Αφηρημένο

RECEPTEUR d’origine Nantais (Ron) υπερεκφράζεται σε μια ομάδα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα και δείγματα ιστών από ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος. Ron μπορεί να ενεργοποιηθεί από συνδέτη διέγερση μακροφάγων πρωτεΐνη της (MSP), ενεργοποιώντας έτσι ογκογόνο μονοπάτια σηματοδότησης. Παρεμβολής μεταξύ Ron και EGFR, c-Met, ή IGF-1 R μπορεί να παρέχει ένα μηχανισμό υποκείμενες αντοχή φαρμάκου. Έτσι, η στόχευση Ron μπορεί να αντιπροσωπεύει μία νέα θεραπευτική στρατηγική. IMC-RON8 είναι το πρώτο μονοκλωνικό αντίσωμα Ron (mAb) που εισέρχονται κλινική δοκιμή για τη στόχευση Ron υπερέκφραση. Οι μελέτες μας δείχνουν IMC-RON8 downmodulated έκφραση Ron σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα και σημαντικά μπλοκάρει MSP-διεγείρονται ενεργοποίηση Ron, κατάντη Akt και φωσφορυλίωση ERK, και την έκφραση survivin mRNA. IMC-RON8 παρεμποδίζεται MSP που προκαλείται από τη μετανάστευση των κυττάρων και μειωμένη μετασχηματισμό των κυττάρων. Οι αναστολείς της αποακετυλάσης ιστόνης (HDACi) ανέφεραν τη στόχευση της έκφρασης διαφόρων γονιδίων μέσω τροποποίησης της νουκλεοσώματος ιστονών και μη ιστονικές πρωτεΐνες. Η εργασία μας δείχνει HDACi TSA και Panobinostat (PS) μειώθηκε Ron mRNA και η έκφραση της πρωτεΐνης στα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. PS μείωσε επίσης κατάντη σηματοδότησης pAkt, survivin, και ΧΙΑΡ, καθώς και ενισχυμένη κυτταρική απόπτωση. Είναι ενδιαφέρον ότι, PS μειωμένο σχηματισμό αποικίας σε κύτταρα knockdown Ron σε μεγαλύτερο βαθμό από ό, τι Ron κύτταρα ελέγχου αγώνα στην σχηματισμό αποικίας και προσδιορισμούς μαλακή αγαρόζη. IMC-RON8 θα μπορούσε επίσης να ευαισθητοποιήσει παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα σε PS, όπως αντικατοπτρίζεται από μείωση του αριθμού και του μεγέθους σε συνδυασμένη θεραπεία με IMC-RON8 και PS σε σύγκριση με μόνη ενιαία μεταχείριση αποικία. Η συν-θεραπεία μειωθούν περαιτέρω έκφραση Ron και pAkt, και αυξημένη διάσπαση PARP σε σύγκριση με οποιαδήποτε μόνη θεραπεία. Αυτή η μελέτη προτείνει τη δυνατότητα για μια νέα προσέγγιση συνδυασμού που μπορεί τελικά να έχουν αξία στη θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος

Παράθεση:. Ζου Υ, Howell GM, Humphrey LE, Wang J, Brattain MG (2013) Ron Νοκ ντάουν και Ron μονοκλωνικό αντίσωμα IMC-RON8 ευαισθητοποιήσει καρκίνο του παγκρέατος σε αναστολείς δεακετυλάσης ιστόνης (HDACi). PLoS ONE 8 (7): e69992. doi: 10.1371 /journal.pone.0069992

Επιμέλεια: Lu-Zhe Sun, Πανεπιστήμιο του Τέξας Επιστημών Υγείας Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 29 Μάρ 2013? Αποδεκτές: 13 Ιούν, 2013? Δημοσιεύθηκε: 29 του Ιούλη του 2013

Copyright: © 2013 Ζου et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας για χρηματοδότηση: CA34432, CA38173, CA72001 και CA54807, απονέμεται σε MG Brattain. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του παγκρέατος είναι μια εξαιρετικά κακοήθης νόσος, με περίπου 40.000 νέες περιπτώσεις διαγιγνώσκονται στις ΗΠΑ το 2012 [1]. Το ποσοστό πενταετούς επιβίωσης είναι πολύ χαμηλή (& lt? 5%) [2]. Επί του παρόντος, λιγότερο από το 10% των ασθενών είναι επιλέξιμοι για θεραπευτική χειρουργική επέμβαση, ενώ περισσότερο από το 90% με τοπικά προχωρημένο ή μεταστατικό ασθένειες αντιμετωπίζονται με ακτινοθεραπεία ή /και χημειοθεραπεία [3]. Ο καρκίνος του παγκρέατος αναπτύσσεται τελικά την αντίσταση σε αυτές τις θεραπείες. Μοριακές μελέτες αποκάλυψαν ότι οι γενετικές και επιγενετικές μεταβολές οδηγούν τον καρκίνο του παγκρέατος [4]. Μια καλύτερη κατανόηση της μοριακής βάσης του καρκίνου του παγκρέατος θα ωφελήσει την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών στρατηγικών.

Πρόσφατα, Ron έχει ταυτοποιηθεί ότι υπερεκφράζεται σε ένα υποσύνολο των ασθενών με καρκίνο του παγκρέατος και καθιερωμένες κυτταρικές σειρές καρκίνου [5], [ ,,,0],6]. Ron ανήκει στην οικογένεια ΚΟΑ υποδοχέα κινάσης τυροσίνης (RTK). Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι τα επίπεδα Ron αυξημένα σε πολλές επιθηλιακούς καρκίνους συμπεριλαμβανομένου του μαστού [7], του παχέος εντέρου [8], του πνεύμονα [9], και της ουροδόχου κύστης [10] καρκίνους. Ron υπερέκφραση ήταν προγνωστικοί των φτωχών επιβίωση και συσχετίζονται με την εξέλιξη της νόσου [11].

Λειτουργικές μελέτες έδειξαν ότι ο Ron μπορεί να ενεργοποιηθεί από MSP συνδέτη της να κινήσει έναν καταρράκτη της μοριακής σηματοδότησης, συμπεριλαμβανομένης της PI3K /Akt, ΜΑΡΚ, β κατενίνης, JNK και μονοπάτια ΡΑΚ να ρυθμίζουν διάφορες κυτταρικές λειτουργίες [12]. Ο άξονας MSP /Ron έχει δειχθεί ότι επηρεάζουν την κυτταρική μετανάστευση και εισβολή, και ενδεχομένως την προώθηση μετάσταση όγκου [12], [13]. Προς τα κάτω ρύθμιση του Ron με knockdown οδήγησε σε μειωμένη πολλαπλασιασμού των κυττάρων, τον μετασχηματισμό, ανάπτυξη όγκου, μετάσταση και αυξημένη κυτταρική απόπτωση, σε καρκινικά κύτταρα κόλου [14], [15]? και ευαισθητοποιημένων παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα να γεμσιταβίνης [16]. Ως εκ τούτου, Ron παίζει σημαντικό ρόλο στη διατήρηση κακοήθων φαινοτύπων σε ανθρώπινους καρκίνους. IMC-41A10 ήταν το μόνο ανθρώπινο αντι-Ron mAb που έχει αναφερθεί ότι έχει αντικαρκινική δράση [17]. IMC-41A10 ανέστειλε MSP σύνδεση με τον Ron, μειωμένη Ron φωσφορυλίωση MSP-μεσολάβηση, PI3K /Akt και ενεργοποίηση ΜΑΡΚ, και τη μετανάστευση των κυττάρων

in vitro

. Πρόσφατα, μια νέα ανθρώπινη mAb IMC-RON8 δημιουργήθηκε και τέθηκε φάσης Ι των κλινικών δοκιμών ως το πρώτο Ron mAb.

Η αντοχή στα φάρμακα είναι ένα σημαντικό εμπόδιο στη θεραπευτική του καρκίνου. Στιχομυθία μεταξύ RTKs μπορεί να αντιπροσωπεύει έναν από τους μηχανισμούς ανθεκτικότητας στα φάρμακα. Ron έχει αναφερθεί ότι ετεροδιμερίζονται με c-Met [18], και cross-talk με EGFR [19], [20] για την ενεργοποίηση των RTKs με αμοιβαίο τρόπο. Ιντεγκρίνη και IGF1-R μπορεί επίσης να ενεργοποιήσει Ron μέσω MSP-ανεξάρτητο τρόπο [21], [22]. Η υπερέκφραση του Ron αυξημένης αντίστασης φαρμάκου σε αναστολέα IGF1-R BMS-536924 στην παιδική ηλικία σάρκωμα [23]? ενώ knockdown του Ron ευαισθητοποιημένων των ανθεκτικών κυττάρων σε BMS-536924 [23]. Τα ευρήματα αυτά υπογραμμίζουν ένα δυνητικό όφελος για την ορθολογική συνδυασμένες θεραπείες με βάση Ron δίκτυα τυροσινικής κινάσης.

επιγενετικές μεταβολές, όπως ακετυλίωση και μεθυλίωση, είναι τα βασικά μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις των ιδιαίτερα φορτισμένα κατάλοιπα λυσίνης του πυρήνα του νουκλεοσώματος ιστονών. Αλλαγές στην ακετυλίωση των ιστονών είναι υπό τον έλεγχο των αντίθετων δραστηριοτήτων acetytransferases ιστόνης (καπέλα) και αποακετυλάσες ιστόνης (HDACs) [24], ο οποίος καθορίζει την μεταγραφική ενεργοποίηση ή καταστολή της γονιδιακής έκφρασης. Καπέλα και HDACs παίζουν επίσης σημαντικό ρόλο στην ακετυλίωση και η αποακετυλίωση της ιστόνης μη πρωτεΐνες [25], [26].

Η υπερέκφραση του HDACs έχει βρεθεί στο κόλον, του μαστού, του παγκρέατος, και άλλων καρκίνων [27] – [31], που δείχνουν ότι μπορεί να είναι ελκυστική αντικαρκινική στόχους. Οι αναστολείς HDAC που αναφέρθηκαν για τη στόχευση της έκφρασης διαφόρων γονιδίων μέσω τροποποίησης της νουκλεοσώματος ιστονών και μη-ιστόνης πρωτείνες. Το παν-HDACi TSA, Vorinostat, Belinostat και Panobinostat (PS) έχουν ευρέως ερευνηθεί. PS εξασκείται ισχυρή αντικαρκινική δράση σε κύτταρα λευχαιμίας μέσω υπερακετυλίωση του νουκλεοσώματος ιστονών και μεταγραφική ρύθμιση προς τα άνω του ρ21 και ρ27 έκφρασης [32]. PS μειωμένη παγκρεατική ανάπτυξη του καρκίνου μέσω της αναστολής του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και επαγωγή της κυτταρικής απόπτωσης [33]. TSA ενίσχυσε την απόκριση του παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα με τις συμβατικές χημειοθεραπείες, συμπεριλαμβανομένων των 5-FU και γεμσιταβίνη [2], [34]. Ωστόσο, οι ακριβείς μηχανισμοί που διέπουν τη θεραπεία HDACi είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστη. εργαστήριο μας έδειξαν ότι HDACi Belinostat επάγεται η έκφραση του επιγενετικώς σιωπηλός ΤΟΡβ RII και ως εκ τούτου αποκατασταθεί ΤΟΡβ σηματοδότηση που διαμεσολαβείται αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης σε Smad4 άγριου τύπου (wt) παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα (π.χ., MIAPaCa-2), [35]. Ron εκφράζεται υψηλά σε Smad4 μεταλλαγμένο παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. έκφραση Smad4 άγριου τύπου αναφέρθηκε ότι καταστέλλει την έκφραση Ron [36]. Νοκ ντάουν της Smad4 ή την αναστολή της TGFβ σηματοδότησης είχε ως αποτέλεσμα την επαγωγή της έκφρασης Ron. Οι μελέτες εδώ δείχνουν ότι HDACi PS και TSA μειωτικά Ρον και κατάντη σηματοδότησης του σε καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος. Ron KD ή Ron mAb ευαισθητοποιημένων παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα σε PS. Προφορική PS έχει χρησιμοποιηθεί σε κλινικές δοκιμές φάσης ΙΙ σε ενήλικες ασθενείς με ανθεκτική /υποτροπιάζον Hodgkin λέμφωμα και φάσης Ι δίκη για προχωρημένους συμπαγείς όγκους [32]. Οι μελέτες μας έχουν διερευνηθεί ένα πιθανό μηχανισμό που διέπουν τη θεραπεία PS του καρκίνου του παγκρέατος και παρείχε σημαντικά στοιχεία για τη δυνατότητα μιας ορθολογικής θεραπείας συνδυασμού για Ron εκφράζουν καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταροκαλλιεργειών

Ανθρώπινο παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές Capan-1 και CFPAC-1 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD), και L3.6pl κύτταρα προέρχονταν από τον Dr. IJ Fidler [37]. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο SM (5Α ελεύθερο ορού μέσο McCoy με πυροσταφυλικό, βιταμίνες, αμινοξέα και αντιβιοτικά), συμπληρωμένο με 10% FBS. Όλα τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα και 5% CO

2 στους 37 ° C.

Αντισώματα και Αντιδραστήρια

Αντισώματα για Ron C-20, survivin, ΜΑΡΚ και pERK1 /2 αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology Inc. πολυ- (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP), pAkt (Ser

473), Akt, κασπάση 9 αντισώματα ελήφθησαν από την Cell Signaling Technology. ΧΙΑΡ αντισώματος ήταν από Abcam. Anti-pTry κλώνος 4G10 αγοράστηκε από την Millipore. Αντίσωμα για ακτίνη αγοράστηκε από την Sigma

Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη MSP αγοράσθηκε από την R &?. Συστήματα D (Minneapolis, ΜΝ) και χρησιμοποιήθηκαν σε μία συγκέντρωση 400 ng /ml σε όλα τα πειράματα. IMC-RON8 παρεσχέθη από σύστημα ImClone LLC (New York, ΝΥ). Panobinostat (PS) ελήφθη από την Selleckchem. Η τριχοστατίνη (TSA) ήταν από την Sigma-Aldrich. Τόσο PS και TSA διαλυτοποιήθηκαν σε DMSO και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C μέχρι τη χρήση.

Δημιουργία Ron Νοκ ντάουν γραμμές σταθερές κυτταρικές

Η αγωνίζομαι έκφρασης (PSR-SC) και shRNA PSR-Ron πλασμίδια που παρέχονται από τον Dr. J. Wang [15]. Για τη δημιουργία σταθερών κυτταρικών σειρών με τον Ρον χτύπησε κάτω από shRNA για τα κύτταρα L3.6pl, PSR-Ρον και ένας φορέας ελέγχου (PSR-SC) ήταν συν-επιμολύνονται σε μια κυτταρική γραμμή συσκευασίας HEK293GP μαζί με φυσαλιδώδους στοματίτιδας ιό-G (pVSV-G ) πλασμίδιο χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο επιμόλυνσης Fugene HD. Το υπερκείμενο συλλέχθηκε 48 ώρες αργότερα και χρησιμοποιήθηκαν για να μολύνουν κύτταρα L3.6pl. Πουρομυκίνη χρησιμοποιηθεί για την επιλογή μολυσμένων κυττάρων. Μεμονωμένα κύτταρα στη συνέχεια απομονώθηκαν με επίστρωση των κυττάρων συγκεντρώθηκαν σε χαμηλές πυκνότητες. Δύο κλώνοι Α6 και B21 με Ron συγκεκριμένες KD χρησιμοποιήθηκαν στις περαιτέρω μελέτες.

Ανάλυση Western Blot

Τα κύτταρα λύθηκαν σε ΝΡ40 ρυθμιστικό λύσης [50 mmol /L Tris-HCl (ρΗ 7.4) , 150 mmol /L NaCl, 0,5% ΝΡ40, 50 mmol /L NaF, 1 mmol /L Na

3νο

3, 1 mmol /L φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο, 1 mmol /L ϋΤΤ, 25 μg /mL απροτινίνη, /mL αναστολέα τρυψίνης 25 μg, και 25 μg /mL λευπεπτίνη] στους 4 ° C. Τα κυτταρολύματα υπέστησαν ζέση σε ρυθμιστικό διάλυμα πηκτώματος φόρτωσης και διαχωρίστηκαν με SDS /PAGE σε 4~15% γέλες. Μετά PAGE, οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μια μεμβράνη PVDF (Millipore). Μετά τη μεταφορά, οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% γάλα εντός TBST επί 1 ώρα. Στη συνέχεια, οι μεμβράνες ανιχνεύθηκαν με τα υποδεικνυόμενα πρώτα αντισώματα στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Μετά από πλύση τρεις φορές σε TBST, οι μεμβράνες επωάστηκαν για 1 ώρα με τα κατάλληλα συζευγμένο με HRP δεύτερα αντισώματα συγκεκριμένα είδη. Μετά από ένα άλλο τρεις φορές πλύσιμο, οι μεμβράνες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία και οπτικοποιούνται με ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (ECL) αντιδραστηρίων (Amersham).

Vitro

Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού στην χρήση του ΜΤΤ

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων αναλύθηκε χρησιμοποιώντας 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) 2,5- διφαινυλτετραζόλιο βρωμίδιο (ΜΤΤ). Εν συντομία, Capan-1, CFPAC-1 και L3.6pl κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 2000~3000 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις PS την ημέρα 2. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την αγωγή, τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με ΜΤΤ (0,5 mg /ml) για 2 ώρες στους 37 ° C. Αφού το μέσο που περιείχε ΜΤΤ απομακρύνθηκε, 150 μΐ DMSO προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο και αναμείχθηκαν στο rocker. Οι πλάκες αναγνώστηκαν στα 570 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη μικροπλάκας (Bio-Rad). Η απορρόφηση που μετρήθηκε είναι ευθέως ανάλογη με τον αριθμό των βιώσιμων κυττάρων στην καλλιέργεια.

DNA θρυμματισμού (κυτταρικός θάνατος ELISA)

Η απόπτωση προσδιορίστηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας την κατάτμηση DNA Cell Death Detection ELISA Plus kit ( Roche) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με PS, όπως περιγράφεται παραπάνω. Φορές αυξήσεις του κατακερματισμού του DNA ομαλοποιήθηκαν με τιμές ΜΤΤ από ταυτόσημες συνθήκες θεραπείας.

RNA Εκχύλιση και ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR

Ολικό RNA παρασκευάστηκε από επεξεργασμένα κύτταρα χρησιμοποιώντας την υψηλής καθαρότητας απομόνωση RNA κιτ (Roche). Η έκφραση του mRNA Ron μετρήθηκε με ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου με αντιδραστήρια TaqMan (Applied Biosystems) επί cDNAs μεταγράφεται αντίστροφα από 2 μg ολικού RNA. Το mRNA GAPDH ενισχύθηκαν ταυτόχρονα για έναν ενδογενή μάρτυρα.

Ανοσοκαθίζηση (ΙΡ)

κυτταρολύματα με 600 μg πρωτεΐνης επωάστηκαν με 10 μg σφαιρίδια αντι-Ron αντίσωμα και Sepharose όλη τη νύκτα στους 4 ° C . Την επόμενη ημέρα, τα σφαιρίδια συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση και το υπερκείμενο απομακρύνθηκε για περαιτέρω ανάλυση. Τα σφαιρίδια πλύθηκαν τρεις φορές με PBST. Μετά την τελική πλύση, τα σβωλοποιούμε σφαιρίδια επαναιωρήθηκαν σε 30 μΐ ρυθμιστικού δείγματος SDS. Τα δείγματα θερμάνθηκαν στους 95 ° C για 5 λεπτά. Τα προκύπτοντα ανοσοσύμπλοκα έτρεξαν σε μια 8% γέλη SDS-PAGE ακολουθούμενη από Ανοσοστύπωμα (ΙΒ) για ρΤγΓ και Ron.

επούλωσης Δοκιμασίες και Transwell Κινητικότητα Δοκιμασίες

Capan-1 κύτταρα σπάρθηκαν σε 60 χιλιοστά πιάτο και μεγάλωσε μέχρι συρροή. Στη συνέχεια νηστεία όλη τη νύκτα πριν από τη θεραπεία IMC-RON8 για 1 ώρα. μονοστοιβάδες κυττάρων Συρρέουσες στη συνέχεια τραυματίστηκαν χειροκίνητα από ρύγχος πιπέτας για να σχηματίσει ένα κενό. Το μέσο κυτταρικής καλλιέργειας αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο SM ακολουθούμενη από MSP διέγερση για 24 ώρες και 48 ώρες. Το κλείσιμο της πληγής παρακολουθήθηκε μέσω μικροσκοπίας.

Η μετανάστευση των κυττάρων σε απόκριση προς MSP μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα τροποποιημένο θάλαμο Boyden με 8 μm πόρου πολυανθρακικά φίλτρα transwell 6,5-mm (Corning Costar). Μετά θρυψινοποίηση, εναιωρήματα μονών κυττάρων σπάρθηκαν πάνω στα άνω θαλάμους σε μέσο SM σε πλάκες 24 φρεατίων. Chemo-προσελκυστικό MSP προστέθηκε στους θαλάμους πυθμένα, με 10% FBS χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. IMC-RON8 προστέθηκε στον άνω θάλαμο 2 ώρες πριν από την προσθήκη του MSP. Τα κύτταρα αφέθηκαν να μεταναστεύσουν προς τα κάτω θάλαμο με χημειο-προσελκυστικά. Μετά την επώαση 24h, 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζόλιο προστέθηκε στο μέσο. Τα κύτταρα επί της άνω θάλαμο του φίλτρου απομακρύνθηκαν με μια μπατονέτα, και τα κύτταρα μεταναστεύουν στο κάτω μέρος του φίλτρου οπτικοποιήθηκαν υπό το μικροσκόπιο που ακολουθείται από διαλυτοποίηση σε DMSO και ποσοτικοποίηση στα 570 nm.

Σχηματισμού Αποικίας Δοκιμασίες και μαλακή αγαρόζη Δοκιμασίες

SC κύτταρα L3.6pl και οι κλώνοι shRNA KD Α6 και B21 απλώθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων σε πυκνότητα 300 κύτταρα /φρεάτιο. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με PS την ημέρα 2 σε υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις για 48 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS τρεις φορές. Προστέθηκαν φρέσκα μέσα με 10% FBS. Μετά επιπλέον 10 ημέρες επώασης, οι αποικίες των κυττάρων έγιναν ορατά με χρώση με ΜΤΤ, που ακολουθείται από διαλυτοποίηση σε DMSO και quatifying στα 570 nm.

δοκιμασίες μαλακή αγαρόζη χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό των ιδιοτήτων μετασχηματισμού της CFPAC-1 και L3. 6pl κύτταρα παρουσία ή απουσία IMC-RON8 ή /και PS. Εν συντομία, τα κύτταρα εναιωρήθηκαν σε 2000 κύτταρα /ml σε 1 ml 0,4% αγαρόζης σε μέσο SM που περιείχε 10% FBS και επιστρώθηκαν πάνω σε 1 ml 0,8% αγαρόζης στο ίδιο μέσο σε πλάκες 6 φρεατίων. Οι πλάκες επωάστηκαν για 2 εβδομάδες στους 37 ° C με 5% CO

2 σε υγροποιημένο επωαστή. αποικίες κυττάρων έγιναν ορατά με χρώση με 0,5 mol του

σ

-iodonitrotetrazolium ιώδες (Sigma) και φωτογραφήθηκαν. Οι αριθμοί των αποικιών μετρήθηκαν. Η αγκύρωση-ανεξάρτητη ανάπτυξη των L3.6pl SC και κυττάρων Ron KD μετρήθηκαν επίσης με δοκιμασίες μαλακή αγαρόζη με ή χωρίς επεξεργασία PS.

Στατιστική Ανάλυση

Δεδομένα συνοψίστηκαν ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα ( SE). Η στατιστική σημαντικότητα υπολογίστηκε με τη χρήση του λογισμικού SPSS με τη φοιτητική

t

τεστ ή ANOVA για τον προσδιορισμό των διαφορών στα μέσα. Η σημασία έγινε δεκτή για lt

σ

τιμή

&?

0.05. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές ανεξάρτητα.

Αποτελέσματα

IMC-RON8 Downmodulated Ron Έκφραση και ανέστειλε την MSP-εξαρτώμενη Ron φωσφορυλίωση και μεταγενέστεροι Σηματοδοσίας

Για να αξιολογηθεί η επίδραση της IMC- RON8 επί της έκφρασης Ron σε Ron-υπερεκφράζουν παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, Capan-1 και CFPAC-1 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 ηΜ του IMC-RON8 για διάφορα χρονικά διαστήματα που ακολουθείται από ανάλυση κηλίδος Western. Σχήμα 1Α έδειξε ότι μείωση Ron παρατηρήθηκε μετά από αγωγή 4 ώρες με IMC-RON8 και διήρκεσε έως 48 ώρες και στις δύο κυτταρικές σειρές. IMC-RON8 στη συνέχεια αξιολογήθηκε για την ικανότητά του να μπλοκάρει την ενεργοποίηση Ron και κατάντη επενεργητές του, ΜΑΡΚ και Akt. κύτταρα CFPAC-1 στερήθηκαν ορού όλη νύκτα και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με IMC-RON8 ακολουθούμενη από MSP διέγερσης για 30 λεπτά. Τα αποτελέσματα από IP (Εικ. 1Β) έδειξε ότι η ίδια IMC-RON8 δεν προκάλεσε φωσφορυλίωση Ron, υποδεικνύοντας ότι IMC-RON8 δεν είχε αποτελέσματα αγωνιστή. Η φωσφορυλίωση της τυροσίνης του Ron αυξήθηκε σημαντικά από την MSP διέγερση, αλλά σε μεγάλο βαθμό καταργήθηκε δια κατεργασίας IMC-RON8. Μια προηγούμενη μελέτη ανέφερε ότι MSP διέγερση ενεργοποιεί Ron κατάντη σηματοδότησης PI3K /Akt και ΜΑΡΚ σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα [6]. Κατά συνέπεια, διερευνήσαμε το ρόλο του IMC-RON8 επί ΜΑΡΚ και φωσφορυλίωση της Akt σε Capan-1, L3.6pl και κύτταρα CFPAC-1. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι όλα τα παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές εξετάσαμε εμφάνισε μια ισχυρή MSP-εξαρτώμενη φωσφορυλίωση της Akt και ΜΑΡΚ, και ότι η θεραπεία με IMC-RON8 αποκλεισμένη MSP-επαγόμενη ενεργοποίηση Akt και ΜΑΡΚ σε όλες τις κυτταρικές σειρές (Σχ. 1 C). Για να προσδιορίσετε αν η ενεργοποίηση Ron μπορεί να αυξήσει survivin και της έκφρασης ΧΙΑΡ, θα αντιμετωπίζονται Capan-1 και CFPAC-1 κύτταρα με IMC-RON8 ακολουθείται από MSP διέγερση για 12 ώρες μετά την ασιτία ορού για τη διάρκεια της νύχτας. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι MSP διέγερση αυξημένη έκφραση mRNA survivin (Εικ. 1 D), αλλά δεν επίπεδο ΧΙΑΡ mRNA (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). IMC-RON8 μπορεί να εμποδίσει αυτή την αυξημένη έκφραση του mRNA της survivin. Δεν παρατηρήσαμε σημαντική αύξηση των ΧΙΑΡ και την έκφραση της πρωτεΐνης survivin μετά από MSP διέγερση στη δυτική αποτύπωση.

Α) Επίδραση του IMC-RON8 (100 nm) στην έκφραση Ron. κηλίδα Western για Ron. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Β) Επίδραση του IMC-RON8 για MSP-επαγόμενη ενεργοποίηση Ron. Τα κύτταρα στερήθηκαν ορό επί μία νύκτα και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με IMC-RON8 για 1 ώρα που ακολουθείται από MSP διέγερση επί μισή ώρα. λύματα κυττάρων υποβλήθηκαν σε IP, και ΙΒ για Pron. C) Επίδραση της IMC-RON8 στις κατάντη σηματοδότησης. Ίδια μεταχείριση ως Β). κηλίδα Western για pERK και pAkt. Δ) την ενεργοποίηση του Ρον και της έκφρασης του mRNA της survivin. Capan-1 και τα κύτταρα CFPAC-1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με IMC-RON8 ακολουθούμενη από MSP διέγερση για 12 ώρες μετά την ασιτία ορού για τη διάρκεια της νύχτας. RT- qPCR διεξήχθη σε ολικό RNA για να προσδιοριστεί το επίπεδο του mRNA της survivin. GAPDH mRNA χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος.

Η

IMC-RON8 ανέστειλε σημαντικά MSP με γνώμονα την κυτταρική κινητικότητα

Για να εκτιμηθεί η επίδραση του IMC-RON8 στην κυτταρική κινητικότητα, μια δοκιμασία μετανάστευσης φρεατίων διεξήχθη σε κύτταρα Capan-1 με κατεργασία IMC-RON8 παρουσία ή απουσία του MSP. IMC-RON8 μείωσε σημαντικά MSP- επαγόμενη μετανάστευση των κυττάρων σε κύτταρα Capan-1 με 80~90% (Σχ. 2Α).

In vitro

επούλωση των πληγών αναλύσεις περαιτέρω επιβεβαίωσε την ικανότητα του IMC-RON8 να εμποδίσει τη μετανάστευση των κυττάρων. Capan-1 κύτταρα που διεγείρονται με MSP άρχισαν να μεταναστεύουν στην περιοχή του τραύματος 24 ώρες μετά την γρατσουνιά (Εικ. 2Β). Το τραύμα επουλώθηκε σχεδόν από μεταναστεύοντα κύτταρα στις 48 ώρες μετά την κατεργασία MSP, ενώ IMC-RON8 μείωσε σημαντικά την κινητικότητα των κυττάρων.

Capan-1 κύτταρα στερήθηκαν τη διάρκεια της νύχτας ορού. Η μετανάστευση των κυττάρων εκτιμήθηκε με transwell δοκιμασία με MSP ως χημειοελκτικό στον κάτω θάλαμο. Α) Εικόνες κυττάρων που μετανάστευσαν με επιτυχία στην κάτω πλευρά της μεμβράνης transwell. Β) Ποσοτικοποίηση των μετανάστευσαν κυττάρων. Γ

In vitro

πληγή δοκιμασία επούλωσης.

Η

HDACi μειωτικά Ron mRNA και η έκφραση πρωτεΐνης και μεταγενέστεροι Σηματοδοσίας

Για να προσδιοριστεί η επίδραση της HDACi στην έκφραση Ron, Capan -1, L3.6pl και τα κύτταρα CFPAC-1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με παν-HDACi PS για 8, 24 και 48 ώρες. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το PS απεμπλουτισμένο έκφραση Ron σε όλες Ron-κυτταρικές σειρές που εκφράζουν εξετάστηκαν (Εικ. 3Α). Μείωση του Ron σημειώθηκε μέσα σε 8 ώρες με αυξανόμενη εξάντληση που συμβαίνουν πάνω από 48 περιόδους h (Εικ. 3Α). Η έντονη αρνητική ρύθμιση του Ron παρατηρήθηκε επίσης σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με ένα άλλο τηγάνι-HDACi, TSA (Εικ. 3Β), δείχνοντας μείωση Ron είναι ένα κοινό χαρακτηριστικό για τη θεραπεία Pan-HDACi. Στη συνέχεια προσδιορίζεται αν οι αλλαγές στην Ron πρωτεΐνη ήταν τουλάχιστον εν μέρει λόγω των αλλαγών στη μεταγραφή του. Η θεραπεία με PS μειώθηκε σημαντικά το επίπεδο mRNA του Ron σε έναν χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο (εικ. 3C). Επιπλέον, τα κύτταρα που κατεργάζονται με DMSO μόνο (διαλύτης για PS και TSA) δεν είχε καμία επίδραση στην έκφραση Ron τόσο στα επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι η φωσφορυλίωση Ron ενεργοποιεί έναν καταρράκτη κατάντη μορίων σηματοδότησης περιλαμβανομένων φωσφορυλίωσης Akt [6], [15], [17]. Στην συνέχεια προσδιορίσαμε τις επιδράσεις της PS στο κατάντη κυτταρική σηματοδότηση. Capan-1, L3.6pl και CFPAC-1 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με PS. Μετά τη θεραπεία για 8 και 24 ώρες, η φωσφορυλίωση της Akt μειώθηκε σε εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο σε όλες τις 3 παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές (Σχ. 3D). θεραπεία PS για 24 και 48 ώρες μειώνεται επίσης τόσο τα επίπεδα ΧΙΑΡ και πρωτεΐνη survivin σε εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα (Εικ. 3D).

Α) Ο καρκίνος του παγκρέατος κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις PS για 8h, 24h, και 48 ώρες. κηλίδα Western για Ron εκτελέστηκε. ακτίνη β χρησίμευσε ως μάρτυρας φόρτωσης. Β) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με TSA με ΙΒ για Ron. Ουσιαστική αριθμός των κυττάρων ήταν νεκρά (περίπου 80%) σε 1000 ηΜ TSA-κατεργασμένα κύτταρα Capan-1 στις 48 ώρες. C) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 50 ηΜ του PS για 8, 24 και 48 ώρες. RT- qPCR διεξήχθη σε ολικό RNA για να προσδιοριστεί το επίπεδο του mRNA του Ron. GAPDH mRNA χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Δ) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις PS στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία. κηλίδα Western για pAkt, ΧΙΑΡ και έκφραση survivin. Β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ένα στοιχείο ελέγχου φόρτωσης.

Η

PS Ανάπτυξη Μείωση των κυττάρων και αυξημένη κυτταρική απόπτωση μέσω της επαγωγής του κυτταρικού κύκλου p21 Ρυθμιστή και κασπάσης Δραστηριότητα

Η λειτουργία του ΙΑΡ μέλη της οικογένειας ΧΙΑΡ και survivin είναι η αναστολή κασπάσης 3, 7, 9 και δραστικότητα κασπάσης-εξαρτώμενη κυτταρική απόπτωση με δέσμευση των δραστικών κασπασών [42]. Δείχνουμε ότι μετά από 48 ώρες επώασης, PS μειωμένη πολλαπλασιασμό των κυττάρων (Σχ. 4Α) και αυξημένη κυτταρική απόπτωση (Σχ. 4Β) σε ένα εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο σε όλες τις 3 κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν, όπως προσδιορίζεται με ΜΤΤ και κατάτμηση του DNA. Προηγούμενες μελέτες ανέφεραν ότι HDACi αποτελέσματα της θεραπείας σε εξασθενημένη πολλαπλασιασμό των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων οφείλεται σε μια σύλληψη στη κυτταρικού κύκλου και την επαγωγή του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου κασπάσης-εξαρτώμενη [33]. Διαπιστώσαμε μια αύξηση της εξαρτώμενης από κυκλίνη αναστολέα κινάσης (CDK) ρ21 σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα μετά από θεραπεία HDACi (Εικ. 4C). Αυξημένη Capase-9 και διάσπαση PARP ενεργοποίηση μετά κασπάσης παρατηρήθηκε επίσης σε Capan-1 και κύτταρα L3.6pl (Εικ. 4C). Βρήκαμε ότι σε κύτταρα CFPAC-1, αυξημένη διάσπαση της κασπάσης 9 ανιχνεύθηκε μόνο σε υψηλές συγκεντρώσεις της θεραπείας PS στις 48 ώρες, αλλά όχι στις 24 ώρες. Αντίστοιχα, η διάσπαση PARP παρατηρήθηκε μόνο στην υψηλή συγκέντρωση της θεραπείας PS σε κύτταρα CFPAC-1, δείχνοντας έτσι ότι τα κύτταρα CFPAC-1 είναι σχετικά ανθεκτικά στην απόπτωση που επάγεται PS-κυττάρων σε σύγκριση με Capan-1 και L3.6pl κύτταρα.

τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις του PS, Α) κυτταρική ανάπτυξη μετρήθηκε με ΜΤΤ? Β) κυτταρικής απόπτωσης μετρήθηκε με κατάτμηση DNA? Γ) Western blots για ρ21, και η δράση της κασπάσης (PARP και κασπάσης 9 χάσματα). Β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

Ρον Νοκ ντάουν ή Ron mAb IMC-RON8 ευαισθητοποιεί καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος σε PS Θεραπεία

Τόσο IMC-RON8 και PS downmodulated έκφραση Ron. IMC-RON8 μειώνει ογκογόνο σηματοδότηση μέσω pAkt και pERK και αναστέλλει την κυτταρική μετανάστευση σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Ωστόσο, IMC-RON8 δεν επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την απόπτωση των κυττάρων

in vitro

όπως αποδεικνύεται από ΜΤΤ, PARP και κασπάσης 9 διασπάσεις, η οποία είναι η ίδια για Ron knockdown (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). PS, ωστόσο, προκαλεί σημαντικά απόπτωση των κυττάρων και μειώνει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Ο συνδυασμός μεταξύ Ron νοκ ντάουν ή IMC-RON8 και PS μπορεί να αντισταθμίσει την έλλειψη της αναστολής της κυτταρικής επιβίωσης σε Ron στόχευση IMC-RON8 ή Ron νοκ ντάουν. Για τον προσδιορισμό των πολλαπλασιαστικών επιδράσεων του Ron knockdown και θεραπεία PS, ένα πρότυπο δοκιμασία σχηματισμού αποικίας διεξήχθη. Πρώτον, τα κωδικοποιημένα (SC) και Ron shRNA πλασμίδια παραδόθηκαν στα κύτταρα L3.6pl με επιμόλυνση μόλυνση για τη δημιουργία L3.6pl ελέγχου SC και Ron νοκ ντάουν σταθερές κυτταρικές σειρές. Ενιαία κυτταρικοί κλώνοι Α6 και B21 επιλέχθηκαν μετά τη θεραπεία πουρομυκίνης. Ron shRNA χτύπησε ειδικά προς τα κάτω την έκφραση του Ρον, αφού c-Met που έχει υψηλή ταυτότητα αλληλουχίας με τον Ρον, δεν παρουσίασαν καμία μεταβολή (Εικ. 5Α). Στη συνέχεια L3.6pl SC και κλώνοι Ron KD Α6 και B21 κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με χαμηλές συγκεντρώσεις του PS. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι και οι δύο L3.6pl SC και την ανάπτυξη των κυττάρων Ron KD ανεστάλησαν σημαντικά από PS σε εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο (Εικ. 5Α). θεραπεία PS στην ίδια συγκέντρωση μειωμένο σχηματισμό αποικίας σε κύτταρα Ron KD L3.6pl σε μεγαλύτερο βαθμό από ό, τι Ron κύτταρα ελέγχου SC (Εικ. 5Α). ίδια Ron KD δεν άλλαξε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Είμαστε δίπλα διεξάγονται αναλύσεις μαλακή αγαρόζη για να καθορίσει περαιτέρω τις ιδιότητες μετασχηματισμού των κυττάρων L3.6pl με τον Ρον KD και θεραπεία PS. Εικόνα 5Β έδειξε ότι L3.6pl Ron KD κλώνοι παράγονται λιγότερες αποικίες (30-40%) από ό, τι τα κύτταρα SC Ron στο μαλακό αγαρόζης. PS μείωσε σημαντικά αποικίες που σχηματίζονται και στα δύο L3.6pl Ron SC και κυτταρικών κλώνων KD (Εικ. 5Β). Είναι ενδιαφέρον ότι, η θεραπεία PS οδήγησε σε σημαντική περαιτέρω λιγότερους αριθμούς αποικιών σε κύτταρα L3.6pl Ron KD από ό, τι στα κύτταρα SC L3.6pl σε όλες τις συγκεντρώσεις PS (Εικ. 5Β). Τα μεγέθη των αποικιών σε PS επεξεργασμένα κύτταρα L3.6pl Ron KD ήταν προφανώς μικρότερη από PS κατεργασμένα κύτταρα SC (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Για να προσδιοριστεί περαιτέρω ο ρόλος του Ron στον καρκίνο του παγκρέατος, IMC-RON8 εισήχθη για να μετρήσει τις πιθανές επιπτώσεις συνδυασμό μαζί με το PS. Σε αμφότερες κύτταρα L3.6pl (Σχ. 5C) και CFPAC-1 (Σχ. 5D), αποκλεισμός του Ron με IMC-RON8 θα μπορούσε να μειώσει το σχηματισμό αποικιών σε σύγκριση με τους μάρτυρες χωρίς καμία επεξεργασία (έως 50%). θεραπεία συνδυασμού με PS και IMC-RON8 δημιουργείται περαιτέρω σημαντικά μικρότερο αριθμό αποικιών με μικρότερο μέγεθος από ό, τι μόνο φαρμακευτική θεραπεία μόνη της τόσο L3.6pl και CFPAC-1 κύτταρα (Εικ. 5C και 5D).

Α) L3. 6pl κύτταρα σταθερά επιμολυσμένα με Ron SC και πλασμίδια shRNA. Επελέγησαν Ron KD κλώνοι Α6 και B21 για κλωνογονική δοκιμασία: L3.6pl Ron SC και KD κλώνοι Α6 και B21 υποβλήθηκαν σε αγωγή την ημέρα 2 με PS σε υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις για 48 ώρες. Μετά το πλύσιμο, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν επί άλλες 10 ημέρες σε 10% FBS μέσο που περιέχει. αποικίες κυττάρων οπτικοποιήθηκαν μετά από χρώση ΜΤΤ και ποσοτικοποιούνται σε DMSO. ΣΙ). Anchorage-ανεξάρτητη ανάπτυξη των L3.6pl SC και Ron KD κλώνοι αντιμετωπίζονται από PS προσδιορίστηκε όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. δοκιμασία μαλακό argrose εκτελέστηκε επίσης για το C) κύτταρα L3.6pl και D) CFPAC-1 κύτταρα επεξεργασμένα είτε με IMC-RON8 ή PS μόνα τους ή συνδυασμούς τους.

Η

Οι μηχανισμοί αποτελούν τη βάση IMC-RON8 Ευαισθητοποίηση παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα σε PS

για να προσδιοριστεί η επίδραση της θεραπείας συνδυασμού με PS και IMC-RON8 επί της έκφρασης Ron, Capan-1, L3.6pl και CFPAC-1 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις IMC-RON8 , PS ή συνδυασμό τους. Βρήκαμε ότι ο Ρον είχε υποβαθμιστεί από IMC-RON8 μετά από θεραπεία 24 ώρες (Σχ. 6Α). PS ενιαία θεραπεία μείωσε Ron, pAkt και αυξημένη διάσπαση PARP. Ωστόσο, συν-θεραπεία μείωσε περαιτέρω έκφραση Ron (Σχ. 6Α), σε σύγκριση με μόνη στις τρεις παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές εξετάσαμε μόνο θεραπεία. Επιπλέον, η συν-θεραπεία επίσης μειωθεί περαιτέρω pAkt και αυξημένη διάσπαση PARP (Σχήμα 6Β). Αυτά μπορεί να εξηγήσει τη μειωμένη σχηματισμού αποικιών σε συνδυασμό θεραπείας σε σχέση με το ενιαίο παράγοντα μόνο. ​​

Α) έκφραση Ron μετά την συν-επεξεργασία των Capan-1, L3.6pl και τα κύτταρα CFPAC-1 με IMC-RON8 και PS. Β) Επίδραση της συν-θεραπείας του IMC-RON8 και PS στο pAkt και διάσπαση PARP. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

Συζήτηση

Αυτή η μελέτη εντόπισε μια πιθανή νέα θεραπευτική προσέγγιση στον καρκίνο του παγκρέατος χρησιμοποιεί μια στρατηγική συνδυασμού μέσω της εκμετάλλευσης τόσο γενετικοί όσο και επιγενετικές χαρακτηριστικά. Ο καρκίνος του παγκρέατος είναι ένα από τα πιο δύσκολα προβλήματα στη θεραπεία του καρκίνου. Τρέχουσα χημειοθεραπεία με γεμσιταμπίνη έχει ένα πολύ χαμηλό ποσοστό ανταπόκρισης (& lt? 20%) και η αντίσταση των ναρκωτικών αναπτύσσεται ταχύτατα με αποτέλεσμα την αποτυχία της θεραπείας [2]. Έτσι, νέες θεραπευτικές στρατηγικές απαιτούνται επειγόντως.

Ron έχει πρόσφατα αναφερθεί ότι εκφράζεται υψηλά σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα και τα δείγματα των ασθενών [5], [6]. Η διέγερση με MSP ενεργοποιεί Ρον και κατάντη σηματοδότησης της, συμπεριλαμβανομένης της PI3K /Akt και ΜΑΡΚ και προάγει την κυτταρική μετανάστευση και την εισβολή. Ωστόσο, η ενεργοποίηση Ρον δεν είχε καμία επίδραση επί του πολλαπλασιασμού σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα [6]. Knockdown του Ron έδειξε αυξημένη ευαισθησία σε απόπτωση των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου σε στέρηση στρες παράγοντας ανάπτυξης μέσω μεταλλάκτη ενεργοποίησης ρ110α [14], [15]. Ωστόσο, παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα δεν περιέχουν ρ110α μεταλλάξεις. Ron KD δεν είχε καμία επίδραση επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και απόπτωσης όπως αξιολογήθηκε με ΜΤΤ, PARP και κασπάσης 9 σχάσεις

in vitro

(τα δεδομένα δεν δείχνονται) σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα.

Οι μελέτες μας έδειξαν ότι εδώ IMC -RON8 downmodulated έκφραση Ron, η οποία ήταν σύμφωνη με προηγούμενες μελέτες που ποντικού αντι-Ron mAbs Ζί /G4, Ζί /f2 και Ζί /C9 μειωμένη έκφραση Ron σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου [43]. Ανθρώπινο mAb IMC-41A10 μειωθεί αποτελεσματικά MSP-μεσολαβητική ενεργοποίηση του Ρον και κατάντη PI3K /Akt και ΜΑΡΚ ενεργοποίηση της [17]. ΜΑΡΚ μείωση σηματοδότηση από IMC41A10 αποδείχθηκε με pERK μείωση σε όλες τις κυτταρικές γραμμές καρκίνου που επιλέγεται. Ωστόσο, η επίδραση του IMC41A10 επί pAkt δεν είναι συνεπής σε όλες τις κυτταρικές σειρές. Για παράδειγμα, IMC41A10 είχε ισχυρό αντίκτυπο στη μείωση της ενεργοποίησης της Akt σε ΗΤ29, Du-145 και AGS, ενώ IMC-41A10 δεν άλλαξε pAkt σε άλλα κύτταρα, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παγκρέατος κυτταρική σειρά BxPC3 [17].

IMC-RON8, ένα άλλο πλήρως ανθρώπινα αντι-Ron mAb, εμφανίζεται αντικαρκινική δραστικότητα έναντι του ανθρώπινου παχέος εντέρου, του πνεύμονα και του παγκρέατος ξενομοσχεύματα σε γυμνά ποντίκια [44]. Οι μελέτες μας έδειξαν ότι εδώ IMC-RON8 ανέστειλε αποτελεσματικά τη φωσφορυλίωση Ron σε κύτταρα CFPAC-1, καθώς και οι μεταγενέστεροι pMAPK και ενεργοποίηση pAkt σε όλες τις παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές εξετάσαμε συμπεριλαμβανομένων BxPC3 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτό έδειξε ότι IMC-RON8 είναι λειτουργική για την αναστολή μονοπατιών σηματοδότησης MSP-μεσολάβηση και παρουσιάζει ισχυρή αποτελεσματικότητα σε σχέση με την παρεμπόδιση της PI3K /Akt μονοπατιού.

Προηγούμενη εργασία από το εργαστήριο μας και τους άλλους απέδειξε ότι η ενεργοποίηση Akt συνδέεται με