Αφηρημένο

Βερβερίνη έχει ταυτιστεί με αντι-πολλαπλασιαστικές επιδράσεις σε διάφορα καρκινικά κύτταρα. Πολλές ερευνητές έχουν προσπαθήσει να φωτιστούν οι μηχανισμοί αντικαρκινική berberine βασίζονται σε διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια. Ωστόσο, διαφορικά εναλλακτικό μάτισμα γονιδίων που προκαλείται από berberine θα μπορούσε επίσης να συμβάλει στην φαρμακολογικές δράσεις της και δεν έχουν αναφερθεί ακόμα. Επιπλέον, η πιθανή λειτουργική cross-μιλώντας μεταξύ των δύο συνόλων των γονιδίων αξίζει περαιτέρω διερεύνηση. Σε αυτή τη μελέτη, το RNA-seq τεχνολογία χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση των διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων και διαφορικά εναλλακτικά ματισμένες γονιδίων σε BEL-7402 καρκινικά κύτταρα επάγεται από berberine. ανάλυση Λειτουργική εμπλουτισμός έδειξε ότι αυτά τα γονίδια εμπλουτίστηκαν κυρίως στην οδό σηματοδότησης ρ53 και του κυτταρικού κύκλου. Επιπλέον, ήταν στατιστικώς αποδεδειγμένο ότι τα δύο σύνολα των γονιδίων ήταν τοπικά συν-εμπλουτισμένο κατά μήκος των χρωμοσωμάτων, στενά συνδεδεμένα μεταξύ τους με βάση την αλληλεπίδραση πρωτεΐνης-πρωτεΐνης και λειτουργικά παρόμοια επί Gene Ontology δέντρο. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα δύο σύνολα των γονιδίων που ρυθμίζονται από berberine μπορεί να είναι λειτουργικά διασταυρούμενη μιλήσει και να συμβάλλουν από κοινού με τον κυτταρικό κύκλο σύλληψη αποτέλεσμα. Έχει παράσχει νέες ενδείξεις για περαιτέρω έρευνες σχετικά με τις φαρμακολογικές τους μηχανισμούς της berberine, καθώς και τα άλλα βοτανικό φάρμακα

Παράθεση:. Sheng Ζ, Sun Υ, Zhu R, Jiao Ν, Τανγκ Κ, Cao Ζ, κ.ά. . (2015) Λειτουργική Cross-Μιλώντας μεταξύ διαφορικά εκφρασμένα και Εναλλακτικά μάτισμα γονιδίων σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του ήπατος επεξεργασμένο με Βερβερίνη. PLoS ONE 10 (11): e0143742. doi: 10.1371 /journal.pone.0143742

Επιμέλεια: Emanuele Buratti, Διεθνές Κέντρο Γενετικής Μηχανικής και Βιοτεχνολογίας, Ιταλία

Ελήφθη: May 14, 2015? Αποδεκτές: 9 Νοέμβρη 2015? Δημοσιεύθηκε: 25 Νοεμβρίου, 2015

Copyright: © 2015 Sheng et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από το Εθνικό Πρόγραμμα υψηλής Τεχνολογίας Έρευνας και Ανάπτυξης ( «863» Πρόγραμμα) της Κίνας (2012AA020405), και η χρηματοδότηση του Υπουργείου υγείας (2012ZX10005001). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Συντομογραφίες : DASG, διαφορικά Εναλλακτικές συγκολλημένα γονιδίων μεταξύ δύο δείγματα? DEG, διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων μεταξύ δύο δειγμάτων

Εισαγωγή

Το εναλλακτικό μάτισμα είναι μια αυστηρά ελεγχόμενη διεργασία κατά τη διάρκεια της γονιδιακής έκφρασης που μπορούν να παράγουν διαφορετικές μορφές μιας πρωτεΐνης από το ίδιο γονίδιο. Επιπλέον, έχει αποδειχθεί ότι εναλλακτικό μάτισμα μπορεί επίσης να καθορίσει συνδετικές ιδιότητες, ενδοκυτταρική εντόπιση, ενζυματική δραστικότητα, σταθερότητα πρωτεΐνης και μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις ενός μεγάλου αριθμού πρωτεϊνών [1]. Τα τελευταία χρόνια, όλο και περισσότερες φαρμακολογικές ερευνητές έχουν διαπιστώσει ότι τα μικρά μοριακά φάρμακα θα μπορούσε να ασκήσει φαρμακολογική δράση τους, όχι μόνο μέσω της ρύθμισης των επιπέδων μεταγραφής των γονιδίων, αλλά και μέσω της αλλαγής των γονιδίων εναλλακτικό μάτισμα [2].

Βερβερίνη, μια ισοκινολίνη τεταρτοταγούς αλκαλοειδές που απομονώνεται από τα είδη Berberis [3], έχει ένα ευρύ φάσμα των φαρμακολογικών αποτελεσμάτων όπως αντι-μικροβίων, κατά του διαβήτη και αντι-φλεγμονής [4]. Κλινικά, έχει χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία μιας σειράς διαταραχών, συμπεριλαμβανομένης της νόσου της στεφανιαίας αρτηρίας, διαβήτη, μη αλκοολική λιπώδη νόσο του ήπατος, υπερλιπιδαιμία, το μεταβολικό σύνδρομο, η παχυσαρκία και το σύνδρομο πολυκυστικών ωοθηκών (https://www.clinicaltrials.gov/). Πρόσφατα, συσσωρεύοντας μελέτες έχουν διαπιστώσει ότι berberine κατείχε επίσης ισχυρή αντικαρκινική δράση, με λίγες ή ελάχιστες ανεπιθύμητες τοξικές επιδράσεις [5, 6]. Ως εκ τούτου, πολλοί ερευνητές έχουν προσπαθήσει να φωτιστούν οι μηχανισμοί αντικαρκινική berberine βασίζονται σε διαφορική γονιδιακή έκφραση. Για παράδειγμα, αναφέρεται ότι berberine θα μπορούσε να επάγει απόπτωση σε κύτταρα HepG2 μέσω μιτοχονδριακής οδού ΑΜΡΚ μεσολάβηση με την αύξηση της αναλογίας του Βαχ /Bcl-2 [7]. Σε προηγούμενη μελέτη μας, έχουμε επίσης διαπιστώσει ότι berberine θα μπορούσε να προκαλέσει τη σύλληψη του κύκλου G1 τηλέφωνο σε BEL-7402 κύτταρα εν μέρει μέσω διαταράσσοντας την αλληλεπίδραση της καλμοδουλίνης με CaMKII και κλείδωμα επακόλουθη υποβάθμιση της πρωτεΐνης p27. [8]

Παρά το γεγονός ότι αυτά τα έργα έχουν δώσει κάποιες βασικές γνώσεις σχετικά με την αντικαρκινική μηχανισμό berberine, εναλλακτικό μάτισμα σε καρκινικά κύτταρα μετά από επεξεργασία με berberine δεν έχει αναφερθεί ακόμα. Πρώτον, έχει υπονοηθεί ότι πολλά αντικαρκινικά φάρμακα θα μπορούσε να αναστείλει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων, μεταβάλλοντας γονίδιο εναλλακτικό μάτισμα [9-11]. Επιπλέον, έχει αναφερθεί ότι η γονιδιακή μεταγραφή και εναλλακτικό μάτισμα μπορεί να φυσικά και λειτουργικά συζευγμένο [12, 13], με τον τρόπο αυτό συμβάλλουν από κοινού με τις φαρμακολογικές δράσεις των φαρμάκων αυτών. Ως εκ τούτου, είναι αναγκαίο για την ταυτόχρονη μέτρηση των διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων (βαθμούς με) και τα διαφορικά εναλλακτικά ματισμένες γονίδια (DASGs) σε καρκινικά κύτταρα μετά από θεραπεία με βερβερίνης και συστηματικά εξετάζει εάν υπάρχει οποιοδήποτε είδος λειτουργικών διασταυρούμενη ομιλία μεταξύ αυτών των δύο συνόλων των γονιδίων .

για το θέμα που αναφέρονται παραπάνω, την τελευταία τεχνολογία αλληλούχισης επόμενης γενιάς (RNA-επόμενα) χρησιμοποιήθηκε για να ληφθεί η transcriptomic προφίλ της BEL-7402 κυττάρων μετά τη θεραπεία berberine. Στη συνέχεια, οι βαθμούς με και DASGs προκαλείται από berberine ανιχνεύθηκαν προσεκτικά από μια σουίτα εργαλείων ανάλυσης αλληλουχίας. Τέλος, η λειτουργική στιχομυθία μεταξύ αυτών βαθμούς με και DASGs αναλύθηκαν στατιστικά και την πιθανή συμβολή τους στην αντικαρκινική δράση της berberine συζητήθηκαν.

Υλικά και Μέθοδοι

καλλιέργειας κυττάρων

Η ιδρύθηκε ανθρώπινου ήπατος καρκινική κυτταρική σειρά (BEL-7402, αρ. κατ .: TCHu_10) [8, 14, 15] αγοράστηκε από και κατατίθεται στην τράπεζα κυττάρων του Ινστιτούτου Βιοχημείας και κυτταρικής Βιολογίας, Σαγκάη Ινστιτούτα Βιολογικών Επιστημών, κινεζική Ακαδημία Επιστημών (https://www.cellbank.org.cn/) και παραχωρήθηκε ευγενικά από τον Dr. Xuan Liu (Shanghai Institute of Materia Medica, κινεζική Ακαδημία Επιστημών, Σαγκάη, PRChina). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 37 ° C που περιέχει 5% CO

2 και καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI-1640 (GIBCO, Grand Island, ΝΥ, USA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου, 2 mM /L-γλουταμίνη, 50 μονάδες /mL πενικιλίνη, και 50 mg /mL στρεπτομυκίνη. Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε συνενώθηκαν 3 ~ 5 βιολογική επαναλήψεις σε ένα RNA-seq πείραμα για να επιτευχθεί το ίδιο ποσό της συνολικής περιεκτικότητας σε RNA. Πιο συγκεκριμένα, στο τμήμα των κυττάρων καλλιέργειας, τα καρκινικά κύτταρα σε 8 ~ 10 διαφορετικά τρυβλία Petri χωρίστηκαν σε δύο ίσες ομάδες. Μία ομάδα χρησιμοποιήθηκε ως ομάδα που έλαβε αγωγή berberine, το άλλο χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος /χωρίς θεραπεία ομάδα.

RNA απομόνωση

Για την εκχύλιση ολικού RNA, τα κύτταρα απλώθηκαν σε 10-cm πλάκες (Corning, Acton, ΜΑ, USA) σε πλήρες μέσο για 12 ώρες. Στη συνέχεια, 50 μΜ berberine (καθαρότητα ≥ 98%, Tauto Biotech, Σαγκάη, Κίνα, IC50 σύμφωνα με Ref. [8]) προστέθηκε και αφέθηκε σε επαφή για 24 ώρες. Μετά από αυτό, τα κύτταρα ξεπλύθηκαν σε PBS και λύθηκαν σε αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA). Υπολειμματική μολυσματικό γονιδιωματικό DNA απομακρύνθηκε από το συνολικό κλάσμα RNA χρησιμοποιώντας Turbo ελεύθερο DNA kit (Ambion, Austin, ΤΧ, USA). mRNA απομονώθηκε από ελεύθερο DNA ολικό RNA χρησιμοποιώντας το Dynabeads mRNA Purification Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τέλος, για να ληφθούν αρκετά ποσότητα του περιεχομένου mRNA για αλληλούχιση, οι συνολικές δείγματα RNA από κάθε ομάδα ομαδοποιήθηκαν μαζί σαν ένα συγχωνευμένο δείγμα.

αλληλούχιση μεταγραφικό

επιλογή mRNA, βιβλιοθήκη προετοιμασία και αλληλούχιση διεξήχθη από Σαγκάη Ceneter για βιοπληροφορικής Τεχνολογίας (SCBIT) σε μια πλατφόρμα αλληλουχίας 2000 Illumina Hiseq σύμφωνα με τις προδιαγραφές του κατασκευαστή. Εν συντομία, επιλεγμένες πιΚΝΑ χρησιμοποιώντας ολιγο (dT) ανιχνευτών και στη συνέχεια κατακερματίζεται χρησιμοποιώντας δισθενή κατιόντα. cDNAs συντέθηκαν με χρήση τυχαίων εκκινητών, τροποποιημένες και εμπλουτίζεται για προσάρτηση στο κύτταρο ροής Illumina. Εμείς αλληλουχία δύο 100 bp × 2 ζεύγη τέλος λωρίδες 60-κύκλο, δημιουργώντας ~ 83.100.000 διαβάζει.

Διαβάστε

ευθυγράμμιση

Πρώτες αλληλουχίας διαβάζει ήταν στολισμένα έξω Ns και περιφέρειες χαμηλής ποιότητας (μέσης ποιότητας βάσης σκοράρει σε ένα slide-παράθυρο 5-mer λιγότερο από 20, δηλαδή, αλληλουχίας ποσοστό σφάλματος ≤1%). Διαβάστε ζεύγη με τουλάχιστον 36 bp αριστερά σε κάθε διαβάσετε κρατήθηκαν ως καθαρό διαβάζει. ποιότητα Αλληλούχιση εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας FastQC [16]. Στη συνέχεια, καθαρό διαβάζει χαρτογραφήθηκαν στο γονιδίωμα αναφοράς του ανθρώπου (Ensembl GRCh37.66 = hg19) χρησιμοποιώντας aligner ΤΟΡΗΑΤ C [17] (έκδοση 2.0.6) με παραμέτρους (-r /-inner-mate-απόσταση: 70, -g /-Max -multihits: 1, -Δεν-κάλυψη-αναζήτησης, -δεν-μυθιστόρημα-junc, οι άλλοι ως προεπιλογή). Οι έξοδοι των ΤΟΡΗΑΤ C χρησιμοποιήθηκαν ως εισροές για HTSeq [18] και AltAnalyze [19] για την εκτέλεση διαφορική γονιδιακή έκφραση ή εναλλακτική ανάλυση μάτισμα αντίστοιχα.

διαφορική γονιδιακή έκφραση ανάλυση

βαθμούς με (διαφορικά εκφρασμένων γονίδια) αναφέρονται σε αυτά τα γονίδια με σημαντικές μεταβολές στο επίπεδο έκφρασης τους. Πρώτον, ο αριθμός των αναγνώσεις χαρτογραφηθεί στην γονιδιωματική περιοχή του κάθε γονιδίου για κάθε δείγμα υπολογίστηκε με HTSeq [18]. Τότε DESeq [20] χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί η διαφορά στην έκφραση γονιδίων μεταξύ διαφορετικών δειγμάτων. Τέλος, βαθμούς με διηθούνται από τους ακόλουθους κανόνες:. 1) της απόλυτης τιμής της log2 [fold-αλλαγή] ήταν μεγαλύτερη από 1. 2) Η τιμή p ήταν μικρότερη από 0,05

διαφορικά γονίδιο ανάλυση εναλλακτικό μάτισμα

DASGs (διαφορικά εναλλακτική συγκολλημένα γονίδια) αναφέρονται σε εκείνα τα γονίδια χωρίς ή με μικρές παραλλαγές στο επίπεδο έκφρασης ολόκληρου του γονιδίου τους, αλλά σημαντικές αλλαγές στη χρήση εξόνιο τους, ειδικά αυτές τις εναλλακτικές εξώνια (Σχήμα 1). Διαφορική ανάλυση μάτισμα περιγράφει τις διαφορές στην εναλλακτική χρήση του site μάτισμα μεταξύ δύο δειγμάτων, η οποία είναι κρίσιμη για μελέτες που αφορούν τους μηχανισμούς του εναλλακτικού ματίσματος και τη ρύθμιση του, και είναι σε θέση να αποκαλύψει λειτουργική ποικιλομορφία που είναι χαμένη από ανάλυση διαφορικής έκφρασης γονιδίων [21]. Δεκάδες διαθέσιμων εργαλείων λογισμικού και πακέτα, όπως Cuffdiff2 [22], MISO [23], DEXseq [24], DEGseq [25], DiffSplice [26], Συγκόλληση πυξίδα [27], AltAnalyze [19] και το κ.λπ., πήρε εννοιολογικά διαφορετικές προσεγγίσεις που θα μπορούσαν να προσδιορίσουν διαφορικό μάτισμα στο επίπεδο της ισομορφής /απομαγνητοφώνηση, εξόνιο, ή και τα δύο. Ωστόσο, η επιλογή μιας κατάλληλης προσέγγισης για μελέτη εξαρτάται από την πειραματική αντικειμενικά και αναμενόμενο αποτέλεσμα. Ανάμεσα σε αυτές τις προσεγγίσεις και τα πακέτα, μόνο AltAnalyze παρέχει μια γραφική διεπαφή χρήστη, ενώ τα υπόλοιπα κυκλοφορούν στη γραμμή επαινέσω. Εκτός αυτού, AltAnalyze παρέχει ένα βολικό ροής εργασίας για την εκχύλιση των σημαντικών συμβάντων εναλλακτική ρύθμιση ματίσματος και στη συνέχεια να διερευνήσει τις πιθανές βιολογικές επιπτώσεις αυτών των γεγονότων ματίσματος και οι σχετικοί μηχανισμοί στο πλαίσιο των μοριακών αλληλεπιδράσεων και θέσεις σύνδεσης [19]. Πολλαπλές αλγόριθμοι είναι διαθέσιμα σε AltAnalyze να προσδιορίσει μεμονωμένα χαρακτηριστικά (εξώνια ή διασταυρώσεις) ή αμοιβαίες συνδέσεις που ρυθμίζονται διαφορικά σε σχέση με τις αλλαγές της γονιδιακής έκφρασης. Σε αυτό το έργο, μόνο ανάλυσης χαρακτηριστικό (splicing Index, SI) πραγματοποιήθηκε αμέσως μετά την αμοιβαία αναλύσεις διασταύρωση (Ανάλυση της Συγκόλλησης από Ισόμορφης αμοιβαιότητα, ASPIRE) [28] για την ίδια λίστα εκφράζεται χαρακτηριστικά, η οποία μας επιτρέπει να εξετάσουμε εναλλακτικές εξώνια προβλέπεται από ζεύγη των αμοιβαίων διασταυρώσεις, επιπλέον εκείνων που προβλέπονται από ένα μόνο ρυθμιζόμενη εξώνια /κόμβους (βλέπε AltAnalyze-Manual). δείκτης μάτισμα είναι μία μέτρηση της διαφορικής συναρμογής μεταξύ δύο δειγμάτων. Εξώνια με SI τιμή μεγαλύτερη από το 1 σημαίνει περισσότερη ενσωμάτωση της εξόνιο στην ωρίμανση του mRNA κατά τη διάρκεια της διαδικασίας ματίσματος στο επεξεργασμένο δείγμα σε σύγκριση με το δείγμα ελέγχου, ενώ εκείνοι με SI τιμή μικρότερη του 1 σημαίνει λιγότερη ένταξη, αλλά περισσότερο παράκαμψη του εξωνίου, και εκείνων με τιμή SI ίση με 1 σημαίνει ότι δεν υπάρχει αλλαγή στην χρήση του εξωνίου.

A. Η έκφραση ή εναλλακτικό μάτισμα του γονιδίου DPM1 παρέμεινε αμετάβλητη μετά τη θεραπεία berberine. B. Το μοτίβο μάτισμα γονιδίου NFKBIA παρέμεινε αμετάβλητη μετά τη θεραπεία berberine όπως υποδεικνύεται από την τιμή του δείκτη splicing (SI) του καθενός από τα εξώνια της. Ωστόσο, η έκφραση του γονιδίου NFKBIA ρυθμίζεται αυξητικά κατά περισσότερο ότι 2-φορές μετά την κατεργασία berberine (ρ & lt? 0,05) από το καθένα από τα εξόνια του υπερεκφράστηκαν. C. Το μοτίβο μάτισμα γονιδίου RLIM μεταβλήθηκε με berberine κατεργασία όπως υποδεικνύεται από την τιμή SI του εξωνίου 2 (SI & lt? 0,5) μέσα στο γονίδιο RLIM. Όμως, η έκφραση του γονιδίου RLIM δεν άλλαξε σημαντικά μετά την αγωγή berberine. Σχετική έκφραση, το σχετικό επίπεδο έκφρασης του γονιδίου ή όλα τα εξώνια του σε σύγκριση με το δείγμα ελέγχου.

*, DEG?

#, DSAG.

Η

διαφορικά εναλλακτική ανάλυση μάτισμα διεξήχθη χρησιμοποιώντας AltAnalyze με τις προεπιλεγμένες παραμέτρους. Πρώτον, υπήρχαν τρία κριτήρια της εξώνια να εκτελέσει διαφορικά γονίδιο εναλλακτική ανάλυση μάτισμα: 1) Τουλάχιστον 5 διαβάζει χαρτογραφήθηκαν στο εξόνιο? 2) η RPKM (Διαβάζει ανά κιλό-βάση του μοντέλου εξόνιο ανά εκατομμύριο χαρτογραφηθεί διαβάζει) την αξία της εξόνιο ήταν μεγαλύτερη από 0,3? 3) Η αλλαγή έκφραση του αντίστοιχου γονιδίου ήταν μικρότερη από 2 φορές. Στη συνέχεια, δύο εξόνιο-centric αλγόριθμοι που χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση των διαφορικά εναλλακτικό μάτισμα εξώνια: Συγκόλληση Index (SI) και Ανάλυση της Συγκόλληση με Ισόμορφης Αμοιβαιότητα (ASPIRE) [28]. Η τιμή SI για κάθε εξόνιο ή διασταύρωση υπολογίστηκε ως κατωτέρω.

(1)

Σε ποια,

RPKM

(

εξόνιο

i

) και

RPKM

(

γονίδιο

) ήταν η τιμή της έκφρασης του i-ου εξόνιο και το γονίδιο αντίστοιχα. Σε αλγόριθμο SI, εξώνια με SI & gt? 2-φορές κλήθηκαν AS-exons_SI. Σε αλγόριθμο φιλοδοξεί, εξώνια με ΔΙ & gt? 0.2 κλήθηκαν AS-exons_ASPIRE. Οι λεπτομέρειες αυτών των δύο αλγορίθμων έχουν περιγραφεί στη ροή εργασίας AltAnalyze (https://www.altanalyze.org/). Μόνο επικαλύπτονται AS-εξώνια στις δύο αλγορίθμους επιλέχθηκαν για περαιτέρω λειτουργική ανάλυση. Και τα γονίδια που περιέχουν αυτά τα εξώνια κλήθηκαν διαφορετικά εναλλακτικά συγκολλημένα γονίδια (DASG).

Εμπλουτισμός Ανάλυση

αναλύσεις εμπλουτισμό σετ Gene λειτουργικό γονίδιο Ρύθμιση πραγματοποιήθηκαν για τη λειτουργική σχολιασμό των βαθμούς με και DASGs ξεχωριστά. Λειτουργικά εργαλεία σχολιασμού σε DAVID Βιοπληροφορική πόρους [29] χρησιμοποιήθηκαν για να πραγματοποιήσουν τις αναλύσεις αυτές. Εκείνοι γονίδιο οντολογίας (GO) [30] βιολογικής απόψεως διαδικασίας ή του Κιότο Εγκυκλοπαίδεια γονιδίων και γονιδιωμάτων (KEGG) [31] μονοπάτια με p-value εμπλουτισμού λιγότερο από 0,05 (τροποποιημένο ακριβής δοκιμασία Fisher) και πάνω από τα δύο γονίδια θεωρήθηκαν ως σημαντικά εμπλουτισμένη λειτουργίες για περαιτέρω ανάλυση.

ανάλυση τοπική co-εμπλουτισμού μαζί αλληλουχιών χρωμοσώματος

για να ελέγξετε αν οι βαθμούς με και DASGs έδειξε παρόμοια κατανομή εμπλουτισμό κατά μήκος των χρωμοσωμάτων, τοπικές συν-εμπλουτισμού ανάλυση πραγματοποιήθηκε. Πρώτον, ένας εμπλουτισμός σκορ (

ES

) υπολογίστηκε για ένα γονίδιο ορίζεται σε κάθε ζώνη χρωμόσωμα, το οποίο επίσης εμφανίζεται ως η ένταση της εν λόγω περιοχής, όπως φαίνεται στο σχήμα 2Α [32]. Δεδομένο γονίδιο που

X

:

{x

1

,

x

2

,

… x

Ν

}

, μπάντα χρωμόσωμα

β

:

{b

1

,

β

2

,

… β

Μ

}

, ο αριθμός των γονίδια σε κάθε ζώνη

g

:

{g

1

,

g

2

,

… g

Μ

}

, στη συνέχεια,

ES

βαθμολογία υπολογίστηκε ως εξής.

(2)

Α. Παγκόσμια οικόπεδο ένταση της θέσης εμπλουτισμού για βαθμούς με και DASGs. Κάθε κύτταρο αντιπροσωπεύει μια χρωμοσωμική ζώνη και η ένταση του χρώματος της είναι ανάλογο με το αντίστοιχο εμπλουτισμό βαθμούς με ή DASGs σε αυτή την ζώνη, η οποία κανονικοποιείται τόσο από το συνολικό ποσό των γονιδίων στη ζώνη και του αριθμού των είτε βαθμούς με ή DASGs. Κάθε στήλη αντιπροσωπεύει το χρωμόσωμα περιέχει όλες τις μπάντες και το χρώμα, είτε μπλε ή κόκκινο, μπροστά από τη στήλη διακρίνει την τάξη των γονιδίων από βαθμούς με και DASGs. B. Το οικόπεδο βιολί για το σκορ θέσης συν-εμπλουτισμού (απόσταση) μεταξύ δύο συνόλων γονιδίων. Η καμπύλη που καλύπτει την κίτρινη περιοχή αντιπροσωπεύει την κατανομή της απόστασης των δύο συνόλων τυχαίων γονιδίων στο ίδιο μέγεθος του βαθμούς με και DASGs αντίστοιχα. Μια μικρότερη απόσταση σημαίνει υψηλότερη συν-εμπλουτισμό αυτών των δύο συνόλων γονιδίων. Το κόκκινο σημείο διαμάντι αναφέρεται στην απόσταση μεταξύ βαθμούς με και DASGs

Η

Στη συνέχεια, ένα

ES

σκοράρει διάνυσμα

EX

:.

{ex

1

,

ex

2

,

… πρώην

Μ

}

ήταν πήρε για σετ γονιδίων

X

σε όλες τις ζώνες στο

Β

. Ομοίως, ένας άλλος φορέας

EY

:

{ey

1

,

ey

2

,

… ey

Μ

}

μπορεί να έχεις για ένα άλλο σύνολο γονιδίων

Y

. Τέλος, η ομοιότητα (

LCE

) μεταξύ των δύο χρωμάτων μπάντες του

X

και

Y

μετρήθηκε ως η Ευκλείδεια απόσταση μεταξύ τους.

(3)

Παγκόσμια εγγύτητα σε αλληλεπίδραση πρωτεΐνης-πρωτεΐνης (PPI) δικτύου

Για να αξιολογηθεί η τοπολογική εγγύτητα μεταξύ βαθμούς με και DASGs στο δίκτυο ΠΠΑ, το μέσο μήκος συντομότερης διαδρομής μεταξύ τους χρησιμοποιήθηκε ως μέτρο. Μέσος βραχύτερο μήκος διαδρομής είναι μια έννοια στην τοπολογία δικτύου που ορίζεται ως ο μέσος αριθμός των βημάτων κατά μήκος των συντομότερων μονοπατιών για όλα τα δυνατά ζεύγη των κόμβων του δικτύου, η οποία είναι ένα μέτρο της αποτελεσματικότητας της μεταφοράς πληροφοριών του δικτύου [33]. Το μέτρο αυτό ισχύει επίσης για τα θέματα των δύο υποδίκτυο με τον υπολογισμό της μέσης απόστασης μονοπάτι για όλες τις πιθανές ζεύγη των κόμβων από αυτά τα δύο δίκτυα, x και y. (4) Σε περίπτωση που DIS (i, j) είναι η μικρότερη απόσταση διαδρομής μεταξύ του

i

-ου γονίδιο του υποσυνόλου x και την -στο γονίδιο του υποσυνόλου y. Σε αυτή την ανάλυση, το δίκτυο φόντο χτίστηκε χρησιμοποιώντας το σύνολο των δεδομένων ΠΠΑ από την ηλεκτρονική βάση δεδομένων Ανθρώπινη Πρωτεΐνη Βάση Δεδομένων Αναφοράς (HPRD).

Λειτουργική σημασιολογικής ομοιότητας σε Γονιδιακή Οντολογία (GO) δέντρο

Από το δέντρο of Gene Οντολογίας, γονίδια κατηγοριοποιούνται σε διαφορετικές λειτουργικές ομάδες που ονομάζεται ως όροι GO βασίζονται στις βιολογικές διαδικασίες στις οποίες εμπλέκονται. Με βάση τη δομή γραφική παράσταση της GO, η σημασιολογική ομοιότητα μεταξύ οποιωνδήποτε δύο όρων GO υπολογίστηκε όπως περιγράφεται από τους Wang et.al [34] χρησιμοποιώντας πακέτο GOSemSim [35]. Στη συνέχεια, η σημασιολογική ομοιότητα μεταξύ δύο συνόλων γονιδίων όπως βαθμούς με και DASGs θα μπορούσε να υπολογιστεί ως ο μέσος όρος όλων των πιθανών ζευγών όρων GO αφορούν γονίδια σε αυτά τα δύο σύνολα γονιδίων. Δεδομένης δύο λίστες των όρων GO,

πάει

1

και

πάει

2

αφορούν γονίδια σε δύο σετ γονιδίων,

X

και

Y

, η σημασιολογική ομοιότητα

SemSim

ορίστηκε ως εξής: (5) Σε περίπτωση που

Ν

GO

είναι το συνολικό ποσό των όρων GO που χρησιμοποιούνται για τον υπολογισμό σημασιολογική ομοιότητα.

αποτελέσματα

Σύνοψη της RNA-επόμενα αποτελέσματα για BEL-7402 κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με berberine

το σύνολο transcriptomic προφίλ κυττάρων BEL-7402 αγωγή με ή χωρίς berberine εκτιμήθηκε σε ανάλυση ζευγών βάσεων μέσω της αλληλουχίας RNA. Μετά χαμηλής ποιότητας διαβάζει (όπως αναφέρεται στην ενότητα ευθυγράμμιση Διαβάστε, Υλικά και Μέθοδοι) έχουν καθαριστεί, περίπου 30 εκατομμύρια διαβάζει από ~ 41,5 εκατομμυρίων πρώτες διαβάζει (διαβάζει ποσοστό παρακράτησης: & gt? 70%, περιεκτικότητα σε GC: 45 ~ 46%, ακολουθία μήκος: 36 ~ 100 bp) χαρτογραφήθηκαν στο γονιδίωμα αναφοράς για κάθε δείγμα (Πίνακας 1). Σύμφωνα με την «

Πρότυπα

,

Οδηγίες και βέλτιστες πρακτικές για την RNA-Seq

» που εγκρίθηκε από ΚΩΔΙΚΟΠΟΙΗΣΗ [36], αυτό το βάθος αλληλουχίας είναι καλό για την ανάλυση διαφορικής έκφρασης και είναι αποδεκτό για την εναλλακτική ανάλυση μάτισμα στην ανθρώπινη μεταγραφικό.

η

διαφορικά εκφράζονται και εναλλακτικό μάτισμα γονιδίων που προκαλείται από berberine θεραπεία

αφού αναλύθηκαν με τη χρήση του λογισμικού DESeq, RNA-επόμενα αποτελέσματα επέστρεψε 343 βαθμούς με το BEL-7402 κύτταρα μετά από επεξεργασία με berberine, με 111 έως ρυθμιζόμενα και 232 κάτω-ρυθμιζόμενη (Πίνακας Α σε S1 αρχείου). Είναι ενδιαφέρον, βιολογική απόκριση διαδικασία για βακτηρίδιο (GO: 0009617) βρέθηκε να εμπλουτιστεί σημαντικά από τα επάνω ρυθμισμένη βαθμούς με (Πίνακας 2), η οποία είναι συνεπής με την κλινική χρήση του berberine ως ευρέως φάσματος αντιμικροβιακή φάρμακο [3]. Και βρήκαμε τα γονίδια που σχετίζονται με την θετική ρύθμιση της αγγειογένεσης ήταν σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται από berberine, η οποία αντιπροσωπεύει την αντι-αγγειογενετική δραστηριότητα των berberine αναφερθεί σε προηγούμενα έργα. [37-39] Σύμφωνα με την ανάλυση του εμπλουτισμού οδό KEGG, οι βαθμούς με σημαντικά εμπλουτισμένη με σηματοδοτικό μονοπάτι p53 (hsa04115) και αρκετές καρκίνου που σχετίζονται με οδούς, όπως η οδός σηματοδότησης JAK-STAT (hsa04630), απόπτωση (hsa04210) και Pathways στον καρκίνο ( hsa05200) (Πίνακας 3). Το μονοπάτι σηματοδότησης Jak-STAT είναι μια σημαντική σηματοδότησης που εμπλέκονται στην ρύθμιση του ανοσοποιητικού συστήματος, γεγονός που υποδηλώνει η δραστικότητα ανοσία ρύθμισης του berberine μπορεί να συμβάλει στην αντικαρκινικό αποτέλεσμα της.

Η

Εν τω μεταξύ, οι εναλλακτικές ανάλυση μάτισμα διεξήχθη χρησιμοποιώντας λογισμικό AltAnalyze. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι 1.083 διαφορικά εναλλακτικά ματισμένες εξώνια, που αντιστοιχεί σε 867 DASGs (Πίνακας Β στο S1 File) ταυτοποιήθηκαν στο BEL-7402 καρκινικά κύτταρα μετά από θεραπεία berberine. Λαμβάνεται RLIM γονίδιο ως παράδειγμα (σχήμα 1), το επίπεδο συμπερίληψη του εξωνίου 2 στην ωρίμανση mRNA άλλαξε σημαντικά (δείκτης μάτισμα & lt? 0,5) μετά τη θεραπεία berberine, ενώ υπήρχε μόνο μία μικρή αλλαγή στο σύνολό επίπεδο έκφρασης του γονιδίου του. Σε σύγκριση με RLIM, υπήρχε δραματική διακύμανση (πολλαπλή μεταβολή & gt? 6) του επιπέδου έκφρασης των γονιδίων του NFKBIA (ως παράδειγμα DEG), αλλά χωρίς σημαντικές αλλαγές (δείκτης splicing ≈ 1) στην συμπερίληψη των εξονίων του (Εικ 1). Όπως φαίνεται στον Πίνακα 2, οι DASGs είχαν εμπλακεί σε μια ποικιλία βιολογικών διεργασιών, όπως του κυτταρικού κύκλου (GO: 0007049), οργάνωση των χρωμοσωμάτων (GO: 0051276), μακρομοριακές συγκρότημα συναρμολόγησης (GO: 0065003) και η κυτταρική απόκριση στο στρες (GO: 0033554). ανάλυση εμπλουτισμός Pathway αντιπροσωπεύονται ότι αυτές DASGs εμπλουτίστηκαν σε ΡΙ3Κ-ΑΚΤ mTOR μονοπάτι σηματοδότησης (διαθέτει: 04150) και ρύθμιση του κυτταροσκελετού της ακτίνης (διαθέτει: 04.810) (Πίνακας 3), τα οποία όλα πολύ σχετικές με τη διαδικασία του κυτταρικού κύκλου και του κυτταρικού πολλαπλασιασμού [40 ]. Προφανώς, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι αυτές οι DASGs μπορεί επίσης να σχετίζεται με την αντικαρκινική δράση των berberine.

Η στατιστική ανάλυση των λειτουργικών cross-μιλώντας μεταξύ βαθμούς με και DASGs

Για να διερευνηθεί εάν υπάρχει οποιοδήποτε είδος λειτουργικών cross-μιλώντας μεταξύ βαθμούς με και DASGs, πραγματοποιήθηκαν στατιστικοί έλεγχοι έξω από τρία βασικά αλλά διαφορετικές οπτικές γωνίες.

Τοπική co-εμπλουτισμού μεταξύ των αλληλουχιών χρωμοσώματος.

Διαισθητικά, θα πρέπει να εξεταστεί κατ ‘αρχάς αν οι εν λόγω βαθμούς με και DASGs εμπλουτίζεται μαζί στο ίδιο ή σε κοντινές περιοχές στα χρωμοσώματα. Για να πραγματοποιήσει αυτή την εξέταση, ένας εμπλουτισμός βαθμολογία ανατέθηκε σε κάθε μπάντα σε όλα τα χρωμοσώματα για DASGs και βαθμούς με αντίστοιχα [32]. Όπως φαίνεται στο σχήμα 2Α, οι εν λόγω βαθμούς με και DASGs εμφάνισαν αρκετά διαφορετικές κατανομές εμπλουτισμό σε παγκόσμιο επίπεδο. Ωστόσο, τα πρότυπα θα μπορούσαν να βρεθούν σε κάθε τοπική περιοχή. Οι περισσότερες από τις περιοχές DASG εμπλουτισμένα βρίσκονται πάνω ή κοντά στις θέσεις εμπλουτισμένος με βαθμούς με. Για να ποσοτικοποιηθεί η συν-εμπλουτισμού μοτίβο μεταξύ βαθμούς με και DASGs, Ευκλείδεια απόσταση (0,941) υπολογίστηκε μεταξύ των βαθμολογιών του εμπλουτισμού σε όλες τις ζώνες χρωμόσωμα βαθμούς με και DASGs. Για να ελεγχθεί η στατιστική σημασία της απόστασης μεταξύ βαθμούς με και DASGs, προσομοιώσεις με τυχαία δειγματοληψία δύο σετ γονιδίων στο ίδιο μέγεθος του βαθμούς με και DASGs διεξήχθησαν για 10.000 φορές για να παραχθεί η κατανομή του Ευκλείδεια απόσταση μεταξύ οποιωνδήποτε δύο σετ γονιδίων στα χρωμοσώματα . Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Β, η απόσταση μεταξύ βαθμούς με και DASGs ήταν σημαντικά μικρότερη από αυτές μεταξύ τυχαία δείγματα σετ. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν σαφώς ότι οι βαθμούς με και DASGs είναι σωματικά συν-εμπλουτισμένη με τις αντίστοιχες χρωμοσώματα.

Παγκόσμια εγγύτητα βασίζεται σε δίκτυο αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-πρωτεΐνης (ΠΠΑ).

Μετά την ως άνω αποτέλεσμα, πρόσθετες ελήφθησαν οι προσπάθειες για να μετρηθεί η λειτουργική σύνδεση μεταξύ αυτών των δύο συνόλων γονιδίων που βασίζεται στο δίκτυο ΠΠΑ. Κατά την πρώτη, 100.000 φορά τυχαία προσομοιώσεις εκτελέστηκαν για να χτίσει τη διανομή κατά μέσο όρο απόσταση συντομότερη διαδρομή μεταξύ δύο οποιωνδήποτε συνόλων γονιδίων στα ίδια κλίμακες όπως βαθμούς με και DASGs [33]. Στη συνέχεια, το μέσο όρο απόσταση μεταξύ βαθμούς με και DASGs υπολογίστηκαν και συγκρίθηκαν με την κατανομή. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3, η πρώτη είναι πολύ μακριά από τη μέση του προσομοιωμένου διανομή σε στατιστική σημασία του p-value & lt? 0.05. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι αυτές οι βαθμούς με και DASGs ενδέχεται να συνδέονται στενά μέσω της αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-πρωτεΐνης.

Α. Ένα παράδειγμα απεικόνιση της εγγύτητας μεταξύ δύο συνόλων γονιδίων. Κάθε κύκλο σημείο αντιπροσωπεύει έναν κόμβο του δικτύου και κάθε γραμμή αντιπροσωπεύει την άκρη μεταξύ δύο κόμβων. Το κόκκινο χρώμα διαδρομή είναι η συντομότερη διαδρομή μεταξύ Χ και Υ σε αυτό το δίκτυο, το οποίο είναι με 3 βήματα. Το δεξί μέρος είναι η μήτρα των βραχύτερο μήκος διαδρομής μεταξύ όλων των δυνατών ζευγών από δύο σετ γονιδίων (set_1 {Υ, C, D}, {set_2 Χ, Α, F}). Και κατά μέσο όρο μικρότερο μήκος της διαδρομής τους είναι 2,78. B. Η μπλε καμπύλη πάνω από το κίτρινο ιστόγραμμα ταιριάζει με την κατανομή της εγγύτητας ανάμεσα σε δύο σύνολα τυχαίων γονιδίων στα ίδια μεγέθη βαθμούς με και DASGs αντίστοιχα. Η κόκκινη διακεκομμένη γραμμή αναφέρεται στην απόσταση μεταξύ βαθμούς με και DASGs. Η τιμή p αντιπροσωπεύει την αναλογία του συνόλου του γονιδίου ζεύγη με μικρότερη απόσταση από ότι μεταξύ βαθμούς με και DASGs.

Η

Λειτουργική σημασιολογικής ομοιότητας σε Γονιδιακή Οντολογία (GO) δέντρο.

Ενώ βαθμούς με και DASGs βρέθηκαν να έχουν σημαντικά μικρότερη απόσταση σε σχέση με τυχαία δειγματοληψία-σύνολα γονιδίου σύμφωνα με δίκτυο ΠΠΑ, αυτό το είδος της λειτουργικής συσχέτιση είναι έμμεση και όχι με την ισχυρή βιολογική σημασία. Ετσι, μια πιο απλή μέθοδος χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση της λειτουργικής συσχέτιση μεταξύ βαθμούς με και DASGs βασίζονται στις βιολογικές διεργασίες που επηρεάζονται από αυτές [35]. Για την εξισορρόπηση της υπολογιστικής απόδοσης και τη μέτρηση ευρωστία, εκείνοι GO βιολογικής απόψεως διαδικασίας με τουλάχιστον 10 γονίδια επιλέξτε ως σύνολο αναφοράς βιολογική διαδικασία (Σχήμα 4Α). Μια σημασιολογική σκορ ομοιότητας ανατέθηκε σε κάθε δύο θητείες GO βασίζεται στη δομή γράφημα του GO, όπως απεικονίζεται στο σχήμα 4Β. Στη συνέχεια, ένας μέσος όρος βαθμολογίας σημασιολογική ομοιότητα υπολογίζεται πάνω από όλα τα ζεύγη των όρων GO αντίστοιχα από τις βιολογικές διαδικασίες επηρεάζονται από βαθμούς με και DASGs με βάση το μέσο στρατηγικής καλύτερο αγώνα. Και οι διαδικασίες που πραγματοποιήθηκαν σε δύο σύνολα γονιδίων τυχαία δειγματοληψία στην ίδια κλίμακα με βαθμούς με και DASGs για 10000 φορές για να πάρει την κατανομή του κατά μέσο όρο σημασιολογικής ομοιότητας. Όπως φαίνεται στο σχήμα 4Γ, η κατά μέσο όρο σημασιολογική ομοιότητα μεταξύ βαθμούς με και DASGs είναι εξαιρετικά υψηλότερη από δύο τυχαίες-pickup σύνολα, υποδεικνύοντας ότι αυτά τα δύο σετ γονιδίων θα μπορούσε να συνδεθεί λειτουργικά.

A. Το οικόπεδο πίτας δείχνει την αναλογία των όρων GO με τον αντίστοιχο αριθμό γονιδίων. Η barplot αντιπροσωπεύει τον αριθμό των όρων GO με γονίδια περισσότερο από κάθε αποκοπής του αριθμού γονιδίων. Και το τμήμα των όρων GO με περισσότερα από 10 γονίδια που επιλέχθηκαν για περαιτέρω υπολογισμό. Β ο θερμικός χάρτης της GO σημασιολογικής ομοιότητας μεταξύ κάθε δύο επιλεγμένους όρους GO. Το θερμότερο το χρώμα είναι, τόσο μεγαλύτερη είναι η ομοιότητα μεταξύ των δύο όρων. C. Η καμπύλη αναπαριστά την κατανομή της σημασιολογικής ομοιότητας μεταξύ δύο συνόλων γονιδίων τυχαία δειγματοληψία στο ίδιο μέγεθος βαθμούς με και DASGs αντίστοιχα. Το κόκκινο σημείο διαμάντι αναφέρεται στη σημασιολογική ομοιότητα μεταξύ βαθμούς με και DASGs.

Η

Συζήτηση

Μεταγραφή και εναλλακτικό μάτισμα είναι δύο σημαντικές βιολογικές διεργασίες κατά τη διάρκεια της γονιδιακής έκφρασης, η οποία μαζί καθορίζουν την proteome των κυττάρων υπό ορισμένες προϋποθέσεις. Σε αυτή τη μελέτη, για την εξερεύνηση της λειτουργικής σύνδεσης μεταξύ διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων και διαφορικά εναλλακτικά ματισμένες γονιδίων σε καρκινικά κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με berberine, το προφίλ mRNA του BEL-7402 κύτταρα συλλέχθηκαν μέσω ΚΝΑ-seq. Στη συνέχεια, και οι δύο βαθμούς με και DASGs προκαλείται από berberine εντοπίστηκαν προσεκτικά από μια σουίτα λογισμικού ανάλυσης αλληλουχίας. Με βάση την ανάλυση λειτουργική εμπλουτισμό βαθμούς με δύο πιθανούς μηχανισμούς που διέπουν την ιδιοκτησία διακοπή του κυτταρικού κύκλου για berberine προτάθηκαν ως κατωτέρω.

Βερβερίνη θα μπορούσε να προκαλέσει p53-εξαρτώμενη σύλληψη φάση G1 του BEL-7402 καρκινικά κύτταρα. Μετά BEL-7402 κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με berberine, πέντε γονίδια (

BBC3

,

FAS

,

CCNG2

,

GADD45B

, και

IGFBP3

) ήταν πάνω ρυθμισμένα και τα δύο γονίδια (

CASP9

,

THBS1

) ήταν κάτω-ρυθμιζόμενη (Πίνακας C σε S1 File) στο σηματοδοτικό μονοπάτι p53. Αξίζει να σημειωθεί ότι, οι πέντε επάνω ρυθμισμένη γονίδια είναι κατάντη στόχοι της ρ53 [41-45]. Εν τω μεταξύ, ρ53 βρέθηκε να εκφράζεται σε ένα μέτριο επίπεδο σε BEL-7402 κύτταρα πριν και μετά τη θεραπεία βερβερίνης. Η κατάσταση ρ53 άγριου τύπου σε κυτταρική σειρά BEL-7402 επιβεβαιώθηκε και από άλλους ερευνητές [46, 47]. Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι σηματοδοτικό μονοπάτι ρ53 μπορεί να επηρεασθούν υπό berberine διαταραχή. Όπως είναι γνωστό, το ρ53 είναι ένα κρίσιμο πρωτεΐνη του κυτταρικού κύκλου οδοφράγματος που θα προκαλέσει διακοπή του κυτταρικού κύκλου ανταποκρίνεται σε βλάβη του DNA [48]. Δύο κυτταρικό κύκλο που σχετίζονται με γονίδια (CDKN2D, GADD45B), τα οποία είναι στην κατάντη οδός της ρ53, βρέθηκαν να είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω μετά την αγωγή berberine. Θα μπορούσαν να αναστέλλουν τη δράση των CDK που ρυθμίζουν τη μετάβαση φάσης G1-S. Και σύλληψη κυτταρικού κύκλου στην φάση G1 στην BEL-7402 κυττάρων που προκαλείται από berberine βρέθηκε επίσης σε προηγούμενη εργασία μας μέσα από την ανάλυση με κυτταρομετρία ροής. [8] Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι berberine μπορεί να αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό BEL-7402 κυττάρων από επαγωγή G1 του κυτταρικού κύκλου σύλληψη σε ρ53-εξαρτώμενο τρόπο. Επιπλέον, ρ53-εξαρτώμενη αναστολή του κυτταρικού κύκλου σε G1 φάση αναφέρθηκε επίσης σε διάφορες άλλες κυτταρικές σειρές καρκίνου μετά από θεραπεία berberine. [37-39] προηγούμενες μελέτες μας ανέφερε την επίδραση διακοπή του κυτταρικού κύκλου των berberine με τη στόχευση καλμοδουλίνη, το οποίο θα μπορούσε να είναι το σήμα ανάντη των οδών p53 [8].

Βερβερίνη μπορεί να καταστείλει την παραγωγή των φλεγμονωδών κυτοκινών μέσω αναστολής του ΝΡκΒ. αναφέρεται σε RNA επόμενα αποτελέσματα ότι

NFKBIA

(

ΙκΒ

) ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα με κατεργασία berberine (Πίνακας Α S1 αρχείου). Ως ένας αναστολέας του ΝΡκΒ,

ΙκΒ

μπορεί να εμποδίζουν την μετατόπιση του ΝΡκΒ από κυτόπλασμα προς πυρήνα [49]. Προηγούμενες μελέτες έχουν αποδείξει ότι η αναστολή της ΝΡκΒ μπορεί να επηρεάσει την έκφραση πολλών φλεγμονωδών παραγόντων που θα μπορούσαν να προωθήσουν την ανάπτυξη των κυττάρων του όγκου και εισβολή όγκου και η μετάσταση διευκόλυνσης [50]. Σε αυτή τη μελέτη, πέντε κυτοκίνες (

IL-6

,

IL-8

,

IL1A

,

IL-33

και

IL11

) (Πίνακας Δ στο S1 File) βρέθηκαν να είναι κάτω ρυθμισμένα μετά τη θεραπεία berberine σύμφωνα με τα RNA-seq αποτελέσματα. Αξίζει να σημειωθεί ότι, όλες αυτές οι κυτοκίνες έχουν αναφερθεί ως προ-φλεγμονώδεις παράγοντες. Για παράδειγμα,

IL-6

και

IL-8

αναφέρθηκαν να είναι σημαντικά υψηλή εκφράζεται και παίζουν σημαντικό ρόλο στη μετανάστευση και βιώσιμη πολλαπλασιασμό ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων του ήπατος [51-53].