφορές στην ανάπτυξη παρατηρήθηκαν επίσης μεταξύ πληθυσμών σε καλλιέργεια σε σύγκριση με εντός του όγκου. Χρησιμοποιώντας το PH3 δείκτη Μ-φάσης ως υποκατάστατο του πολλαπλασιασμού, παρατηρήσαμε 2,1 τοις εκατό YFP θετικά κύτταρα (CSC προέρχεται) και 0,2 τοις εκατό ΚΑΠ θετικά κύτταρα (μη-στέλεχος που προέρχεται) σε πολιτισμό, σε σύγκριση με το 1,7 τοις εκατό YFP θετικών κυττάρων και λιγότερο από 0,01 τοις εκατό ΚΑΠ θετικά κύτταρα στους όγκους (Σχήμα 5Α-C). Αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι αν και τα καρκινικά κύτταρα μη-βλαστικών κυριαρχούσε σε πρώιμα χρονικά σημεία, λόγω των αναλογιών κατά το χρόνο της μεταμόσχευσης, αναπτυσσόμενοι όγκοι είχαν περιορισμένο αριθμό των κυττάρων που προέρχονται από κύτταρα όγκου μη στέλεχος, από τα οποία λίγα εκφράζονται σημειωτές βλαστοκυττάρων ή ήσαν ενεργά πολλαπλασιάζονται. Οι όγκοι που προκύπτουν αποτελούνταν από ΚΕΠ και των απογόνων τους, ένα μέρος των οποίων εξακολουθούν να περιέχονται βλαστικά έκφρασης δείκτη κυττάρων και ενεργά πολλαπλασιάζονται.

Εκπρόσωπος μικρογραφίες (Α) και γράφημα ράβδων (Β) του διογκωμένου κύτταρα πριν από τη μεταμόσχευση αποδείξουν Sox2 και έκφραση ΡΗ3 (κόκκινο) είναι υψηλότερη στο κλάσμα CSC των κυττάρων σε σύγκριση με τα κύτταρα του όγκου μη-στελέχους. Περίληψη σχήμα απεικονίζει έκφρασης δείκτη από in vivo και in vitro αναλύσεις (C). μπαρ κλίμακας αντιπροσωπεύει 50 μm. Τα δεδομένα εμφανίζονται σαν μέσες τιμές +/- S.E.M. *** P & lt? 0.001 και N.S. δεν αντιπροσωπεύει σημαντική (p & gt? 0,05). όπως εκτιμήθηκε με μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA), πυρήνες αντίθετα με Hoechst 33342 (μπλε)

Η

Συζήτηση

Το μικροπεριβάλλον του όγκου είναι ένα κρίσιμο ρυθμιστή του σχηματισμού όγκων και συντήρησης με συνεισφορές σε θεραπευτική ανταπόκριση και την αποτυχία. Ωστόσο, πολλές μελέτες CSC και του όγκου του εγκεφάλου δεν έχουν κατάλληλα διαμορφωθεί το μικροπεριβάλλον. Συχνά CSC και καρκινικά κύτταρα μη-βλαστικών καλλιεργούνται σε διαφορετικές συνθήκες, που περιλαμβάνουν διάφορα μέσα μαζικής ενημέρωσης και ΚΕΠ καλλιεργείται ως σφαίρες και τα κύτταρα του όγκου μη βλαστικών καλλιεργούνται προσκολλημένα. Δεδομένου ότι αυτές οι συνθήκες ενεργοποιούν διαφορετικές οδούς κυτταρική σηματοδότηση, μερικά αποτελέσματα CSC μπορεί να οφείλεται σε τεχνούργημα του πολιτισμού και όχι εγγενή κυτταρική διαφορές. Πολλές μελέτες που πραγματοποιήθηκαν με τους πληθυσμούς σε απομόνωση, η οποία δεν επιτρέπει την σηματοδότηση μεταξύ των κυττάρων που είναι κρίσιμης σημασίας για την ανάπτυξη των κυττάρων ή την εκτίμηση της συνεισφοράς του κάθε τύπου κυττάρου στο σχηματισμό όγκων in vivo. Επιπλέον, εξειδικευμένες αλληλεπιδράσεις με στοιχεία όπως το αγγειακό σύστημα ή στρώματος δεν μπορεί να αξιολογηθεί πλήρως, εκτός εάν μελέτες που πραγματοποιήθηκαν in vivo. Για το μοντέλο καλύτερα το μικροπεριβάλλον του όγκου, έχουμε διαφορικά σημασμένα ΚΕΠ και καρκινικά κύτταρα μη βλαστικών και εισήγαγε τα κύτταρα εντός του ίδιου in vivo συνθήκες. αξιολόγησή μας ανάπτυξη παρέχει την πρώτη άμεση απόδειξη για πολλαπλασιασμό του όγκου από έναν συμπαγή όγκο CSC υποπληθυσμός in vivo χρησιμοποιώντας απεικόνιση σε πραγματικό χρόνο και δείχνει ότι ένα μικρό κλάσμα των κυττάρων του όγκου μπορεί να μεταδοθεί ένα ετερογενές όγκου. Οι μελέτες μας προσφέρουν σημαντικά πλεονεκτήματα έναντι ex vivo ή συμφωνημένα μελέτες πληθυσμού οφείλεται στην ικανότητά μας να καταλληλότερο μοντέλο της in vivo περιβάλλον και να αξιολογήσει τη συμπεριφορά των πολλών πληθυσμών σε πραγματικό χρόνο χρησιμοποιώντας υψηλής μικροσκοπία ανάλυση.

Υπάρχουν πολλές πτυχές της μοντέλα ξενομεταμόσχευση που παρέχουν δυνητικά πλεονεκτήματα, ωστόσο εξακολουθούν να υπάρχουν περιορισμοί. Εννοιολογικά, αυτές οι δοκιμασίες μεταμόσχευση προσφέρουν ένα καλύτερο in vivo περιβάλλον σε βάρος του μια εκτίμηση για ογκογόνο διεργασίες σε πραγματικό χρόνο, το οποίο μπορεί να συναχθεί μόνο μετά το σχηματισμό όγκων. Ωστόσο, αυτό το μαύρο κουτί προσέγγιση μπορεί να αντιμετωπιστεί με τη χρήση ζωντανών απεικόνισης, όπως περιγράφεται στην παρούσα έκθεση. Χρησιμοποιώντας ζωντανή απεικόνιση, οι περιπλοκές του μοντέλου ξενομεταμόσχευση μπορεί να διευκρινιστεί και ενημερωτικό προβλέψεις μπορούν να γίνουν για την ανάπτυξη των όγκων, τη συντήρηση και την ανταπόκριση στη θεραπεία. Προσεκτική χρήση των μοντέλων ξενομεταμόσχευση θα επιτρέψει την καλύτερη κατανόηση της αλληλεπίδρασης μεταξύ των ΚΕΠ και των καρκινικών κυττάρων μη-στελέχους, καθώς και κυτταρική επικοινωνία με τα αιμοφόρα αγγεία, μια θέση CSC σε πολλές όγκων του εγκεφάλου [16]. Επιπλέον, αυτές οι προσεγγίσεις μπορεί να διευκρινίσει το πρόσφατα εντοπίστηκαν φαινόμενο της GBM CSC διαφοροποίηση σε αγγειακά κύτταρα και να αποσαφηνίσει το ρόλο αυτής της πλαστικότητας σε ογκογόνο διαδικασίες [21], [22], [23], [24]. Αξίζει να σημειωθεί ότι δεν παρατηρήσαμε ενσωμάτωση των σημασμένων κυττάρων στο αγγειακό τοίχωμα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτές οι αγγειακές αλληλεπιδράσεις έχουν εκτεταμένες θεραπευτικές επιπτώσεις ιδίως στο πλαίσιο της αγγειογένεσης όπου πολλές θεραπείες είναι υπό διερεύνηση. Επιπλέον, μια μεγαλύτερη εκτίμηση της αλληλεπίδρασης μεταξύ του μικροπεριβάλλοντος και μεταμοσχευμένων κυττάρων όγκου μπορεί να βοηθήσει να εξηγήσει την καθυστέρηση στην ανάπτυξη του όγκου σε μοντέλα μεταμόσχευσης. Αυτό τονίζεται από τις παρατηρήσεις μας φαίνεται στο Σχήμα 1, όπου η ανάπτυξη CSC μεταξύ ημερών 35 έως 38 ημερών είναι αρκετά αξιοσημείωτο, αλλά σύμφωνες με τη δυναμική της ανάπτυξης του όγκου σε ένα μοντέλο μεταμόσχευσης [25], [26]. Οι διαφορές αυτές είναι πιθανό να είναι μια αντανάκλαση μιας διαδικασίας πολλών σταδίων που περιλαμβάνει την επιβίωση των κυττάρων του όγκου, την προσαρμογή στο περιβάλλον ξενιστή, που ακολουθείται από την εκθετική αύξηση, η οποία μπορεί να προεκταθεί για την κατανόηση υποτροπών σε ασθενείς.

Τα δεδομένα μας επίσης αποδεικνύουν ότι μια τέτοια προσέγγιση μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να καθορίσει την καλύτερη καρκίνο κυτταρική ετερογένεια, η οποία θα είναι κρίσιμη τόσο για τη βασική κατανόηση της ογκογένεσης και ένα μοντέλο για τη δοκιμή πιο κατάλληλα ελπιδοφόρο προ-κλινικές θεραπείες. Στις μελέτες μας, τα προκύπτοντα όγκων που σχηματίζονται περιείχε ένα ετερογενή πληθυσμό, όπως αξιολογείται με έκφραση Sox2, παρά τη σημαντική αντιπροσώπευση των κυττάρων YFP (CSC προέρχονται). Αυτό το είδος της in vivo γράμμωσης ιχνηλάτηση έχει περιοριστεί σε μελέτες GBM και τα αποτελέσματά μας επιβεβαιώνουν ότι ΚΕΠ εκφράζει ένα δείκτη βλαστικών κυττάρων μπορεί να παράγει κύτταρα που δεν εκφράζουν το δείκτη βλαστικών κυττάρων, καταδεικνύοντας τη μετάβαση μεταξύ των βλαστικών κυττάρων μελών in vivo. Προ-κλινικές μελέτες βασίζονται στο μέγεθος του όγκου ως εκτίμηση της αποτελεσματικότητας. επίδειξη μας ότι ένα μικρό κλάσμα των καρκινικών κυττάρων διαδίδεται ενός όγκου in vivo αντιπροσωπεύει μια συμπληρωματική προσέγγιση για την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας ενός δεδομένου θεραπεία με γενεαλογία ιχνηλάτηση. Λαμβάνονται σε κλινικό πλαίσιο, μια θεραπεία που σκοτώνει την πλειοψηφία των κυττάρων και αφήνει πίσω του ένα μικρό πληθυσμό των πυρίμαχων κυττάρων (πιθανόν να εμπλουτιστεί στο ΚΕΠ) θα εμφανιστεί αποτελεσματική, εάν το μέγεθος του όγκου είναι το μετρούμενο αποτέλεσμα. Ωστόσο, τα υπόλοιπα κύτταρα, μερικά από τα οποία είναι ΚΕΠ, είναι πιθανό να συμβάλλουν στην υποτροπή του όγκου, όπως συχνά παρατηρείται σε ασθενείς μετά από θεραπείες αποτελεσματική στη μείωση του μεγέθους του όγκου [27]. Ως εκ τούτου, την αξιολόγηση των κυτταρικών σειρών σε όγκο μετά τη θεραπεία σε συνδυασμό με την αξιολόγηση του μεγέθους του όγκου και ιστολογική ανάλυση είναι πιθανό να παρέχει μια πιο ακριβή εικόνα των επιπτώσεων της θεραπείας. Η ικανότητα να αξιολογήσει τη συμπεριφορά των κυττάρων όγκου η ίδια σε ένα σχετικό κλινικό μοντέλο είναι πολύτιμη. Τα δεδομένα μας (αυτή η έκθεση και [11], [28]) και εκείνων που προέρχονται από άλλες ομάδες [16] δείχνουν ότι τα καρκινικά κύτταρα έχουν μια οικεία σχέση με το αγγειακό σύστημα? Ωστόσο, η FDA ενέκρινε αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα κυττάρων (VEGF) εξουδετέρωσης bevacizumab αντίσωμα (Avastin) είχε μικτή επιτυχία κλινικά, παρά την επιτυχία σε προ-κλινικά μοντέλα [29]. Αντοχή σε αντι-VEGF θεραπεία είναι αξιωματική να συμβεί μέσω της φοροδιαφυγής ή αδιαφορία και περιλαμβάνει διαμορφωμένο αγγειογένεση, αγγειακού συστήματος, αγγειακή εξομάλυνση [30], [31]. Ωστόσο, ο κυρίαρχος τρόπος αντίστασης είναι ακόμα να προσδιοριστεί και η προσέγγισή μας με τη χρήση πολλαπλών κυτταρικών πληθυσμών του όγκου και υψηλής ανάλυσης in vivo μικροσκοπία είναι πιθανό να προσφέρει κρίσιμη διορατικότητα. Για μεγαλύτερη επίδραση, αυτές οι μέθοδοι μπορούν να συνδυαστούν με τη χρήση του φθορίζοντος συστημάτων αναφοράς για την αξιολόγηση της μεταγραφικής δραστικότητας σε πραγματικό χρόνο και σε συσχετισμό με θεραπευτική ανταπόκριση. Ένας άλλος τομέας στον οποίο οι εν λόγω προσεγγίσεων απεικόνισης θα είναι χρήσιμη είναι η αξιολόγηση των αναστολέων Sonic hedgehog (Shh). Δεν είναι σαφές αν ο τρόπος δράσης είναι απευθείας στα κύτταρα του όγκου, το στρώμα του όγκου, ή και τα δύο, και διερεύνηση του μηχανισμού της δράσης αποτελεί άμεση προτεραιότητα ως διάφορους αναστολείς Shh είναι επί του παρόντος υπό έρευνα για μία ποικιλία όγκων, συμπεριλαμβανομένων GBM [32] , [33].