Αφηρημένο

Ιστορικό

Τα microRNAs (miRNAs) λειτουργούν ως ενδογενείς ρυθμιστές της βιολογικής συμπεριφοράς των ανθρώπινων καρκίνων. Πολλές φυσικές μη-κωδικοποίησης RNAs αναφερθεί ότι αναστέλλει miRNAs με αλληλεπιδράσεις ζευγαρώματος βάσεων. Τα φαινόμενα αυτά εγείρουν ερωτήματα σχετικά με την ικανότητα των τεχνητών συσκευή για τη ρύθμιση των miRNAs. Ο σκοπός αυτής της μελέτης είναι η δημιουργία συνθετικών συσκευές που στοχεύουν σε ένα ενιαίο miRNA ή ένα σύμπλεγμα miRNA και να εξακριβώσει θεραπευτικές επιδράσεις τους στις φαινοτύπους καρκίνου της ουροδόχου κύστης κυττάρων.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Tandem θέσεις πρόσδεσης εξογκωμένο miRNA εισήχθησαν στο 3 ‘αμετάφραστη περιοχή (UTR) του γονιδίου λουσιφεράσης Renilla SV-40 προαγωγός με γνώμονα να κατασκευάσει δύο «miRNA-μηχανές κουρέματος» για την καταστολή του miR-183-96-182 συμπλέγματος ή miR-210. Μία τρίτη συσκευή με επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες tandem δεν είναι συμπληρωματικά σε κάθε γνωστή miRNA δημιουργήθηκε ως άστοχα-μάρτυρα. Σε λειτουργικές αναλύσεις Τ24 καρκίνου της ουροδόχου κύστης και κυττάρων UM-UC-3 επιμολύνθηκαν με κάθε μία από τις τρεις συσκευές, που ακολουθείται από δοκιμασίες για την ανίχνευση των επιπτώσεών τους. δοκιμασίες λουσιφεράσης έδειξαν ότι οι δραστηριότητες των λουσιφεράσης δημοσιογράφους στα miRNA-χλοοκοπτικά μειώθηκαν σε 30-50% της άστοχα ελέγχου. Χρησιμοποιώντας Real-Time qPCR, τα επίπεδα έκφρασης των miRNAs στόχου έδειξαν να μειώνονται 2-3 φορές από την αντίστοιχη miRNA-κοπής. Η κυτταρική ανάπτυξη, η απόπτωση και η μετανάστευση ελέγχθηκαν με τη δοκιμασία ΜΤΤ, κυτταρομετρία ροής δοκιμασίας, και σε δοκιμασία μηδέν vitro, αντίστοιχα. αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης, αυξημένη απόπτωση και μειωμένη κινητικότητα παρατηρήθηκαν σε miRNA-χορτοκοπτικά-επιμολυσμένα κύτταρα καρκίνου της ουροδόχου κύστης.

Συμπεράσματα /Σημασία

Δεν είναι μόνο ένα στόχο miRNA αλλά και το σύνολο των μελών μιας cluster στόχο miRNA μπορεί να μπλοκαριστεί χρησιμοποιώντας αυτό το modular στρατηγική σχεδιασμού. Οι αντικαρκινικές επιδράσεις που προκαλούνται από τις συνθετικές miRNA-θεριστικές μηχανές στις κυτταρικές σειρές καρκίνου της ουροδόχου κύστης. miR-183/96/182 cluster και miR-210 εμφανίζονται να παίζουν ογκογόνο ρόλο στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Μια δυνητικά χρήσιμη πλατφόρμα συνθετική βιολογία για miRNA απώλειας λειτουργίας μελέτης και θεραπείας του καρκίνου έχει καθιερωθεί σε αυτό το έργο

Παράθεση:. Liu Υ, Han Υ, Zhang Η, Nie L, Jiang Ζ, Φα P, et al. (2012) Συνθετικό miRNA-Χορτοκοπτικά Στόχευση miR-183-96-182 Cluster ή miR-210 εμποδίζουν την ανάπτυξη και τη μετανάστευση και επάγουν απόπτωση σε κύτταρα καρκίνο της ουροδόχου κύστης. PLoS ONE 7 (12): e52280. doi: 10.1371 /journal.pone.0052280

Συντάκτης: William C. S. Cho, Queen Elizabeth Hospital, το Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 31 του Αυγούστου, 2012? Αποδεκτές: 12 του Νοεμβρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 17 Δεκ, 2012

Copyright: © 2012 Liu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε από το Ph.D. Προγράμματα Ίδρυμα του Υπουργείου Παιδείας της Κίνας (20100001110100 στο ZC)? το Πρόγραμμα προώθησης για Shenzhen Βασικά Εργαστήριο, Shenzhen, Λαϊκή Δημοκρατία της Κίνας (CXB201005250016A να ZC). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Μεταβατικές καρκίνωμα της ουροδόχου κύστης είναι η πιο κοινή μορφή καρκίνου του ουροποιητικού συστήματος στην Ανατολική και τη Δυτική χώρες [1]. Η πλειονότητα των καρκίνων της ουροδόχου κύστης είναι χαμηλού βαθμού μη επεμβατική όγκων που μπορεί να εξελιχθεί προς την επεμβατική φαινότυπο. Σε αντίθεση με μη επεμβατική καρκίνους της ουροδόχου κύστης, διηθητικό όγκοι τείνουν να μεταστάσεις σε άλλα όργανα και έχουν μια πολύ φτωχή πρόγνωση [2] – [3]. Οι πιο κοινές θεραπείες για τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης είναι η χειρουργική επέμβαση, χημειοθεραπεία, ανοσοθεραπεία και ακτινοθεραπεία. Ωστόσο, είναι κάθε άλλο παρά ικανοποιητικές οφείλεται σε διάφορους παράγοντες, συμπεριλαμβανομένης της έλλειψης αποτελεσματικότητας, απουσία εξειδίκευσης, και γεμάτη δυσάρεστες παρενέργειες [4] – [5]. Έτσι, υπάρχει μια αυξανόμενη ανάγκη για την ανάπτυξη νέων τρόπων για την αντιμετώπιση του καρκίνου. Αρκετά νέα αντινεοπλασματικών θεραπειών είναι επί του παρόντος υπό πειραματική και κλινική έρευνα, αλλά δεν έχουν μεγάλες ανακαλύψεις έχουν επιτευχθεί με αυτές τις θεραπευτικές στρατηγικές [6].

Από καιρό έχει προταθεί ότι τα καρκινικά κύτταρα μπορούν να επαναπρογραμματιστούν με συναρμολόγηση διαφορετικών DNA ή τμήματα RNA σε νέες συσκευές για να οδηγούν σε καλοήθη βιολογική συμπεριφορά [7] – [8]. Συνθετική βιολογία θεραπεία με πολλαπλές συσκευές που απευθύνονται σε μονοπάτια γονίδιο του καρκίνου ειδικά ανοίγει πολλά υποσχόμενες νέες προοπτικές για τη βελτίωση της θεραπείας του καρκίνου [9]. Με βάση μια λεπτομερή κατανόηση των γενετικών προφίλ των καρκίνων, συνθετικά βιολόγοι να προσπαθήσουμε να παράγουν προβλέψιμες και ισχυρή βιολογική συσκευές με νέες λειτουργικότητες θεραπεία που δεν υπάρχουν στη φύση. Αν και αυτό το πεδίο είναι σχετικά νέα και είναι ακόμη στη φάση εργαστηριακές δοκιμές, ορισμένες από τις σχετικές εργασίες έχουν ήδη δείξει μεγάλο δυναμικό στις θεραπείες των διαφόρων τύπων καρκίνων [10] – [11].

Τα microRNAs (miRNAs ), μια κατηγορία σύντομη ενδογενούς RNAs, ρυθμίζουν τη γονιδιακή έκφραση μέσω δέσμευσης σε μερικώς συμπληρωματικές αλληλουχίες στην 3’UTR του mRNA [12]. Πολυάριθμες μελέτες έχουν αναφέρει ότι τα miRNAs εμπλέκονται στην ανάπτυξη και την εξέλιξη των ανθρώπινων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων της ανάπτυξης, απόπτωση, εισβολή, και μετάσταση [13] – [14]. Σε προηγούμενη εργασία μας καθορίζεται το γονιδίωμα-ευρεία προφίλ miRNA στον ανθρώπινο καρκίνο της ουροδόχου κύστης από βαθιά αλληλουχίας. miR-183-96-182 διασποράς και miR-210 βρέθηκαν να είναι επάνω ρυθμισμένη σε ανθρώπινο καρκίνο της ουροδόχου κύστης, γεγονός που υποδηλώνει ότι μπορεί να παίζουν σημαντικό ρόλο ως ογκογονίδια σε αυτού του καρκίνου [15].

Ένα από τα σημαντικότερα στόχοι της συνθετικής βιολογίας έρευνα μας είναι να συνδεθούν τα συνθετικά γενετική συσκευές στον έλεγχο ενός φαινοτύπου κυττάρου όγκου. Σε αυτή την εργασία, παρουσιάζουμε δύο χρήσιμα γενετική συσκευές-το miR-183-96-182-cluster-μηχανή (miRM-183/96/182) και το miR-210-μηχανή (miRM-210) -δηλαδή miRNAs στόχο με το μερικώς συμπληρωματικές αλληλουχίες. Ερευνήσαμε επίσης θεραπευτικά αποτελέσματα τους επί των φαινοτύπων των καρκινικών κυττάρων κύστης. Η προσέγγιση αυτή παρέχει μια δυνητικά χρήσιμη πλατφόρμα συνθετική βιολογία για miRNA θεραπεία της μελέτης και του καρκίνου απώλειας λειτουργίας.

Αποτελέσματα

Σχεδιασμός και κατασκευή των miRNA-χορτοκοπτικά

Εμπνευσμένο από οι παρατηρήσεις που μερικά μόρια RNA που εκφράζεται από το

του ιού του έρπητα saimiri

ή τα ανθρώπινα ψευδογονίδια ρυθμίζουν τα ενδογενή miRNAs με αλληλεπιδράσεις ζευγαρώματος βάσεων σε κύτταρα θηλαστικών [16] – περιοχές [18], έχουμε δημιουργήσει miRNA-χορτοκοπτικά που περιέχουν δεσμευτικές μερικώς συμπληρωματικά των miRNAs στόχος για μελέτες miRNA απώλειας λειτουργίας σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα κύστης (Εικ. 1). Για να σχηματιστεί μια πιο σταθερή αλληλεπίδραση με το miRNA, σχεδιάσαμε πολλαπλές θέσεις πρόσδεσης του miRNA ενδιαφέροντος με ένα κεντρικό εξόγκωμα στις θέσεις διάσπασης του Argonaute 2 [19]. Ο ισχυρισμός αυτός βασίζεται επίσης στην ανακάλυψη ότι η μερική αντιστοίχιση μεταξύ των miRNAs και αλληλουχίες στόχους τους είναι πιο συχνή σε ζώα από ό, τι στα φυτά [12]. Οι θέσεις πρόσδεσης συνδέθηκαν με «συνδετήρες» (μερικά νουκλεοτίδια) για τους σκοπούς της ενίσχυσης της δέσμευσης των συμπλεγμάτων miRNA-πρωτεΐνη (miRNPs) σε κάθε πιθανή θέση δέσμευσης, και την αύξηση των miRNAs νοκ ντάουν απόδοσης [20].

κατασκευάσαμε miRNA-χορτοκοπτικά εισάγοντας πολλαπλές θέσεις δέσμευσης miRNA στο 3 ‘UTR ενός γονιδίου λουσιφεράσης Renilla. Κάθε κατασκεύασμα υπό τον έλεγχο ενός προαγωγέα SV-40 έκλεισε με ένα σήμα SV40 πολυαδενυλίωσης. Μια ανεξέλεγκτη ΤΚ προαγωγός με γνώμονα γονίδιο που κωδικοποιεί λουσιφεράση πυγολαμπίδας χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Τα μαύρα τετράγωνα αντιπροσώπευαν τα συνδετικά μεταξύ των θέσεων πρόσδεσης.

Η

Κάναμε 6 τυχαία διατεταγμένα αντίγραφα των θέσεων δέσμευσης για το σύμπλεγμα miR-183-96-182 (2 αντίγραφα για κάθε miRNA του συμπλέγματος) . Η miRM-183/96/182, στη συνέχεια, κατασκευάστηκε με εισαγωγή των εν λόγω θέσεις πρόσδεσης στο 3 ‘UTR ενός γονιδίου αναφοράς της λουσιφεράσης SV-40 προωθητή καθοδηγείται στο siCHECKTM-2 (Promega, Madison, WI, USA). Για να αποδειχθεί η σπονδυλωτής των συσκευών, εισαγάγαμε ένα άλλο 6 διαδοχικά παρατάσσονται αντίγραφα των θέσεων σύνδεσης για miR-210 στο 3 ‘UTR του γονιδίου αναφοράς για την παραγωγή miRM-210 με τη χρήση του ιδίου φορέα. Ως άστοχα ελέγχου, έχουμε επίσης δημιουργήσει μια συσκευή με 6 διαδοχικές επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες δεν είναι συμπληρωματικά σε όλες τις γνωστές miRNAs. Οι αλληλουχίες που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη ήταν διαθέσιμα στον Πίνακα S1 και S2 πίνακα.

Μειωμένη δραστηριότητες της λουσιφεράσης σε δημοσιογράφους στην miRNA-χορτοκοπτικά μπορεί να συμβάλει στις θέσεις δέσμευσης miRNA

Για να ελεγχθεί η αποτελεσματικότητα της miRNA- θεριστικές μηχανές, προσδιορίσαμε δραστικότητα λουσιφεράσης Renilla σε σχέση με την δραστικότητα λουσιφεράσης πυγολαμπίδας σε Τ24 ή κύτταρα UM-UC-3 48 ώρες μετά την επιμόλυνση με κάθε συσκευή. Οι προσδιορισμοί λουσιφεράσης ανταποκριτή έδειξε ότι οι δραστηριότητες των ρεπόρτερ που περιέχει τις θέσεις δέσμευσης διογκωμένα miRNA μειώθηκαν σε καρκινικά κύτταρα κύστης, σε σύγκριση με τον μη στοχευμένου ελέγχου (Ρ & lt? 0,01 για κάθε ομάδα). Οι αναστολές (%) της λουσιφεράσης εκφράσεις παρουσιάζονται στον Πίνακα 1.

Η

Τα miRNA-χορτοκοπτικά επιτευχθεί αποτελεσματική καταστολή των επιπέδων στόχων miRNA σε κυτταρικές σειρές καρκίνου της ουροδόχου κύστης

Για να διερευνήσουν περαιτέρω τη λειτουργικότητα του miRNA-θεριστικές μηχανές, εξετάσαμε τα σχετικά επίπεδα έκφρασης των miRNAs στόχου στην ανθρώπινη κύστη Τ24 καρκίνος συσκευές-επιμολυσμένα κύτταρα και UM-UC-3. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι qPCR έκφραση του αντίστοιχου miRNA-θεριστής προκάλεσε μία δραματική μείωση στα επίπεδα έκφρασης των miRNAs στόχου στις δύο κυτταρικές σειρές καρκίνου της κύστεως (Ρ & lt? 0,05 για κάθε ομάδα). Οι αναστολές (%) των miRNA εκφράσεις φαίνονται στον Πίνακα 2. Τα επίπεδα έκφρασης του miR-96, miR-182, και miR-183 δεν θα μπορούσε να κατασταλεί με miRM-210. Την ίδια στιγμή, το επίπεδο έκφρασης του miR-210, επίσης, δεν θα μπορούσε να αλλάξει με miRM-183/96/182. Αποτελέσματα του πειράματος qPCR φαίνονται στον πίνακα S3.

Η

Αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης που προκαλείται από τα miRNA-μηχανές κουρέματος σε κυτταρικές σειρές καρκίνου της κύστεως

καρκινικές κυτταρικές σειρές ανθρώπινου κύστη Τ24 και UM- UC-3 διαμολύνθηκαν παροδικά με τις συσκευές σε πλάκες 96 φρεατίων. Σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές της ουροδόχου κύστης, miRM-183/96/182 ή ο miRM-210 μειώθηκε ΜΤΤ αντιδραστικότητα (Εικ. 2). Τέτοια παρατήρηση θα μπορούσε είτε να υποδεικνύουν μια διακοπή κυτταρικής ανάπτυξης ή κυτταρικού θανάτου.

Τ24 και τα κύτταρα UM-UC-3 επιμολύνθηκαν με τις συσκευές σε πλάκες 96 φρεατίων. Η κυτταρική ανάπτυξη μετρήθηκε με ανάλυση ΜΤΤ σε διαφορετικά χρονικά διαστήματα. ANOVA χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση των καμπυλών της κυτταρικής ανάπτυξης. (Α) miRM-183/96/182 ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων σε κύτταρα Τ24 (Ρ & lt? 0,05). (Β) miRM-183/96/182 ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων σε UM-UC-3 κύτταρα (Ρ & lt? 0,05). (C) miRM-210 ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων σε κύτταρα Τ24 (Ρ & lt? 0,01). (D) miRM-210 ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων σε UM-UC-3 κύτταρα (Ρ & lt? 0,01). Τα δεδομένα ήταν ο μέσος όρος των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων? μπαρ, SD.

Η

Η έναρξη της κυτταρικής απόπτωσης που προκαλείται από τα miRNA-χλοοκοπτικά σε κυτταρικές σειρές καρκίνου της ουροδόχου κύστης

Για να ελέγξετε τον κυτταρικό θάνατο, πειράματα απόπτωσης πραγματοποιήθηκαν. Και οι δύο από τις δύο κυτταρικές γραμμές σπάρθηκαν σε πλάκες έξι φρεατίων και επιμολύνθηκαν με συσκευές. Διενεργήσαμε δοκιμασίες απόπτωσης χρησιμοποιώντας ένα κιτ ανίχνευσης απόπτωσης αννεξίνης V-ΡΕ για να προσδιοριστεί κατά πόσον οι δύο τύποι συνθετικών miRNA-θεριστικές μηχανές μας επάγουν την κυτταρική απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα κύστης. Τα αποτελέσματα φαίνονται στο Σχ. 3 απέδειξαν ότι τα αποπτωτικά κύτταρα (%) των Τ24 και κυτταρικές σειρές UM-UC-3 επιμολυσμένα με το miRM-183/96/182 ή το miRM-210 ήταν υψηλότερα από αυτά που μορφομετατρέπονται με το άστοχα-μάρτυρα.

Τ24 και UM-UC-3 κύτταρα επιμολύνθηκαν με τις συσκευές σε πλάκες 6 φρεατίων. Κυτταρικής απόπτωσης μετρήθηκε με την κυτταρομετρία ροής σε 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. (ΈΝΑ). Αντιπροσωπευτικές εικόνες ανάλυση κυτταρομετρίας ροής σε κύτταρα Τ24. (ΣΙ). Εκπρόσωπος εικόνες της ανάλυσης κυτταρομετρίας ροής σε UM-UC-3 κύτταρα. (ΝΤΟ). επαγωγή κυτταρικής απόπτωσης παρατηρήθηκε σε miRM-183/96/182-επιμολυσμένα Τ24 καρκίνου της ουροδόχου κύστης και UM-UC-3 κύτταρα χρησιμοποιώντας ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. (ΡΕ). επαγωγή κυτταρικής απόπτωσης παρατηρήθηκε σε miRM-210-μορφομετατραπέντα Τ24 καρκίνου της ουροδόχου κύστης και κυττάρων UM-UC-3 χρησιμοποιώντας ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Πραγματοποιήσαμε κάθε πείραμα τουλάχιστον τρεις φορές. Οι ράβδοι σφάλματος, SD. ** Ρ & lt? 0,01, σε σύγκριση με τον μη στοχευμένου ελέγχου

Η

Αναστολή της μετανάστευσης κυττάρων που προκαλείται από τα miRNA-μηχανές κουρέματος σε κυτταρικές σειρές καρκίνου της κύστεως

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 12 φρεατίων. πλάκες και επιμολύνθηκαν με τις συσκευές. Στη συνέχεια εξετάσαμε το ρόλο της κάθε συσκευής για τη μετανάστευση των κυττάρων του όγκου με την εκτέλεση δοκιμασιών μηδέν. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4, οι αποστάσεις μετανάστευση των κυττάρων στις ομάδες που επιμολύνθηκαν με τα miRNA-μηχανές κουρέματος ήταν σημαντικά χαμηλότερες από εκείνες στις ομάδες επιμολυσμένα με το άστοχα-μάρτυρα.

Τ24 και τα κύτταρα UM-UC-3 επιμολύνθηκαν με τις συσκευές σε πλάκες 12 φρεατίων. μετανάστευση των κυττάρων μετρήθηκε με τη δοκιμασία μηδέν. (Α) miRM-183/96/182 και miRM-210 μετανάστευση ανέστειλε κύτταρο σε κύτταρα Τ24 ανεξάρτητα. (Β) miRM-183/96/182 και miRM-210 ανέστειλε την κυτταρική μετανάστευση σε UM-UC-3 κύτταρα ανεξάρτητα. Κάθε πείραμα διεξήχθη τουλάχιστον τρεις φορές και μία αντιπροσωπευτική εικόνα παρουσιάστηκε. Τα αποτελέσματα φαίνονται ως μέση τιμή ± SD. ** P & lt?. 0.01, σε σύγκριση με τον άστοχα ελέγχου

Η

Συζήτηση

Είναι ευρέως αναγνωρισμένο ότι miRNAs να προκαλέσει υποβάθμιση του mRNA μέσω αλληλουχίας-ειδικές αλληλεπιδράσεις. Ωστόσο, πρόσφατη εργασία έχει προτείνει ότι η κύρια λειτουργία κάποιων αλληλεπιδράσεων miRNA-mRNA είναι να μπλοκάρουν το miRNA, σε αντίθεση με την καταστολή της έκφρασης των γονιδίων στόχων [12]. Αρκετά πειραματικά αποτελέσματα υποστηρίζουν αυτή τη νέα αντίληψη της ρύθμισης miRNA. Στα κύτταρα των θηλαστικών, το

PTENP1

ψευδογονίδιο με συντηρημένες θέσεις πρόσδεσης miRNA στην 3’UTR του φάνηκε να ρυθμίσει

PTEN

έκφραση μέσω ζευγαρώματος βάσεων αλληλεπίδραση με τα miRNAs. Ένα παρόμοιο φαινόμενο ανακαλύφθηκε επίσης στο

KRAS

και ψευδογονιδίου του

KRAS1P

[16] – [17]. Αλληλουχίας-ειδική αποικοδόμηση miRNA παρατηρήθηκε πρόσφατα στην marmoset Τ κύτταρα μετασχηματισμένα με το

του ιού του έρπητα saimiri

(HVS). Ο ιός κωδικοποιεί ένα μικρό μη-κωδικοποίησης RNA ονομάζεται hSUR1-που περιέχει περιοχές με εκτεταμένες συμπληρωματικότητα με miR-27a. Ζευγαρώματος βάσης μεταξύ miR-27a και hSUR1 μπορεί ρυθμίζουν προς τα κάτω τα επίπεδα έκφρασης του miR-27a [18]. Με βάση αυτά τα ευρήματα, έχουμε υποθέσει ότι ένα φυσικό μικρό μόριο RNA μπορεί να ενεργεί ως μια μηχανή για miRNAs που δεσμεύονται με τις συγκεκριμένες θέσεις αναγνώρισης σε αλληλουχία νουκλεοτιδίων της. Έτσι, φαίνεται λογικό ότι η τεχνητή ρυθμιστικές συσκευές miRNA με ακολουθίες μερικώς συμπληρωματικές προς miRNA ενδιαφέροντος έχουν επίσης την ικανότητα να αναστέλλουν την αντίστοιχη ενδογενή δραστηριότητα miRNA ή /και της έκφρασης.

Για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, κατασκευάσαμε συνθετικά συσκευές που περιέχουν πολλαπλές διόγκωσαν θέσεις πρόσδεσης miRNA και να τους το όνομα «miRNA-μηχανές κουρέματος». Προφανώς ο λόγος για την επιλογή αυτού του ονόματος για το συνθετικό συσκευής είναι ότι μπορεί να «κόψει τα κάτω» έκφραση των miRNAs ακριβώς όπως μια μηχανή του γκαζόν. Οι συσκευές έχουν σχεδιαστεί για να είναι αρθρωτή, όπου οι θέσεις σύνδεσης παράλληλα θα μπορούσε να αλλάξει από τις άλλες. Η έκφρασή τους οδηγήθηκε στην υψηλού επιπέδου από τον ισχυρό ιικό προαγωγέα SV-40 σε καρκινικά κύτταρα ανθρώπινης κύστεως. Χρησιμοποιώντας δύο πειράματα επικύρωσης, δείξαμε ότι τα miRNA-χορτοκοπτικά κατασκευάστηκε από εμάς ήταν λειτουργικά. Πρώτον, προσδιορισμοί λουσιφεράσης επιβεβαίωσε ότι οι δραστηριότητες των λουσιφεράσης δημοσιογράφους στα miRNA-χλοοκοπτικά κατεστάλησαν στα δύο καρκίνο της ουροδόχου κύστης κύτταρα. Δεύτερον, σε πραγματικό χρόνο qPCR διεξήχθη για την ανίχνευση των επιπέδων έκφρασης των miRNAs στόχου σε καρκινικά κύτταρα της κύστης επιμολύνθηκαν με τις συσκευές, και αποδείξαμε ότι τα ποσά αυτών των miRNAs μειώθηκαν από την αντίστοιχη miRNA-κοπής. Σύμφωνα με αυτές τις δύο διαπιστώσεις, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι τα miRNA-χλοοκοπτικά μπορεί να αναστέλλει λειτουργικά ένα ενιαίο στόχο miRNA ή να αποκλείσετε ένα ολόκληρο σύμπλεγμα των σχετικών miRNAs.

Όλο και περισσότερες μελέτες έχουν δείξει ότι miRNAs συχνά απελευθερωθεί σε πολλούς τύπους ανθρώπινων καρκίνων. Καθώς οι κρίσιμους ρόλους των miRNAs σε καρκίνους σταδιακά διερευνηθεί, τις εφαρμογές τους ως πιθανούς θεραπευτικούς στόχους έχουν προκαλέσει μεγάλο ενδιαφέρον για την ανάπτυξη νέα στρατηγική για τη θεραπεία του καρκίνου [21] – [22]. Είτε μεμονωμένα είτε ως ένα σύμπλεγμα, τα επίπεδα έκφρασης του miR-96, miR-182, και miR-183 έχει δειχθεί ότι είναι προς τα πάνω ρυθμισμένα σε διάφορες μορφές καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη, ο καρκίνος του μαστού, ο καρκίνος του πνεύμονα, μυελοβλάστωμα, καρκίνο της ουροδόχου κύστης και κλπ [23] – [27]. Lin et al. Βρέθηκε ότι miR-96 που προκαλείται από τον πολλαπλασιασμό και ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη του καρκίνου του μαστού κυτταρικές γραμμές [28]. Segura et al. Βρέθηκε ότι miR-182 υπερ-έκφραση προώθησε τη μετανάστευση των ανθρώπινων κυττάρων μελανώματος in vitro και μεταστάσεις τους in vivo [29]. Sarver et al. Βρέθηκε ότι miR-183 λειτούργησε ως ένα ογκογονίδιο αυξάνοντας τα καρκινικά κύτταρα μετανάστευση [30]. miR-210 έχει αναδειχθεί ως ένα νέο βιοδείκτη όγκου ρυθμίζεται από την υποξία. Η μοναδική περιοχή σπόρος του miR-210 το διακρίνει από όλα τα άλλα miRNAs. Η έκφραση του miR-210 συνδέεται με την ανάπτυξη του όγκου, εισβολή και την κακή επιβίωση του ασθενούς [31]. Yang et al. ανακάλυψαν ότι miR-210 προς τα κάτω ρύθμιση ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων και την επαγωγή απόπτωσης σε κύτταρα ανθρώπινου ηπατώματος [32]. Fasanaro et al. ανακάλυψαν ότι τα αντι-miR-210 διαμόλυνση μειωμένη κυτταρική μετανάστευση, ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων και την απόπτωση που επάγεται [33]. Αυτές οι μελέτες παρέχουν αποδείξεις για τους σημαντικούς ρόλους των τεσσάρων επιλεκτικής miRNAs στην παθογένεση ανθρώπινων καρκίνων. Ωστόσο, τα αποτελέσματά τους στις φαινοτύπους των καρκινικών κυττάρων της ουροδόχου κύστης παραμένουν σε μεγάλο βαθμό άγνωστες.

Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε ότι το miR-183-96-182 συμπλέγματος ή miR-210 καταστολής από την αντίστοιχη miRNA-μηχανή όχι μόνο ανέστειλε την ανάπτυξη και τη μετανάστευση, αλλά επίσης προκάλεσε απόπτωση σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα κύστης. Η αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης οφειλόταν στην επαγωγή κυτταρικής απόπτωσης. Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι miR-183/96/182 και σύμπλεγμα miR-210 παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση των βιολογικών συμπεριφορών των καρκινικών κυττάρων κύστης.

Όλες οι παρατηρούμενες αλλαγές στο φαινότυπο πρέπει να διαμεσολαβείται από miRNA ρυθμιζόμενα γονίδια . Έχει αποδειχθεί στην προηγούμενη εργασία ότι knockdown του συμπλέγματος miR-183/96/182 οδήγησε σε εμπλουτισμό των οδών απόπτωσης και απορύθμιση του μονοπατιού ΡΙ3Κ /ΑΚΤ /mTOR [26]. Συστατικά της οδού ΡΙ3Κ /ΑΚΤ /mTOR αναφέρθηκαν να είναι κρίσιμη για την ογκογένεση, συμπεριλαμβανομένων του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, της ανάπτυξης, την επιβίωση και την κινητικότητα [34]. Υπήρξε, επίσης, έκθεση που να καταδεικνύει ότι αυτό το σύμπλεγμα ανέστειλε την πρόσληψη ψευδαργύρου μέσω καταστολή των μεταφορέων ψευδαργύρου [23]. Ο ψευδάργυρος είναι ένας αναστολέας του HIF-1α σε ανθρώπινους καρκίνους που καταστέλλει σημαντικά γονίδια που εμπλέκονται στην εξέλιξη του όγκου, όπως ο VEGF, MDR1 και Bcl2 [35]. miR-210 έχει γίνει γνωστό να ρυθμίσει υποξία, η οποία είναι σημαντική για την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων και εισβολή. Αρκετές miR-210 στόχους που επηρεάζουν την ανάπτυξη των κυττάρων, την απόπτωση, και η μετανάστευση έχουν ήδη εντοπιστεί, όπως ο παράγοντας E2F μεταγραφής 3 (E2F3) [36], ινοβλαστών υποδοχέα αυξητικού παράγοντα όπως 1 (FGFRL1) [37], ομοιοκυτίου Α1 (HOXA1) [38], FLICE σχετιζόμενη τεράστια πρωτεΐνη (FLASH) /κασπάσης-8-πρωτεΐνη που συνδέεται-2 (Casp8ap2) [39] και Ephrin-A3 (EFNA3) [33]. Περαιτέρω αναλύσεις που απαιτούνται για τη διερεύνηση της γενετικής ρύθμισης τους στα καρκινικά κύτταρα της ουροδόχου κύστης.

Θα πρέπει επίσης να σημειωθεί ότι οι δύο miRNA-θεριστικές μηχανές δεν είναι απολύτως αποτελεσματική, επειδή έχουν σαν αποτέλεσμα μόνο περιθωριακή φαινοτυπικές αλλαγές σε καρκινικά κύτταρα κύστης . Υπάρχουν διάφοροι παράγοντες που μπορούν να επηρεάσουν την αποτελεσματικότητα των συσκευών. Η λειτουργία ενός miRNA-μηχανή δεν εξαρτάται μόνο από τον αριθμό των θέσεων δέσμευσης miRNA, αλλά και από την ποσότητα του RNA που θεριστής σε σχέση με το ποσό των ενδογενών miRNAs. Προκειμένου να υπάρξει ένα πιο αποτελεσματική θεραπεία του καρκίνου, μπορούν να ληφθούν υπόψη διάφορα σημεία. Η προσθήκη περισσότερων miRNA θέσεων δέσμευσης με τις συσκευές μπορεί να αυξήσει τη συγκέντρωση των μερικώς συμπληρωματικών αλληλουχιών και ως εκ τούτου θα αυξήσει τις ανασταλτικές επιδράσεις των miRNA-μηχανές κουρέματος. Για την έκφραση των συσκευών σε υψηλό επίπεδο, μπορεί κανείς να επιλέξει περισσότερους πιθανούς ισχυροί προαγωγείς για την οδήγηση της μεταγραφής και τη χρήση ιικών φορέων για παράδοση των miRNA-θεριστικές μηχανές. Κάποιες άλλες δυνατότητες παραμένουν να αποδειχθεί.

Εν κατακλείδι, τα αποτελέσματα αντι-ανάπτυξης που διαμεσολαβείται από απόπτωση και αντι-μεταναστευτική επιδράσεις τόσο που προκαλείται από τις συνθετικές miRNA-χορτοκοπτικά στόχευση miR-183-96-182 συμπλέγματος ή ΜΙΚ 210 στα καρκινικά κύτταρα κύστης. Περαιτέρω έρευνες χρειάζονται ακόμη για να αποδείξει τη χρησιμότητα της συνθετικής βιολογίας πλατφόρμας μας στο miRNAs λειτουργίες μελέτες και θεραπείες για τον καρκίνο.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές και κυτταρική καλλιέργεια

Ανθρώπινο της ουροδόχου κύστης μεταβατικού κυτταρικές σειρές καρκινώματος Τ24 και UM-UC-3 αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Και οι δύο από αυτούς διατηρήθηκαν σε RPMI-1640 (1640) μέσο συμπληρωμένο με αντιβιοτικά 10% εμβρυϊκό ορό βοοειδούς και 1% (100 U /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη θειικά). Τα κύτταρα συνήθως αναπτύσσονται στους 37 ° C σε ατμόσφαιρα 5% CO

2.

Δημιουργία του miRNA-χορτοκοπτικά

θέσεις δέσμευσης διόγκωσαν miRNA για το miR-96, ΜΙΚ 182, miR-183, και miR-210 και οι συνδετήρες μεταξύ τους σχεδιάστηκαν και συντέθηκαν χημικά. Είτε το τμήμα συνδυασμός DNA για το σύμπλεγμα miR-183-96-182 περιέχει 2 αντίγραφα των θέσεων σύνδεσης για κάθε συστάδα miRNA ή το συγκεκριμένο μέρος του DNA για miR-210 που περιέχει 6 αντίγραφα των χώρων για miR-210 πρόσδεσης κλωνοποιήθηκε σε siCHECKTM-2 διάνυσμα λουσιφεράσης (Promega, Madison, WI, USA) χωνεύεται με

Xhol

και

Notl

. Ως μη στοχευμένες ελέγχου, μια συσκευή με 6 tandem επαναλαμβανόμενες θέσεις συμπληρωματικές προς καμία γνωστή miRNAs δεσμευτικός κατασκευάστηκε επίσης χρησιμοποιώντας τις ίδιες μεθόδους όπως περιγράφεται παραπάνω. Λεπτομερείς περιγραφές των σχετικών αλληλουχίες παρουσιάζονται στον Πίνακα S1 και S2 Πίνακα.

διαμόλυνσης κυττάρων

Τα κύτταρα επιστρώθηκαν είκοσι ώρες πριν από την επιμόλυνση για να επιτευχθεί 70-80% συρροή κατά τη στιγμή της διαμόλυνσης. 1 μg της κάθε συσκευής διαμολύνθηκε σε κύτταρα χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο Επιμόλυνσης Hiperfect (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή.

λουσιφεράσης ανταποκριτής δοκιμασία

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες έξι φρεατίων (5 × 10

5 /καλά) και επιμολυσμένα με τα miRNA-χλοοκοπτικά ή άστοχα ελέγχου. Η δραστικότητα λουσιφεράσης ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα διπλής δοκιμασίας λουσιφεράσης (Promega, Madison, WI, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή σε 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Η δραστικότητα λουσιφεράσης Renilla κανονικοποιήθηκε στην δραστικότητα λουσιφεράσης πυγολαμπίδας. Η αναστολή (%) της έκφρασης λουσιφεράσης υπολογίστηκε με τον ακόλουθο τύπο: Παρεμπόδιση (%) = (σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης στην μη στοχευμένων-ελέγχου – σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης στην miRNA-θεριστή) /σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης στην μη στοχευμένων ελέγχου Χ 100 %. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις διπλούν και επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές.

εκχύλιση RNA και Real-Time qPCR

Ολικά RNAs απομονώθηκαν από κύτταρα Τ24 και UM-UC-3 κύτταρα χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. cDNAs συντέθηκαν με τη χρήση του Μ-ΜΙΛ ανάστροφης μεταγραφάσης (Promega, Madison, WI, USA). Real time PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του All-in-One

TM miRNA qRT-PCR ανίχνευση Kit (GeneCopoiea Inc, Rockville, MD, USA). U6 μικρό πυρηνικό RNA (snRNA) επιλέχθηκε ως ενδογενή έλεγχο. Τα miRNA qPCR εκκινητές παραγγέλθηκαν από GeneCopoeia, Inc. Οι αριθμοί καταλόγου του All-in-One ™ miRNA qPCR Αστάρια είχαν ως εξής: HSA-miR-96~HmiRQP0852? HSA-miR-182~HmiRQP0239? HSA-miR-183~HmiRQP0244? έχει-miR-210~HmiRQP0317? snRNA U6 ~ HmiRQP9001 (Η εταιρεία δεν παρείχε πληροφορίες αλληλουχία αυτών των εκκινητών). Τα μίγματα PCR παρασκευάστηκαν σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή με τις συνθήκες της PCR 40 κύκλων των 15 sec στους 95 ° C, 20 sec στους 55 ° C, και 30 sec στους 70 ° C σε ένα ΑΒΙ PRISM 7000 Fluorescent Ποσοτική PCR System (Applied Biosystems , Foster City, CA, USA). Η σχετική έκφραση της κάθε miRNA υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας 2 μεθόδους

-ΔΔCt. Η αναστολή (%) της έκφρασης miRNA υπολογίστηκε από τον ακόλουθο τύπο: Παρεμπόδιση (%) = (σχετικό επίπεδο έκφρασης miRNA σε κύτταρα επιμολυσμένα με τον μη στοχευμένου ελέγχου – επίπεδο έκφρασης σε σχέση miRNA σε κύτταρα επιμολυσμένα με το miRNA-θεριστή) /σχετική miRNA επίπεδο έκφρασης σε κύτταρα επιμολυσμένα με τον μη στοχευμένου ελέγχου Χ 100%.

η ανάπτυξη των κυττάρων δοκιμασία

τα αποτελέσματα των σχεδιασμένων συσκευών στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων εξετάστηκαν με δοκιμασία ΜΤΤ σύμφωνα με τις αναφερόμενες μεθόδους [40 ]. 24, 48 ή 72 ώρες μετά την επιμόλυνση, 20 μΐ ΜΤΤ (5 mg /ml) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο μιας πλάκας 96 φρεατίων και τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 5 ώρες. Στη συνέχεια, τα μίγματα μέσον ΜΤΤ απορρίφθηκαν και 100 μΐ διμεθυλοσουλφοξειδίου (DMSO) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο. Η απορρόφηση μετρήθηκε σε μήκος κύματος 490 nm (με 630 nm ως μήκος κύματος αναφοράς) χρησιμοποιώντας μία συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας ELISA (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Οι δοκιμασίες επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές.

κυτταρικής απόπτωσης δοκιμασία

κυτταρικής απόπτωσης ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας ένα V-ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη αννεξίνης (FITC) /ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) κιτ ανίχνευσης απόπτωσης (BD, San Jose, CA, USA) σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του προμηθευτή. 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, φυγοκεντρήθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε 500 μΐ ρυθμιστικού πρόσδεσης 1 ×. Annexin V-FITC (5 μΙ) και 10 μΙ ΡΙ προστέθηκαν στη συνέχεια σε κάθε σωλήνα. Οι σωλήνες επωάστηκαν στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά. δοκιμασία κυτταρικής απόπτωσης διεξήχθη αμέσως σε κυτταρομετρία ροής (EPICS, XL-4, Beckman, CA, USA). Κάθε πείραμα έγινε τρεις φορές τουλάχιστον.

Η μετανάστευση των κυττάρων δοκιμασία

Η κυτταρική κινητικότητα εξετάσθηκε με ανίχνευση μηδέν σύμφωνα με τις μεθόδους που περιγράφηκαν προηγουμένως [41]. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 12 φρεατίων σε πυκνότητα 1,0 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο. Εμείς επιμολυσμένα κύτταρα με τις συσκευές και επωάζονται τα πιάτα σε 37 ° C έως ότου τα κύτταρα έφθασαν το 100% συρροή. Ένα τεχνητό χάσμα στη συνέχεια δημιουργείται από το ξύσιμο με ένα ρύγχος πιπέτας. Φωτογραφικές εικόνες πάρθηκαν από κάθε φρεάτιο αμέσως και πάλι μετά από 20 ώρες χρησιμοποιώντας μια ψηφιακή φωτογραφική μηχανή σύστημα. Το πρόγραμμα λογισμικού HMIAS-2000 χρησιμοποιήθηκε για να υπολογίσει την απόσταση μετανάστευσης κυττάρων (μm). Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον τρεις φορές.

Στατιστικές αναλύσεις

Τα στοιχεία από όλα τα πειράματα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± την τυπική απόκλιση (SD). Η στατιστική σημαντικότητα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας t-test ή ANOVA και η P & lt Φοιτητών? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Όλες οι στατιστικές δοκιμασίες διεξήχθησαν με τη χρήση SPSS έκδοση 17.0 του λογισμικού (SPSS, Chicago, IL, USA).

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακα S1.

miRNA ακολουθίες στη Μελέτη

doi:. 10.1371 /journal.pone.0052280.s001

(DOC)

Πίνακας S2.

Συνθετικά miRNA-θεριστής Ακολουθίες στο Vector

doi:. 10.1371 /journal.pone.0052280.s002

(DOC)

Πίνακα S3. τιμές

Delt-Ct του Real-Time qPCR στις δύο καρκίνου της ουροδόχου κύστης κύτταρα γραμμών επιμολυσμένων με τις συνθετικές συσκευές

doi:. 10.1371 /journal.pone.0052280.s003

(DOC)

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς είναι ευγνώμων προς τους χορηγούς, των οποίων τα ονόματα δεν περιλαμβάνονταν στον κατάλογο συγγραφέα, αλλά που συμμετείχαν σε αυτό το πρόγραμμα.