Αφηρημένο

επιβίωση του όγκου συσχετίστηκε σημαντικά με την ανοσολογική απόκριση των ασθενών. IFNg παίζει σημαντικό ρόλο στην απόκριση ξενιστή όγκου και μειωμένη έκφραση IFNg συχνά παρατηρείται στον καρκίνο του πνεύμονα. Μελέτες έχουν δείξει ότι CpG νησίδα υπερμεθυλίωση διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην μεταγραφική σίγηση της γονιδιακής έκφρασης IFNg. Ωστόσο, υπάρχει περιορισμένη αντίληψη σχετικά με τους μοριακούς μηχανισμούς μεταβληθεί μεθυλίωσης, και αν το μικροπεριβάλλον του όγκου έχει καμία επίδραση στην μεθυλίωση του DNA και ΙΡΝγ παραγωγής. Στην παρούσα μελέτη, δείχνουμε ότι το πλάσμα και ενδο-κυτταρικών επιπέδων IFNg είναι σημαντικά χαμηλότερα σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα. Υπερμεθυλίωση του υποκινητή ΙΡΝγ σε CD4

+ Τ κύτταρα και το πλάσμα IFNg σχετίστηκε αρνητικά. CD4

+ Τ κύτταρα από υγιή άτομα συν-καλλιεργήθηκαν με κύτταρα SPC-A1 που δημιουργείται χαμηλότερα επίπεδα ΙΡΝγ μετά την ενεργοποίηση, αυξημένη έκφραση του μεθυλτρανσφερασών DNA (DNMTs), και παρουσίασε υπερμεθυλίωση του προαγωγού IFNg. Εν κατακλείδι, μειωμένη IFNg έκφραση του CD4

+ Τ κύτταρα συν-καλλιεργήθηκαν με καρκίνο του πνεύμονα σχετίζεται με υπερμεθυλίωση IFNg υποκινητή. Η μελέτη μας δείχνει ότι η αλληλεπίδραση μεταξύ του καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων και CD4

+ Τ κύτταρα επάγει DNMT έκφρασης και ΙΡΝγ υπερμεθυλίωση προαγωγού σε CD4

+ Τ κυττάρων, η οποία μπορεί να χρησιμεύσει ως ένα σημαντικό μηχανισμό του όγκου που προκαλείται από ανοσοκαταστολή.

Παράθεση: Wang F, Xu J, Zhu Q, Τσιν Χ, Cao Υ, Lou J, et al. (2013) Ελάττωση της ΙΡΝγ σε CD4

+ Τ κύτταρα στον καρκίνο του πνεύμονα μέσω υπερμεθυλίωση: Ένας πιθανός μηχανισμός των όγκων-επαγόμενη ανοσοκαταστολή. PLoS ONE 8 (11): e79064. doi: 10.1371 /journal.pone.0079064

Επιμέλεια: Javier Σ Castresana, Πανεπιστήμιο της Ναβάρα, Ισπανία

Ελήφθη: 2 Ιουλ 2013? Αποδεκτές: 24 του Σεπτεμβρίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 11 Νοεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 81371894, 81272324, 81201359, 81101322), Key Εργαστήριο Εργαστήριο Ιατρικής της επαρχία Jiangsu της Κίνας (Αρ XK201114), ένα έργο που χρηματοδοτείται από την Προτεραιότητα Ακαδημαϊκό Πρόγραμμα Ανάπτυξης των Jiangsu Τριτοβάθμιας Εκπαίδευσης ιδρύματα. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του πνεύμονα έχει ένα μικρό ποσοστό επιβίωσης 5 ετών, δεδομένου ότι είναι δύσκολο να εντοπιστεί και τη θεραπεία σε πρώιμο στάδιο [1]. Αν και οι μηχανισμοί για την έναρξη του καρκίνου του πνεύμονα δεν είναι πλήρως κατανοητοί, πιστεύεται ότι ο όγκος διαφεύγει της ανοσολογικής επίβλεψης [2].

Οι κυτοκίνες είναι μέρος ενός σύνθετου ανοσοαπόκριση που μπορεί να βοηθήσει την ανάπτυξη του καρκίνου, καθώς και την εξάλειψή της. Υπάρχει στενή σχέση μεταξύ της εξέλιξης του όγκου και απορύθμιση της έκφρασης κυτοκίνης, όπως φαίνεται για IFNg, ΤΟΡ-β, και IL-17 [3], [4]. Μεταξύ αυτών των κυτοκινών, ΙΡΝγ, ο οποίος ανακαλύφθηκε το 1965, έχει μια φήμη για την παροχή βοήθειας στην προστασία από νεοπλασματική νόσο. IFNg αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό, ευαισθητοποιεί κύτταρα όγκου σε απόπτωση, μέχρι ρυθμίζει MHC τάξης Ι και τάξης II έκφραση, και διεγείρει το ανοσοποιητικό αντικαρκινική δραστικότητα [5], [6]. έχουν μειωμένα επίπεδα στον ορό IFNg έχουν συνδεθεί με βραχύτερη επιβίωση στον καρκίνο του πνεύμονα [7]. Ως εκ τούτου, αποσαφήνιση των μοριακών μηχανισμών IFNg στην ογκογένεση είναι κρίσιμης σημασίας να υπάρχει περισσότερο σαφή κατανόηση της παθογένεσης των όγκων.

έχουν επιγενετικές μεταβολές όπως τροποποιήσεις των ιστονών, μεθυλίωση του DNA, και παραλλαγές στη δομή της χρωματίνης έχει αποδειχθεί ότι είναι σημαντικό για την η επιλεκτική μεταγραφή των γονιδίων κυτοκίνης σε υποσύνολα Τ κυττάρων. Μεταξύ αυτών, μεθυλίωση του DNA έχει μελετηθεί ευρέως σε σχέση με την έκφραση του γονιδίου κυτοκίνης [8] – [10]. Σε αυτή τη μελέτη, εξετάσαμε την αντίστροφη συσχέτιση της έκφρασης IFNg και μεθυλίωσης του DNA σε ασθενείς πνεύμονα. Το πιο σημαντικό, να αξιολογήσει κατά πόσον ο καρκίνος του πνεύμονα κύτταρα θα μπορούσαν να επηρεάσουν την κατάσταση μεθυλίωσης των κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος από τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης ΙΡΝγ, ιδρύσαμε ένα in vitro transwell σύστημα καλλιέργειας και στη συνέχεια να διερευνηθεί CpG μεθυλίωση του υποκινητή ΙΡΝγ σε CD4

+ Τ κύτταρα.

Αποτελέσματα

IFNg επίπεδα υγιών ελέγχων και καρκίνο του πνεύμονα ασθενείς

ELISA χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση των επιπέδων IFNg πλάσμα (Σχ. 1Α). Τα επίπεδα ΙΡΝγ σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα ήταν σημαντικά χαμηλότερη (69,30 ± 38,56 pg /ml) από ό, τι στους υγιείς μάρτυρες (92,62 ± 34,75 pg /ml,

P

= 0,017).

(Α) Σύγκριση των επιπέδων IFNg πλάσμα σε ομάδες μελέτης. ELISA χρησιμοποιήθηκε για να μετρηθούν τα επίπεδα ΙΡΝγ στο πλάσμα σε 30 ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα και 30 υγιείς μάρτυρες. επίπεδα IFNg πλάσματος σε ασθενείς και υγιείς μάρτυρες ήταν 69,30 ± 38,56 pg /ml και 92,62 ± 34,75 pg /ml αντίστοιχα (*

P

= 0,017). (Β) Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα της έκφρασης IFNg με CD4

+ Τ κύτταρα από ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα (n = 2) και των υγιών μαρτύρων (n = 2). (Γ) Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής των επιπέδων IFNg σε ομάδες μελέτης. Τα δεδομένα είναι το άτομο συχνότητα από ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα (n = 9) και των υγιών μαρτύρων (n = 9). Οριζόντιες μπάρες δείχνουν σημαίνει ότι η ομάδα. Ανεξάρτητη t τεστ χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό

P

αξιών (***

P

& lt? 0.001).

Η

ΙΡΝγ παράγεται κυρίως από CD4

+ Τ κύτταρα, αλλά επίσης από τα κύτταρα ΝΚ και CD8

+ Τ κύτταρα. Προκειμένου να εκφραστεί IFNg έκφραση σε CD4

+ Τ κύτταρα, αξιολογήσαμε CD4

+ Τ κύτταρα με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. PBMCs από τους 9 ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα και 9 υγιείς μάρτυρες συλλέχθηκαν και IFNg ανιχνεύθηκαν. Μια χαμηλότερη συχνότητα IFNg παραγωγή CD4

+ Τ κύτταρα ανιχνεύθηκαν σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα σε σύγκριση με υγιείς μάρτυρες (Σχήμα 1Β-C, P & lt?. 0.001).

IFNg γονίδιο υποκινητή της μεθυλίωσης συσχετίζεται αρνητικά με IFNg Επίπεδα

CD4

+ Τ κύτταρα απομονώθηκαν από PBMCs από τους 11 ασθενείς και 10 ελέγχους. IFNg περιοχές προαγωγού γονιδίου 526 bp σε μήκος εξετάσθηκαν με όξινο θειώδες σειράς PCR. 15 αντίστροφη αλληλουχίες κλώνου κάθε δείγματος βαθμολογήθηκαν για το προφίλ τους σε μεθυλίωση CpG θέσεις -295, -186, -54, 122, 128 και 171 σε σχέση με τη θέση έναρξης μεταγραφής (Εικ. 2Α).

(Α) Α 526-bp περιοχής του υποκινητή IFNg ενισχύθηκε με PCR από το κατεργασμένου με όξινο θειώδες αντίστροφη κλώνου. Μεθυλιωμένος κυτοσίνες ανθεκτικά σε κατεργασία όξινου θειώδους βαθμολογήθηκαν από 15 κλωνοποιημένες αλληλουχίες PCR για κάθε άτομο και σημειώνονται στο γονίδιο χάρτη ως CpG (τετράγωνα). (Β) Gene χάρτης της μεθυλιωμένης υποκινητή IFNg σε CD4

+ Τ κύτταρα από δέκα υγιείς μάρτυρες. Ο βαθμός μεθυλίωσης σε κάθε θέση CpG απεικονίζεται από τη δύναμη της σκίασης. (C) Gene χάρτης της μεθυλιωμένης υποκινητή IFNg σε CD4

+ Τ κύτταρα από 11 διαφορετικούς ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα. Ο βαθμός μεθυλίωσης σε κάθε θέση CpG απεικονίζεται όπως περιγράφεται στο Β (Δ) IFNg μεθυλίωση των CpG θέσεων στον προαγωγό IFNg του CD4

+ Τ κυττάρων ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα και υγιών μαρτύρων. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι το ποσοστό μεθυλίωσης για κάθε χώρο IFNg υποστηρικτής CpG. Μια Chi-τετράγωνο τραπέζι δοκιμή έκτακτης ανάγκης χρησιμοποιήθηκε για να εκχωρήσετε

P

τιμές για τους ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα vs υγιείς μάρτυρες. Συγκρίσεις μετά από να σημειώσει τις ονομαστικές μεταβλητές για τους ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα /υγιείς μάρτυρες και μεθυλιωμένα /μη μεθυλιωμένα σε συνεχή δεδομένα για κάθε θέση CpG (ράβδοι σφάλματος, SD, *,

P

& lt? 0,05? **,

P

& lt? 0,01, ***

P

& lt? 0.001). (Ε) Ανάλυση συσχέτισης για το συνολικό επί τοις εκατό μεθυλίωσης με τις συγκεντρώσεις στο πλάσμα IFNg σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα. Η συσχέτιση αναλύθηκε με συντελεστή Spearman του.

Η

Bisulfite αλληλουχία του υποκινητή IFNg από ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα (n = 165 κλώνοι) αποκάλυψε ένα σημαντικά υψηλότερο βαθμό μεθυλίωσης σε θέσεις CpG σε σχέση με εκείνες σε υγιείς μάρτυρες ( n = 150 κλώνοι). Σύνολο μεθυλίωση σε θέσεις CpG σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα και των υγιών μαρτύρων ήταν 85,4% και 71,4%, αντίστοιχα (

P

& lt? 0.001) (Πίνακας 1). Συγκρίναμε το ποσοστό των ειδικών θέσεων μεθυλίωσης CpG για κάθε δείγμα. Ο υποκινητής IFNg του CD4

+ Τ κύτταρα εμφανίζονται υπερμεθυλίωση σε 6 θέσεις CpG σε ασθενείς σε σύγκριση με υγιείς μάρτυρες (Εικ. 2Β, 2C). Ειδικότερα, CpG μεθυλίωση στον υποκινητή IFNg του ασθενούς CD4

+ Τ κυττάρων ήταν σημαντικά υψηλότερη στις θέσεις -186, -54, 122, 128 και 171 (ρ & lt? 0,01) από Pearson Chi-square test (Σχ . 2D). Μεταξύ αυτών των θέσεων, θέσεις πρόσδεσης μεταγραφικού παράγοντα συμβεί σε -186, -54, με τοποθεσίες σε 122, 128 εγγύς προς τη θέση έναρξης της μεταγραφής.

Η

Για να αξιολογηθεί περαιτέρω η επίδραση της μεθυλίωσης στο IFNg έκφρασης , θα υπολογίζεται η συσχέτιση μεταξύ της συγκέντρωσης IFNg πλάσμα και ποσοστό μεθυλίωσης σε ασθενείς. Οι συγκεντρώσεις πλάσματος IFNg συσχετίζεται αρνητικά με το ποσοστό της μεθυλίωσης υποκινητή IFNg σε ασθενή CD4

+ Τ κύτταρα (r = -0.797,

P

= 0,004, σχ. 2Ε).

Καταστέλλεται ΙΡΝγ έκφραση των CD4

+ Τ κυττάρων στο σύστημα καλλιέργειας SPC-Α1 Transwell

Ένα σύστημα φρεατίων καλλιέργειας χρησιμοποιήθηκε για να διερευνήσει την επίδραση της καρκινικής κυτταρικής γραμμής πνεύμονα SPC-A1 για ΙΡΝγ έκφραση των CD4

+ Τ κύτταρα (Σχ. 3Α). CD4

+ Τ κύτταρα που απομονώνονται από το σύστημα καλλιέργειας transwell με SPC-Α1 έδειξε φτωχή παραγωγή ΙΡΝγ μετά αντι-CD3 διέγερση για 6 ώρες ή 24 ώρες. Σε αντίθεση, CD4

+ Τ κύτταρα καλλιεργήθηκαν απουσία του SPC-Α1 έδειξε μια έντονη απόκριση IFNg μετά αντι-CD3 διέγερση για 6 ώρες ή 24 ώρες. (

P & lt?

0,05?

P & lt?

0.05, Σχήμα 3Β.). Αποτελέσματα ποσοτικής ανάλυσης RT-PCR έδειξε επίσης ότι CD4

+ Τ κύτταρα καλλιεργήθηκαν απουσία του SPC-Α1 έδειξε μια έντονη έκφραση IFNg mRNA μετά αντι-CD3 διέγερση για 6 ώρες ή 24 ώρες, σε σύγκριση με CD4

+ Τ κύτταρα συν-καλλιεργήθηκαν με SPC-Α1 (

Διπλώστε = 2,37, P & lt?

0,05?

Διπλώστε = 2,37, P & lt?.

0.05, Σχήμα 3C).

( Α) CD4

+ Τ κύτταρα συν-καλλιεργήθηκαν με SPC-Α1. CD4

+ Τ κύτταρα (6 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο) και SPC-Α1 (2 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο) αναπτύχθηκαν χωρίζονται από ένα ένθετο 0,4 μm πόρου σε πλάκες καλλιέργειας 24 φρεατίων . κύτταρα SPC-A1 αναπτύχθηκαν στα εξωτερικά φρεάτια και CD4

+ Τ κύτταρα αναπτύχθηκαν σε εναιώρημα σε εσωτερικά φρεάτια. (Β) παραγωγή ΙΡΝγ σε CD4

+ Τ κύτταρα καλλιεργήθηκαν με ή χωρίς SPC-Α1. Τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν μετά αντι-CD3, ή CD28 διέγερση για 6 ή 24 ώρες, και IFNg ανιχνεύθηκε με ELISA. Τα αποτελέσματα είναι από πειράματα που πραγματοποιήθηκαν σε CD4

+ Τ κυττάρων από 6 υγιείς εθελοντές (ράβδοι σφάλματος, SD). ανάλυση (C) Ποσοτική RT-PCR των μεταγραφημάτων IFNg από CD4

+ Τ κύτταρα καλλιεργήθηκαν με ή χωρίς SPC-Α1. RNA απομονώθηκε μετά από αντι-CD3, ή CD28 διέγερση για 6 ή 24 ώρες. Τα αποτελέσματα είναι από πειράματα που πραγματοποιήθηκαν σε CD4

+ Τ κυττάρων από 6 υγιείς εθελοντές. IFNg επίπεδα αυξήθηκαν 2,37 φορές όταν διεγείρονται για 6 ώρες σε CD4

+ Τ κύτταρα καλλιεργούνται χωρίς SPC-Α1 σύγκριση με CD4

+ Τ κύτταρα που αναπτύσσονται με SPC-Α1.

Η

υπερμεθυλίωση Καθεστώς ο IFNg υποστηρικτής σε CD4

+ Τ κύτταρα συν-καλλιεργήθηκαν με SPC-A1

η κατάσταση μεθυλίωσης του υποκινητή IFNg σε CD4

+ Τ κύτταρα καλλιεργήθηκαν με και χωρίς κύτταρα SPC-Α1 αξιολογήθηκε. Ο προαγωγός που εμφανίζεται υπερμεθυλίωση μετά συν-καλλιεργήθηκαν με κύτταρα SPC-A1 (n = 90 κλώνοι), έδειξε μια έντονη αντίθεση με το CD4

+ Τ κύτταρα καλλιεργήθηκαν χωρίς κύτταρα SPC-A1 (n = 90 κλώνοι). Το ποσοστό των CpG θέσεων σε CD4

+ Τ κύτταρα καλλιεργήθηκαν με ή χωρίς SPC-Α1 ήταν 85,4% και 70,9%, αντίστοιχα. Ο αριθμός των μεθυλιωμένων και μη-μεθυλιωμένων sites βαθμολογήθηκε και ανάλυση Chi-square χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογήσει τιμές ρ (***

P

& lt? 0.001) (Πίνακας 2). Στη συνέχεια έγινε σύγκριση της επί τοις εκατό των ειδικών θέσεων μεθυλίωσης CpG για κάθε ομάδα (Σχ. 4Α, Β). Το ποσοστό μεθυλίωσης στον υποκινητή IFNg ήταν 80.0% -95.5% και 64,4% -78,9%, με και χωρίς SPC-Α1 συν-καλλιέργεια, αντίστοιχα. Οι θέσεις CpG στις θέσεις -295, -186, -54, 128 και 171, ειδικότερα, εμφανίζονται σημαντικές διαφορές (Εικ. 4C).

(Α) Gene χάρτης της μεθυλιωμένης υποκινητή IFNg σε CD4

+ Τ κύτταρα που καλλιεργήθηκαν χωρίς SPC-Α1 από 6 υγιείς εθελοντές. Ο βαθμός μεθυλίωσης σε κάθε θέση CpG απεικονίζεται από τη δύναμη της σκίασης. (Β) Gene χάρτης της υπερμεθυλιωμένων υποκινητή IFNg σε CD4

+ Τ κύτταρα καλλιεργήθηκαν με SPC-Α1 από 6 υγιείς εθελοντές. Ο βαθμός μεθυλίωσης σε κάθε θέση CpG απεικονίζεται από τη δύναμη της σκίασης. (C) Μεθυλίωση CpG θέσεων στον υποκινητή IFNg ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ CD4

+ Τ κύτταρα καλλιεργήθηκαν με ή χωρίς κύτταρα SPC-Α1. Γράφημα που συνοψίζει το ποσοστό των μετουσιωμένο ιστοσελίδα CpG που παρατηρείται σε κάθε θέση που αναλύθηκαν. IFNg προαγωγός υπερμεθυλίωση δείχνει μεταξύ CD4

+ Τ κύτταρα καλλιεργήθηκαν με κύτταρα SPC-A1 σύγκριση με CD4

+ Τ κύτταρα καλλιεργήθηκαν χωρίς κύτταρα SPC-Α1. Chi-τετράγωνο τραπέζι δοκιμή έκτακτης ανάγκης χρησιμοποιήθηκε για να εκχωρήσετε

P

τιμές. Σύγκριση των CD4

+ Τ κύτταρα που καλλιεργήθηκαν με κύτταρα SPC-Α1 vs CD4

+ Τ κύτταρα που καλλιεργήθηκαν χωρίς κύτταρα SPC-Α1 (ράβδοι σφάλματος, SD,

*

P

& lt? 0,05?

**

P

& lt? 0,01). (D) Συνολική εκχύλιση RNA και ποσοτική RT-PCR πραγματοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση των επιπέδων DNMT1 και DNMT3b mRNA. Τα επίπεδα mRNA κανονικοποιήθηκαν σε β-ακτίνη. Είχαν έδειξε να είναι οι αναλογίες CD4

+ Τ κύτταρα καλλιεργήθηκαν με ή χωρίς κύτταρα SPC-Α1, από τρία ανεξάρτητα πειράματα, εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD.

Η

DNMT1 και DNMT3b τα επίπεδα mRNA σε CD4

+ Τ κύτταρα που καλλιεργήθηκαν με κύτταρα SPC-Α1 ήταν μέχρι ρυθμιζόμενη σε σύγκριση με CD4

+ Τ κύτταρα καλλιεργήθηκαν μόνο (DNMT1 φορές = 2,7,

P

& lt? 0,05? DNMT3b φορές = 2.2,

P

& lt?. 0.05)

Συζήτηση

Μια σαφέστερη εικόνα της δυναμικής σχέσης μεταξύ του ανοσοποιητικού συστήματος του ξενιστή και την ανάπτυξη του όγκου αναδύεται ως τα κύτταρα και τα μόρια που συμμετέχουν σε φυσική αντινεοπλασματική ανοσοαπόκριση είναι να αναγνωρίζεται [11], [12]. Υποδοχής ενεργοποίηση του ανοσοποιητικού συστήματος με IFNg είναι ζωτικής σημασίας για μια απόκριση κατά του όγκου. Πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι IFNg είναι ζωτικής σημασίας για την επιτήρηση του όγκου από το ανοσοποιητικό σύστημα και ότι υπήρχε μεγάλη συσχέτιση μεταξύ της παραγωγής ΙΡΝγ και υποχώρηση του όγκου κατά τη διάρκεια της ανοσοθεραπείας [5]. Ποντικοί που στερούνται ή ανεπάρκεια σε ταχύτερα IFNg υποδοχείς ή STAT1 ανέπτυξαν όγκους, και είχε μια υψηλότερη συχνότητα των όγκων από τα ποντίκια άγριου τύπου μετά από πρόκληση με μεθυλοχολανθρένιο [13], [14].

Είναι γνωστό ότι η έκφραση κυτοκίνης ελέγχεται μέσω ενός δικτύου των μεταγραφικών παραγόντων και επιγενετικές τροποποιήσεις [15] – [18]. Ανθρώπινα μελέτες έχουν δείξει ότι η παραγωγή ΙΡΝγ σε ενήλικες περιφερικό αίμα και αίμα ομφάλιου λώρου ρυθμίζεται από CpG μεθυλίωση σε θέσεις εντός ή πλησίον του υποκινητή IFNg σε CD4

+ /CD45RO

– Τ κύτταρα [19], [20]. Επιπλέον, ένας ρόλος για μεθυλίωση προαγωγού IFNg στο σύνδρομο ατοπική έχει προταθεί [21], η οποία επεσήμανε μεθυλίωση ως μηχανισμός για τον έλεγχο της έκφρασης. ασθενείς με βρογχικό άσθμα εμφανίζουν υπερμεθυλίωση του γονιδίου ΙΡΝγ σε CD4

+ Τ κυττάρων μετά από πρόκληση με αλλεργιογόνο που συσχετίζεται με μειωμένη έκφραση IFNg [22], [23]. Παρόμοια ευρήματα έχουν επίσης αναφερθεί σε PBMCs από οξεία-επί-χρόνιας ηπατίτιδας Β ηπατική ανεπάρκεια και ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου [24], [25]. Όλες αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν μεθυλίωση του DNA είναι ένα σημαντικό επιγενετική μηχανισμό που περιλαμβάνει στη ρύθμιση της έκφρασης ΙΡΝγ.

Στη μελέτη μας, παρατηρήσαμε μειωμένα επίπεδα ΙΡΝγ πλάσματος και ενδοκυτταρική ΙΡΝγ σε CD4

+ Τ κύτταρα από καρκίνο του πνεύμονα ασθενείς. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι IFNg εκφράζεται κάτω στον καρκίνο του πνεύμονα. Μια συσσώρευση σώμα των στοιχείων έχει ενοχοποιηθεί CpG μεθυλίωση του υποκινητή IFNg ως σημαντικός αρνητικός ρυθμιστής της μεταγραφής της παραγωγής ΙΡΝγ σε ανθρώπινα Τ κύτταρα [26], [27]. Στην παρούσα μελέτη, εφαρμόσαμε θειώδους αλληλουχίας για τον προσδιορισμό της κατάστασης μεθυλίωσης CpG του υποκινητή IFNg. Παρατηρήθηκε μία σημαντική αρνητική συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων πλάσματος IFNg και συνολική μεθυλίωση IFNg υποκινητή σε CD4

+ Τ κύτταρα των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα. Στο καλύτερο της γνώσης μας, αυτή είναι η πρώτη μελέτη που να υποδηλώνουν ότι η μεθυλίωση IFNg προαγωγού μπορεί να επηρεάσει IFNg έκφραση στον καρκίνο του πνεύμονα. Τα αποτελέσματά μας συμφωνούν με τα ευρήματα ότι η κατάσταση επιγενετική μεθυλίωσης του ΙΡΝγ μπορεί να παίξει καθοριστικό ρόλο στη διαμόρφωση του βλεννογόνου έκκρισης κυτοκινών [28], καθώς και σε ασθενείς με βρογχικό άσθμα [22].

Συγκρίναμε επίσης την κατάσταση μεθυλίωσης αρκετών CpG sites. Σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα, πέντε από τις έξι CpG περιοχές (-295, -186, -54, 122, 128, 171) που αναλύθηκαν ήταν σημαντικά υπερμεθυλίωση (η μόνη εξαίρεση ήταν το site -295). Ειδικότερα, ο βαθμός της μεθυλίωσης αυξημένη ευδιάκριτα στα 122, και 128, γεγονός που υποδηλώνει μια στενή σχέση με την έκφραση IFNg. Βρήκαμε μια εξέχουσα αύξηση του βαθμού μεθυλίωσης στις θέσεις -295, -186, -54, 128 και 171 (χωρίς αλλαγή στη θέση 122) σε CD4

+ Τ κύτταρα συν-καλλιεργήθηκαν με το κύτταρο αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα γραμμή SPC-Α1. Συγκεκριμένα, ο βαθμός μεθυλίωσης αυξήθηκε περίοπτη θέση στις θέσεις -54, 128, και 171. Αυτό το αποτέλεσμα έδειξε μια μικρή διαφορά από το αποτέλεσμα που παρατηρείται σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα, καθώς η ύπαρξη του περιβάλλοντος διακύμανση μεταξύ των in vitro και in vivo κατάσταση.

Υπάρχει μεγάλο ενδιαφέρον για την καλύτερη κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που οδηγούν σε αλλαγμένη μεθυλίωση της ο υποκινητής του γονιδίου ΙΡΝγ κατά την διάρκεια ογκογένεσης [29], [30]. Μέχρι πρόσφατα, υπήρχε λίγα στοιχεία σχετικά με το εάν ο καρκίνος του πνεύμονα κύτταρα δρουν άμεσα στα κύτταρα του ανοσοποιητικού να επάγουν υπερμεθυλίωση του προαγωγού IFNg. Στην έρευνά μας, η κατάσταση υπερμεθυλίωση σε CD4

+ Τ κύτταρα σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα δείχνει ότι η παρουσία των καρκινικών κυττάρων μπορεί να συμβάλλουν στην αλλαγμένη προφίλ έκφρασης.

μικροπεριβάλλοντα παίζουν έναν κρίσιμο ρόλο στην πρόοδο του όγκου, όπου το ανοσοποιητικό οι ανθεκτικών παραλλαγές όγκου επιλεγεί [31]. Που προέρχονται από όγκους διαλυτών παραγόντων ωθούν διάφορους μηχανισμούς για να ξεφύγουν από το ανοσοποιητικό επίθεση στο μικροπεριβάλλον του όγκου [32], [33]. Στο σύστημα καλλιέργειας transwell εφαρμόζεται εδώ, βρήκαμε σαφείς διαφορές στην επιγενετική ρύθμιση του υποκινητή IFNg μεταξύ CD4

+ Τ κύτταρα από υγιή άτομα καλλιεργήθηκαν με και χωρίς SPC-Α1. Το αποτέλεσμα της μεθυλίωσης υποκινητή IFNg θέσεων CpG κατέδειξε υπερμεθυλίωση ήταν παρόμοιο με αυτό που παρατηρήθηκε σε CD4

+ Τ κύτταρα των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα (85,4% έναντι 85,4%), το οποίο παράγεται χαμηλότερα επίπεδα ΙΡΝγ κατά την ενεργοποίηση. Είναι ενδιαφέρον, Janson et al είχε αναφέρει ότι διηθούν όγκο CD4

+ Τ κύτταρα ακατάλληλα υπερμεθυλίωση σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου [34].

SPC-A1 κύτταρα θα μπορούσαν να δράσουν επί CD4

+ Τ κύτταρα του υγιείς εθελοντές για να επάγει υπερμεθυλίωση χωρίς άμεση επαφή, γεγονός που υποδηλώνει την παρουσία ενός διαλυτού ανέπαφα εξαρτώμενη μικρο-παράγοντα (ες). Μελέτες έχουν δείξει ότι το DNA μεθυλίωση καταλύεται από DNMTs, συμπεριλαμβανομένης της μεθυλτρανσφεράση DNMT1 συντήρησης που δρα επί ημι-μεθυλιωμένης υποστρώματα για τη διατήρηση προτύπων μεθυλίωσης μετά την αντιγραφή του DNA [35], [36]. Επιπλέον, υπάρχουν οι de novo μεθυλτρανσφεράσες Dnmt3a και DNMT3b που καταλύουν τη μεθυλίωση του μη μεθυλιωμένου DNA [37], [38]. Μεταβολές στην έκφραση DNMT συσχετίζονται με αλλαγές στο γονιδιωματικό μεθυλίωσης του DNA, και περιγράφονται καλά σε πολλούς καρκίνους [39] – [44]. Κατά την εξέταση των προτύπων έκφρασης DNMT στο μοντέλο μας, παρατηρήσαμε μια σημαντική αύξηση στην έκφραση DNMT1 και DNMT3b mRNA σε CD4

+ Τ κύτταρα καλλιεργήθηκαν με κύτταρα SPC-Α1. Ως εκ τούτου, πιθανολογείται ότι οι διαλυτές ανέπαφα εξαρτάται από παράγοντες μπορούν να προκαλέσουν υπερμεθυλίωση του υποκινητή του ΙΡΝγ με την τόνωση της δραστηριότητας μεθυλοτρανσφεράσης DNA, το οποίο στη συνέχεια ρυθμίζουν προς τα κάτω την έκκριση ΙΡΝγ. Αυτοί οι παράγοντες μπορεί να είναι κυτοκίνες, νουκλεϊκά οξέα, ή microRNAs εκκρίνεται ή που προέρχεται από καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων [45] – [47]. Ωστόσο, θα απαιτηθούν πρόσθετες έρευνες επιβεβαιώνουν αυτή την υπόθεση. Αυτά τα in vitro αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η μεθυλίωση προαγωγού μπορεί να επηρεάσει την έκφραση ΙΡΝγ σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα. Η μεθυλίωση με τη μεσολάβηση IFNg μειώσεις μπορούν να επωφεληθούν επιβίωση του όγκου και την επαναφορά της ισορροπίας της ασυλίας του όγκου προς την εξέλιξη του όγκου.

Έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι μειωμένη έκφραση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων σχετίζεται με παρεκκλίνουσα CpG νησί μεθυλίωσης σε περιοχές υποκινητή του γονιδίου στον πνεύμονα ασθενείς με καρκίνο, και η έκφραση αυτή θα μπορούσε να αποκατασταθεί με απομεθυλίωση [48]. Αυτό πρότεινε ότι απομεθυλίωση όπως διαμεσολαβείται από 5-αζα-dC θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως μια χρήσιμη προσέγγιση για την θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα [48] – [50]. Ως εκ τούτου, η θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα μέσω απομεθυλίωσης, η οποία αυξάνει την έκφραση όχι μόνο των ογκοκατασταλτικών γονιδίων, αλλά και των γονιδίων κυτοκίνης όπως IFNg, βοηθούν στην προστασία κατά των όγκων.

Εν κατακλείδι, η μεθυλίωση προαγωγού IFNg σχετίζεται με μειωμένο IFNg έκφραση σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα. Η αλληλεπίδραση μεταξύ κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα και CD4

+ Τ κύτταρα επάγει υπερμεθυλίωση του προαγωγού IFNg σε CD4

+ Τ κύτταρα, τα οποία χρησιμεύουν ως μηχανισμός προκαλούμενης από όγκο ανοσοκαταστολή.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Αυτή η μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας της θεραπεία ανθρώπων του πρώτου Ενταγμένο Νοσοκομείο Ιατρικό Πανεπιστήμιο Nanjing (Αριθμός άδειας: 20A6-2869), και γραπτή ενημέρωσε συγκατάθεση ελήφθη επίσης από κάθε συμμετέχοντα.

η επιλογή του καρκίνου του πνεύμονα ασθενείς και υγιείς μάρτυρες

ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα (Ν = 30) και υγιείς ενήλικες (Ν = 30) ήταν από το πρώτο συνδεδεμένες νοσοκομείο της Nanjing Ιατρικό Πανεπιστήμιο (Nanjing, Κίνα). ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα διαγνώστηκαν ως καρκίνωμα από παθολογική διάγνωση. Οι ασθενείς που έλαβαν προεγχειρητική χημειοθεραπεία, ακτινοθεραπεία ή τη λειτουργία πριν από τη συλλογή δείγματος αίματος είχαν αποκλειστεί. Τα λεπτομερή κλινικά στοιχεία (συμπεριλαμβανομένης της ηλικίας, του φύλου, το ιστορικό καπνίσματος) ελήφθησαν από τα ιατρικά αρχεία του κάθε αντικειμένου και παρατίθενται στον Πίνακα 3. Μεταξύ των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα, υπήρξαν 24 περιπτώσεις αδενοκαρκινώματος, 2 περιπτώσεις πλακώδους καρκινώματος, 2 περιπτώσεις καρκινώματος φατνιακού κυττάρων , και 2 περιπτώσεις ελάχιστα διαφοροποιημένο καρκίνωμα.

η Συλλογή

δείγμα αίματος και Επεξεργασίας

φλεβικό αίμα (10 ml) με EDTA-K

2 συλλέχθηκε από υγιείς ελέγχους και τους πνεύμονες ασθενείς με καρκίνο πριν από τη λειτουργία. Το πλάσμα διαχωρίστηκε και αποθηκεύτηκε στους -70 ° C πριν από τη μέτρηση IFNg. Μονοπυρηνικά κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMCs) διαχωρίστηκαν με φυγοκέντρηση διαβάθμισης πυκνότητας Ficoll-Hypaque (GE Health Care Life Sciences, Piscataway, NJ, USA). CD4

+ Τ κύτταρα απομονώθηκαν από PBMCs χρησιμοποιώντας ένα CD4-θετικά κιτ απομόνωσης (Dynal, Όσλο, Νορβηγία). Η καθαρότητα των απομονωμένων CD4

+ Τ κυττάρων προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας ΡΕ-συζευγμένο αντι-CD4 (Beckman, Μασσαλία, Γαλλία). CD4

+ Τ κύτταρα στη συνέχεια συλλέγονται για την εκχύλιση του DNA, τροποποίηση όξινου θειώδους, και αλληλούχιση.

Γραμμές κυττάρων και συνθήκες καλλιέργειας

Η ανθρώπινη κυτταρική σειρά NSCLC SPC-Α1 αγοράστηκε από την κινεζική Ακαδημία Επιστημών στη Σαγκάη, και καλλιεργήθηκαν σε 5% CO

2 σε RPMI 1640 με 2 mmol /L Ε-γλουταμίνη, 10% ορό εμβρύου μόσχου (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), πενικιλλίνη G (50 U /mL ), και στρεπτομυκίνη (50 μg /mL).

CD4

+ Τ κύτταρα συν-καλλιεργήθηκαν στο σύστημα Καλλιέργεια Transwell

πειράματα

Transwell διεξήχθησαν σε πλάκες 24 φρεατίων με μέγεθος πόρων 0,4 μm (Corning Costar, Coming, ΝΥ, USA). κύτταρα SPC-Α1 (2 × 10

5) καλλιεργήθηκαν στα εξωτερικά φρεάτια πλάκες 24 φρεατίων σε 1640-μέσο συμπληρωμένο με 10% ανθρώπινο ορό ΑΒ. CD4

+ Τ κύτταρα (6 × 10

5) που διαχωρίζεται από υγιείς ενήλικες προστέθηκαν μέσα στα εσωτερικά φρεάτια στο ίδιο μέσο. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3, οι ομάδες ελέγχου καθορίστηκαν με CD4

+ Τ κύτταρα που αναπτύσσονταν στα εσωτερικά φρεάτια χωρίς κύτταρα SPC-Α1. Μετά από 5 ημέρες καλλιέργειας, τα CD4

+ Τ κύτταρα πλύθηκαν, και 1 × 10

6 κύτταρα συλλέχθηκαν για εκχύλιση του DNA, το υπόλοιπο ενώ μεταφέρθηκε σε πλάκες καλλιέργειας 96 φρεατίων. 5 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο διεγέρθηκαν με 1 μg /ml διαλυτό αντι-CD3 (eBioscience, San Diego, CA, USA) και 1 μg /ml διαλυτού αντι-CD28 (eBioscience) (σε συνολικό όγκο 200 μλ) επί 6 ή 24 ώρες. Μετά την τόνωση, τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν για ανίχνευση IFNg με ELISA, CD4

+ Τ κύτταρα συλλέχθηκαν για ανάλυση IFNg mRNA.

ELISA

επίπεδα ΙΡΝγ στα υπερκείμενα καλλιέργειας και πλάσματος προσδιορίστηκαν με ELISA (R &? D Systems, Minneapolis, ΜΝ, USA)., σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή

FACS Ανάλυση

PBMCs διεγέρθηκαν με ΡΜΑ (10 ng /mL). Brefeldin Α (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ, USA) προστέθηκε σε μια τελική συγκέντρωση 10 μg /ml και επωάστηκαν 4 ώρες. δείγματα PBMCs ελήφθησαν από καλλιέργειες ανταπόκριση και χρωματίστηκαν με συνδυασμό συζευγμένου με φθορόχρωμα mAbs που αποτελείται από αντι-CD8-ΡΕ-CY5 και αντι-CD3-FITC (BD PharMingen, San Diego, CA, USA). Μετά τη στερέωση και διαπερατότητα (Fix Perm, Caltag, Buckingham, Ηνωμένο Βασίλειο), τα κύτταρα βάφτηκαν με αντι-ΙΡΝγ-PE και ισοτυπική μονοκλωνικά αντισώματα (BD PharMingen). αντισώματα ελέγχου που ταιριάζουν στον ισότυπο χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί το επίπεδο της χρώσης υποβάθρου για το μίγμα mAb. Όλες οι εκδηλώσεις αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ροής FACSCalibur κυτταρόμετρο (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Τα δεδομένα αναλύθηκαν με λογισμικό Cell Quest (BD PharMingen).

Απομόνωση RNA και ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR

απομόνωση του RNA πραγματοποιήθηκε με τη χρήση miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Germantown, MD, USA) και μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας ένα κιτ αντιδραστηρίου RT PrimeScript (Takara, Tokyo, Japan) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. cDNA αναλύθηκε για την έκφραση των γονιδίων στόχων και ποσοτικοποιείται με RT-PCR χρησιμοποιώντας SYBR Premix Ex Taq ™ .Quantitative PCR πραγματοποιήθηκε σε ένα 7500 σε πραγματικό χρόνο σύστημα PCR ΑΒΙ (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Οι εκκινητές PCR που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: IFN-γ-εμπρός, 5′-GCA GGT CAT TCA GAT GTA GCG G-3 ‘? IFN-γ-αντίστροφη, 5’-TGT CTT ΚΔ TGA ΤΟΟ TCT CCA CAC-3 ‘? DNMT1 προς τα εμπρός, 5’-GAT CGA ΑΤΤ CAT GCC ΟΟΟ ΟΟΟ TAC CGC CCC AG-3 ‘? DNMT1-αντίστροφη, 5’-ATG GTG GTT TGC CTG GTG C-3 ‘? DNMT3b προς τα εμπρός, 5’-ΚΔ GCT GAA ΤΤΑ CTC ACG CCC C-3 ‘? DNMT3b-αντίστροφη, 5’-GTC TGT GTA GTG CAC ΑΓΓ ΑΑΑ GCC-3 ‘? β-ακτίνης προς τα εμπρός, 5’-ΤΟΟ CAC CCA GCA CAA TGA Α-3 ‘? β-ακτίνης αντίστροφη, 5’-CTA AGT CAT AGT CCG ΚΔ AGA AGC Α-3 ‘. τιμές Ct κανονικοποιήθηκαν προς έκφραση σε CD4

+ Τ κύτταρα χρησιμοποιώντας την 2

-ΔΔCt μέθοδο και β-ακτίνης ως το γονίδιο καθαριότητας. Τα πειράματα γίνονται εις τριπλούν, και τα αποτελέσματα από τρία ανεξάρτητα πειράματα ο μέσος όρος.

Απομόνωση DNA και Ανάλυση μεθυλίωσης

ανάλυση μεθυλίωσης διεξήχθη χρησιμοποιώντας διθειώδους προσδιορισμού αλληλουχίας. Γονιδιωματικό DNA από CD4

+ Τ κύτταρα απομονώθηκε χρησιμοποιώντας QIAamp Mini Kit (Qiagen), όπως συνιστάται από τον κατασκευαστή. Το DNA ήταν όξινο θειώδες μετατρέπεται χρησιμοποιώντας CpGenome ™ Kit τροποποίηση DNA (Millipore Corporation, Billerica, ΜΑ, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για την ενίσχυση του προαγωγέα IFNg ήταν: IFNg-εμπρός, 5′-TGT GAA TGA AGA GTT ΑΑΤ ΑΤΤ ΤΤΑ ΤΤΑ-3 ‘? ΙΡΝγ-αντίστροφη, 5’-TTG GTA GTA ΑΤΑ Γ.Ο.Σ. ΑΑΟ AGA ΑΤΤ TA-3 ‘[19]. Τα προϊόντα PCR παράγονται χρησιμοποιώντας το κατεργασμένου με όξινο θειώδες DNA ως μήτρα.

Το πιο εξέχον ζώνη PCR διαχωρίστηκε σε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 2% και καθαρίστηκαν με εκχύλιση πήγματος (Qiagen), υποβλήθηκε σε επεξεργασία με κλωνοποίησης ΤΑ χρησιμοποιώντας DNA-ουράς (Takara) και αλληλουχήθηκε επί ΑΒΙ 3730 (Applied Biosystems). Όλες οι εργασίες πραγματοποιήθηκαν από GeneScript Corporation (ένα σινο-Αμερικής κοινή επιχείρηση, Nanjing, Κίνα). Ακολουθίες αναλύθηκαν από βιοπληροφορικής λογισμικού χρωματισμών Έκδοση 1.45 (Technelysium, Νότια Μπρίσμπεϊν, Αυστραλία).

Στατιστική Ανάλυση

Όλα τα δεδομένα αναλύθηκαν με τη χρήση του SPSS 16.0 λογισμικού (IBM, Chicago, IL, USA). Ανεξάρτητες t τεστ χρησιμοποιήθηκαν για να συγκριθούν τα επίπεδα ΙΡΝγ πλάσμα και ενδοκυτταρική διαφορές μεταξύ των ασθενών και των υγιών μαρτύρων. Τα στοιχεία συνοψίζονται ως μέση τιμή ± SD. διαφορών μεθυλίωσης στον υποκινητή IFNg μεταξύ των διαφόρων ομάδων αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας Pearson Chi-square τεστ.

P

τιμές μικρότερες από 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές.

Ευχαριστίες

Είμαστε ευγνώμονες για την τεχνική υποστήριξη από το Εθνικό Key Κλινικής του Εργαστηρίου Ιατρικής της επαρχίας Jiangsu Νοσοκομείου.