Αφηρημένο

Ανθρώπινο ενδογενών ρετροϊών K (HERV-K) είναι η πιο ανέπαφη ρετροϊός στο ανθρώπινο γονιδίωμα. Υπάρχουν πολλαπλές πλήρους μήκους ή σχεδόν πλήρους μήκους HERV-K προϊούς σε αυτό. Για να αναλυθεί η οποία HERV-K προϊούς προκαλούν ιικών μεταγραφημάτων σε κυτταρικές σειρές καρκίνου και να ελεγχθεί αν ιονίζουσα ακτινοβολία μπορεί να μεταβάλει τα επίπεδα των HERV-K μεταγραφές, μελέτες RT-PCR πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση πολλαπλών ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών. Εκκινητές από διάφορες θέσεις στο γονιδίωμα του ιού χρησιμοποιήθηκαν και περιλαμβάνονται ζεύγη σχεδιαστεί για να διασχίσει κόμβους ματίσματος σε ιικά RNA. Σε περίπτωση απουσίας της ιονίζουσας ακτινοβολίας, μεταγραφές ανιχνεύτηκαν από πολλαπλά προϊούς HERV-K σε κυτταρικές γραμμές από ανθρώπινο προστάτη, του τραχήλου της μήτρας, το κεφάλι και το λαιμό, ή καρκίνοι του μαστού, και των προϊούς από το οποίο προήλθαν οι μεταγραφές ποικίλη μεταξύ των διαφόρων γραμμών. Μόνο ένα από τα 13 κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν (αυχενική γραμμή καρκίνου C33A) απέτυχε να δείξει HERV-K μεταγραφές. Συγκολλημένα RNAs ανιχνεύθηκαν περιλαμβάνονται ιικά RNA συγκολλημένα όπως αναμένεται στις συμβατικές περιοχές ιογενή συναρμογής, καθώς και διάφορες εναλλακτικό μάτισμα RNA. Εναλλακτικά ματισμένες μεταγραφές προέκυψαν από συγκεκριμένες προϊούς, και ανιχνεύθηκαν στις περισσότερες από τις κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιήθηκαν. Ποσοτική RT-PCR διεξήχθη για να εκτιμήσει τις επιπτώσεις της ιονίζουσας ακτινοβολίας. Οι αναλύσεις έδειξαν ότι HERV-K μεταγραφές ήταν αυξημένα σε τέσσερις από τις δώδεκα γραμμές που εξετάστηκαν, ειδικότερα όλες οι γραμμές του καρκίνου του προστάτη τρεις χρησιμοποιείται και μία γραμμή του καρκίνου του μαστού. Οι αυξήσεις ήταν παροδικές, κορυφώθηκε σε 24 ώρες μετά από μία μόνο δόση του γ-ακτινοβολίας που κυμαίνονταν από 2,5 έως 20 Gy, και επιστρέφοντας στα αρχικά επίπεδα 72 ώρες. Συνοπτικά, οι μελέτες αυτές έδειξαν ότι η ιοντίζουσα ακτινοβολία μπορεί να επηρεάσει τα επίπεδα του HERV-K μεταγραφές σε κύτταρα, και αυτά τα αποτελέσματα διαφέρουν μεταξύ διαφορετικών κυττάρων. Οι αλλαγές στα επίπεδα μεταγραφής HERV-K μπορεί να επηρεάσει πολλαπλά βιολογικών διεργασιών στα κύτταρα, και μελλοντικές μελέτες των επιπτώσεων της ιονίζουσας ακτινοβολίας σε HERV-K είναι αξίζει να επιδιωχθεί

Παράθεση:. Άγονη L, Lenz J, Guha C ( 2013) παραλλαγή Συγκόλληση και Επίδραση της ιονίζουσας ακτινοβολίας στην ανθρώπινη ενδογενής Ρετροϊών K (HERV-K) μεταγραφές στις γραμμές καρκινικών κυττάρων. PLoS ONE 8 (10): e76472. doi: 10.1371 /journal.pone.0076472

Συντάκτης: Robert Belshaw, το Πανεπιστήμιο του Πλύμουθ, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 3 Ιουλίου 2013? Αποδεκτές: 27 Αύγ 2013? Δημοσιεύθηκε: 18 Οκτωβρίου του 2013

Copyright: © 2013 Άγονη et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το έργο υποστηρίχθηκε από NIBIB 1 R01 EB009040 (σε CG). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Οι επιπτώσεις της ιονίζουσας ακτινοβολίας (IR) σε ενδογενείς ρετροϊούς (ERVs) είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστη. Τα γονιδιώματα DNA του ERVs ενσωματώνονται στο γονιδίωμα του ξενιστή ειδών τους ως αποτέλεσμα των μολύνσεων των κυττάρων βλαστικής σειράς πάνω εξελικτικού χρόνου. Μέχρι σήμερα, οι επιπτώσεις της ιονίζουσας ακτινοβολίας σε ERVs έχουν διερευνηθεί μόνο σε ποντίκια [1], όπου έχει γίνει γνωστό εδώ και δεκαετίες ότι η ιοντίζουσα ακτινοβολία μπορεί να επανενεργοποιήσει το ποντίκι ενδογενείς ρετροϊούς (MERVs) [2] – [4]. Η ιονίζουσα ακτινοβολία επηρεάζει επίσης ανοσοαποκρίσεις σε καρκινικά κύτταρα, και μία μελέτη ανιχνεύθηκε CD8 + Τ-κυττάρων τα οποία αντιδρούν προς ένα αντιγόνο Merv σε μυϊκό, ακτινοβολημένα μοντέλο καρκινώματος κόλου [5]. Έτσι, είναι εύλογο ότι οι επιπτώσεις της ιονίζουσας ακτινοβολίας σε ενδογενή έκφραση ρετροϊός θα μπορούσε να έχει συνέπειες για τις ανοσολογικές αποκρίσεις προς τα καρκινικά κύτταρα.

Η ιονίζουσα ακτινοβολία έχει αναφερθεί ότι αυξάνει την μεταγραφική δραστηριότητα πολλών ιών συμπεριλαμβανομένου του CMV [6], [7 ], HPV [8] και Ηΐν [9], [10] σε μολυσμένα κύτταρα. Οι μοριακοί μηχανισμοί είναι ακόμη σε μεγάλο βαθμό μη χαρακτηρισμένα, αν και για τον ιό HIV, IR έχει αναφερθεί να αυξήσουν την μεταγραφή μέσω της ενεργοποίησης υποκινητή LTR [9], [10]. Στο κλινικό επίπεδο, μελέτες έχουν δείξει απρόσμενα υψηλό ποσοστό επανενεργοποίηση της λανθάνουσας λοίμωξης HBV σε ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα μετά από ακτινοθεραπεία [11]. Σε HPV μολυσμένα κύτταρα, αυξημένη παραγωγή μεταγραφημάτων Ε6 /Ε7 και πρωτεΐνες έχει αποδειχθεί μετά γ-ακτινοβολία [8]. Σε κλινικό επίπεδο, έχουν αυξηθεί ειδικών κυτταροτοξικών λεμφοκυττάρων (CTL) αποκρίσεις έναντι αντιγόνων HPV Ε6 /Ε7 έχουν ανιχνευθεί σε ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας μετά από ακτινοθεραπεία [12]. Εκτός από επιδράσεις στα επίπεδα της έκφρασης του ιού, την ιονίζουσα ακτινοβολία είναι γνωστό ότι ρυθμίζουν ανοσοαποκρίσεις κατά του καρκίνου [13] – [15]

ενδογενείς ρετροϊούς είναι παρόντα στο γονιδίωμα κάθε κυττάρου ενός ατόμου και μπορεί να είναι. στόχοι για ανοσολογικές αποκρίσεις όπως εκείνες κατά MERVs [16]. Αμφότερα τα Τ- και Β-λεμφοκυττάρων αποκρίσεις έχουν επίσης παρατηρηθεί κατά της ανθρώπινης ενδογενείς ρετροϊούς (HERVs) [17] – [21]. Πιο συγκεκριμένα, έχουν ανοσολογικές αποκρίσεις παρατηρήθηκαν έναντι πιο πρόσφατα απέκτησε σειρά των ρετροϊών στο ανθρώπινο γονιδίωμα, HERV-K [18], [19], [22], [23]. HERVs υπάρχουν στο ανθρώπινο γονιδίωμα, με τη μορφή ολοκληρωμένου ρετροϊικού γονιδιωμάτων DNA ονομάζεται προϊούς. Συλλογικά έχει εκτιμηθεί ότι περιλαμβάνουν περίπου 8% του ανθρώπινου γονιδιώματος [24]. Στην απουσία πίεσης επιλογής με τον ξενιστή να διατηρήσει αυτές προϊούς σε ανέπαφη μορφή, οι μεταλλάξεις αναπόφευκτα συσσωρεύονται σε αυτά πάνω εξελικτικού χρόνου διαταράσσοντας ιικό γονιδιωματικό εξαρτήματα και αδρανοποιεί την ιογενή μολυσματικότητα. Η HML2 υπότυπος του HERV-K είναι η μόνη ρετροϊός ότι έχουν εισέλθει στο γονιδίωμα του ανθρώπινου καταγωγή από την απόκλιση των σειρών του ανθρώπου και του χιμπατζή συνέβη περίπου 6 εκατομμύρια χρόνια πριν [25] – [31]. Επειδή είναι το πιο πρόσφατα εισαχθεί, HERV-K HML2 αποτελεί την πιο άθικτο σύνολο των ρετροϊών στο ανθρώπινο γονιδίωμα [25], [32] – [39]. Παρ ‘όλα αυτά, κανένα μεμονωμένο HERV-K locus προϊικό είναι γνωστό ότι είναι πλήρως λειτουργική και σε θέση να παράγει μολυσματικά ιοσωμάτια, αν και ο ανασυνδυασμός μεταξύ των τόπων που υπάρχουν σήμερα στο ανθρώπινο γονιδίωμα θα μπορούσε να αποκαταστήσει την ιογενή μολυσματικότητα [37]. Πολλά από τα προϊούς HERV-K είναι επαρκώς άθικτες να κωδικοποιούν πρωτεΐνες οι οποίες μπορεί να διατηρούν κάποια λειτουργικότητα [25], [35], [36], [38], [39], και της έκφρασης αυτών των πρωτεϊνών έχει προταθεί ότι συσχετίζονται με ασθένειες συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου [40] – [44].

HERV-K μεταγράφεται σε διάφορους βαθμούς σε αρκετές ανθρώπινες ασθένειες, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου [20], [45] – [48], HIV λοίμωξη [18], [49 ] – [51] και αυτοάνοσων διαταραχών [52], [53]. Μεμονωμένα loci HERV-K στο ανθρώπινο γονιδίωμα διαφέρουν ως προς την ακεραιότητα των ειδικών ανοικτών πλαισίων ανάγνωσης, η λειτουργικότητα των κωδικοποιημένων πρωτεϊνών, η ακεραιότητα των στοιχείων cis-δράσης, και, ενδεχομένως, με την ιδιότητα των αλληλουχιών DNA που πλαισιώνει την ιικό DNA να επηρεάσουν την μεταγραφή. Αυτά κυμαίνονται από περίπου 97 έως πάνω από 99% ταυτόσημη σε κατά ζεύγη συγκρίσεις μεταξύ τους, και πολλές από τις διαφορές μεταξύ τους είναι μονά αλλαγές ζευγών βάσεων. Ως εκ τούτου, ο προσδιορισμός του συγκεκριμένου loci HERV-K εκφράζεται σε ένα ανθρώπινο δείγμα και να κατανοήσουν σε βάθος του βιολογικού ρόλου του HERV-K σε ανθρώπινες ασθένειες, εάν υπάρχει, είναι απαραίτητο να περιλαμβάνουν την ανάλυση των ιικών μεταγραφημάτων στο επίπεδο του ενός νουκλεοτιδίου σε οποιοδήποτε μελέτη του τους [54]. Έχουμε προηγουμένως ανιχνευθεί HERV-K μεταγραφές σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη και παρατήρησε ότι ορισμένες από τις μεταγραφές είχαν ματιστεί σε ασυνήθιστες θέσεις στο ιικό γονιδίωμα [55]. Η ανίχνευση της παραλλαγής ματίσματος του HERV-K μεταγραφές σε σειρές καρκίνου του προστάτη ήταν απροσδόκητη. Στην έκθεση αυτή, η νουκλεοτιδική βάση την ανάλυση των συγκεκριμένων τόπων HERV-K που μεταγράφονται και τη δυνατότητα ασυνήθιστη παραλλαγές ματίσματος επεκτάθηκαν και σε άλλους τύπους καρκίνου κυτταρικές σειρές. Δοκιμάσαμε επίσης την υπόθεση ότι η ιονίζουσα ακτινοβολία μπορεί να μεταβάλλει τα επίπεδα της ανθρώπινης ενδογενούς ρετροϊού μεταγραφημάτων Κ. HERV-K πρωτεΐνες είναι γνωστό ότι είναι στόχοι για τις δύο αποκρίσεις λεμφοκυττάρων Τ και Β- [17] – [21], [46]. Ως πρώτο βήμα προς προσδιορισμό αν τα αντιγόνα HERV-K μπορεί να υπόκειται σε ακτινοβολία επαγόμενη διαφοροποίηση και ίσως αποτελούν υποψήφιων στόχων για την αντι-όγκου, με βάση Τ-κυττάρων ανοσοθεραπεία για τον καρκίνο μετά από χορήγηση ιονίζουσας ακτινοβολίας, ερευνήσαμε αν ιονίζουσα ακτινοβολία επηρεάζει τα επίπεδα του HERV-K μεταγραφές σε διάφορες καρκινικές κυτταρικές σειρές.

Αποτελέσματα

HERV-K μεταγραφή σε καρκινικές κυτταρικές σειρές

HERV-K μεταγραφή έχει αναφερθεί ότι συμβαίνουν στον καρκίνο του ανθρώπου . Ωστόσο, η απόκριση του HERV-K σε ιοντίζουσα ακτινοβολία δεν έχει ποτέ δοκιμαστεί σε καρκινικά ή φυσιολογικά κύτταρα. Για την επαλήθευση HERV-K μεταγραφή και τη δημιουργία μιας βάσης αναφοράς για πειράματα με IR, πρώτα πραγματοποιείται ανάστροφης μεταγραφάσης-PCR (RT-PCR) επί RNA που απομονώνεται από κυτταρικές γραμμές 13 καρκίνο από τοποθεσίες καρκίνο συνήθως αντιμετωπίζονται με ακτινοθεραπεία: προστάτη, του τραχήλου της μήτρας, το κεφάλι λαιμό, και του μαστού. RT-PCR διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας ζεύγη εκκινητών από πολλαπλά τμήματα του γονιδιώματος του ιού φαίνεται στο σχήμα 1. Τα εναύσματα από την ιική πρωτεάση (

pro

), πολυμεράση (

pol

) ήταν ικανή να ανιχνεύει μη ματισμένου ιικό RNA, και φάκελο (

env

) γονίδιο εκκινητές ήταν σε θέση να ανιχνεύσουν τόσο μη συρραμμένο και μεμονωμένα ματισμένων mRNAs env. Τα αναμενόμενα προϊόντα μεγέθους παρατηρήθηκαν σε 12 κυτταρικές σειρές από τη δοκιμή για το

pro

13 και

pol

αναδιπλασιασμού και 11 κυτταρικές σειρές για το

env

αμπλικόνιο (Εικ . 2Α). Παράλληλη RT-PCR εκτελέσθηκαν με εκκινητές για το

GAPDH

γονίδιο για την επαλήθευση ακριβής συγκρίσιμες φόρτωση του RNA σε όλα τα δείγματα και τη φόρτωση των γελών. Έλεγχοι χωρίς αντίστροφη μεταγραφάση επαληθευτεί ότι τα προϊόντα παρήχθησαν από RNA εκμαγεία και όχι από δυνητικά μολυσματικό γονιδιωματικό DNA (Εικ. 2).

Ένα γενετικό χάρτη του προϊού ενός HERV-K (γκρι) εισάγεται εντός πλευρικές αλληλουχίες γονιδιώματος ξενιστή είναι παρουσιάζεται με διπλές αλληλουχίας στόχου 5 ή 6 bp (TDS) υποδεικνύεται ως μαύρα κουτιά. Η μη συρραμμένο πρωτογενές ιική μεταγραφή, μεμονωμένα-ματισμένα

env

mRNA και διπλά-ματίζεται

rec

και

Οι ΝΡ9

mRNAs εμφανίζεται κάτω από το ιικό γονιδίωμα, μαζί με το μεμονωμένα ματισμένο RNA [56] που δεν είναι γνωστό ότι κωδικοποιεί οποιαδήποτε πρωτεΐνη. Τα 3 ‘πολυ (Α) ουρές που αναφέρεται (ΑΑΑΑ). Το 292 νουκλεοτιδίων διαγραφή του τύπου 1 HERV-K προϊών που καλύπτουν την διασταύρωση pol-env υποδεικνύεται (Δ292). Πληκτρολογήστε 2 προϊών HERV-K και οι μεταγραφές τους περιέχουν αυτά τα νουκλεοτίδια. Οι θέσεις των ζευγών εκκινητών PCR παρουσιάζεται στο κάτω μέρος ως μαύρα βέλη με τα ονόματα με τα οποία έχουν ταυτοποιηθεί σε όλη την χαρτί. Τα γκρίζα βέλη εντοπισμό εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για την ένθετη PCR. Η διακεκομμένη, γωνιακή γραμμή δείχνει τις αποκομμένο ιντρονικές ακολουθίες που η 1Χ-env και ζεύγη 2X-rec αστάρι σχεδιάστηκαν για να διασχίσουν. Το ζεύγος εκκινητών που χρησιμοποιείται για ποσοτική RT-PCR παρουσιάζεται επίσης (q-env).

Η

RT-PCR για την ανίχνευση ιικών μεταγραφημάτων σε πέντε διαφορετικές θέσεις σε HERV-K γονιδιώματος, δύο εκ των οποίων απέναντι κόμβους ματίσματος για την ανίχνευση RNA που συγκολλημένα στη συμβατική διασταύρωση mRNA env ματίσματος (1x-env) και τις REC διασταυρώσεις ματίσματος mRNA. GAPDH RT-PCR πραγματοποιήθηκε ταυτόχρονα και χρησίμευσε ως θετικός έλεγχος για ακεραιότητα RNA και ως σύγκριση φόρτωσης. Τα προϊόντα αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. Οι Genomic θέσεις των εκκινητών που χρησιμοποιούνται φαίνονται στο Σχ. 1. Παράλληλες έλεγχοι πραγματοποιήθηκαν χωρίς ανάστροφης μεταγραφάσης (-RT) ως έλεγχοι για τον αποκλεισμό της μόλυνσης DNA. Οι δείκτες μεγέθους DNA που φαίνεται στα αριστερά.

Η

Αυτά τα δεδομένα επιβεβαίωσαν ότι HERV-K μεταγραφές ήταν παρούσες στα περισσότερα από τα ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν. Υπήρξαν μερικές περιπτώσεις όπου τα προϊόντα HERV-K RT-PCR δεν ανιχνεύθηκαν (Εικ. 2). Ένα τραχήλου κυτταρική σειρά καρκίνου, C33A, δεν απέδωσε τα προϊόντα RT-PCR με οποιοδήποτε από τα τρία ζεύγη εκκινητών, αν και έδωσε το αναμενόμενο προϊόν για το

GAPDH

ενίσχυση ελέγχου (Εικ. 2Α). Ένα καρκίνου του μαστού κυτταρική γραμμή, MDA-MB-468, επανειλημμένα αποτύχει να αποδώσει το

env

προϊόν ενίσχυσης, αν και η

pro

και

pol

προϊόντα ήταν παρόντες (Σχ. 2Α ). Για να αυξηθεί η ευαισθησία, μια ένθετη RT-PCR εκτελέστηκε για το

env

amplicon χρησιμοποιώντας εκκινητές τοποθετούνται όπως φαίνεται στο σχήμα 1. Η

env

προϊόν ανιχνεύθηκε στο MDA-MB-468 στήθους γραμμή του καρκίνου, όπως ήταν σε 11 άλλες γραμμές (Εικ. 3Α). Ωστόσο, εξακολουθεί να ήταν μη ανιχνεύσιμη σε C33A του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα, υποδεικνύοντας ότι οι μη συναρμολογημένο και μεμονωμένα συγκολλημένα HERV-K RNA που δεν ήταν παρόντες σε ανιχνεύσιμα επίπεδα σε αυτή την κυτταρική γραμμή. Αντιδράσεις Παράλληλες ενίσχυσης διεξήχθησαν χωρίς αντίστροφη μεταγραφάση και ήταν ομοιόμορφα αρνητική, δείχνοντας έτσι ότι η ενίσχυση ήταν από RNA εκμαγεία και όχι από οποιοδήποτε δυνητικά μολυσματικό γονιδιωματικό DNA (Εικ. 3).

Nested PCR πραγματοποιήθηκε σε προϊόντα RT-PCR φαίνεται στο Σχ. 2 για την ανίχνευση ιικών μεταγραφημάτων σε τρεις διαφορετικές θέσεις στο γονιδίωμά HERV-K. Δύο από RT-PCR για κόμβους σταυρό μάτισμα για την ανίχνευση RNA που συγκολλημένα στη συμβατική διασταύρωση mRNA env ματίσματος (1x-env) και rec και mRNA ΝΡ9 (2Χ-rec, 2X-ΝΡ9) splice κόμβους. Τα προϊόντα αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση. Οι Genomic θέσεις των εκκινητών που χρησιμοποιούνται φαίνονται στο Σχ. 1. Παράλληλες έλεγχοι πραγματοποιήθηκαν χωρίς ανάστροφης μεταγραφάσης (-RT) ως έλεγχοι για τον αποκλεισμό της μόλυνσης DNA. Οι δείκτες μέγεθος του DNA που φαίνεται στα αριστερά.

Η

Παρουσία του HERV-K ματίσματος στον Καρκίνο Γραμμές κυττάρων

Για να εκτιμηθεί κατά πόσον οι μεταγραφές HERV-K έχει επαρκή ακεραιότητα για τα RNAs να να ματιστεί, εκτελέσαμε RT-PCR και από τις δύο ιικές συμβατικά κόμβους ματίσματος. Πολλαπλές συγκολλημένα HERV-K mRNAs έχουν χαρακτηριστεί [40], [56] – [58], συμπεριλαμβανομένης της μόνας ματισμένο mRNA που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη Εην, και τρία διπλά συγκολλημένα RNAs, ένα από τα οποία κωδικοποιεί Rec, και ένα άλλο από τα οποία κωδικοποιεί ΝΡ9 (Σχ . 1). HERV-K HML2 προϊούς υφίστανται ως δύο διαφορετικών τύπων που ονομάζονται τύπου 1 και τύπου 2, ανάλογα με το αν ένα 292 bp τέντωμα νουκλεοτιδίων είναι παρούσα (τύπος 2) ή να διαγραφούν (τύπος 1). Σε τύπου 1 προϊών, η διαγραφή αφαιρεί το τμήμα τερματικού-κωδικοποιεί τα αμινοξέα των

env

και

rec

, και προκαλεί μια σε πλαίσιο σύντηξη του

pol

και

env

ανοικτά πλαίσια ανάγνωσης (Εικ. 1). Αντίθετα, σε τύπου 2 προϊών, το τμήμα άκρο-κωδικοποίηση καρβοξυλομάδα του

pol

και το ότι για το αμινο τέρματα των

env

και

rec

είναι πλήρως παρόντες. θέση ματίσματος 3 ‘(3’ SS) για

env

mRNA και το πρώτο ιντρόνιο του

rec

mRNA βρίσκεται ανάντη της bp τέντωμα 292, αλλά η 5’SS για το δεύτερο ιντρόνιο του

rec

mRNA βρίσκεται εντός του 292 bp (Σχ. 1). Έτσι, πληκτρολογήστε 1 προϊών δεν παράγουν το

rec

μορφή διπλά συγκολλημένα RNA (Εικ. 1) ή κωδικοποιούν την πρωτεΐνη Rec.

Η χρήση εκκινητών σχεδιασμένο να ανιχνεύει την μεμονωμένα-συγκολλημένα

env

mRNA (1Χ-env, Εικ. 1) και οι δύο κόμβους ματίσματος σε διπλά-συγκολλημένα

rec

ή

ΝΡ9

mRNAs (ονομάζεται 2X-rec, Εικ. 1), 11 από τα 13 κυτταρικές γραμμές βρέθηκαν να είναι θετικοί με το 1X-

env

εκκινητές, και 10 από τις 13 απέδωσαν προϊόντων με τα 2Χ-rec εκκινητές (Σχ. 2Β). Η ανίχνευση των ματισμένων προϊόντων που παρέχονται επίσης περαιτέρω απόδειξη ότι τα προϊόντα RT-PCR προήλθαν στην πραγματικότητα από ιικώς κωδικοποιημένη RNA και όχι από οποιαδήποτε δυνητικά μολυσματικό κυτταρικό γονιδιωματικό DNA. Η ανίχνευση πολλαπλών προϊόντων μεγέθους με τους εκκινητές 1Χ-env ήταν απροσδόκητη.

Για να βεβαιωθείτε ότι οι ζώνες απροσδόκητη μέγεθος προήλθαν από HERV-K RNA και να επιτευχθεί μια καλύτερη ανάλυση των προϊόντων PCR ζώνες σε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης , εκτελέσαμε ένθετη PCRs (Σχήμα 1). Πολλαπλές ζώνες παρατηρήθηκαν και πάλι, και κανένα προϊόν ανιχνεύθηκαν με την απουσία της ανάστροφης μεταγραφάσης, επιβεβαιώνοντας έτσι ότι προέρχονται από συγκολλημένα ιικά RNA (Εικ. 3). Τα προϊόντα PCR ταυτοποιήθηκαν για 1Χ-env amplicon σε 12 από τα 13 κυτταρικές σειρές και ταινίες από τρία διαφορετικά μεγέθη ανιχνεύθηκαν, με τις αναλογίες της έντασης των τρεις ζώνες μεταβολής μεταξύ των διαφόρων γραμμών. προϊόντα Πολλαπλές μέγεθος παρατηρήθηκαν επίσης για την 2X-rec amplicon, συμπεριλαμβανομένης της λιποθυμίας ζώνη περίπου 500 bp και εμφανή ζώνη περίπου 250 bp. Αμφότερα τα προϊόντα PCR ήταν παρούσα σε MDA-MB-468 κύτταρα καρκίνου του μαστού, δείχνοντας έτσι ότι ματισμένο RNA του ιού ήταν παρόν σε αυτή την κυτταρική γραμμή. Για C33A καρκινικά κύτταρα του τραχήλου της μήτρας, καμία από τις ένθετων προϊόντων από συγκολλημένα RNA ανιχνεύθηκε, επιβεβαιώνοντας έτσι την απουσία ανιχνεύσιμων μεταγραφές HERV-K σε αυτή την κυτταρική γραμμή. Η ανάλυση αυτή ανιχνεύεται επίσης την παρουσία του ΝΡ9 μεταγραφές σε πέντε από τις γραμμές (Σχ. 3).

αναγνώριση των ατομικών HERV-K Active Loci

Ο λόγος για την ανίχνευση πολλαπλών ζωνών μεγέθους σε το RT-PCRs των σχημάτων 2Β και 3, ιδιαίτερα για την 1Χ-env RT-PCRs, ήταν αβέβαιο. Μία πιθανότητα ήταν ότι θα μπορούσαν να αντικατοπτρίζουν το μοναδικό διαγραφές ή παρεμβολές που είχαν συγκεντρωθεί σε συγκεκριμένες θέσεις HERV-K πάνω εξελικτικού χρόνου με αποτέλεσμα μεταγραφήματα αλλαγμένη μέγεθος, και αυτά συγκεκριμένους τόπους ήταν αυτά μεταγράφονται στις κυτταρικές γραμμές που χρησιμοποιούνται. Ένα άλλο ήταν ότι οι θέσεις ματίσματος που χρησιμοποιούνται ποικίλη μεταξύ των μεμονωμένων loci HERV-K στο ανθρώπινο γονιδίωμα, οδηγώντας έτσι σε διαφορετικά προϊόντα μέγεθος. Για να γίνει διάκριση μεταξύ αυτών των υποθέσεων και να προσδιορίσει την ειδική loci από το οποίο προήλθαν οι μεταγραφές, τα προϊόντα PCR που φαίνεται στο Σχήμα 2 αλληλουχήθηκαν. Αυτή η απαιτούμενη ανάλυση των μεταγραφών στο επίπεδο των νουκλεοτιδίων, επειδή οι προϊοί είναι τόσο όμοιες μεταξύ τους. Ενώ η ατομική προϊοί συσσωρεύουν μεταλλάξεις μοναδικό πάνω εξελικτικό διάστημα, ορισμένες από τις προϊούς HERV-K στο ανθρώπινο γονιδίωμα είναι τόσο νέα ώστε να είναι πάνω από 99% ταυτόσημες, και το επίπεδο της ταυτότητας μπορεί να ποικίλει σε διαφορετικά μέρη του γονιδιώματος του ιού. Προϊών που σχηματίστηκε νωρίτερα στο χρόνο έχουν γίνει σταδιακά πιο αποκλίνουσες. Αλληλούχηση επαρκώς μακρά προϊόντα PCR μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να συναχθεί το ειδικό ιικό loci που συμφωνούν περισσότερο με τις μεταγραφές, ακόμα και όταν οι διαφορές είναι λιγότερο από ένα νουκλεοτίδιο σε 100 μεταξύ δύο συγκεκριμένων προϊούς και μεταγραφές RNA από αυτά. Ο Πίνακας 1 παραθέτει 23 από τις πιο άθικτες προϊών HERV-K HML2 στο ανθρώπινο γονιδίωμα με το οποίο συγκρίθηκαν οι ακολουθίες [39].

Η

Αρχικά, η

pro

,

pol

και

env

PCR προϊόντα απευθείας αλληλουχία. Ένα παράδειγμα

pro

αλληλουχίες από τέσσερις κυτταρικές γραμμές ευθυγραμμισμένη με πολλά από τα σχετικά άθικτο προϊούς HERV-K στο ανθρώπινο γονιδίωμα φαίνεται στο Σχήμα 4. Σύγκριση των αλληλουχιών έδειξε ότι οι μεταγραφές HERV-K ανιχνεύεται συμφωνημένα εκείνες συμμερίζονται την ανθρώπινη-συγκεκριμένες προϊών, δείχνοντας ότι προέρχεται τουλάχιστον κατά κύριο λόγο από το υποσύνολο του HERV-K HML2 προϊών που σχηματίστηκε μετά απέκλιναν οι καταγωγές του ανθρώπου και του χιμπατζή. Σε άλλες θέσεις, υπήρχαν πολλαπλές δευτερεύουσες αιχμές στα χρωματογραφήματα αλληλουχίας, που δείχνει ότι τα PCR προϊόντα προέρχονται από τα μίγματα των προϊόντων μεταγραφής από πολλαπλές θέσεις. Ο Πίνακας 1 συνοψίζει τα πιο κυρίαρχη νουκλεοτίδια ( «πολλαπλότητα», Πίνακας 1) σε κάθε μία από τις θέσεις όπου πολλαπλά νουκλεοτίδια σαφώς παρατηρήθηκαν εντός των

pro

αμπλικόνια. Παρά το γεγονός ότι, αυτή συνδυάζεται στενότερα τον προϊό HERV-K102 (Πίνακας 1), δεν ήταν δυνατόν να διακριθεί από την παρούσα ανάλυση εάν αυτό προϊού ήταν στην πραγματικότητα μεταγράφεται, επειδή ήταν επίσης εύλογο ότι η αλληλουχία πλειάδα από ένα μείγμα που μεταγράφεται προϊούς μόλις coincidently ταιριάζει αυτό το προϊό. Τα μίγματα αλληλουχία ποικίλει σε κάποιο βαθμό μεταξύ των διαφόρων κυτταρικών σειρών (Πίνακας 1), και ομοίως παρατηρήθηκαν σε άλλα μέρη του γονιδιώματος του ιού (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ενώ οι ιδέες που θα μπορούσαν να προκύψουν από την άμεση αλληλούχιση των προϊόντων RT-PCR ήταν ως εκ τούτου περιορισμένες, τα μείγματα έκαναν δείχνουν ότι πολλαπλές προϊών μεταγράφηκαν μεταξύ των διαφόρων καρκινικών κυτταρικών σειρών.

Στο κάτω πίνακα, ο HERV οι -Κ προϊών πλήρους μήκους χρησιμοποιούνται ως σημεία αναφοράς για τον προσδιορισμό της τόπους καταγωγής των μεταγραφών mRNA φαίνεται. Στα αριστερά, οι μεγάλες υποκαταστήματα των σωζόμενων ανθρωποειδή εμφανίζονται, μαζί με τις κατά προσέγγιση χρόνους της διακλάδωσης τους από τη γενεαλογία που οδηγεί στο σύγχρονο άνθρωπο σε εκατομμύρια χρόνια πριν (Ma). Προϊών που εισάγονται σε ακριβώς ορθόλογες θέσεις σε ανθρώπους και άλλα ανθρωποειδή, και ως εκ τούτου είναι πανομοιότυπα με την κάθοδο, υποδεικνύονται.

Η

Για να διερευνηθεί με μεγαλύτερη ακρίβεια ποιες θέσεις HERV-K μεταγράφηκαν, μείγματα RT-PCR προϊόντα διαχωρίστηκαν σε μεμονωμένα αλληλουχίες με κλωνοποίηση σε πλασμιδικούς φορείς. Αυτό, επίσης, επέτρεψε τη διερεύνηση τι αντιπροσώπευαν για τα προϊόντα πολλαπλών μεγέθους (Σχ. 2 και 3). Η 1X-

env προϊόντα

RT-PCR (Σχ. 2Α) έχουν τυφλά κλωνοποιήθηκαν σε πλασμιδιακούς φορείς. Για τα προϊόντα που 1Χ-env, είκοσι τέσσερις μεμονωμένων κλώνων από κάθε κυτταρική σειρά αναλύθηκαν με PCR διαλογή για να καθοριστεί το μέγεθος του κλωνοποιημένου amplicon. Για διάφορα δείγματα, 4 έως 13 κλώνοι επελέγησαν για αλληλούχιση, και τα αποτελέσματα συνοψίζονται στον Πίνακα 2. Οι κλώνοι επιλέχθηκαν για να συμπεριλάβει το σύνολο των διαφόρων προϊόντων μεγέθους σε κάθε γραμμή, και έτσι τον αριθμό των φορών που λήφθηκε οποιαδήποτε αλληλουχία δεν το έκανε αντανακλούν τη σχετική αφθονία του μεταξύ των μεταγραφές HERV-K σε κάθε κυτταρική σειρά. Επιπλέον, η έκταση της αλληλούχισης περιορίστηκε σε εξέταση των πιο κοινά προϊόντα, και είναι πιθανό ότι λιγότερο άφθονα μεταγράφεται προϊούς δεν ανιχνεύθηκαν με την ανάλυση αυτή.

Η

Αυτές οι αναλύσεις εντόπισε συνολικά έξι διαφορετικών ατομικές θέσεις HERV-K μεταξύ των 12 κυτταρικών σειρών (Πίνακας 2). Δύο από αυτά ήταν HERV-K102 και HERV-K108 (οι προϊών στη συνέχεια προσδιορίζονται απλά ως K102, K108, κλπ). Μαζί με μια τρίτη προϊός, Κ (Ι), αυτά ανιχνεύθηκαν σε πολλαπλές κυτταρικές σειρές (Πίνακας 2). προϊόντα RT-PCR ανιχνεύθηκαν επίσης από τρεις επιπλέον προϊούς, K107, K111, K117 και σε ένα ή μερικά κυτταρικές σειρές η κάθε μία. Οι μεταγραφές από πολλαπλές προϊοί ανιχνεύθηκαν σε περισσότερες από τις γραμμές. Είναι πιθανό ότι πιο εκτεταμένη ανάλυση αλληλουχίας των κλώνων θα αυξήσει τον αριθμό των HERV-K loci ανιχνευθεί. Πέντε των τόπων από τους οποίους εντοπίστηκαν ιογενή μεταγραφές ήταν ανθρώπινα ειδικά HERV-K προϊών, επιβεβαιώνοντας ότι οι ανιχνεύεται μεταγραφές προέρχονται σε μεγάλο βαθμό από το υποσύνολο του HERV-K HML2 προϊών που σχηματίστηκε μετά απέκλιναν οι καταγωγές του ανθρώπου και του χιμπατζή. Έτσι, η πιο συχνά ανιχνεύεται HERV-K συγκολλημένα

env

μεταγραφές στις γραμμές ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων προήλθαν από την πιο πρόσφατα αποκτήθηκε υποσύνολο των ρετροϊών στο ανθρώπινο γονιδίωμα.

εναλλακτικό μάτισμα των ατομικών HERV- K Active Loci

αλληλουχίας του 1X-env προϊόντα RT-PCR έδειξε μάτισμα στις αναμενόμενες θέσεις εντός του γονιδιώματος HERV-K, αλλά, απροσδόκητα, έδειξε επίσης μεταγραφές ματιστεί σε επιπλέον θέσεις (Σχήμα 5). Τα συμβατικά θέσεις εντοπίστηκαν για τις 2 προϊούς τύπου, K108, K109, και Κ (Ι), και τύπου 1 προϊούς, Κ102 και K117 (Εικ. 5). K108 είναι ένα από τα πιο ανέπαφα προϊούς στο ανθρώπινο γονιδίωμα που έχει πλήρους μήκους ανοικτά πλαίσια ανάγνωσης για όλες τις ιικές πρωτεΐνες [25], [35], και συμβατικά ματισμένα μεταγραφήματα από αυτό ανιχνεύθηκαν σε επτά διαφορετικές γραμμές (Εικ. 5). Ωστόσο τέσσερα τόπους, Κ102, Κ (Ι), K117 και K111, έδειξε ασυνήθιστη παραλλαγές ματίσματος 1X-env που σχηματίζονται από τη χρήση εναλλακτικών 5 ‘και 3’ θέσεις ματίσματος. Οι εναλλακτικές θέσεις ματίσματος που χρησιμοποιήθηκαν ποικίλες μεταξύ των διαφόρων προϊούς (Εικ. 5). Εκείνοι που ανιχνεύθηκαν (Εικ. 5), σε ορισμένες περιπτώσεις συμφωνημένα τα σήματα συναίνεση για τα μείζονα ή ελάσσονα σώματα συναρμογής, ενώ σε άλλες περιπτώσεις δεν έκαναν (Εικ. 5). Οι περισσότεροι από εναλλακτικά ματισμένων μεταγράφων ήταν από τύπου 1 προϊούς, αλλά ένας από αυτούς, Κ (Ι), ήταν από ένα τύπου 2 προϊού. Έτσι, η χρήση εναλλακτικών θέση ματίσματος δεν ήταν μόνο συνέπεια της απουσίας του 292 bp. K111 είναι ένα παλαιότερο προϊό που σχηματίστηκε πριν από την απόκλιση της γενεαλογίας γορίλα από τη γενεαλογία του ανθρώπου-χιμπατζή πριν από περίπου 8.000.000 χρόνια [25], [59], αλλά τα άλλα προ-ιών από τα οποία εντοπίστηκαν εδώ οι ματίσματος είναι ανθρώπινα-ειδικά.

Τα τμήματα 5 ‘και 3’ ενός HERV-K προϊό εμφανίζεται στο πάνω μέρος που χωρίζονται από /και /. 5’SS και 3 ‘SS αναφέρει τις συμβατικές θέσεις ματίσματος του HERV-K, και οι θέσεις τους σημειώνονται με μαύρους κύκλους. Οι θέσεις των εξωτερικών αρχικών τεμαχίων PCR που χρησιμοποιήθηκε για την ένθετη PCR παρουσιάζεται ως βέλη. Δομές της env συγκολλημένα προϊόντα RT-PCR από τις κυτταρικές σειρές και προϊούς υποδεικνύεται είναι διαγραμματικά κάτω από το γονιδίωμα του ιού. Οι διακεκομμένες γραμμές δείχνουν γωνιακές τα αποκόπηκε εσώνια. Red κύκλοι δείχνουν τις θέσεις των αλληλουχιών όπου συνέβη αντισυμβατικό ματίσματος. Για κάθε ματισμένο προϊόν, η κορυφαία σειρά δείχνει την συναγόμενη αλληλουχία πρωτογενούς μεταγραφής προσδιορίζεται από ότι του συγγενούς γενωμικού τόπου, και η κάτω αλληλουχία δείχνει την αλληλουχία του RT-PCR προϊόντος. Κόκκινο νουκλεοτίδια ενώθηκαν σε συγκολλημένα προϊόντα. Gray νουκλεοτίδια δείχνουν τα άκρα των αποκομμένο ιντρονικές αλληλουχίες. Η θέση του 292 νουκλεοτιδίων διαγραφή οριστική του τύπου 1 προϊών δείχνεται.

Η

Οι κυτταρικές γραμμές στις οποίες ανιχνεύτηκαν συνοψίζονται στον Πίνακα 2 και στο Σχήμα 5. Για K102 οι εναλλακτικές θέσεις ματίσματος 1Χ-env, οι ίδιες εναλλακτικές θέσεις ματίσματος ανιχνεύθηκαν σε έξι διαφορετικές κυτταρικές σειρές, και για K117, οι ίδιες θέσεις εντοπίστηκαν σε δύο (Εικ. 5). Αυτό υποδηλώνει ότι οι αλληλουχίες των ειδικών προϊόντων μετεγγραφής (και τα προϊούς από το οποίο προήλθαν) προσδιορίστηκε εναλλακτική χρήση θέση ματίσματος. Εναλλακτικά ματισμένες μεταγραφές ανιχνεύτηκαν στην πλειονότητα των κυτταρικών γραμμών, και σε ορισμένες περιπτώσεις, τόσο τα συμβατικά και εναλλακτικές θέσεις ματίσματος ανιχνεύθηκαν για συγκεκριμένα προϊούς (Κ102, Κ (Ι), και K117). Είναι ασαφές από αυτή την ανάλυση εάν η φύση των κυττάρων συνέβαλε τα μοτίβα ματίσματος που παρατηρήθηκαν. Συνοπτικά, οι εναλλακτικές θέσεις ματίσματος ανιχνεύονται αντιπροσώπευαν διάφορες ζώνες μεγέθους ανιχνεύθηκε στα RT-PCR αντιδράσεις σε όλη τη διασταύρωση 1X-env ματίσματος (Εικ. 2 και 3). Ωστόσο, η συχνή ανίχνευση τους και η διακύμανση μεταξύ των διαφόρων προϊούς HERV-K ήταν απροσδόκητο, καθώς και η πιθανή μοριακή βιολογική βάση για αυτούς ήταν άγνωστη.

αλληλουχίας των διαφορετικού μεγέθους προϊόντα επίσης έχουν αναληφθεί για PCRs διεξήχθησαν με οι εκκινητές για την ανίχνευση των διπλά συγκολλημένα RNAs (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Το λιγότερο σημαντικό, περίπου 800 bp προϊόν (Εικ. 2Β) αντιστοιχούσαν σε συμβατικά συγκολλημένα

rec

mRNA. Οι ένθετες PCRs επιβεβαίωσε την παρουσία του rec mRNA σε 9 από 13 κυτταρικές γραμμές (Εικ. 3). Επιπλέον, ο προσδιορισμός αλληλουχίας έδειξε ότι η εξέχουσα μικρότερα μπάντα στο Σχήμα 2Β αντιστοιχούσαν σε RNA ματίζεται από την 5’SS ανάντη του

gag

στο 3 ‘SS κατάντη του δεύτερου ιντρονίου σε ποσοστό

rec

mRNA . Αυτό το RNA έχει περιγραφεί στο παρελθόν [57], αλλά δεν είναι γνωστό να κωδικοποιήσει οποιαδήποτε πρωτεΐνη.

Ιονίζουσες Ακτινοβολίες (IR) Αυξάνει HERV-K Μεταγραφή στον καρκίνο του προστάτη κυτταρικές γραμμές

Αφού διαπιστώθηκε ότι HERV -Κ μεταγράφηκε σε μία ποικιλία ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών, εξετάσαμε αν ιονίζουσας ακτινοβολίας θα μπορούσε να μεταβάλει τα επίπεδα των ιικών μεταγραφημάτων. Ποσοτική RT-PCR (qRT-PCR) πραγματοποιήθηκε σε RNA που απομονώθηκε από τις κυτταρικές σειρές 12 η οποία έδειξε HERV-K μεταγραφής. Κύτταρα σε 50% συρροή ακτινοβολούνται σε μία και μόνη έκθεση σε

πηγή 137Cs. Δόσεις γ-ακτινοβολία ποίκιλαν σε 0, 2,5, 5, 10 ή 20 Gy, και τα κύτταρα σε κάθε δόση συλλέχθηκαν 1, 3, 8, 24, και 72 ώρες μετά την ακτινοβόληση. Το ζεύγος εκκινητών που χρησιμοποιείται σχεδιάστηκε σε

env

, κατάντη της διαγραφής 292 νουκλεοτιδίων, έτσι ώστε να ανιχνεύεται τόσο μη συρραμμένο RNA και μεμονωμένα-ματισμένο mRNA env (Εικ. 1). Κάθε πείραμα εκτελέστηκε τρεις ξεχωριστές φορές, και τρεις RT-PCR επαναλήψεις πραγματοποιήθηκαν σε κάθε μία από τις βιολογικές επαναλήψεις.

Οι περισσότερες από τις κυτταρικές σειρές που περιλαμβάνουν τις τρεις σειρές καρκίνου του τραχήλου της μήτρας που εξετάστηκαν, οι τρεις όγκους κεφαλής και τραχήλου, και τρεις από τις γραμμές καρκίνου του μαστού δεν έδειξε αξιοσημείωτες διαφορές στο επίπεδο του HERV-K μεταγραφές σε οποιαδήποτε δόση ιονίζουσας ακτινοβολίας και σε οποιοδήποτε χρονικό σημείο (Σχ. 6). Ωστόσο, όλες οι κυτταρικές γραμμές καρκινώματος προστάτη τρία έδειξαν σημαντικά αυξημένα επίπεδα HERV-K μεταγραφές (Εικ. 6). Οι αυξήσεις στις τρεις κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη ήταν πιο εμφανής στις 24 ώρες μετά την ακτινοβόληση. Τα επίπεδα του ιικού

env

RNA στις 24 ώρες αυξήθηκαν δύο έως οκτώ φορές σε σύγκριση με μη-ακτινοβολημένα κύτταρα. Μη παραμετρική, Wilcoxon-υπογεγραμμένο τεστ rank εκτελέστηκαν για να συγκρίνουν τις μετρήσεις σε κάθε δόση ακτινοβολίας γάμμα με αυτές στους 0 Gy, και οι Ρ-τιμές που παρουσιάζονται στον Πίνακα 3. Ολες οι αυξήσεις στις κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη στις 24 ώρες ήταν σημαντικές με Ρ-τιμές & lt? 0,01. Έτσι, ήταν ομοιόμορφα σημαντική σε αυτές τις γραμμές και παρατηρήθηκαν σε όλες τις δόσεις της ακτινοβολίας που χρησιμοποιείται. Ορισμένες αυξήσεις σε αυτές τις γραμμές ήταν εμφανείς σε ορισμένα από τα δείγματα σε 8 ώρες μετά την ακτινοβόληση, αλλά όχι σε 3 ώρες. Όλες οι αυξήσεις ήταν παροδικές, αφού με 72 ώρες μετά την ακτινοβόληση, τα επίπεδα του HERV-K είχε επιστρέψει στην βασική γραμμή με όλες τις δόσεις του γ-ακτινοβολία. Σε γενικές γραμμές, το υψηλότερο επίπεδο επαγωγής παρατηρήθηκε στα 20 Gy, η υψηλότερη δόση που χρησιμοποιείται, αν και παρατηρήθηκαν σημαντικές αυξήσεις σε όλες τις δόσεις και δεν υπήρχε εμφανής συσχέτιση μεταξύ συγκεκριμένη δόση και η αύξηση αναδίπλωσης μεταξύ των καρκίνου του προστάτη κυτταρικές γραμμές.

Genomic θέσεις των εκκινητών που χρησιμοποιούνται φαίνονται στο Σχ. 1. Πέντε διαφορετικές δόσεις ιονίζουσας ακτινοβολίας που χρησιμοποιείται (0, 2,5, 5, 10, και 20 Gy), το καθένα εφαρμόστηκε σε μία μονή δόση, παρουσιάζονται σε διάφορα χρώματα σε πέντε διαφορετικούς χρόνους μετά την γ-ακτινοβόληση (1, 3, 8 , 24, και 72 ώρες). Fold μεταβολή σε σχέση με 0 Gy για κάθε χρονικό σημείο ελήφθη με ομαλοποίηση έως 3 γονίδια καθαριότητας. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν το μέσο τριών ανεξάρτητων RT-PCR των επαναλήψεων που εκτελούνται για κάθε ένα από τρία πειράματα. Οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν τυπικές αποκλίσεις.

Η

Ένα από τα κυτταρικές γραμμές καρκινώματος μαστού τέσσερα (MCF-7) έδειξαν επίσης μια αύξηση στα επίπεδα HERV-K RNA εξής γ-ακτινοβολία (Εικ. 6) . Η κινητική της αύξησης ήταν παρόμοιο με αυτό που παρατηρήθηκε σε τρεις σειρές καρκίνου του προστάτη, με μέγιστη αύξηση του έξι φορές παρατηρούνται 24 ώρες μετά την ακτινοβόληση στα κύτταρα Gy αγωγή 10. Τόσο οι δόσεις 5 και 10 Gy έδωσε στατιστικά σημαντικές αυξήσεις (Πίνακας 3), και οι αυξήσεις άνω των δύο φορές παρατηρήθηκαν 8 και 24 ώρες μετά από αρκετές διαφορετικές δόσεις γ-ακτινοβολία, υποδεικνύοντας ότι υπήρχε μια μέτρια επίδραση του γ-ακτινοβολίας σε αυτή τη γραμμή.

συνοπτικά, τα επίπεδα του HERV-K RNAs αυξήθηκαν σημαντικά από ιοντίζουσα ακτινοβολία σε ένα κλάσμα από τις καρκινικές κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν. Οι αυξήσεις ήταν παροδικές και κορυφώθηκε σε περίπου 24 ώρες μετά την ακτινοβόληση. Αυτό το φαινόμενο παρατηρήθηκε σε όλες τις τρεις γραμμές κυττάρων καρκίνου του προστάτη που ελέγχθηκαν, γεγονός που υποδηλώνει ότι HERV-K σε αυτά τα κύτταρα μπορεί να είναι ιδιαίτερα ευαίσθητοι στην ιονίζουσα ακτινοβολία.

Συζήτηση

Οι κυριότερες διαπιστώσεις της μελέτης αυτής ήταν ότι η ιοντίζουσα ακτινοβολία αύξησε τα επίπεδα του HERV-K μεταγραφές σε μερικά καρκινικά κύτταρα, και ότι τα αποτελέσματα ποικίλουν μεταξύ των γραμμών που εξετάστηκαν. Συγκεκριμένα, όλες οι σειρές καρκίνου του προστάτη που τρία ελέγχθηκαν εμφάνισαν σημαντικά αυξημένα επίπεδα HERV-K RNAs, τα οποία κορυφώθηκε σε περίπου 24 ώρες μετά την έκθεση σε μία μόνο δόση του γ-ακτινοβολία και στη συνέχεια υποχώρησε. Μια παρόμοια αύξηση και επακόλουθη μείωση παρατηρήθηκαν επίσης σε μία από τις τρεις σειρές καρκίνου του μαστού.