Αφηρημένο

πνεύμονα είναι η κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο σχετίζονται με παγκόσμιος. Παρά τις δεκαετίες έρευνας, οι θεραπευτικές επιλογές για τους ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα εξακολουθούν να είναι ανεπαρκείς, είτε να προσφέρουν μια θεραπεία ή ακόμα και ένα σημαντικό πλεονέκτημα επιβίωσης λόγω των εγγενών αντοχή του σε χημειοθεραπεία. Τα αποτελέσματά μας προτείνουν την αποτελεσματικότητα της καψαϊκίνης στην έκφραση του VEGF κάτω ρύθμιση σε κύτταρα μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα (NSCLC) σε υποξικό περιβάλλον. Καψαϊκίνη-θεραπεία επανενεργοποιηθεί p53-SMAR1 θετική ανάδραση βρόχου σε αυτά τα κύτταρα να πείσει ρ53 μεσολάβηση αποικοδόμηση HIF-1α και SMAR1 επαγόμενη καταστολή του COX-2 έκφρασης που συγκρατούνται HIF-1α πυρηνικού εντοπισμού. Τέτοιο σήμα-διαμορφώσεις, κατά συνέπεια, προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης του VEGF να ματαιώσει τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων και το σχηματισμό του δικτύου, προαπαιτούμενα της αγγειογένεσης σε όγκο μικρο-περιβάλλον. Τα παραπάνω αποτελέσματα υποστηρίζουν την υποψηφιότητα της καψαϊκίνης στο στόχο αποκλειστικά την αγγειογένεση από τα κάτω ρύθμιση VEGF σε καρκινικά κύτταρα για να επιτευχθεί πιο αποτελεσματική και πειστική θεραπεία των ανθεκτικών NSCLC

Παράθεση:. Chakraborty S, Adhikary Α, Mazumdar M, Mukherjee S , Bhattacharjee Ρ, Guha D, et al. (2014) που διεγείρεται από καψαϊκίνη ενεργοποίηση της p53-SMAR1 Auto-Ρυθμιστική Loop ρυθμίζει προς τα κάτω VEGF σε μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα να συγκρατήσει την αγγειογένεση. PLoS ONE 9 (6): e99743. doi: 10.1371 /journal.pone.0099743

Επιμέλεια: Α Ρ Μ Ruhul Amin, Winship Cancer Institute του Πανεπιστημίου Emory, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 31 Δεκεμβρίου 2013? Αποδεκτές: 16η του Μαΐου 2014? Δημοσιεύθηκε: 13 Ιουνίου 2014

Copyright: © 2014 Chakraborty et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. SC- Πανεπιστήμιο Επιχορηγήσεις Επιτροπή- UGC 2-8 /2002 (SA Ι) (SA-Ι) με ημερομηνία 06.11.2008. AA- Τμήμα Επιστήμης Τεχνολογίας και DST R /3393/06 με ημερομηνία 16.10.2006. MM-Τμήμα Βιοτεχνολογίας-DBT-RA με ημερομηνία 05.06.2009. SM-Συμβούλιο Επιστημονικής και Βιομηχανικής Έρευνα-CSIR 09/015 (0386) /2010 EMR-1 με ημερομηνία 22.02.2010. ΡΒ Τμήμα Βιοτεχνολογίας-DBT-RA με ημερομηνία 01.06.2010. DG- Πανεπιστήμιο Επιχορηγήσεις Επιτροπή- UGC 2-8 /2002 (SA Ι) με ημερομηνία 21.04.2011. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Εντόνως ανθεκτικό μη καρκίνωμα μικρού κυττάρου του πνεύμονα (NSCLC), που περιλαμβάνει 80% όλων των καρκίνων του πνεύμονα είναι εγγενώς ανθεκτικά στη χημειοθεραπεία ή /και θεραπεία ακτινοβολίας. Δεδομένου ότι, η αγγειογένεση είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη και μετάσταση NSCLC, ως εκ τούτου τον έλεγχο που σχετίζονται με όγκους αγγειογένεση μπορεί να είναι μια πολλά υποσχόμενη τακτική στον περιορισμό NSCLC πρόοδο. Αρκετές προ-αγγειογόνοι παράγοντες, όπως ο αγγειακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγοντας (VEGF) είναι εντόνως εκφρασμένη σε μικροπεριβάλλον του όγκου και επάγουν έντονα angiogenesishttp όγκου: //www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3827603/- Β3 [1] . Αυτή η μετατόπιση του μικροπεριβάλλον του όγκου σε έναν αγγειογόνο κατάσταση, ή «αγγειογόνος διακόπτης» [1], [2], είναι ένας σημαντικός συντελεστής περιοριστικός παράγοντας στην ανάπτυξη των όγκων.

Η έκφραση του γονιδίου VEGF έχει αποδειχθεί ότι είναι αυξητικά από την υποξία [3] – [5] και ο κύκλος εργασιών του VEGF διαμεσολαβείται από την υποξία παράγοντα-1 (HIF-1) [2], [3]. Υπό ορθοξικές συνθήκες, HIF-1α επίπεδα έντονα ρυθμίζονται από τάση οξυγόνου μέσω υδροξυλίωση υπολειμμάτων προλίνης, ενώ υποξικές συνθήκες εμποδίζουν προλυλ υδροξυλίωση του HIF-1α [4] και η πρωτεΐνη σταθεροποιείται, επιτρέπουν να διενεργοποιεί γονίδια-στόχους, όπως ο VEGF [3] . Μια πληθώρα εκθέσεων σφιχτά τη σύνδεση του HIF-1α σε p53 σε μια αντίστροφη σχέση στην οποία p53 αναστέλλει τη μεταγραφή του HIF-1α [6] και προκαλεί υποβάθμιση της στο πλαίσιο πολλών υπο-κυτταρικό συνθήκες στρες [7] έτσι http: //www.jbc. org /αναζήτηση author1 = Joanna + Zawacka-Pankau sortspec = ημερομηνία & amp? υποβάλουν = Submitresulting στην ισχυρή καταστολή. Είναι ενδιαφέρον, ρ53 σταθεροποιείται από SMAR1, μια πρωτεΐνη περιοχή δέσμευσης μήτρα που σχετίζεται με ικρίωμα, μέσω μετατόπισης του Mdm2 από ρ53 Ν-τερματικό τσέπη και κατά συνέπεια τη διάσωση ρ53 από την Mdm2 μεσολάβηση της υποβάθμισης του πρωτεασώματος [8]. Σύγχρονη εκθέσεις [9], [10] δείχνουν ότι στις ήπιες βλάβες του DNA SMAR1 προωθεί p53 αποακετυλίωση μέσω πρόσληψης HDAC1 και συγκεκριμένα καταστέλλει Bax και Puma έκφραση αναστέλλοντας έτσι την απόπτωση. Οι εκθέσεις αυτές όχι μόνο να βεβαιώνει την υποψηφιότητα της SMAR1 στη ρύθμιση της δραστηριότητας του p53, αλλά επίσης να αυξήσει την πιθανότητα συμμετοχής των p53 σε άλλες κυτταρικές λειτουργίες στην ήπια DNA που βλάπτουν μικρο-περιβάλλον του κυττάρου. Είναι σημαντικό, αρκετές μελέτες έχουν επίσης εντοπιστεί συγκρότημα πολλαπλής συνομιλίες μεταξύ p5

3

και Cox-2, σύμφωνα με την οποία Cox-2 καταστέλλει p53-δίκτυο στα καρκινικά κύτταρα [11], [12] και

αντίστροφα

[12]. Όλες αυτές οι πληροφορίες μας στον πειρασμό να καταστήσει εικόνα για την ύπαρξη μιας διαδραστικής σχέσης μεταξύ SMAR1, p53, Cox-2 και HIF1-α, αν υπάρχουν, που αποφασίζει για την τύχη της έκφρασης του VEGF κατά τη διάρκεια αγγειογένεσης των όγκων σε NSCLC. Η αναστολή της ανάπτυξης του όγκου από αντι-αγγειογόνοι παράγοντες έχουν επιτευχθεί όπου ελπιδοφόρες αποκρίσεις κατά του όγκου έχουν αναφερθεί για μία ποικιλία παραγόντων αντι-VEGF. Ωστόσο, η τοξικότητα των περισσότερων από αυτά τα φάρμακα, καθώς και την ανάπτυξη αντοχής έναντι αυτών των παραγόντων σηματοδοτούν την αναγκαιότητα της αναγνώρισης εναλλακτικών μη τοξικών παραγόντων για να επιτευχθεί η συνεχής αναστολή της αγγειογένεσης για την αποτελεσματική θεραπεία NSCLC.

Αύξηση αποδεικτικά στοιχεία δείχνουν την αντικαρκινική επιδράσεις της καψαϊκίνης (8-μεθυλ-

N

-vanillyl-6-νονεναμίδιο), το δραστικό συστατικό του πιπέρι τσίλι, κατά διαφόρων μορφών καρκίνου [13] – [18]. Η καψαϊκίνη έχει αναφερθεί ότι προκαλούν απόπτωση και περιορίζει το βενζο (α) πυρένιο προκαλούμενη πνευμονική ογκογένεση σε Swiss albino ποντικούς [19] και ομαλοποιεί την ανισορροπία σε ξενοβιοτικών ενζύμων μεταβολισμού και δείκτες όγκου [20]. Σύμφωνα με Anandakumar

et al.

[20] καψαϊκίνη διαμορφώνει πνευμονική αντιοξειδωτικό αμυντικό σύστημα κατά τη διάρκεια του βενζο (a) πυρένιο που προκαλείται από τον καρκίνο του πνεύμονα σε ποντίκια Swiss albino [19]. Επιπλέον, η καψαϊκίνη εμφανίζει αντι-πολλαπλασιαστική δραστικότητα έναντι του ανθρώπινου μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα σε κυτταρική καλλιέργεια και γυμνά μοντέλα ποντικών μέσω της οδού E2F [21]. Πρόσφατη έκθεση από το εργαστήριο μας έχει δείξει το apoptogenic επίδραση της καψαϊκίνης στην ανθρώπινη NSCLC κύτταρα [22]. Ωστόσο, δεν υπάρχει καμία αναφορά σχετικά με το ρόλο αυτής της φυτοχημικές επί NSCLC επαγόμενη αγγειογένεση. Επιπλέον, αν και capsacin έχει αποδειχθεί ότι καταστέλλει ανθρώπινο ινοσάρκωμα επαγόμενη αγγειογένεση σε νεοσσό δοκιμασία χοριοαλλαντοϊκής μεμβράνης [23] με αναστολή νΕΟΡ-επαγόμενου πολλαπλασιασμού, και τριχοειδή σαν σχηματισμός σωλήνα πρωτογενών καλλιεργημένα ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα, το αποτέλεσμα αυτής της φυτοχημικές για την έκφραση του VEGF σε NSCLC κυττάρων δεν έχει ακόμη διερευνηθεί λεπτομερώς.

Τα αποτελέσματά μας υποδηλώνουν ότι ενώ η παρακώλυση του p53-SMAR1 που προκαλείται βρόχο έκφραση του VEGF στα κύτταρα NLCSC ευνοώντας έτσι ενδοθηλιακών κυττάρων (ΕΚ) δικτύου μετανάστευσης και του σχηματισμού στο περιβάλλον του όγκου , επανασχεδίαση αυτών των προ-αγγειογενετική σήματα από καψαϊκίνη μπλοκάρει την παραγωγή VEGF ακόμη και κάτω από υποξικές συνθήκες, εμποδίζοντας έτσι NSCLC που προκαλείται σχηματισμός καθαρό έργο από τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Μια τέτοια εξέλιξη στην κατανόηση μπορεί να προσφέρει το πανόραμα που στοχεύουν αποκλειστικά προ-αγγειογενετικών παραγόντων και μονοπάτια για να επιτευχθεί πιο αποτελεσματική και πειστική θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές, Α549, MCF-7, HeLa, ΗΟΤ-15, ενώ οι κανονικές ινοβλάστες πνεύμονα WI-38, ελήφθησαν από το Εθνικό Κέντρο για Cell Science, την Ινδία, και διατηρήθηκαν στους 37 ° C και 5% CO

2 σε ϋΜΕΜ μέσο συμπληρωμένο με 10% FBS (Lonza, ΝΗ), L-γλουταμίνη (2 mM), πυροσταφυλικό νάτριο (100 μg /ml), μη βασικά αμινοξέα (100 μΜ), στρεπτομυκίνη (100 μg /ml), πενικιλλίνη (50 U /ml? Invitogen, CA) [24]. Ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα ομφάλιας φλέβας (HUVEC) ελήφθησαν από HIMEDIA Cell Culture (Mumbai, Ινδία) και διατηρήθηκαν στους 37 ° C και 5% CO

2 σε Μ199 (Gibco, Grand Island, ΝΥ) συμπληρωμένο με 20% FBS και συμπλήρωμα ΕΚ ανάπτυξης (ECGS? BD Biosciences, Bedford, ΜΑ). Όλα τα πειράματα εκτελέστηκαν με HUVECs μεταξύ διόδους 2-5. Αριθμοί των βιώσιμων κυττάρων προσδιορίστηκαν με δοκιμή αποκλεισμού Trypan μπλε [11].

Για να μιμούνται υποξία, κύτταρα Α549 αναπτύχθηκαν σε παρουσία 100 μmol /L CoCl

2 (Sigma, St Louis). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με καψαϊκίνη (Sigma, St. Louis) όπως απαιτείται στο πείραμα. Όταν απαιτείται, τα κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Brefeldin Α (1 μg /ml, Calbiochem, NJ) και /ή MG 132 (10 μΜ, Sigma, St Louis) και /ή ανασυνδυασμένη VEGF (0.8 ng /ml, για να διατηρήσει ισοδύναμη ποσότητα VEGF που ήταν παρούσα σε Hy-Α549 δαπανάται μέσα που χρησιμοποιήθηκε σε 1:01 αναλογία με Μ199 επί ενδοθηλιακών κυττάρων? Peprotech, CA) ή /και VEGF αντίσωμα εξουδετέρωσης (25 ng /ml, R &? D Biosystems, ΜΝ), 6 ωρών πριν από τη συγκομιδή των κυττάρων.

πληγή επούλωση δοκιμασία

τραύματος δοκιμασία επούλωσης διεξήχθη για να εκτιμηθεί η μετανάστευση των HUVECs. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 12-φρεατίων και αφέθηκαν να σχηματίσουν συρρέουσες μονοστοιβάδες. Οι μονοστιβάδες στη συνέχεια γδαρμένο οριζόντια χρησιμοποιώντας ένα στείρο ρύγχος πιπέτας 100 μΐ. Στη συνέχεια, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο που περιείχε 0.5% FBS όλη τη νύχτα και εκτίθενται σε διαφορετική συγκέντρωση παραγόντων. Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και καλλιεργήθηκαν σε μέσο DMEM. ελήφθησαν φωτεινές εικόνες τομέα των τυχαία επιλεγμένων θέα κατά μήκος της γραμμής ξύνεται. Η μετανάστευση ποσοτικοποιήθηκε με μια διαδικασία ημι-αυτοματοποιημένη με τη βοήθεια υπολογιστή από ένα πρόσωπο τυφλωμένο σε σχέση με την πειραματική αγωγή. Τα δεδομένα από φρεάτια εις τριπλούν υπολογίστηκαν ως η μέση τιμή +/- SEM. Το ποσοστό της μετανάστευσης των κυττάρων ελέγχου λήφθηκε ως 100% και αυτή των άλλων πλάκες σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου [25].

βλαστάρι δοκιμασία σχηματισμού

Matrigel Matrix (BD Biosciences, Χαϊδελβέργη, Γερμανία) αποψύχθηκαν στους 4 ° C όλη τη νύκτα. 12-φρεατίων επικαλύφθηκε με 500 μΙ Matrigel /ανά φρεάτιο και επωάστηκαν στους 37 ° C για 20 λεπτά για τον πολυμερισμό. HUVECs (1 × 10

5) επαναιωρήθηκαν σε 500 μΙ Μ199 που περιέχει 2% FBS και διάφορες συγκεντρώσεις των παραγόντων, και σπάρθηκαν πάνω στο Matrigel επικαλυμμένα πλάκα. Μετά από 6-8 ώρες επώασης, κύτταρα HUVEC σε ομάδα ελέγχου που σχηματίζονται σωληνοειδή δομή, τα οποία ορίστηκαν ως σχηματισμοί ενδοθηλιακά καλώδιο που συνδέεται στα δύο άκρα. Ο σχηματισμός σωλήνα οπτικοποιήθηκε με μικροσκόπιο (Olympus IX71) και φωτογραφίες των 10 τυχαία επιλεγμένα πεδία συλλήφθηκαν από κάμερα CCD.

κηλίδωση Western και συν-ανοσοκαταβύθιση

Τα κύτταρα ομογενοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα Hepes (20 mM Hepes, ρΗ 7.5, 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl

2, 1 mM Na-EDTA, 1 mM Na-EGTA και 1 mM DTT) συμπληρωμένο με πρωτεάση και φωσφατάση μίγματα αναστολέα [24]. Η συνολική συγκέντρωση πρωτεΐνης του κυτταρολύματος εκτιμήθηκε με τη μέθοδο Lowry του. Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE, και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν πάνω σε ηλεκτρικώς μεμβράνες PVDF (Millipore, Darmstadt, Germany). Ακολούθως, η μεμβράνη μπλοκαρίστηκε για 1 ώρα με 5% άπαχο γάλα σε TBS-0.1% Tween 20 (TBST) και ανιχνεύθηκαν με ειδικά αντισώματα, όπως, αντι-VEGF, αντι-ΤΟΡ-β, αντι-ΕΟΡ, αντι bFGF, αντι-HIF-1α, αντι-ρ53, αντι-Cox-2, αντι-SMAR1 /BANP, αντι-H1-ιστόνης και αντι-α-ακτίνης (Santa Cruz, CA), αντι-φωσφο-Ser15-p53, αντι- EGFR (Cell Signaling, ΜΑ). Η πρωτεΐνη του ενδιαφέροντος οπτικοποιήθηκε με χημειοφωταύγεια (GE Biosciences, NJ) [24]. Για συν-ανοσοκαταβύθιση, ανοσοσύμπλοκα από λύμα ολόκληρων κυττάρων καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας ειδικό αντίσωμα και σφαιρίδια πρωτεΐνης Α-Sepharose (Invitrogen, MD) και ανοσοστυπώθηκαν. Η πρωτεΐνη του ενδιαφέροντος οπτικοποιήθηκε με χημικο-φωτοβολίας. Ισοδύναμο φορτίο πρωτεΐνης επαληθεύτηκε χρησιμοποιώντας αντι-α-ακτίνης αντισώματα.

Η κυτταρομετρία ροής

Για τον προσδιορισμό του αποπτωτικού κυτταρικού θανάτου, τα κύτταρα βάφτηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) και Annexin-V-FITC ( BD Pharmingen, CA) και αναλύθηκαν σε κυτταρόμετρο ροής (FACS Callibur, BD Biosciences, CA). Ηλεκτρονική αντιστάθμιση του οργάνου έγινε για να αποκλείσει την επικάλυψη των φασμάτων εκπομπής. Σύνολο 10.000 γεγονότα αποκτήθηκαν για ανάλυση χρησιμοποιώντας το λογισμικό CellQuest (BD Biosciences, CA) [26]. Annexin-V-θετικά κύτταρα είχαν θεωρηθεί ως πρώιμων αποπτωτικών κυττάρων [24]. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό των ενδοκυτταρικών VEGF, κύτταρα προ-επεξεργασμένο με Brefelidin Α συλλέχθηκαν, πλύθηκαν με PBS, μονιμοποιήθηκαν με 4% παρα-φορμαλδεΰδης για 10 λεπτά και κατέστησαν διαπερατά με 0,1% Triton-X-100 για 5 λεπτά και επωάστηκαν με αντίσωμα αντι-νΕΟΡ που ακολουθείται από δευτερογενές αντίσωμα TRITC-συζευγμένο. Ο φθορισμός προσδιορίστηκε ροοκυττομετρικά χρησιμοποιώντας λογισμικό CellQuest (Becton Dickinson, San Jose, CA).

απεικόνισης φθορισμού

κύτταρα αναπτύσσονται σε μία καλυπτρίδα μονιμοποιήθηκαν με 4% παρα-φορμαλδεΰδη και χρωματίστηκαν με ειδικό αντίσωμα μετά διαπερατοποίηση με Triton Χ100, ακολουθούμενο από TRITC /δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με FITC και οπτικοποιήθηκαν με ομοεστιακό μικροσκόπιο (Carl Zeiss, Germany).

ELISA

Το εμπλουτισμένο μέσο των κυττάρων συλλέχθηκε και διαυγάστηκε με φυγοκέντρηση στις 2000 rpm για 10 λεπτά. Συγκέντρωση της πρωτεΐνης του ενδιαφέροντος μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ ELISA σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Ray Biotech, GA).

RT-PCR δοκιμασία

Μετά Saha

et al

. [11], 2 μg του συνολικού RNA που εξάγεται με το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen, CA, USA) μεταγράφηκε ανάστροφα και υποβλήθηκε σε PCR χρησιμοποιώντας σύστημα RTplus PCR (Eppendorf, Hamburg, Germany) ένα σύστημα GeneAmp PCR 2720 (Applied Biosystems? Πόλη Foster , CA). Τα προκύπτοντα cDNA ενισχύθηκαν με εκκινητές ειδικούς για τον VEGF 5′-GAGATGAGCTTCCTACAGCAC-3 ‘(προς τα εμπρός) και 5′-TCACCGCCTCGGCTTGTCACAT-3′ (αντίστροφο), ρ53 5’-CCCACTCACCGTACTAA-3 ‘(προς τα εμπρός) και 5′-GTGGTTTCAAGGCCAGATGT-3 «(reverse), HIF-1α 5’-TGGTGACATGATTTACATTTCTGA-3 ‘(προς τα εμπρός) και 5′-AAGGCCATTTCTGTGTGTAAGC-3′ (αντίστροφο), SMAR1, 5’-GCATTGAGGCCAAGCTGAA-AGCTC-3 ‘(προς τα εμπρός) και 5’-GGAGTTCAGGGTGATGAGTGTGA C -3 ‘(reverse), Cox-2 5′-TGAT-CGAAGACTACGTGCAACA-3′ (προς τα εμπρός) και 5’-GCGGATGCCAGTGATAGAGTG-3 ‘(αντίστροφο) και GAPDH (εσωτερικό πρότυπο) 5′-CAGAACATCATCCCTGC-CTCT-3′ (προς τα εμπρός ), 5’-GCTT-GACAAAGTGGTCGTTGA-G-3 ‘(αντίστροφο).

πλασμίδια και siRNA επιμολύνσεις

pcDNA3.1 p53, pcDNA3.1 SMAR1 και pcDNA3.0 Cox-2 ή SMAR1-shRNA (300 pmole /εκατομμύριο κύτταρα), και οι φορείς ελέγχου pcDNA3.0 (2 μg /εκατομμύριο κύτταρα) εισήχθησαν σε εκθετικά αναπτυσσόμενων καρκινικών κυττάρων χρησιμοποιώντας λιποφεκταμίνη-2000 (Invitrogen, CA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο που παρέχεται από τον κατασκευαστή. Που εκφράζουν σταθερά κλώνοι απομονώθηκαν με περιοριστική αραίωση με επιλογή με G418 (400 μg /ml? Cellgro, USA) και πουρομυκίνη (1 μg /ml? Cellgro, USA) για 14 ημέρες, και τα κύτταρα που επιβίωσαν αυτής της αγωγής κλωνοποιήθηκαν και αξιολογήθηκαν για ρ53, SMAR1 και Cox-2 με ανοσοκηλίδωση. Για ενδογενή αποσιώπηση συγκεκριμένων γονιδίων, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 300 pmol του HIF-1α- /Cox-2 -siRNA (Santa Cruz, CA) και p53 shRNA (Santa Cruz, CA) χρησιμοποιώντας λιποφεκταμίνη-2000 για 12 ώρες. Τα επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν με RT-PCR και κηλίδωση Western.

χρωματίνης Ανοσοκαταβύθιση και PCR

Η δοκιμασία ChIP διεξήχθη όπως αναφέρθηκε προηγουμένως από το εργαστήριο μας [9]. Εν συντομία, σφαιρίδια αγαρόζης μπλοκαρίστηκαν με BSA και, μετά το πλύσιμο, τα σφαιρίδια προ-επωάστηκαν με αντίσωμα έναντι SMAR1 /BANP (BTG-3 που συνδέεται πυρηνική πρωτεΐνη? Santa Cruz, CA). Τα κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε υπερήχους για τη διάτμηση του DNA σε μήκη μεταξύ 200 και 1000 ζεύγη βάσεων και κατόπιν φυγοκεντρήθηκε στις 13.000 rpm για 10 λεπτά στους 4 ° C. Τα υπερκείμενα αραιώθηκαν 10 φορές σε ρυθμιστικό διάλυμα αραίωσης chip και προστίθεται στα σφαιρίδια αγαρόζης σύμπηκτα που είχαν προ-επωάστηκαν με αντισώματα. Μετά από ολονύκτια επώαση στους 4 ° C, τα σφαιρίδια πλύθηκαν με χαμηλή περιεκτικότητα σε αλάτι, υψηλή συγκέντρωση άλατος, LiCl και Τρις /EDTA ρυθμιστικά διαλύματα. Τέλος, η χρωματίνη εκλούστηκε με επώαση των σφαιριδίων με 5 Μ NaCl στους 65 ° C και οι πρωτεΐνες απομακρύνονται με κατεργασία με πρωτεϊνάση Κ ϋΝΑ τσιπ στη συνέχεια καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας ένα κατάλληλο κιτ καθαρισμού και φυλάσσεται στους -20 ° C. SMAR1-συνδεδεμένη ChIP DNA ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας PCR. Οι αλληλουχίες των πιθανών θέσεων σύνδεσης SMAR1 επί Cox-2 προαγωγού είναι ως ακολούθως: θέση-1: 5′-TGA-CCAGCATCCCAAATGTA-3 ‘(προς τα εμπρός) και 5′-TGAGGGA-AAAACAGGGCATA-3′ (αντίστροφο)? ιστοσελίδα-2 5’-CAAAAAGAAAATGA-TCCACGC-3 ‘(προς τα εμπρός) και 5′-TCATGAGACACGGATGCCTA-3′ (αντίστροφο)? ιστοσελίδα-3 5’-CCGTGTCTCA-TGAGGAATCA-3 ‘(προς τα εμπρός) και 5′-ATCATGGGTAGTGCTCAGGG-3′ (αντίστροφο)? ιστοσελίδα-4 5’-TGCT-GTCATTTTCCTGAATGC-3 ‘(προς τα εμπρός) και 5′-GGGGATTTTGACAGTTGGAA-3′ (αντίστροφο)? ιστοσελίδα-5 5’-GCCCAGGCA-ACTGAAAAGTA-3 ‘(προς τα εμπρός) και 5′-CTCCCTGATGCGTGGATTAT-3′ (αντίστροφο)? ιστοσελίδα-6 5’-ΤΤΤ-TGGACATTTAGCG-TCCC-3 ‘(προς τα εμπρός) και 5′-TGTTCTCCGTACCTTCA -CCC-3′ (αντίστροφο)? ιστοσελίδα-7 5’-TACCTTTCCC-GCCTCTCTTT-3 ‘(προς τα εμπρός) και 5′-TGGGGCGAGTA-AGGTTAAGA-3′ (αντίστροφο)? ιστοσελίδα-8 5’-AAC-CTTACTCGCCCCAGTCT-3 ‘(προς τα εμπρός) και 5′-CAGA-AGGACACTTGG-CTTCC-3’ (αντίστροφο).

Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου

Ποσοτική πραγματικού -Time PCR έγινε για την ποσοτικοποίηση των επιπέδων έκφρασης που εξαρτώνται από το χρόνο του VEGF και HIF-1α σε κύτταρα Hy-Α549 καψαϊκίνη φάρμακο (22). Ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR πραγματοποιήθηκε στη βασική κυκλοποιητή κλίση (ένας Applied Biosystems 7500 Sequence Detection System) χρησιμοποιώντας SYBR πράσινο μίγμα Rox (AbGene, Epsom, Ηνωμένο Βασίλειο). Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για τον VEGF είναι 5′-TCACAGGTACAGGGATGAGGACAC-3 ‘(προς τα εμπρός) και 5′-CAAAGCACAG-CAATGTCCTGAAG-3′ (αντίστροφο) και για HIF-1α 5’-TGGTGACATGATTTACATTTCTGA-3 ‘(προς τα εμπρός) και 5’-AAGGCCATTTCTGTGTGTAAGC-3 «(reverse).

Στατιστικές αναλύσεις

οι τιμές έχουν αποδειχθεί ως τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής (SEM) ή τον αντιπρόσωπό του τυπικού πειράματος, εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά. Τα δεδομένα αναλύθηκαν, και κατά περίπτωση, τη σημασία των διαφορών μεταξύ των μέσων τιμών προσδιορίστηκε με

t

test του Student. Τα αποτελέσματα θεωρήθηκαν σημαντικές στο

σ

& lt? 0,05. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν ανεξάρτητα τρεις φορές

Αποτελέσματα

Η καψαϊκίνη αναστέλλει NSCLC που προκαλείται από τη μετανάστευση και το δίκτυο σχηματισμό ΕΚ

Από το ΕΚ μετανάστευση αποτελεί καίριο βήμα για την προκαλούμενη από όγκο αγγειογένεση.? ερευνήσαμε την μετανάστευση του HUVECs παρουσία του εξαντλημένου μέσων από καλλιέργειες τόσο φυσιολογικά κύτταρα και NSCLC. Στην ουσία, HUVECs καλλιεργήθηκαν απουσία ή παρουσία των χρησιμοποιημένων μέσων των κυττάρων φυσιολογικού πνεύμονα ινοβλαστών (WI-38) και κύτταρα NSCLC (Α549), καθώς και CoCl

2-διεγερμένα κύτταρα Α549 (Hy-Α549). Αποτελέσματα της επούλωσης τραύματος δοκιμασίας εμφάνισαν μη σημαντική μετανάστευση του HUVECs παρουσία των χρησιμοποιημένων μέσων του WI-38 κύτταρα, ενώ, σημαντική μετανάστευση παρατηρήθηκε παρουσία Α549 χρησιμοποιημένων μέσων, μια κατάσταση που μιμείται την κατάσταση που φέρει όγκο (Σχήμα 1Α) . Ποσοστό μετανάστευση των HUVECs ήταν ακόμη περισσότερο σε Hy-Α549 χρησιμοποιημένων μέσων (Σχήμα 1Α) που δείχνει ότι η υποξική κατάσταση ευνοεί την αγγειογένεση. κύτταρα Hy-Α549, ως εκ τούτου, χρησιμοποιούνται για ανάπαυση των πειραμάτων για να καθορίσετε υποξική κατάσταση.

(Α) Η μετανάστευση των HUVECs στην παρουσία ή απουσία των χρησιμοποιημένων μέσων της NME, WI-38, Α549 και Hy-Α549 (COCI

2 που διεγείρεται ώστε να μιμείται υποξικό προϋπόθεση που απαιτείται για την προκαλούμενη από όγκο αγγειογένεση) υποβλήθηκαν σε αμφίδρομη επούλωσης πληγών δοκιμασία για 24 ώρες (

αριστερό πλαίσιο

). Ο αριθμός των κυττάρων που μετανάστευσαν στην περιοχή του τραύματος είναι γραφικής παράστασης (

δεξί πάνελ

). (Β) Εκπρόσωπος εικόνες της HUVEC μετανάστευσης κατά την επώαση με καψαϊκίνη επεξεργασμένο (0-50 μΜ) Hy-Α549 κυττάρων πέρασε μέσο (

αριστερό πάνελ

). Τοις εκατό των κυττάρων μετανάστευσαν στην περιοχή του τραύματος έχει γραφικής παράστασης (

δεξί πάνελ

). κύτταρα (C) Hy-Α549 υποβλήθηκαν σε αγωγή με καψαϊκίνη σε μία δοσο-εξαρτώμενο τρόπο για 24 ώρες και η βιωσιμότητα των κυττάρων βαθμολογήθηκε με trypan δοκιμασία μπλε χρωστική αποκλεισμού (

αριστερό πλαίσιο

). κύτταρα Hy-Α549, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με καψαϊκίνη (37,5 μΜ), υποβλήθηκαν σε αννεξίνη-V-FITC /ΡΙ πρόσδεσης και αναλύθηκαν ροοκυττομετρικά για τον προσδιορισμό της επί τοις εκατό πρώιμη απόπτωση (

δεξί πάνελ

). (D) κυτταροτοξική δράση διαφορετικών δόσεων του capsaisin σε κύτταρα HUVEC μετρήθηκαν με trypan blue δοκιμασία χρωστικής αποκλεισμό. (Ε) Γραφική αναπαράσταση των HUVEC μετανάστευσης κατά την επώαση με πέρασε μέσα ενημέρωσης από την καψαϊκίνη φάρμακο (37,5 μΜ) HBL-100, ΗΟΤ-15, HeLa και Α549. (F) Εκπρόσωπος εικόνες των τριχοειδών που μοιάζει με το σχηματισμό βλαστών από HUVECs στην παρουσία των μέσων ενημέρωσης μόνο του ή πέρασε μέσα ενημέρωσης της WI-38 /Α549 /Hy-Α549 /καψαϊκίνη που έλαβαν Hy-Α549. Οι τιμές είναι μέση ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων σε κάθε περίπτωση ή αντιπρόσωπο του τυπικού πειράματος.

Η

Είναι ενδιαφέρον, πέρασε-media καψαϊκίνης επεξεργασμένου Hy-Α549 ανέστειλε σημαντικά την προκαλούμενη από όγκο μετανάστευση HUVEC σε μία δόση καψαϊκίνης εξαρτώμενης τρόπο, το βέλτιστο αποτέλεσμα είναι στο 37,5 μΜ καψαϊκίνης στις 24 ώρες, πέραν του οποίου θα μπορούσε να ληφθεί καμία περαιτέρω σημαντική μεταβολή (Σχήμα 1Β). Η επίδραση της καψαϊκίνης στην βιωσιμότητα των κυττάρων Hy-Α549 εξετάστηκε με trypan blue δοκιμασία χρωστικής αποκλεισμό. Το σχήμα 1C (

αριστερό πάνελ)

απεικονίζεται το δοσο-εξαρτώμενο αποτέλεσμα καψαϊκίνης στην βιωσιμότητα των κυττάρων Hy-Α549, καθώς και HUVEC (Σχήμα 1 D). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι κατά την έκθεση για 24 ώρες, η καψαϊκίνη δεν προκάλεσε καμία σημαντική θάνατο σε είτε των κυττάρων μέχρι συγκεντρώσεις 37,5 μΜ. Τα αποτελέσματα με αυτόν τον τρόπο απέκλεισε το ενδεχόμενο επιβράδυνσης της ΕΚ μετανάστευσης λόγω του θανάτου των κυττάρων Hy-Α549 σε αυτή τη συγκέντρωση της καψαϊκίνης. Ωστόσο, οι συγκεντρώσεις πέρα ​​37,5 μΜ βρέθηκαν να είναι τοξικά για τα δύο Hy-Α549 κύτταρα και HUVEC (Σχήμα 1 C,

αριστερό πάνελ

και 1D). Περαιτέρω πειράματα επομένως, περιορίζεται σε 37.5 μΜ. Για να εκτιμηθεί κατά πόσον η μείωση στον αριθμό κυττάρων οφείλεται σε πρώιμη απόπτωση, ο αριθμός αννεξίνης-ν θετικών κυττάρων προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής. Τα αποτελέσματα του σχήματος 1C (

δεξί πάνελ

) έδειξε 37,5 δόση μΜ καψαϊκίνη ως υπο-αποπτωτικών δόσης για τα κύτταρα Hy-Α549. Αυτά τα αποτελέσματα μαζί εξασφάλισε την απουσία της «προσβολής» των αποπτωτικών κυττάρων σε 37.5 μΜ δόση καψαϊκίνης που χρησιμοποιούνται στα επόμενα πειράματα. Αυτή η επίδραση της καψαϊκίνης δεν περιορίζεται σε ένα συγκεκριμένο τύπο, ελέγχθηκε χρησιμοποιώντας μια μπαταρία κυτταρικών γραμμών, δηλαδή, HBL-100, ΗΟΤ-15, HeLa και, MCF-7 (Σχήμα 1 Ε). Ωστόσο, για λεπτομερείς μηχανιστικές μελέτες πειράματα έγιναν με κύτταρα Hy-Α549.

Στη συνέχεια, η δοκιμασία σχηματισμού βλαστάρι της ECS διεξήχθη σε Matrigel, μια καθιερωμένη δοκιμασία αγγειογένεσης. HUVECs σχηματίζεται σωλήνα-όπως τα δίκτυα μέσα σε 8 ώρες (Σχήμα 1 F). Αγγειογόνοι σχηματισμός βλαστάρι του HUVECs ήταν υψηλότερη στην παρουσία των χρησιμοποιημένων μέσων των κυττάρων Hy-Α549 που ακολουθείται από εκείνη των κυττάρων Α549 και WI-38 κύτταρα (Σχήμα 1 F). Ωστόσο, η καψαϊκίνη προ-επεξεργασία του Hy-Α549 παρεμποδίζεται αποτελεσματικά το σχηματισμό της βλαστήσεως με HUVECs (Σχήμα 1 F) όπου δομών τύπου σωλήνα μειώθηκαν τόσο σε πλάτος και σε μήκος και έδειξε ατελή καθώς και σπασμένα δομές δικτύου (Σχήμα 1 F).

η καψαϊκίνη αναστέλλει VEGF για την επιβράδυνση των καρκινικών κυττάρων που προκαλείται από μετανάστευση ΕΚ

Όλες οι αντιδράσεις μέχρι τώρα ορίζεται σημειώθηκαν ανεξάρτητα από την άμεση επαφή των κυττάρων HUVEC με κύτταρα όγκου ή ακόμη και εγγύτητα, αυξάνοντας έτσι την πιθανότητα της παρουσίας του όγκου -shed διαλυτό προμεταναστευτικές παράγοντες στις πέρασε μέσα μαζικής ενημέρωσης. Στήριξη αυτό, πέρασε μέσο Brefeldin-Α-θεραπεία Hy-Α549 απέτυχε να προκαλέσει σημαντική μετανάστευση ΕΚ (Εικόνα 2Α) και η καψαϊκίνη δεν θα μπορούσε να εισαγάγει περαιτέρω δράση (Εικόνα 2Α). Για την εκ νέου επιβεβαίωση υπόθεσή μας, αποτέλεσμα της καψαϊκίνης στη ρύθμιση προ-αγγειογενετικών παραγόντων όπως VEGF, bFGF, EGF, TGF-β, παρακολουθήθηκε σε Brefeldin-προ-επεξεργασμένα κύτταρα Hy-Α549. Παρά το γεγονός ότι η καψαϊκίνη απέτυχε να μεταβάλλει bFGF, EGF και ΤΟΡ-β επίπεδα που σημαντικά κάτω-ρυθμιζόμενη έκφραση VEGF (Σχήμα 2Β). Περαιτέρω μελέτες αποκάλυψαν ότι το αναλωμένο μέσα κυττάρων Hy-Α549 (10

6 κύτταρα /ml μέσου) περιείχε ένα μέσο όρο 1.6 ng VEGF που μειώθηκαν σημαντικά μετά καψαϊκίνη αγωγή (Σχήμα 2C,

αριστερά

πάνελ) . Να κρίνει την επίδραση της καψαϊκίνης στη ρύθμιση του VEGF στα κύτταρα Hy-Α549, υιοθετήσαμε λίγες προσεγγίσεις. Στην πρώτη προσέγγιση, όταν Brefeldin Α-προεπεξεργασμένων κύτταρα Hy-Α549 υποβλήθηκαν σε αγωγή με καψαϊκίνη για 24 ώρες, η ενδοκυτταρική VEGF καταργήθηκε τόσο σε mRNA και τα επίπεδα της πρωτεΐνης (Σχήμα 2C,

μεσαίο πάνελ

). Οι παρατηρήσεις αυτές υποστηρίζονται περαιτέρω από ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR μας δεδομένα εμφανίζοντας μείωση σε σχέση με την έκφραση του VEGF mRNA σε Hy-Α549 κυττάρων μετά από θεραπεία καψαϊκίνη (Σχήμα 2C,

δεξί πάνελ

) και εκ νέου επιβεβαιώθηκε με συνεστιακή μικροσκοπία (Σχήμα 2D). Στη δεύτερη προσέγγιση, μέσων ελέγχου συμπληρωμένο με ανασυνδυασμένη VEGF (0.8 ng /ml) αύξησε τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων και το σχηματισμό της βλάστησης (Σχήμα 2Ε & amp? 2F). Στην τρίτη προσέγγιση, όταν καψαϊκίνη προεπεξεργασμένων Hy-Α549 δαπανάται μέσο συμπληρώθηκε με ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη VEGF (0.8 ng /ml), αναστροφή της επίδρασης καψαϊκίνης επί ΕΚ μετανάστευση και βλαστάνουν σχηματισμός παρατηρήθηκε (Σχήμα 2Ε & amp? 2F). Στην τέταρτη προσέγγιση, HUVECs έδειξε σημαντική μείωση στην μετανάστευση (Σχήμα 2Ε) και ο σχηματισμός της βλάστησης (Σχήμα 2F) όταν Hy-Α549 κυττάρων αναλωθέν μέσο προ-θεραπεία με αντι-VEGF αντίσωμα. Ωστόσο, αντι-VEGF αντίσωμα απέτυχε να παράσχει σημαντικές συμπληρωματικές ανασταλτική δράση για τη μετανάστευση των HUVEC και σχηματισμός φυτρώνουν σε καψαϊκίνη προ-αγωγή Hy-Α549 χρησιμοποιημένων μέσων (Σχήμα 2Ε & amp? 2F). Αυτά τα αποτελέσματα μαζί επικύρωσε την υπόθεση ότι Hy-Α549 κυττάρων-ρίξει VEGF παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στον καρκίνο που προκαλείται από τη μετανάστευση ΕΚ και το σχηματισμό βλαστών. Προ-επιπλωμένο παρατηρήσεις μας στον πειρασμό να οριοθετήσει τον πλήρη μηχανισμό που διέπουν τη ρύθμιση της αγγειογένεσης των όγκων από καψαϊκίνη.

(Α) μικροφωτογραφίες αντίθεσης Εκπρόσωπος φάση που αποδεικνύουν τη μετανάστευση των HUVEC μετά από επώαση με πέρασε μέσα ενημέρωσης Brefeldin-Α-προεπεξεργασία, καψαϊκίνη ( 37.5 μΜ) κύτταρα κατεργασμένα Hy-Α549 (

αριστερό πάνελ

). Τοις εκατό των κυττάρων μετανάστευσαν στην περιοχή του τραύματος έχει γραφικής παράστασης (

δεξί πάνελ

). (Β) Τα ανοσοστυπώματα που δείχνουν προφίλ έκφρασης των προ-αγγειογόνων παραγόντων VEGF, bFGF, EGF, ΤΟΡ-β, με την παρουσία ή απουσία καψαϊκίνη. (C) που εκκρίνεται από VEGF ελεύθερο κυττάρων υπερκείμενο του Hy-Α549 ποσοστώθηκε με δοκιμασία ELISA (

αριστερό πλαίσιο

). προφίλ έκφρασης εξαρτώμενη από τον χρόνο του VEGF-mRNA /-πρωτεΐνη στα κύτταρα Hy-Α549 καψαϊκίνη αγωγή προσδιορίστηκε με κηλίδα Western και RT-PCR, αντίστοιχα (

μεσαίο πάνελ

). Καψαϊκίνη-επεξεργασμένα κύτταρα Hy-Α549 εξετάστηκαν για χρονικά εξαρτώμενη διακύμανση των προφίλ έκφρασης του VEGF με ποσοτική ανάλυση PCR πραγματικού χρόνου και αναπαρίσταται γραφικά (

δεξί πάνελ

). (D) ανοσο-φθορισμού εικόνες (60x μεγέθυνση) παρουσιάζει εξαρτώμενη από το χρόνο διεξαγωγής των πρωτεϊνών VEGF (TRITC-φθορισμού) σε κύτταρα Hy-Α549 καψαϊκίνη που έλαβαν εκπροσωπήθηκαν μαζί με πυρηνική χρώση (DAPI: μπλε). (Ε) Αντιπροσωπευτικές εικόνες του HUVEC μετανάστευσης κατά την επώαση με ανασυνδυασμένο μέσων ελέγχου VEGF-συμπληρωμένο (Ι), ή VEGF-συμπληρωμένο δαπανηθεί μέσα κυττάρων Hy-Α549 καψαϊκίνη-θεραπεία, ή με (ii) anti-VEGF-αγωγή Hy-Α549 δαπανηθεί μέσα μαζικής ενημέρωσης (

αριστερό πάνελ

). Τοις εκατό των κυττάρων μετανάστευσαν στην περιοχή του τραύματος γραφικής παράστασης (

δεξί πάνελ

). (F) Αντιπροσωπευτικές εικόνες του τύπου τριχοειδούς σχηματισμού βλαστάρι με HUVECs κατά την επώαση με ανασυνδυασμένο VEGF-συμπληρωμένο δαπανηθεί μέσα κυττάρων Hy-Α549 καψαϊκίνη αγωγή ή με αντι-VEGF-αγωγή Hy-Α549 χρησιμοποιημένων μέσων. GAPDH /α-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος φόρτωσης. Οι τιμές είναι μέση ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων σε κάθε περίπτωση ή αντιπρόσωπο του τυπικού πειράματος.

Η

Η καψαϊκίνη αναστέλλει τη μεταγραφή του VEGF με στοχοθέτηση HIF-1α

Όπως καψαϊκίνη μειώνει VEGF τόσο σε μεταγραφικό καθώς και μεταφραστικά επίπεδα υποθέσαμε ότι αυτό φυτοχημικό μπορεί να έχει μια ρυθμιστική επίδραση επί HIF-1α, ο κύριος παράγοντας μεταγραφής του VEGF κατά την υποξία [4]. Είναι ενδιαφέρον ότι, η καψαϊκίνη μειωμένη HIF-1α σε επίπεδο πρωτεΐνης, αλλά όχι σε επίπεδο mRNA σε κύτταρα Hy-Α549 (Σχήμα 3Α,

αριστερό πλαίσιο

), η οποία επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR μας δεδομένα (Σχήμα 3Α,

δεξί πάνελ

). Επιπλέον, ο HIF-1α-siRNA επιμολυσμένα κύτταρα Hy-Α549 επίπλωση μείωση στην έκφραση του VEGF (Σχήμα 3Β) και πέρασε μέσα ενημέρωσης αυτών των επιμολυντών έδειξαν σημαντικά μικρότερη μετανάστευση ΕΚ (Σχήμα 3C). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η καψαϊκίνη αναστέλλεται VEGF από κάτω-ρύθμισης βασικό παράγοντα μεταγραφής HIF-1α (Εικόνα 3C). Ωστόσο, δεδομένου ότι καψαϊκίνης θεραπεία αυτών των επιμολυντών αποδεδειγμένο πρόσθετο μείωση στη VEGF, η συμμετοχή του HIF-1α-ανεξάρτητο μονοπάτι (ες) αναστολής VEGF με καψαϊκίνη δεν μπορεί να αναιρεθεί.

(Α) προφίλ έκφρασης Χρονοελεγχόμενη του HIF -1α mRNA και -πρωτεΐνη προσδιορίστηκαν με στύπωμα Western και RT-PCR, αντίστοιχα, σε κύτταρα Hy-Α549 καψαϊκίνη φάρμακο (

αριστερό πλαίσιο

). Καψαϊκίνη-επεξεργασμένα κύτταρα Hy-Α549 εξετάστηκαν για χρονικά εξαρτώμενη διακύμανση των προφίλ έκφρασης του HIF-1α με ποσοτική ανάλυση PCR πραγματικού χρόνου και αναπαρίσταται γραφικά (

δεξί πάνελ

). (Β) κύτταρα Hy-Α549, παροδικά επιμολυσμένα με ένα μη-στόχευσης ελέγχου-siRNA ή HIF-1α-siRNA, επωάστηκαν με /χωρίς καψαϊκίνης για 24 ώρες? τα κύτταρα στη συνέχεια αναλύθηκαν για να προσδιοριστεί η έκφραση του VEGF σε πρωτεΐνη και τα επίπεδα mRNA (

αριστερό πλαίσιο

). Ανοσοστύπωμα δείχνει αποτελεσματικότητα επιμόλυνσης του HIF-1α (

δεξί πάνελ

) (C) ελέγχου-siRNA /HIF-1α-siRNA επιμολυσμένα Hy-Α549 κυττάρων-υπερκείμενα χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση HUVEC μετανάστευση από τραύμα δοκιμασία επούλωσης μετά καψαϊκίνη -Θεραπεία (37,5 μΜ? 24 h) και γραφικής παράστασης. (D) προφίλ έκφρασης Χρονοελεγχόμενη του ρ53 mRNA και -πρωτεΐνη προσδιορίστηκε με κηλίδωση Western και RT-PCR σε Hy-Α549 κύτταρα καψαϊκίνη φάρμακο (

αριστερό πλαίσιο

). φωσφορυλίωση ρ53 σε σερίνη-15 θέση αξιολογήθηκε επίσης (

δεξί πάνελ

). κύτταρα (Ε) Hy-Α549, επιμολυσμένα με έλεγχο-shRNA /p53-shRNA επωάστηκαν με καψαϊκίνη για 24 ώρες και HIF-1α VEGF-mRNA και -πρωτεΐνη προσδιορίστηκαν με στύπωμα Western και RT-PCR (

αριστερό πάνελ

). αποτελεσματικότητα επιμόλυνσης ελέγχθηκε με ανάλυση επίπεδο έκφρασης p53 (

δεξί πάνελ

). (F) HIF-1α ανοσοκατακρημνίστηκε από κυτταρολύματα Hy-Α549 καψαϊκίνη αγωγή και ανοσοστυπώθηκαν με αντι-Ub αντίσωμα δια τον ποσοτικό προσδιορισμό HIF-1α ουβικουϊτινίωση. Η σκάλα των ζωνών εκπροσωπούνται ουβικουιτινωμένης HIF-1α. Σε παράλληλο πείραμα, ανοσοϊζήματα αναλύθηκαν για τα επίπεδα HIF-1α με κηλίδα Western. Συγκρίσιμα εισόδου πρωτεΐνης επιβεβαιώθηκε με άμεση στύπωση Western με αντι-α-ακτίνης χρησιμοποιώντας 20% των κυτταρολυμάτων που χρησιμοποιήθηκαν για ανοσοκαθίζηση. κύτταρα Hy-Α549 φάρμακο προεπεξεργασμένων (G) Έλεγχος και MG-132 υποβλήθηκαν σε καψαϊκίνη-θεραπεία για 24 ώρες και στη συνέχεια εξετάστηκαν για έκφραση του HIF-1α /VEGF με κηλίδωση Western. α-ακτίνης /GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος φόρτωσης. Οι τιμές είναι μέση ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων σε κάθε περίπτωση ή αντιπρόσωπο του τυπικού πειράματος.

Η

Capsaicin στοχεύει HIF-1α σε ρ53-εξαρτώμενο τρόπο

Από p53 στοχεύει άμεσα HIF- 1α για proteosomal αποδόμηση [9], αξιολογήσαμε το ρόλο της ρ53, αν υπάρχουν, που διεγείρεται από καψαϊκίνη ρύθμιση του HIF-1α και VEGF.