Αφηρημένο

Στόχος

προκυανιδίνες σπόρων σταφυλιού (PC) είναι φλαβαν-3-όλη ολιγομερή και πολυμερή γνωστά για τη βιολογική τους δραστηριότητα στο έντερο. Εκχύλισμα σπόρων σταφυλιού (GSE) έχουν αναφερθεί για τη μείωση εντερική βλάβη σε ένα μοντέλο αρουραίου της μυκητίασης. Επιδιώξαμε να διερευνήσει επιδράσεις των καθαρισμένων κλασμάτων PC που διαφέρουν σε μέσο βαθμό πολυμερισμού (MDP) σε συνδυασμό με 5-φθοριοουρακίλη (5-FU) χημειοθεραπεία για τη βιωσιμότητα των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου (Caco-2).

Σχεδιασμός

SixPC κλάσματα (F1-F6) απομονώθηκαν από σπόρους Cabernet Sauvignon σε δύο ωρίμανσης στάδια: προ-Veraison άγουρες (ανώριμα) και ώριμα (ώριμο), χρησιμοποιώντας κλίση βήμα, χρωματογραφία χαμηλής πίεσης σε Sephadex LH-20 ρετσίνι. Τα κλάσματα ελέγχθηκαν σε κύτταρα Caco-2, μόνο και σε συνδυασμό με 5-FU. Τα εκλουσθέντα κλάσματα που χαρακτηρίζεται από phloroglucinolysis και γέλη χρωματογραφία διαπερατότητας. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με την (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλ-τετραζολίου) (ΜΤΤ) 3-.

Αποτελέσματα

Όλα απομονωμένα κλάσματα μειώνονται σημαντικά Caco-2 κυτταρικής βιωσιμότητας σε σχέση με τον μάρτυρα (Ρ & lt? 0,05), αλλά F2 και F3 (mDP 2-6) ήταν οι πιο δραστικά κλάσματα (ανώριμα F2 = 32% mDP 2.4, F3 = 35% mDP 5.8 και ωριμάζουν F2 = 13 % mDP 3.6 και F3 = 17% mDP 5.9? ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων που παραμένουν) σε κύτταρα Caco-2. Όταν συνδυάζεται με 5-FU, ανώριμα κλάσματα F1-F3 ενισχυμένης τις επιδράσεις κυτταρική τοξικότητα της 5-FU κατά 27-73% (

P & lt?

0,05). Ζευγάρι κλάσματα σπόρων PC (F1-F4) ενίσχυσε σημαντικά την τοξικότητα του 5-FU κατά 60-83% έναντι των κυττάρων Caco-2 (

P & lt?

0.05). Επιπλέον, ορισμένες κλάσματα μόνο ήταν περισσότερο ισχυρές σε μείωση της βιωσιμότητας σε κύτταρα Caco-2 (

P & lt?

0,05? Ανώριμα κλάσματα = 65-68% και ώριμη κλάσματα = 83-87%) σε σύγκριση με μόνη 5-FU ( 37%).

Συμπεράσματα

υπολογιστές της mDP 2-6 (ανώριμο F1-F3 και ώριμη F1 και F4), όχι μόνο ενίσχυσε την επίδραση της 5-FU σε θανάτωση κυττάρων Caco-2, αλλά και ξεπέρασε πρότυπο 5-FU χημειοθεραπεία ως αντι-καρκίνου agent.The βιοδραστικότητα του υπολογιστή είναι ως εκ τούτου, αποδίδεται κυρίως στη μείωση των PCs μοριακού βάρους

Παράθεση:. Cheah KY, Howarth GS, Bindon KA, Kennedy JA, Bastian Σεπτέμβριο (2014) χαμηλού μοριακού βάρους προκυανιδίνες από κουκούτσια σταφυλιού ενισχυθεί ο αντίκτυπος των 5-φθοριοουρακίλη χημειοθεραπεία για

Caco-2

Ανθρωπίνων καρκίνο παχέος εντέρου κύτταρα. PLoS ONE 9 (6): e98921. doi: 10.1371 /journal.pone.0098921

Επιμέλεια: Ρατζίβ Samant, Πανεπιστήμιο της Αλαμπάμα στο Μπέρμιγχαμ, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 17 Νοεμβρίου 2013? Δεκτές: 7 Μαΐου 2014? Δημοσιεύθηκε: 6 Ιουνίου, 2014

Copyright: © 2014 Cheah et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Καθηγητής Gordon Howarth υποστηρίζεται από μια Νότιας Αυστραλίας Υγείας και Ιατρικής Έρευνας Ινστιτούτο Αντικαρκινικό Συμβούλιο Senior Research Fellowship. Η παρούσα μελέτη πραγματοποιήθηκε στο πλαίσιο της συνεργασίας μεταξύ του Κρασιού Επιστήμης και Business Group, το Πανεπιστήμιο της Αδελαΐδας και της Αυστραλίας Ινστιτούτο Οίνου Ερευνών (AWRI). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

εισαγωγή

καρκίνος του παχέος εντέρου έχει τη δεύτερη υψηλότερη θνησιμότητα, και είναι η τέταρτη πιο συχνά διαγιγνώσκονται μορφή καρκίνου στις Ηνωμένες Πολιτείες [1]. Η κύρια θεραπεία για τον καρκίνο του παχέος εντέρου περιλαμβάνει τη χειρουργική εκτομή του εντέρου και τη χημειοθεραπεία, τις περισσότερες φορές με 5-φθοριοουρακίλη (5-FU) [2]. Δυστυχώς, η χημειοθεραπεία δεν μπορούν να διακρίνουν μεταξύ φυσιολογικών και καρκινικών κυττάρων, και στοχεύει σε τομείς όπου τα κύτταρα αντικαθίστανται με υψηλό ρυθμό, όπως στο στόμα και στο έντερο [3]. Αυτό οδηγεί στην ανάπτυξη βλεννογονίτιδας (γαστρεντερική τοξικότητα). Τρέχουσες θεραπείες βλεννογονίτιδα είναι σε μεγάλο βαθμό αναποτελεσματική, δεδομένου ότι στοχεύουν μόνο τα συμπτώματα, αλλά όχι την παθογένεση της κατάστασης [3]. Έτσι, είναι σημαντικό να αναζητήσουν νέες εναλλακτικές θεραπείες που όχι μόνο στοχεύουν μυκητίαση, αλλά και την ενίσχυση της χημειοθεραπευτική δράση χωρίς να θέτει σε κίνδυνο την ευημερία των ασθενών.

Όλο και περισσότερο, τα εκχυλίσματα σπόρων σταφυλιού (Γ.Σ.Ε.Σ.) μελετώνται λόγω αναφέρθηκαν οφέλη για την υγεία για μια ποικιλία διαταραχών, όπως ο καρκίνος [4], καρδιαγγειακής νόσου [5], [6] και η ελκώδης κολίτιδα [7], [8]. Τα ευεργετικά αποτελέσματα του GSEs έχουν αποδοθεί σε πολυφαινολικές προκυανιδίνες (PCs) [9], η οποία περιλαμβάνει φλαβαν-3-όλης υπομονάδες. Το μήκος πολυμερές του PC περιγράφεται από το βαθμό πολυμερισμού (DP). Λόγω της πολυμερισμένη δομή τους, κυτταρική απορρόφηση περιορίζεται σε ολιγομερή με χαμηλότερο DP, αφήνοντας τα μεγαλύτερα μόρια DP για προσρόφηση στον αυλό του εντέρου μετά από στοματική χορήγηση [10], [11]. Ένας αριθμός μελετών έχουν αναφέρει τον πολυμερισμό και galloylation των PCs να είναι υπεύθυνη για την αντι-πολλαπλασιαστική επιπτώσεις τους στην μετασχηματισμένα κύτταρα [9], [12], [13].

Υπάρχουν αυξανόμενα στοιχεία που υποδηλώνουν GSEs είναι αποτελεσματικές στη μείωση του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων χωρίς να είναι κυτταροτοξική σε φυσιολογικά κύτταρα [14]. Επιπλέον, GSE έδειξε μερική βελτίωση της εντερικής βλάβης σε ένα μοντέλο αρουραίου της εντερικής βλεννογονίτιδας και έχει μειωμένη γαστρεντερική τοξικότητα των κυττάρων μετά την χημειοθεραπεία σε φυσιολογικά IEC-6 εντερικά κύτταρα [15]. Ωστόσο, τα βιοδραστικά συστατικά σε GSE παραμένουν άγνωστοι. Ο πρωταρχικός στόχος της παρούσας μελέτης ήταν να προσδιορίσει τη χημική σύνθεση των βιοδραστικών κλάσματα PC, και να διερευνήσουν τις δυνατότητές τους σε συνδυασμό με 5-FU χημειοθεραπεία, για τις επιπτώσεις τους στη βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου. Όταν σε συνδυασμό με 5-FU, ορισμένα κλάσματα PC ενισχυθεί περαιτέρω η τοξικότητα σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δηλώσεις

δείγματα σταφυλιών Cabernet Sauvignon ελήφθησαν από εμπορικές αμπελώνες, Accolade Wines (Ορλάντο) στην αναπτυσσόμενη περιοχή Langhorne Creek της Νότιας Αυστραλίας, η οποία έχει γεωγραφικό πλάτος 35 ° 16’11.56 «S και γεωγραφικό μήκος 139 ° 00’14.47» E, με υψόμετρο περίπου 28 μέτρα πάνω από την επιφάνεια της θάλασσας. Δεν άδειες που απαιτούνται για την περιγραφόμενη μελέτη, η οποία συμμορφώθηκε με όλους τους σχετικούς κανονισμούς

δειγματοληψίας και της προετοιμασίας Σταφύλι

δείγματα σταφυλιών συλλέχθηκαν σε διαφορετικά στάδια ωριμότητας:. Ανώριμα (preveraison, πράσινο σπόρους) και ώριμα (25-26 ° Brix, καφέ σπόροι) κατά τη διάρκεια της καλλιεργητικής περιόδου του 2009. ρόγες σταφυλιού παρασκευάστηκαν σύμφωνα με μια προηγουμένως περιγραφείσα μέθοδο [16] στην οποία τα σταφύλια συλλέχθηκαν και διατηρήθηκαν κατεψυγμένα στους -20 ° C. Ενώ ακόμα κατεψυγμένα, σπόροι απομακρύνθηκαν από τη σάρκα με ένα νυστέρι. Σπόροι συνέχεια ξεχαστεί της σάρκας με μια χαρτοπετσέτα και την εκ νέου κατάψυξη στους -20 ° C πριν από την εκχύλιση.

Προετοιμασία και εκχύλιση των σπόρων procyanidins (PCs)

εξόρυξης PC ξεκίνησε από την εξόρυξη σπόροι (100 g) όλη τη νύκτα για 18 ώρες σε 70% ακετόνη (200 ml, ο /ο) και ασκορβικό οξύ (1 g /L). Το εκχύλισμα συμπυκνώθηκε υπό ελαττωμένη πίεση στους 35 ° C (HeidolphLaborota 4011 περιστροφικό εξατμιστήρα, John Morris Scientific, Adelaide, Australia), και λυοφιλοποιήθηκε σε μια ξηρή σκόνη (DynaVac FD3 πάγωμα ξηραντήριο, DynaVac Pty Ltd, Sydney, Αυστραλία). Οι αποδόσεις για κάθε δείγματα ήταν: ανώριμα 6,31 g και ώριμη 10,29 g. σπόρων σε σκόνη PC (5 g) διαλύθηκε σε 50 mL μεθανόλης (60%, ν /ν) που περιέχει τριφθοριοοξικό οξύ (TFA) (0,05%, ν /ν) και στη συνέχεια εφαρμόζεται (~18.3 mL /λεπτό) προς 300 μΜ x στήλη γυαλιού 21 mm (Michel-Miller, Vineland, NJ, USA) που περιέχει Sephadex LH20 χρωματογραφία ρητίνη (Amersham, Ουψάλα, Σουηδία) σε όγκο κατά προσέγγιση κλίνης 93 ml, και να ξεπλυθεί σε 250 ml μεθανόλης (60%, ν /ν) που περιέχει TFA (0,05%, ν /ν) για την απομάκρυνση των μονομερών χαμηλού μοριακού βάρους. PC στη συνέχεια ανακτήθηκε εντός 150 ml υδατικού ακετόνης (70%, ν /ν) και τα εκχυλίσματα συμπυκνώθηκε σε περιστροφικό εξατμιστήρα στους 35 ° C για να απομακρυνθεί η ακετόνη. Το υδατικό διάλυμα εκχυλίζεται με εξάνιο για να απομακρυνθεί το απομένον λιπόφιλο υλικό χρησιμοποιώντας μία διαχωριστική χοάνη. Το υδατικό εκχύλισμα ξηράνθηκε δια καταψύξεως σε σκόνη και ανακτάται ποσότητα για δύο εκχυλίσματα? ανώριμος, 2,5 g και ώριμη, 0,9 g αντίστοιχα. Σκόνες κρατήθηκαν υπό άζωτο και στους -20 ° C πριν από την κλασματοποίηση.

για κλασμάτωση των PCs, σκόνη σπόρων PC (0,5 g) διαλύθηκε σε μεθανόλη (60%, ν /ν) που περιέχει TFA (0,05% , ν /ν) και εφαρμόστηκε στην ίδια στήλη υπό πανομοιότυπες συνθήκες. εκχύλισμα σπόρων PC κλασματοποιήθηκε σύμφωνα με μια μέθοδο έκλουσης κλιμακωτό περιγράφηκε προηγουμένως [16] για την παραγωγή 6 κλάσματα με αυξανόμενο μέσο βαθμό πολυμερισμού (MDP) και τα μοριακά βάρη των υπολογιστών που χαρακτηρίζονται ως F1 έως F6. Τα εκλουσθέντα κλάσματα συμπυκνώθηκαν υπό πίεση στους 35 ° C για να απομακρυνθεί οργανικούς διαλύτες και περαιτέρω λυοφιλίστηκε σε ξηρή σκόνη. Τα απομονωμένα κλάσματα αποθηκεύτηκαν στους -20 ° C πριν από την ανάλυση. Σταφυλιού εκχύλισμα σπόρων ήταν ένα γενναιόδωρο δώρο από Tarac Technologies (GraPex τανίνη σπόρων? Βόρεια Αδελαΐδα, Νότια Αυστραλία) και συμπεριλήφθηκε στη μελέτη ως μάρτυρας. GSE (1 g) διαλύθηκε σε μεθανόλη (60%, ν /ν) που περιέχει TFA (0,05%, ν /ν) και κλασματοποιήθηκε ανάλογα.

όξινη κατάλυση του PC με την παρουσία περίσσειας φλορογλουκινόλης (Phloroglucinolysis)

Phloroglucinolysis χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της σύνθεσης υπομονάδας, mDP και galloylation του υπολογιστή. Pholoroglucinolysis διεξήχθη σύμφωνα με μια προηγουμένως περιγραφείσα μέθοδο [16]. κλάσματα Seed διαλύθηκαν σε μεθανόλη (10 mg /mL, ν /ν) και ίσοι όγκοι (25 μL) του εκχυλίσματος και διάλυμα φλορογλουκινόλης (0.2 Ν HCL και 100 g /L φλωρογλυκινόλης και 20 g /L ασκορβικό οξύ) για να δώσει μια τελική συγκέντρωση PC 5 g /L. Η αντίδραση phloroglucinolysis διεξήχθη στους 50 ° C για 25 λεπτά και αναλύθηκε με RP-HPLC χρησιμοποιώντας (-) -. Επικατεχίνη (Sigma Aldrich, St. Louis, ΜΟ) ως το ποσοτικό πρότυπο

χρωματογραφία διείσδυσης πηκτής ( GPC)

χρωματογραφία διείσδυσης γέλης διεξήχθη με βάση μια προηγουμένως περιγραφείσα μέθοδο [16]. Η τεχνική GPC χαρακτηρίζει πληροφορίες σχετικά με την κατανομή του μεγέθους των PC για κάθε κλάσμα. Κλασματοποιημένα δείγματα (10 mg /ml) διαλύθηκαν σε μεθανόλη και αραιώνεται περαιτέρω με 4 όγκους HPLC κινητή φάση (

Ν, Ν-διμεθυλφορμαμίδιο

περιέχει παγόμορφο οξικό οξύ (1%, ν /ν), νερό (5 %, ν /ν) και 0.15 Μ χλωριούχο λίθιο). Ο ρυθμός ροής διατηρήθηκε στα 1 ml /min με μία θερμοκρασία στήλης 60 ° C και η έκλουση παρακολουθήθηκε στα 280 nm. Το μέγιστο ποσό του PC εγχύθηκε επί της στήλης ήταν 40 μg. κλάσματα PC σπόρος από μία προηγούμενη μελέτη [17] χρησιμοποιήθηκαν ως πρότυπα για βαθμονόμηση. Οι καμπύλες βαθμονόμησης κλασματικής υπολογιστές με αθροιστική κατανομή της μάζας τους χαράχθηκαν και η μέση μοριακή μάζα των κλασμάτων είχε προβλεφθεί σε 50%.

σίδηρος μείωση αντιοξειδωτική δύναμη (FRAP) δοκιμασία

Αυτή η ανάλυση διεξήχθη έξω μετά από ένα τροποποιημένο πρωτόκολλο [18]. Εν συντομία, αντιδραστήριο FRAP παρασκευάστηκε (300 mM οξικό ρυθμιστικό, ρΗ 3.6, 10 mM 2,4,6-τρι [2-πυριδυλ] -S-τριαζίνη διάλυμα (TPTZ) σε 40 mM HCL, 20 mM χλωριούχο σίδηρο? Σε 10: 1:01 ν /ν) και διατηρούνται στο σκοτάδι στους 37 ° C πριν από την ανάλυση. Τα κλάσματα διαλύθηκαν σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) (0.1 mg /mL) και 15 μL προστέθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων. 15 μL του αντιδραστηρίου FRAP προστέθηκαν στα φρεάτια που περιείχαν τα κλάσματα και η πλάκα αναγνώστηκε σε 593 nm μετά από 4 λεπτά (Multiskan Spectrum, Θερμά Corporation Electron, Vantaa, Φινλανδία) με τη χρήση του λογισμικού Skanit 2.2. θειικό σίδηρο (0,1-1 mM) χρησιμοποιήθηκε για την κατασκευή ενός κατ ‘αποκοπή τιμών καμπύλης και FRAP των ενώσεων δοκιμής εκφράστηκαν ως mMFe (II) /g δείγματος. Κάθε αγωγή ελέγχθηκε εις τριπλούν και όλο το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SEM από 3 ανεξάρτητα πειράματα.

Προετοιμασία κυττάρων και πειραματική θεραπεία

Η ανθρώπινη κυτταρική σειρά καρκίνου του παχέος εντέρου, Caco-2 ελήφθη από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, USA). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) στους 37 ° C και σε 5% CO

2 θερμοκοιτίδα. Media αντικαταστάθηκαν δύο φορές σε κάθε εβδομάδα. κλάσματα PC διαλύθηκαν σε DMSO και διατηρήθηκε σε -20 ° C πριν από την ανάλυση. κύτταρα Caco-2 σπάρθηκαν στα 1000 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων ιστοκαλλιέργειας (Grenier Bio-όνη, Βικτώρια, Αυστραλία) και επωάστηκαν στους 37 ° C σε 5% CO

2 για 48 ώρες για να επιτραπεί η σύνδεση. Μετά από 48 ώρες επώασης, τα μέσα αντικαταστάθηκαν με διαφορετικές συγκεντρώσεις των κλασμάτων σπόρου διαλύεται σε DMEM (μg /mL) που περιέχει & lt? 0,025% (ν /ν) DMSO και 5-FU (100 μΜ) (DBL, Mayne Pharma Pty . Ltd., Βικτώρια, Αυστραλία). Τα κύτταρα επωάστηκαν περαιτέρω στους 37 ° C, 5% CO

2 για 24, 48 και 72 ώρες.

ΜΤΤ δοκιμασία

Ο (3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ ) -2,5-διφαινυλο-τετραζόλιο) (ΜΤΤ) ανίχνευση πραγματοποιήθηκε με βάση μια προηγουμένως περιγραφείσα μέθοδο, με ελαφρά τροποποίηση [19]. Μετά από έκθεση σε θεραπείες (εκχυλίσματα σπόρων και 5-FU), 50 μL ΜΤΤ (1 mg /mL σε φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα Dulbecco Αλατόνερο) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκαν περαιτέρω στους 37 ° C, 5% CO

2 για 4 ώρες. Μετά από 4 ώρες, το μέσο αναρροφήθηκε και 100 μι DMSO προστέθηκαν για να διαλυθεί το προϊόν φορμαζάνης. Οι πλάκες τοποθετήθηκαν σε επωαστή ανακίνησης για 15 λεπτά και αναγνώστηκαν στα 570 nm με ένα φασματοφωτόμετρο UV. Κάθε αγωγή ελέγχθηκε εις τριπλούν και όλο το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση ± SEM από 3 ανεξάρτητα πειράματα. Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων σε σύγκριση με το ποσοστό των κυττάρων που υπέστησαν αγωγή με DMEM χωρίς ορό. Τα κύτταρα ελέγχου αντιπροσωπεύει είτε κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με ελεύθερη ορού DMEM μόνο ή κύτταρο υποβάλλεται σε επεξεργασία με 100 μΜ 5-FU.

Στατιστική ανάλυση

Κάθε πείραμα βασίζεται σε κύτταρα διεξήχθη τουλάχιστον 3 φορές. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση XLSTAT έκδοση 12.0 για Windows ή PASW έκδοση στατιστική 18. Η στατιστική ανάλυση προσδιορίστηκε με αμφίδρομη ANOVA με

post hoc-

δοκιμασία του Tukey.

συντελεστής συσχέτισης Α του Pearson υπολογίστηκε να καθορίσουν τη σχέση μεταξύ των κυττάρων βιωσιμότητες, σύνθεση υπολογιστή και αντιοξειδωτική αξία. Η στατιστική σημαντικότητα θεωρήθηκε σε

P

& lt?. 0.05

Χημικά

Η ακετόνη, ασκορβικό οξύ, μεθανόλη, τριφθοροξεικό οξύ (TFA), φλορογλουκινόλης, (-) – επικατεχίνη, Ν, Ν-διμεθυλοφορμαμίδιο, χλωριούχο λίθιο, οξικό νάτριο (CH3COONa), 2,4,6-τρι [2-πυριδυλ] -s-τριαζίνη (TPTZ), χλωριούχου σιδήρου και μεθανόλη αγοράστηκαν από την Sigma Chemical Co. Ltd, St. Louis , MO. Υδροχλωρικό οξύ (HCl), παγόμορφο οξικό οξύ, αντιδραστήριο Folin-Ciocalteau και θειικού σιδήρου αγοράστηκαν από AnalaR, ΒΟΗ, Merck, Pty. Ltd., Αυστραλία. διαλύματα καλλιέργειας ιστών περιλαμβάνουν Τροποποιημένο Ελάχιστο Απαραίτητο Μέσο Dulbecco Eagle (ϋΜΕΜ), του Dulbecco Αλατόνερο Ρυθμισμένο με Φωσφορικό, διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) και 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλ-τετραζολίου) (ΜΤΤ) ήταν που αγοράστηκαν από Gibco BRL, Life Tehnologies Pty Ltd, Australia.Pty. Ε.Π.Ε.

Όργανα

Ένα μοντέλο Agilent 1100 HPLC (Agilent Technologies Australia Pty Ltd, Μελβούρνη, Αυστραλία) χρησιμοποιήθηκε με το λογισμικό Chemstation για χρωματογραφικές αναλύσεις.

Αποτελέσματα

Χαρακτηρισμός των κλασμάτων PC

GSE συμπεριλήφθηκε στην παρούσα μελέτη ως μάρτυρας. Η σύνθεση της PC της GSE απεικονίζεται στον Πίνακα 1. Σε σύγκριση με τα εκχυλίσματα σπόρων Cabernet Sauvignon, GSE είχαν χαμηλή μετατροπή μάζας (23.8% β /β) και, επίσης, ένα χαμηλότερο μοριακό βάρος, όπως μετράται από phloroglucinolysis και GPC. Οι τερματικό PC υπομονάδες σε GSE ως επί το πλείστον κυριαρχείται από (-) – επικατεχίνη-3-

O

-gallate. Λόγω της φαινομενικά χαμηλή συμβολή των PCs στην GSE, απομονώσαμε υπολογιστές από φρέσκα σπόρους Cabernet Sauvignon που συγκομίζονται σε διάφορα στάδια, όπως προηγούμενες εκθέσεις έδειξαν μια μεγάλη μάζα μετατροπή των μη επεξεργασμένων ειδών σπόρους σταφυλιών [16].

Η

Συγκρίνοντας καθαρισμένο PC από αμφότερα τα δείγματα σπόρων, ο σπόρος ανώριμα είχαν υψηλότερα μάζα μετατροπής (87%) σε σύγκριση με ώριμους σπόρους (71%) (Πίνακας 2). Τα καθαρισμένα PCs περαιτέρω κλασματώθηκαν σε 6 κλάσματα με την αύξηση mDP ή μοριακή μάζα. Η μάζα απόδοση μετατροπής για τη μετατροπή του υπολογιστή σε γνωστό PC ήταν & gt? 49%, με εξαίρεση το υψηλότερο mDP F6 (περίπου 37%). Οι σημαντικές διαφορές μεταξύ των ανώριμων και ώριμων σπόρων κλάσματα ήταν ότι το ώριμο κλάσματα είχαν υψηλότερη αναλογία (-) – επικατεχίνη τερματικό υπομονάδες (9-30%) σε σύγκριση με τα κλάσματα ανώριμα (2-11%). Τόσο ώριμα και ανώριμα κλάσματα σπόρων έδειξε ένα παρόμοιο μοτίβο της μείωσης (-) – επικατεχίνη τερματικό υπομονάδες με την αύξηση mDP. Είναι ενδιαφέρον ότι, οι αυξήσεις στον πολυμερισμό ή μοριακού βάρους ελέγχεται κυρίως από (-) – επικατεχίνη-3-

O

-gallate υπομονάδες επέκτασης. Η galloylation των ανώριμων κλασμάτων κυμαίνονταν 15-35% και ώριμη κλάσματα κυμαίνονται 9-24%. Ανώριμη F2 είχε το υψηλότερο galloylation (35%), κυρίως λόγω της υψηλής αναλογίας της (-) -. Επικατεχίνη-3-

O

-gallate (88%)

Η

Αντιοξειδωτική ικανότητα των κλασμάτων σπόρου

Η αντιοξειδωτική ικανότητα των κλασμάτων των σπόρων μετρήθηκε με τη δοκιμασία FRAP (Σχήμα 1). GSE, το οποίο περιείχε ένα μίγμα ολιγομερών και πολυμερών υπολογιστές, συμπεριλήφθηκε ως θετικός έλεγχος για να προσδιοριστεί η αντιοξειδωτική δράση των κλασμάτων σπόρου. Σε σύγκριση με GSE (5 mM /g), όλα τα κλάσματα είχαν υψηλότερες τιμές FRAP, που κυμαίνονται από 5.4-8.8 mM /g. Η αντιοξειδωτική ικανότητα των κλασμάτων μειώθηκε στις περισσότερες πολυμερισμένο κλάσματα PC. Οι τιμές FRAP είχαν αρνητική συσχέτιση με mDP (r

2 = -0.81,

P

& lt? 0,05).

Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SEM από 3 ανεξάρτητα πειράματα. Η στατιστική ανάλυση προσδιορίστηκε με μονόδρομη ANOVA με

post-hoc

δοκιμασία του Tukey. Τιμές με διαφορετικά γράμματα (α, β, γ) σε κάθε στήλη είναι στατιστικά διαφορετικές σε Ρ & lt?. 0.05

Η

Επιπτώσεις των κλασμάτων σπόρου στην βιωσιμότητα των κυττάρων Caco-2

Η κυτταροτοξικά αποτελέσματα των κλασμάτων σπόρου σε κύτταρα Caco-2 προσδιορίστηκαν με τη δοκιμασία ΜΤΤ (Σχήμα 2). κύτταρα Caco-2 εκτέθηκαν σε σπόρους κλάσματα για 72 ώρες και τα δεδομένα εκφράζονται ως IC

50, που ορίζεται ως η δόση της κάθε ένωσης που ανέστειλε την κυτταρική βιωσιμότητα στο 50%, που αντιπροσωπεύει την μέση τιμή τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Όλα τα κλάσματα εμφάνισε ένα βαθμό τοξικότητας όπως υποδεικνύεται από μειωμένες τιμές απορρόφησης. Το IC

50value (μέσος όρος των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων) για τα κλάσματα ανώριμα σπόρους (F1-F6) κυμαινόταν από 17.7-70.2 μg /mL (Εικόνα 2Α). Ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων συσχετίζεται θετικά με το MDP κλασμάτων ανώριμων σπόρων (r

2 = 0,48,

P

& lt? 0,05), δηλαδή, τα κλάσματα με την υψηλότερη mDP (F5 και F6) ήταν λιγότερο τοξικά σε κύτταρα Caco-2. Παρόμοιες τάσεις από την άποψη των κυτταροτοξικών επιδράσεων παρατηρήθηκαν επίσης για την εφαρμογή των κλασμάτων ώριμων σπόρων (Σχήμα 2Β), όπου ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων παρομοίως συσχετίζεται με το MDP των κλασμάτων (r

2 = 0,50,

P

& lt? 0,05). Ώριμη κλάσματα σπόρων επέδειξαν ισχυρότερη κυτταροτοξικότητα σε σύγκριση με τα κλάσματα ανώριμα σπόρου (Σχήμα 2Α και 2Β).

Τα δεδομένα εκφράζονται ως IC

50 ή δόση (μg /mL) αναστολή της βιωσιμότητας των κυττάρων σε 50% (μέση τιμή ± SEM ) 3 ανεξάρτητων πειραμάτων. Η στατιστική ανάλυση προσδιορίστηκε με μονόδρομη ANOVA με

post-hoc

δοκιμασία του Tukey. Οι τιμές με διαφορετικά γράμματα (α, β, γ) σε κάθε στήλη ήταν στατιστικά διαφορετικές σε Ρ & lt?. 0.05

Η

Το συνδυασμένο αποτέλεσμα των απομονωμένων κλασμάτων σπόρου και 5-FU στην βιωσιμότητα των κυττάρων Caco-2

Το συνδυασμένο αποτέλεσμα των κλασμάτων σπόρου και 5-FU σε κύτταρα Caco-2 διερευνήθηκε (Σχήμα 3). Για κλάσματα ανώριμα σπόρους, η βιωσιμότητα των κυττάρων Caco-2 ανεστάλη σημαντικά από όλα τα κλάσματα των σπόρων (Εικόνα 3Α). Σε σύγκριση με GSE (67%), F2 και F3 ανώριμων σπόρων εκχυλισμάτων ήταν πιο τοξικές για κύτταρα Caco-2 (F2, 32% και F3, 35% της αξίας ελέγχου,

P

& lt? 0,05). Ωστόσο, όταν τα κλάσματα σπόρος ήταν παρούσες με 5-FU (100 μΜ), τα ανασταλτικά αποτελέσματα αύξησης του 5-FU ήταν σημαντικά αυξημένη (

P

& lt? 0,05) (Σχήμα 3Α). 5-FU μείωσε σημαντικά την κυτταρική βιωσιμότητα στο 62% των τιμών ελέγχου (

P

& lt? 0,05). F1-F3 ενίσχυσε σημαντικά τη δραστικότητα ανασταλτική της ανάπτυξης της 5-FU (27%, 73% και 56% αντίστοιχα σε σχέση με τον έλεγχο 5-FU?

P

& lt? 0,05). F2 θα μπορούσε επομένως να θεωρηθεί ως πιο ισχυρός παράγων χημειοθεραπείας από μη κλασματωμένη εμπορικά διαθέσιμα GSE, η οποία ενισχύεται μόνο το αποτέλεσμα αναστολής αύξησης του 5-FU κατά 55% (

P

& lt? 0,05? Σύγκριση με το μάρτυρα 5-FU). Επιπλέον, βρήκαμε επίσης ότι ανώριμα F2 (32%) και F3 (35%) ήταν περισσότερο ισχυρή από 5-FU (62% της αξίας ελέγχου?

P

& lt? 0,05) στη μείωση Caco-2 βιωσιμότητα.

τα δεδομένα παρουσιάζονται ως ποσοστό της κυτταρικής βιωσιμότητας σε σχέση με τη βιωσιμότητα των κυττάρων ελέγχου. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση ± SEM από 3 ανεξάρτητα πειράματα. Η στατιστική ανάλυση προσδιορίστηκε με αμφίδρομη ANOVA με

post-hoc

δοκιμασία του Tukey. Οι τιμές με διαφορετικά γράμματα (α, β, γ) σε κάθε στήλη ήταν στατιστικά διαφορετικές σε Ρ & lt? 0.05. * Υποδηλώνει σημαντική διαφορά σε 5-FU ομάδα αγωγής σε σύγκριση με τον έλεγχο 5-FU.

Η

Ώριμη κλάσματα σπόρων συμπεριφερόταν με τρόπο παρόμοιο με τα κλάσματα ανώριμα σπόρου (Σχήμα 3Β). Ζευγάρι κλάσματα σπόρων μειώνεται σημαντικά η βιωσιμότητα των κυττάρων (

P

& lt? 0,05). F2 και F3 ήταν πιο κυτταροτοξικά σε κύτταρα Caco-2 (13% και 17% αντίστοιχα,

P

& lt? 0,05) από ό, τι GSE (47%) (Σχήμα 3Β). Όταν κύτταρα εκτέθηκαν σε σπόρους κλάσματα και 5-FU, όλα τα κλάσματα σπόρων ενίσχυσε την ικανότητα της 5-FU για να μειωθεί η κυτταρική βιωσιμότητα. GSE ενισχυμένη σημαντικά την αναστολή της ανάπτυξης του 5-FU κατά 49%. Ωστόσο, F1-F4 ενίσχυσε σημαντικά την επίδραση αναστολής της ανάπτυξης της 5-FU (62%, 83%, 80% και 60% αντίστοιχα σε σχέση με τον έλεγχο 5-FU?

P

& lt? 0,05). Επιπλέον, η F2 (13%), F3 (17%) και F4 (50%) κλάσματα ήταν πιο ισχυρά από 5-FU μόνη της (65% της αξίας ελέγχου?

P

& lt? 0,05) (Σχήμα 3Β ).

Συζήτηση

οι υπολογιστές σπόρων σταφυλιού έχουν αναφερθεί να ασκήσει ιδιότητες που προάγουν την υγεία, ιδίως στο έντερο [14], [15], [20], [21]. Εκτός από την αποτελεσματικότητα αντικαρκινικών της, GSE έχει αποδειχθεί ότι μειώνουν γαστρεντερικής τοξικότητας μετά την χημειοθεραπεία σε υγιή ζώα και στην κανονική εντερικά κύτταρα [15]. Αν και υπάρχουν αυξανόμενες ενδείξεις για την υποστήριξη των χημειοθεραπευτικών ιδιοτήτων του GSE στον καρκίνο του παχέος εντέρου, ταυτοποίηση των βιοενεργών συστατικών υπεύθυνη παραμένει απροσδιόριστη.

Στην παρούσα μελέτη, κλάσματα του υπολογιστή απομονωθεί από εμπορικά διαθέσιμες GSE έδειξε διαφορετικά τέτοιους συνεταιρισμούς και μοριακών μεγεθών. Ωστόσο, αυτά τα κλάσματα είχαν πολύ χαμηλές αποδόσεις μετατροπής (& lt? 37%), υποδεικνύοντας ότι λιγότερο από το 40% των κλασμάτων που χαρακτηρίζεται από τη χρήση των επιλεγμένων τεχνικές ανάλυσης, το οποίο ήταν απαράδεκτο για αυτή τη μελέτη. Η εξήγηση για την χαμηλή απόδοση μετατροπής σε PC fractionsmay υπήρξαν λόγω της οξείδωσης που συμβαίνουν κατά την παραγωγή της Γ.Σ.Ε.Σ. από τη διαδικασία οινοποίησης. Έτσι, αποφασίστηκε να απομονώσουν κλάσματα PC από νωπά σταφύλια που συλλέγονται σε διαφορετικές διάρκειες: ανώριμα (προ-Veraison) και να ωριμάσουν (ώριμα). Η απόφαση αυτή βασίστηκε στην παρατήρηση ότι ανώριμους σπόρους έχουν υψηλότερη απόδοση μετατροπής από ώριμους σπόρους [22], τεκμηριώνεται από την παρούσα μελέτη. Επιπλέον, οι μελλοντικές μελέτες χρησιμοποιώντας φασματομετρία μάζας, επιβεβλημένη προκειμένου να καθορίσει περαιτέρω την καθαρότητα των υπολογιστών που απομονώνεται από σπόρους σταφυλιών.

Οι κυτταροτοξικές επιδράσεις των κλασμάτων PC σε καρκινικά κύτταρα έχουν αναφερθεί στο παρελθόν [9], [12], [13 ]. Ωστόσο, αν οι επιδράσεις αυτές εμφανίστηκαν μέσω εξωκυττάριας σηματοδότησης ή μετά την πρόσληψη των υπολογιστών δεν επιχειρήθηκε. Η παρούσα μελέτη έδειξε ότι τα πιο δραστικά κλάσματα που επηρεάζουν τη βιωσιμότητα των κυττάρων Caco-2 περιείχε μικρότερα ολιγομερή: F2 και F3. Οι πιο ισχυρές κυτταροτοξικές επιδράσεις που παρατηρήθηκαν σε κλάσματα σπόρων Cabernet Sauvignon σε σύγκριση με GSE μπορεί να αντανακλά μια χαμηλότερη απόδοση του υπολογιστή στο GSE (-24%) σε σύγκριση με τον υπολογιστή απομονωθεί από νωπά σταφύλια (-60%).

Η απορρόφηση του PC διαμέσου των κυτταρικών μεμβρανών εξαρτιόταν σε μεγάλο βαθμό από τέτοιους συνεταιρισμούς τους [23], [24]. Μόνο ορισμένα χαμηλότερη mDP υπολογιστές απορροφώνται κατά τη διέλευση από το έντερο, αφήνοντας τα μεγαλύτερα mDP υπολογιστές (MDP & gt? 7) εναποτίθεται στον αυλό του εντέρου. Αυτό το αποτέλεσμα υποστηρίζει το τρέχοντα δεδομένα σύμφωνα με την οποία F2 και F3 (MDP 2-6) και πιθανόν να απορροφηθεί κατά μήκος οι κυτταρικές μεμβράνες ήταν πιο ισχυρές από τα κλάσματα με υψηλότερο mDP, τα οποία ασκούν μόνο μια επίδραση επιφάνεια. Ωστόσο, F2 και F3 ήταν πιο βιοδραστικά από F1, πιθανώς λόγω της υψηλότερης ποσοστό των galloylation και αναλογία επικατεχίνη-3-

O

-gallate ως τερματικό υπομονάδες, σε σύγκριση με το F1. Το αποτέλεσμα αυτό είναι σε συμφωνία με άλλες μελέτες στις οποίες κλάσματα PC με υψηλότερη galloylation ήταν πιο κυτταροτοξικά από κλάσματα PC με χαμηλότερο galloylation όταν δοκιμάζεται σε κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου [9], [25]. Ωστόσο, ο πραγματικός μηχανισμός του PC στην ανάπτυξη των κυττάρων παραμένει άγνωστη. Απορροφάται PC μπορεί να διαδραματίσει ζωτικό ρόλο στην αλληλεπίδραση με μονοπάτια σηματοδότησης των κυττάρων. Οι υπολογιστές έχουν αναφερθεί ότι είναι αναστολείς ανδρογόνων υποδοχέων σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη [26], [27] και των υποδοχέων του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα σε κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου [28]. Επιπλέον, οι υπολογιστές που είναι γνωστό ότι εξασθενούν την ΡΙ3-κινάση (πρωτεϊνική κινάση σερίνης /θρεονίνης) μονοπατιού [14], η οποία θα μπορούσε να οδηγήσει στην επαγωγή διακοπή του κυτταρικού κύκλου στη φάση G1 [20] και την ενεργοποίηση της απόπτωσης που επάγει μονοπάτι [29]. Οι μελλοντικές μελέτες που διερευνούν τις παραμέτρους της κυτταρικής ανάπτυξης και της απόπτωσης, συμπεριλαμβανομένης της πρόσληψης ΡΙ, δραστικότητα κασπάσης 3 και περιεχόμενο DNA υπο-G1 δικαιολογημένη.

Προηγούμενα ευρήματα απέδειξαν ότι οι κυτταροτοξικές επιδράσεις των υπολογιστών εξαρτώνται από mDP τους [9] , [13]. Παρ ‘όλα αυτά, η τρέχουσα μελέτη έδειξε ότι τα κλάσματα με υψηλότερα mDP (7-16) απέτυχε να ασκήσει κυτταροτοξικά αποτελέσματα επί κυττάρων καρκίνου του κόλου. Ωστόσο, η τρέχουσα μελέτη χρησιμοποίησε ένα διαφορετικό σύστημα διαλυτών για να απομονωθούν κλάσματα PC σε σύγκριση με άλλες μελέτες [9], [30]. Αυτό το σύστημα διαλύτη απομονώνει κλάσματα PC με ένα ευρύτερο φάσμα μοριακής μάζας (619-6063 g /mol) και mDP (2-9) σε σύγκριση με άλλες μεθόδους (μοριακή μάζα 552 – 1.232 g /mol, mDP 1-4)? υπονοώντας ότι οι προηγούμενες μελέτες μετρούσαν μόνο περιορισμένα κλάσματα PC (& lt? 1200 g /mol). για βιολογικές τους δραστηριότητες

Η αντιοξειδωτική ικανότητα των υπολογιστών εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από το βαθμό πολυμερισμού και galloylation [9]. Η μείωση των μεταλλικών ιόντων, όπως μετράται με τη δοκιμασία FRAP, πιστεύεται ότι συσχετίζεται θετικά με τον αριθμό των ομάδων υδροξυλίου που υπάρχουν στα μόρια, και ότι τα σημεία συνδέσεως για τη μετάβαση μεταλλικά ιόντα στα φλαβονοειδή μόρια είναι κατά τη

o

-catechol ομάδα του δακτυλίου Β [31]. Ωστόσο, αυτό δεν ήταν η περίπτωση στην παρούσα μελέτη. κλάσματα PC με υψηλότερη mDP ήταν ασθενέστερη αντιοξειδωτικά, τα οποία είναι σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες [32], [33]. Κλάσματα με μεγαλύτερες υπομονάδες έχουν την τάση να αυτο-αδρανών και προκαλούν στερεοχημική παρεμπόδιση [33], [34], εκθέτοντας έτσι λιγότερες ομάδες υδροξυλίου για ριζικές δραστηριότητες σάρωσης. Μελλοντικές μελέτες θα πρέπει να γίνει για να αντιμετωπιστούν οι αντιοξειδωτικές ιδιότητες των υπολογιστών σπόρων σταφυλιού συμπεριλαμβανομένων των επιπτώσεων στην κυτταρική αντιοξειδωτική κατάσταση.

Η τρέχουσα μελέτη διεξήχθη με βάση τη βάσει μιας προηγούμενης μελέτης της GSE και τη χημειοθεραπεία για τη βιωσιμότητα του παχέος εντέρου καρκινικά κύτταρα [35]. επιλεγμένα Οι δόσεις των κλασμάτων σπόρου σταφυλιών στην τρέχουσα μελέτη βασίστηκαν στην βάση αυτής της προηγούμενης μελέτης. 5-FU είναι ένα αντι-μεταβολίτης φάρμακα που μπλοκάρουν την σύνθεση του DNA μέσω αναστολής της θυμιδυλικής συνθάσης [3] κλάσματα εκχύλισμα .Όταν σπόρων συνδυάστηκαν με 5-FU, όχι μόνο ενίσχυσε την επίδραση της 5-FU σε θανάτωση κυττάρων Caco-2, αλλά επίσης ξεπέρασε 5-FU ως αντικαρκινικός παράγοντας. Στην παρούσα μελέτη, εξετάστηκαν οι επιδράσεις της κλασμάτων PC και 5-FU στη βιωσιμότητα των κυττάρων Caco-2 έναντι 24-72 ώρες. 5-FU (100 μΜ) μείωσε σημαντικά τη βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων σε 60-80%, γαστρεντερική τοξικότητα σε ασθενείς με καρκίνο. Η έκθεση του κλάσματος PC και 5-FU σε κύτταρα για 24-48 ώρες έδειξε μία τάση προς μια συνεργιστική δράση, αλλά δεν ήταν σημαντική (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Επιπλέον, η μεγαλύτερη χρόνος έκθεσης (72 ώρες) για να κλασμάτων PC και 5-FU είχε σαν αποτέλεσμα μεγαλύτερη μείωση της κυτταρικής βιωσιμότητας. Η τρέχουσα μελέτη αποκάλυψε επίσης ότι ώριμη κλάσματα σπόρων ήταν ανώτερη από ανώριμα κλάσματα σπόρων, όπως χημειοθεραπευτικούς παράγοντες κατά του καρκίνου του παχέος εντέρου

in vitro

. Το χημικό προφίλ των ώριμων σπόρων κλασμάτων έδειξε ότι τα αποτελέσματα αυτά θα μπορούσαν να καθοδηγείται από υψηλότερο ποσοστό τους από (-) – επικατεχίνη ως τερματικό υπομονάδες σε σύγκριση με το ανώριμο εκχύλισμα σπόρων. Μια άλλη πιθανή εξήγηση θα μπορούσε να ήταν η κατανομή μέσα σε κάθε κλάσμα ενός υψηλότερου ποσοστού των υλικών χαμηλού μοριακού βάρους στις ώριμοι σπόροι από ανώριμους σπόρους.

Η τρέχουσα μελέτη έδειξε ότι οι πιο δραστικά κλάσματα που επηρεάζουν τη βιωσιμότητα των Caco-2 ήταν F2 και F3. Ωστόσο, αν οι επιδράσεις αυτές εμφανίστηκαν μέσω εξωκυτταρικών σηματοδότησης ή μετά την πρόσληψη των υπολογιστών δεν είναι γνωστή. Περαιτέρω μελέτες δικαιολογείται να καθοριστεί η εντερική απορρόφηση των κλασμάτων PC σε φυσιολογική εντερική κυτταρικές σειρές. δοκιμασία TheMTT είναι ένα έμμεσο μέτρο της βιωσιμότητας των κυττάρων με βάση την μεταβολική δραστηριότητα. Η μείωση της κυτταρικής βιωσιμότητας που παρατηρήθηκε στην παρούσα μελέτη θα μπορούσε να αποδοθεί σε μια επίδραση επί του κυτταρικού κύκλου ή τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Ως εκ τούτου, οι πρόσθετες μελέτες για τη διερεύνηση του κυτταρικού κύκλου, του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και των δραστηριοτήτων κυτταρικό θάνατο (αννεξίνη V /PI χρώση, ανάλυση απελευθέρωσης της LDL, της κασπάσης-3 και Bcl-2 ποσοτικοποίηση) θα μπορούσε να παρέχει στοιχεία για τον αντίκτυπο των συγκεκριμένων μεγεθών των υπολογιστών oncell σηματοδότησης. κλάσματα δοκιμές PC σε άλλες κυτταρικές σειρές παχέος εντέρου (φυσιολογικών και νεοπλασματικών) μπορεί να αποκλείσει γενική τοξικότητα και να παρέχουν περαιτέρω απόδειξη των δυνατοτήτων του υπολογιστή.

Εν κατακλείδι, χρειάζονται περαιτέρω μελέτες δικαιολογείται να καθοριστεί το μοριακό μηχανισμό της F2 και F3 σε κυτταρικά μονοπάτια που συνδέονται με την κολονική νεοπλασία. Ζευγάρι εκχυλίσματα σπόρων PC δεν έχουν μόνο οι πιθανές χρήσεις στην ανθρώπινη υγεία, αλλά alsoin τη σειρά πρόσθετη αξία στο κρασί παραγωγής της βιομηχανίας, όπως οι ώριμοι σπόροι σταφυλιών είναι τα κύρια υποπροϊόντα της οινοποίησης. Τα δεδομένα μας παρέχει πειστικές αποδείξεις ότι ο συνδυασμός κλάσματα PC και 5-FU μπορεί να είναι ένας πιθανός χημειοπροφυλακτική παράγοντα σε σχήματα θεραπείας του καρκίνου του παχέος εντέρου? Ωστόσο, περαιτέρω επιβεβαιωτικές

in vitro

απαιτούνται μελέτες με διαφορετικές κατηγορίες φαρμάκων χημειοθεραπείας ακολουθούμενη από

in vivo

μοντέλο καρκίνου δοκιμές για να καθοριστεί καλύτερα το δυναμικό ρόλο των υπολογιστών σπόρους σταφυλιών κατά του καρκίνου του παχέος εντέρου.