Abstract

Ιστορικό

υποξία σε καρκίνους έχει ως αποτέλεσμα την προς τα πάνω ρύθμιση της υποξίας επαγώγιμου παράγοντα 1 (HIF-1) και ένα microRNA, HSA-miR-210 (MIR-210) η οποία είναι σχετίζονται με πτωχή πρόγνωση.

Μέθοδοι και Εκτίμηση

ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές γραμμές και όγκους, βρήκαμε ότι miR-210 στόχους, η μιτοχονδριακή θείο ικρίωμα πρωτεΐνη σίδηρο ISCU, απαιτούνται για τη συναρμολόγηση του σιδήρου clusters θείου, συμπαράγοντες για τα βασικά ένζυμα που εμπλέκονται στον κύκλο του Krebs, μεταφορά ηλεκτρονίων, και το μεταβολισμό του σιδήρου. Down ρύθμιση του ISCU ήταν η κύρια αιτία της επαγωγής του αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) σε υποξία. καταστολή ISCU μειωμένη μιτοχονδριακή δραστηριότητα δραστηριότητα και ακονιτάση συγκρότημα 1, προκάλεσε μια στροφή προς γλυκόλυση σε φυσιολογική οξυγόνωση και αυξημένη επιβίωση των κυττάρων. Καρκίνοι με χαμηλή ISCU είχαν χειρότερη πρόγνωση.

Συμπεράσματα

Πρόκληση αυτά τα μεγάλα χαρακτηριστικά γνωρίσματα του καρκίνου δείχνουν ότι μια ενιαία microRNA, του miR-210, μεσολαβεί ένα νέο μηχανισμό προσαρμογής στην υποξία, με τη ρύθμιση μιτοχονδριακή λειτουργία μέσω του μεταβολισμού σύμπλεγμα σιδήρου-θείου και την παραγωγή ελευθέρων ριζών

Παράθεση:. Favaro Ε, Ramachandran Α, McCormick R, Gee Η, Blancher C, Crosby M, et al. (2010) microRNA-210 Ρυθμίζει μιτοχονδριακού Free Radical απόκρισης στην υποξία και Krebs Cycle στα καρκινικά κύτταρα με τη στόχευση Iron Θείο Cluster Πρωτεΐνη ISCU. PLoS ONE 5 (4): e10345. doi: 10.1371 /journal.pone.0010345

Επιμέλεια: Αντρέι Λ Gartel, Πανεπιστήμιο του Ιλινόις στο Σικάγο (UIC), Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 16 Δεκ 2009? Αποδεκτές: 29 του Μάρτη 2010? Δημοσιεύθηκε: 26, Απριλίου, 2010

Copyright: © 2010 Favaro et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Cancer Research το Ηνωμένο Βασίλειο και οι Φίλοι του Kennington Καρκίνου Ταμείου Έρευνας (EF, ALH, JL), The Wellcome Trust (CB1, CC, IR), Royal College of Surgeons & amp? Βρετανικό Ίδρυμα Ουρολογίας (CB2, RMCC), την Ευρωπαϊκή Ένωση, ACGT (FB), τη Ρόδο Υποτροφιών (HG), Nuffield Ιατρική Fellowship (AR), FIRC Μαθητείας (EF). Biobanking υποστηρίζεται από NIHR Ιατροβιολογικών Ερευνών Κέντρο της Οξφόρδης? Ίδρυμα Έλσα Pardee (ΜΙ), American Cancer Society (MC, ΜΙ). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η υποξία είναι μια σημαντική φυσιολογική διαφορά μεταξύ όγκων και φυσιολογικού ιστού, που δημιουργούνται κυρίως από την ανάπτυξη του όγκου με ανεπαρκή παροχή αίματος και την κατανάλωση οξυγόνου από τα κύτταρα του όγκου [επισκοπείται στο [1]]. Υποξία επάγει μια σύνθετη απάντηση μεταγραφικό κυρίως μέσω της επαγωγής της υποξίας επαγώγιμου παράγοντα 1α (HIF1α), που επηρεάζει πολλές βιολογικές διεργασίες, όπως η γλυκολυτική οδό, την αγγειογένεση, τη ρύθμιση του pH, την εισβολή και την αθανασία [2].

Μια αναδυόμενη παράδειγμα σε υποξία είναι ότι τα μιτοχόνδρια παράγουν αντιδραστικά είδη οξυγόνου, με τη μεσολάβηση μεταφοράς ηλεκτρονίων συνεχίζοντας σε υποξία [3]. Αυτή η οδός ελευθέρων ριζών συμβάλλει στην ρύθμιση προς τα πάνω του HIF [4] και ενισχυμένη ανάπτυξη in vivo [5], αλλά μπορεί επίσης να είναι τοξικά. Μια ποικιλία από οδούς που προκαλούνται από HIF έχουν ήδη αναφερθεί για την προστασία από το τελευταίο αποτέλεσμα, για παράδειγμα επαγωγή της κινάσης πυροσταφυλικής αφυδρογονάσης αναστέλλει το ένζυμο συγκρότημα πυροσταφυλικής αφυδρογονάσης και εμποδίζοντας τη μετατροπή του πυροσταφυλικού σε ακετυλ συνένζυμο Α, το πρώτο βήμα στον κύκλο του Krebs [6] και ενισχύει παραγωγή γαλακτικών [7]. Mitophagy μπορεί να προκληθεί από την ΒΗ3 πρωτεΐνη τομέα BNIP3, [8], και κυτόχρωμα C υπομονάδες οξειδάσης μπορεί να στραφούν σε πιο αποτελεσματικές [9].

Πρόσφατα microRNAs (Mirs), τα οποία είναι μικρά (~ 22 nt) μη-κωδικοποιητική RNAs που ρυθμίζουν την γονιδιακή έκφραση στο μετα-μεταγραφικό αναστέλλοντας τη μετάφραση των mRNA στόχου ή με την επιτάχυνση της υποβάθμισης τους [10], [11], έχουν αναφερθεί ότι επάγονται από υποξία. Ωστόσο, λίγοι από τους στόχους ή τους μηχανισμούς δράσης τους είναι γνωστές [αναθεωρηθούν [12]]. Εμείς και άλλοι [13] έδειξαν miR-210 είναι γερά επάγεται από υποξία σε πολλές κυτταρικές γραμμές, μέσω HIF1α [14]. Αναλύσαμε πρόσφατα την έκφρασή του σε μια σειρά 216 ασθενών με καρκίνο του μαστού και έδειξε έκφραση miR-210 συσχετίστηκε με πολλούς στόχους HIF1α σε επίπεδο mRNA (όπως μετράται με metagene υποξία) και συνδέθηκε έντονα με κακή επιβίωση του ασθενούς. Προέρχεται μόνο από αλγορίθμους αλληλουχία που βασίζεται, μερικές από τις προηγουμένως επικυρωθεί στόχους του miR-210 περιλαμβάνουν Ephrin A3 [15], E2F3 [16], RAD52 [17], CASP8AP2 [18], και ΜΝΤ [19]. Συνδυάσαμε δημοσίως διαθέσιμους αλγόριθμους, με το γονίδιο σύνολα δεδομένων σειρά μας, να προβλέψουν πιθανούς στόχους miR σημασία στα καρκινικά κύτταρα. Βρήκαμε ότι η μιτοχονδριακή συμπλέγματος θείου σιδήρου ομόλογο ISCU ήταν το υψηλότερο προβλεπόμενο στόχο για το miR-210. Πρόσφατα, ISCU έχει ταυτοποιηθεί ως ένας στόχος miR-210 επίσης σε φυσιολογικά πνευμονικά ενδοθηλιακά κύτταρα [20], όπου συμβάλλει στο φαινόμενο Pasteur και ελέγχει το επίπεδο της παραγωγής ROS σε υποξία, γεγονός που υποδηλώνει πιθανή προσαρμοστική της ρόλο στην υποξία στο πλαίσιο της πνευμονικό ενδοθήλιο.

Iron clusters θείου [Fe-S] είναι παρόντες στις ενεργές περιοχές των πολλών ενζύμων και πρωτεϊνών, κρίσιμη για τη δραστηριότητά τους και μπορεί να παράσχει ρύθμιση από οξειδοαναγωγική κατάσταση [21]. Αυτές οι συστάδες συναρμολογούνται στα μιτοχόνδρια [22] από μια σύνθετη σειρά σαπερόνες και ένζυμα, συμπεριλαμβανομένων ISCU, στη συνέχεια, εξάγονται στο κυτταρόπλασμα, όπου είναι συγκεντρωμένα στη σχετική πρωτεΐνη [23]. Μεταξύ των πρωτεϊνών του συμπλέγματος Fe-S που συμμετέχουν είναι πολλά που συνθέτουν τα βασικά συστατικά του συμπλόκου Ι, ΙΙ και ΙΙΙ στα μιτοχόνδρια, και τα συστατικά του κύκλου του Krebs, όπως η ηλεκτρική αφυδρογονάση και ακονιτάση. Η κυτταροπλασματική μορφή της τελευταίας ρυθμίζει το μεταβολισμό του σιδήρου μέσω της λειτουργίας του ως μεταφραστική ρυθμιστική-IRP1 [24].

Στην έκθεση αυτή θα δείξουμε τις μεγάλες βιολογικές επιδράσεις του miR-210 στόχευση ISCU, τα οποία είναι πιθανό να να συμβάλει στην σημαντική φαινοτύπους στον καρκίνο. Με την ρύθμιση προς τα κάτω ISCU, miR-210 μειώνει την δραστηριότητα του Krebs ενζύμου κύκλου και μιτοχονδριακή λειτουργία, παρέχει ένα σημαντικό μηχανισμό για την αυξημένη παραγωγή ελευθέρων ριζών σε υποξία, αυξάνει την επιβίωση των κυττάρων κάτω από υποξία, προκαλεί μια αλλαγή σε γλυκόλυση σε φυσιολογική οξυγόνωση και υποξία (Warburg και Pasteur αποτελέσματα) και προς τα πάνω ρύθμιση της πρόσληψης σιδήρου που απαιτείται για την ανάπτυξη των κυττάρων. Σημαντικά, η ανάλυση των πάνω από 900 ασθενείς με διαφορετικούς τύπους όγκων έδειξε ότι η καταστολή της ISCU συσχετίζεται έντονα με μια χειρότερη πρόγνωση. Αυτή η μελέτη αποκαλύπτει έτσι ένα νέο μονοπάτι δραστηριοποιείται στην υποξική όγκους, με τη μεσολάβηση του miR-210 που επηρεάζουν ένζυμο των μιτοχονδρίων δραστηριότητας και τη δημιουργία ελεύθερων ριζών και τονίζει τη σημασία του μιτοχονδριακού μεταβολισμού σε υποξία βιολογία [3].

Αποτελέσματα

Επιλογή ISCU ως πιθανός στόχος

σύγκριση miR-210 έκφρασης δημοσίευσε σειρά μας του καρκίνου του μαστού [14] με την υποξία metagene μας συγκεντρωμένα mRNAs [25] και σε συνδυασμό αξιολόγηση με αλγόριθμους πρόβλεψης στόχο έδειξε ISCU ήταν το υψηλότερο προβλεπόμενο στόχο, και τα τρία γνωστά γονίδια-στόχους και να καθίσει σε εξαιρετικά κατετάγη θέσεις επιλέχθηκαν από αυτή την προσέγγιση (Υλικό και Μέθοδοι S1, Στήριξη Πίνακας S1).

MiR-210 και ISCU mRNA υποβάλλονται σε αμοιβαία ρύθμιση

σε συμφωνία με τις προηγούμενες εκδόσεις [13], [14], miR-210 ήταν γερά προκλήθηκε σε MCF7 και HCT116 από την υποξία (1% ή 0,1% οξυγόνου) στις 24 και 48 ώρες, με μέγιστη επαγωγή παρατηρείται σε 48 ώρες, σε 0,1% του οξυγόνου (Εικόνα 1Α και Υποστήριξη Εικόνα S1 Α). ISCU mRNA ποσοτικοποιούνται με RTPCR ήταν αντιστρόφως συσχετίζεται με miR-210 και μειώθηκε περισσότερο σημαντικά, όταν τα κύτταρα εκτέθηκαν σε υποξία πιο σοβαρές για μεγαλύτερες περιόδους (Σχήμα 1Β και το Σχήμα Υποστηρικτικά S1B). Παρόμοια με τη ρύθμιση του miR-210 κάτω από υποξία, η καταστολή ISCU στο επίπεδο μεταγραφής εξαρτάται από HIF1α και όχι HIF2α (αριθμητικά στοιχεία S1c και S1D). Επιπλέον, το φαινόμενο της αμοιβαίας ρύθμιση του miR-210 και ISCU από υποξία βρέθηκε επίσης σε πολλές άλλες κυτταρικές σειρές (αριθμητικά στοιχεία S1E και S1F).

Μια

, miR-210 αυξάνεται υπό υποξία, με την πιο ισχυρή επαγωγή δει σε 48 ώρες με 0,1% οξυγόνο.

Β

, υπό τις ίδιες συνθήκες, η ισχυρότερη αρνητική ρύθμιση της ISCU mRNA παρατηρείται σε 48 ώρες με 0,1% οξυγόνο. Τα επίπεδα έκφρασης του miR-210 και ISCU mRNA υπό υποξία είναι σχετικές προς νορμοξικό επίπεδα έκφρασης τους σε 24 ώρες (N). Μέση ± s.e.m. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων παρουσιάζεται (* ρ & lt? 0,05, ** ρ & lt? 0,01, *** ρ & lt? 0.001).

C

, επιμόλυνση των αντι-210 διασώζει μερικώς το υποξική καταστολή των ISCU mRNA και μιμούνται-210 υπερέκφραση μειώνεται ISCU mRNA σε φυσιολογική οξυγόνωση σε 48 ώρες. Η έκφραση του mRNA ISCU είναι σχετική προς το αντι-ctrl σε νορμοξία (Ν). Μέση ± s.e.m. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων παρουσιάζεται (** ρ & lt? 0,01, *** ρ & lt? 0.001).

D

, (

πάνω πίνακα

) πρωτεΐνη ISCU ρυθμίζεται προς τα κάτω σε λύματα MCF7 στο 0,1% του οξυγόνου σε σύγκριση με ορθοξικές λύματα (Ν), όταν η αντι-ctrl είναι επιμολυσμένα για 48 ώρες. Αυτή η μείωση σε επίπεδο πρωτεΐνης υπό συνθήκες υποξίας είναι μερικώς διασωθεί όταν το αντι-210 επιμολύνεται. Υπό ορθοξικές συνθήκες, μιμούνται-210 καταστέλλει τα επίπεδα της πρωτεΐνης ISCU σε σύγκριση με μιμούνται-ctrl επιμολυσμένα κύτταρα.

D

, (

κάτω πάνελ

), ποσοτικοποίηση της διάσωσης του επιπέδου πρωτεΐνης ISCU μετά την επιμόλυνση των αντι-210. Η επιμόλυνση των αντι-210 διασώζει τα επίπεδα πρωτεΐνης ISCU σε MCF7 κατά περίπου 40%. Η μέση ± S.E.M από δύο ανεξάρτητα πειράματα. (* P & lt? 0,05).

Η

Μιμούνται-210 κατέστειλε ISCU σε φυσιολογική οξυγόνωση και αντι-210 ανέτρεψε την καταστολή στην υποξία

ανακεφαλαιώνει η παρατηρούμενη υποξική διέγερση του miR-210 με επιμόλυνση MCF7 και HCT116 με μιμούνται-210 σε φυσιολογική οξυγόνωση. Μιμούνται-210 κατέστειλε τα επίπεδα ISCU mRNA κατά περίπου 60% (Σχήμα 1C και Υποστήριξη Εικόνα S2A). Στη συνέχεια ανταγωνίστηκε miR-210 που προκαλείται από συνθήκες υποξίας με αντι-210. Η αναστολή της ενδογενούς miR-210 διασώζονται σημαντικά την καταστολή της ISCU mRNA, αν και αυτό δεν ήταν πλήρης (Εικόνα 1C και Υποστήριξη Εικόνα S2A).

ISCU έχει δύο κύρια εναλλακτικά ματισμένες ισομορφές. ISCU1 έχει μια εναλλακτική αλληλουχία Ν-τερματικά και εντοπίζεται στο κυτοσόλιο, ενώ ISCU2 σχετίζεται με τα μιτοχόνδρια. Για να επιβεβαιωθεί η ειδικότητα του αντισώματος που χρησιμοποιήθηκε σε αυτές τις μελέτες, τα κύτταρα MCF7 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τα siRNA κατά ISCU. Η ζώνη ανιχνεύονται στα κύτταρα ελέγχου είχε κατασταλεί πλήρως μετά από διαμόλυνση με siISCU1 και siISCU3 (Υποστηρικτικά Σχήμα S2B). Οι δύο ισομορφές της ISCU δεν μπορούσε να διακριθεί με στύπωμα Western των προϊόντων λύσης κυττάρου λόγω της μικρής διαφοράς στο μοριακό βάρος συνολικά. Ωστόσο, η ανοσοαντιδραστική ζώνη εντοπίστηκε τόσο στο κυτοσολικά και μιτοχονδριακή κλάσματα (Υποστηρικτικά Σχήμα S2C). Αυτή η ζώνη αυτή αναφέρεται ως ISCU πρωτεΐνη και το μοριακό βάρος του είναι συμβατά με τα αποτελέσματα του Tong et. al. [23].

Σύμφωνα με την υποξία, MCF7 και HCT116 κύτταρα παρουσίασαν μείωση ISCU πρωτεΐνη, και αυτό επαναλήφθηκε με μιμούνται-210 σε φυσιολογική οξυγόνωση (Σχήμα 1D και Υποστήριξη Εικόνα S2D). Επιπλέον, αντι-210 αντιστραφεί εν μέρει την υποξική καταστολή της πρωτεΐνης ISCU (Σχήμα 1D και Υποστήριξη Εικόνα S2D). Η υποξία κατέστειλε έντονα μια ανταποκριτή λουσιφεράσης που περιέχει την 3’UTR της ISCU που περιελάμβανε την υποθετική θέση στόχο miR-210 και η καταστολή αυτή θα μπορούσε να διασωθεί εν μέρει από παροδική επιμόλυνση των αντι-210 (Σχήμα Υποστηρικτικά S2E). Επιπλέον, μιμούνται-210 κατέστειλε σημαντικά την δραστηριότητα της λουσιφεράσης σε σύγκριση με τον μάρτυρα σε νορμοξικά κύτταρα MCF7 (Υποστηρικτικά Σχήμα S2E). Τέλος, ενώ siRNA κατά ISCU οδήγησε σε αρνητική ρύθμιση των δύο ενδογενών ISCU και μια εξωγενής ετικέτα ISCU λείπει η 3’UTR, μιμούνται-210 με τη μεσολάβηση προς τα κάτω ρύθμιση παρατηρήθηκε μόνο στην ενδογενή πρωτεΐνη ISCU (Υποστηρικτικά Σχήμα S2F). Στο σύνολό τους, αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι το miR-210 ρυθμίζει προς τα κάτω ISCU mRNA και τα επίπεδα της πρωτεΐνης με τη στόχευση 3’ΙΙΤΡ του.

Επιδράσεις της ISCU αρνητική ρύθμιση σε πρωτεΐνες Fe-S

Μια αναμενόμενη επίδραση των αρνητική ρύθμιση της ISCU θα ήταν μια μείωση της παράδοσης Fe-S για τη στόχευση πρωτεϊνών. Ως εκ τούτου αναλύσαμε την επίδραση της καταστολής ISCU επί δύο ένζυμα που απαιτούν Fe-S για δραστηριότητες, ακονιτάση τους και μιτοχονδριακού συμπλόκου Ι siRNA κατά ISCU σημαντικά μειωμένη δραστηριότητα ακονιτάση σε MCF7 και κύτταρα HCT116 σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου σε νορμοξία (Σχήμα 2Α). Μια παρόμοια μείωση στην ακονιτάση δραστηριότητα ήταν εμφανής σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές μετά από την επιμόλυνση του μιμητικού-210 (Εικόνα 2Α). Ωστόσο, δεν υπήρξε καμία αλλαγή στην ακονιτάση επίπεδα πρωτεΐνης, όπως αξιολογείται με κηλίδα Western (Υποστήριξη Εικόνα S3A). Ακονιτάση απεμπλουτισμένου του Fe-S ενεργεί ως μεταφραστική ρυθμιστική-IRP1, για την αύξηση της πρόσληψης του σιδήρου. Βρήκαμε το-210 μιμούνται αυξημένη πρόσληψη σιδήρου στα κύτταρα HCT116 (Υποστήριξη Εικόνα S3b). Υπήρχε επίσης σαφές αναστολή της μιτοχονδριακής σύνθετη δραστηριότητα Ι που επάγεται από μιμούνται-210, στις δύο κυτταρικές σειρές (Σχήμα 2Β). Σε αμφότερες τις κυτταρικές γραμμές ήταν κάτω ρύθμιση της δραστικότητας από υποξία, σε παρόμοιο βαθμό με αυτό που επάγεται από μιμούνται-210 ή με εξάντληση ISCU. Επιπλέον, η επιμόλυνση των αντι-210 σε κύτταρα MCF7 ήταν σε θέση να αυξήσει σημαντικά τη δραστικότητα ακονιτάση σε υποξία (Σχήμα 2C).

Κύτταρα μετεμβολιασμένα με siRNA κατά ISCU ή με μιμητικό-210 δείχνουν μία σημαντική μείωση στην δραστηριότητα του πρωτεΐνη ακονιτάση fe-S (

Α

) και συμπλόκου Ι (

Β

) σε 48 ώρες. Η δραστικότητα εκφράζεται σε σχέση με SCR για siISCU3 ή να μιμούνται-Ctrl για να μιμούνται-210. Μέση ± s.e.m. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων παρουσιάζεται (* ρ & lt? 0,05, ** ρ & lt? 0,01, *** ρ & lt? 0.001).

C

, υποξία μειώνεται ακονιτάση και πολύπλοκη μου δραστηριότητα στην MCF7 και HCT116. Η δραστικότητα εκφράζεται σε σχέση με τη φυσιολογική οξυγόνωση (Ν). Η επιμόλυνση των MCF7 με αντισώματα αντι-210 αυξάνει το επίπεδο της ακονιτάση δραστηριότητας, σε σύγκριση με το αντι-Πίν. Μέση ± s.e.m. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων παρουσιάζεται (* ρ & lt? 0,05, ** ρ & lt? 0,01, *** ρ & lt? 0.001).

D

, σε νορμοξία, MCF7 διαμολυσμένα με μιμητικό-210 έχουν μία αύξηση στην συγκέντρωση γαλακτικού οξέος που εκκρίνεται και μια μείωση στην εξωκυτταρική πυροσταφυλικού μετά από 48 ώρες. Γαλακτικό: πυροσταφυλικό δείκτης δείχνει μια σημαντική αύξηση κάτω από τις ίδιες συνθήκες. Η επιμόλυνση με αντι-210 σε υποξία μειωμένη παραγωγή γαλακτικού σε σύγκριση με αντι-ctrl επιμολυσμένων κυττάρων. Μέση ± s.e.m. των τριών βιολογικών επαναλήψεων εμφανίζεται (* p & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01, *** p & lt? 0.001).

Η

Δεδομένου ότι η μείωση στις ακονιτάση και πολύπλοκη μου δραστηριότητα μειώνει τον κύκλο του Krebs και μιτοχονδριακή λειτουργία ερευνήσαμε αν υπήρχε μια στροφή προς γλυκόλυση και παραγωγής γαλακτικού οξέος. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν μια πολύ σημαντική μείωση του πυροσταφυλικού και την αύξηση των γαλακτικών εις νορμοξία με τον μιμητικό-210, με μια αύξηση στην αναλογία γαλακτικού πυροσταφυλικού. Υπήρξε επίσης μια μείωση στην παραγωγή γαλακτικού με το αντι-210 σε υποξία (Σχήμα 2D).

Επιδράσεις της ISCU αρνητική ρύθμιση για την ελεύθερη ρίζα

παραγωγή

Η απώλεια του Fe-S από συγκρότημα Ι είναι ενδέχεται να επηρεάσει την μεταφορά των ηλεκτρονίων στην αλυσίδα μεταφοράς ηλεκτρονίων και των επιπτώσεων στην παραγωγή ελεύθερων ριζών. Ως εκ τούτου, μετράται η παραγωγή υπεροξειδίου στα MCF7 και κύτταρα HCT116. Σε φυσιολογική οξυγόνωση, και οι δύο κυτταρικές σειρές παρουσίασαν μία σημαντική αύξηση στην παραγωγή ελεύθερων ριζών κατά τη μορφομετατροπή του μιμητικού-210 σε σύγκριση με μιμούνται-αναφοράς (Σχήμα 3Α).

A

σε νορμοξία, επιμόλυνση μιμούνται -210 αυξάνει σημαντικά την παραγωγή υπεροξειδίου σε 48 ώρες όπως μετρήθηκε με χρώση MitoSox. Αντιπροσωπευτικά εικόνες από μιμούνται-210 επιμολυσμένα κύτταρα εμφανίζονται στην κορυφή πάνελ και την μέση τιμή ± s.e.m. Οι περίπου 300 κυττάρων παρουσιάζεται στα πάνελ πυθμένα (***, ρ & lt? 0.001).

B

, έκθεση των κυττάρων σε 0,1% οξυγόνο επί 48 ώρες ενισχύει την παραγωγή του υπεροξειδίου? Το αποτέλεσμα αυτό είναι σχεδόν αντιστράφηκε πλήρως με την επιμόλυνση των αντι-210. Αντιπροσωπευτικά εικόνες από miR-210 επιμολυσμένα φαίνεται στα αριστερά πάνελ και τη μέση τιμή ± s.e.m. Οι περίπου 300 κύτταρα φαίνεται στα δεξιά πάνελ (***, p & lt? 0.001).

C

, ROS παραγωγής που προκαλείται από μιμούνται-210 αναστέλλεται σε κύτταρα MCF7 με cotrasfection με το ISCU2 εκφράζει πλασμίδιο. Μέση ± s.e.m. περίπου 300 κυττάρων παρουσιάζεται (*** ρ & lt? 0.001). Γραμμές = 10 μm.

Η

υποξία σημειώσαμε μία πολύ σημαντική αύξηση της παραγωγής υπεροξειδίου, το οποίο σχεδόν τελείως αντιστράφηκε με αντι-210 (Σχήμα 3Β). Επιπροσθέτως, η επιμόλυνση του κατασκευάσματος ISCU2 αντιστραφεί σχεδόν εντελώς την ελεύθερη ρίζα που προκαλείται από miR-210 (Σχήμα 3C). Αυτό καταδεικνύει ένα σημαντικό νέο μηχανισμό για τη ρύθμιση των ROS σε υποξία, και ότι δεν είναι μια παθητική επίδραση της μειωμένης διαθεσιμότητας οξυγόνου.

Επιδράσεις της miR-210 στην απόπτωση και επιβίωση σε νορμοξία και υποξία

Προηγούμενες μελέτες σε ζύμη έδειξαν τις θανατηφόρες συνέπειες της ομόλογα διαγραφή ISCU [23]. Η έννοια αυτή μας οδήγησε στην διερεύνηση των επιδράσεων της miR-210 επί της απόπτωσης σε νορμοξία και υποξία. Υπήρξε μια εντυπωσιακή διαφορά στις επιδράσεις της mir-210 σε αυτές τις αντίθετες συνθήκες. Σε φυσιολογική οξυγόνωση, μιμούνται-210 αυξήθηκαν σημαντικά απόπτωση όπως μετρήθηκε με χρώση αννεξίνης V, αλλά σε υποξία, ανταγωνισμός της miR-210 αυξημένη απόπτωση (Σχήμα 4Α).

A

, απόπτωση (αννεξίνη V + κύτταρα) μετρήθηκε σε MCF7 (

αριστερά

) και HCT116 (

δεξιά

) κύτταρα επεξεργασμένα με miR-210 αναστολέα ή μιμητικό, μετά από 48 ώρες έκθεση σε 0,1% οξυγόνο ή φυσιολογική οξυγόνωση. Μέση ± s.e.m. είναι αντιπροσωπευτική 3 ανεξάρτητων πειραμάτων (* ρ & lt? 0,05, ** ρ & lt? 0,01, *** ρ & lt? 0.001).

B

, μετά επιμόλυνση κυττάρων MCF7 με περιπλεγμένο LNA ή Mir-210 LNA και εκτέθηκαν σε 0,1% οξυγόνο ή νορμοξία (48 ώρες), τα κύτταρα επανα-επιστρώθηκαν (100 και 500 κύτταρα /φρεάτιο). Μετά από μια 12 ημερών επώαση, οι αποικίες σταθεροποιήθηκαν, χρωματίστηκαν, και τα επιζώντα κλάσματα υπολογίστηκε με βάση την απόδοση επιμετάλλωσης.

C

, επιζώντα κλάσματα υπολογίστηκαν όπως στο (

B

) σε κύτταρα HeLa, τα οποία επιμολύνθηκαν με αντι-ctrl ή αντι-210 (Applied Biosystems /Ambion, Austin, ΤΧ, USA) και εκτέθηκαν σε 0,01% οξυγόνο ή φυσιολογική οξυγόνωση. Σε όλους τους προσδιορισμούς αποικίας, σημαίνει ± s.e.m. είναι αντιπροσωπευτική 2 ανεξάρτητα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν χρησιμοποιώντας 2 διαφορετικές πυκνότητες επιμετάλλωσης. (** P & lt? 0,01, *** p & lt? 0.001).

D

, RT-PCR για ISCU και miR-210 σε ξενομοσχεύματα U87 θεραπεία με αντι-αγγειογενετική θεραπεία (bevacizumab). Σχετική έκφραση ISCU ομαλοποιήθηκε σε β-ακτίνη, miR-210 κανονικοποιημένη για τρία μικρά πυρηνισκικός ελέγχους, RNU43, RNU44 και RNU48. Η μέση έκφραση ± s.e.m. σε 4 ζώα /ομάδα παρουσιάζεται (** ρ & lt? 0,01, *** ρ & lt? 0.001).

Η

Για αξιολόγηση των επιδράσεων της miR-210 επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων υπό συνθήκες υποξίας, χρησιμοποιήθηκε μία κλωνογονική δοκιμασία με ένα κλειδωμένο ανταγωνιστή νουκλεϊκό οξύ (LNA) miR-210 μόριο (Σχήμα 4Β). Παρά το γεγονός ότι το μεγαλύτερο μέρος της μείωσης της ικανότητας κλωνισμού σε υποξία είναι σαφώς μέσω άλλων μηχανισμών, τα αποτελέσματα του αντι-210 οδήγησε σε μειωμένη κλωνογονική επιβίωση σε υποξία, η οποία βρήκαμε επίσης σε μια πιο υποξία-ανθεκτική κυτταρική γραμμή, κύτταρα HeLa (Εικόνα 4C).

In vivo καταστολή της ISCU από υποξία και η κλινική σημασία της έκφρασης ISCU

Ερευνήσαμε αν η έκφραση της γονιδιακής έκφρασης ISCU ρυθμιζόταν in vivo, με τη μελέτη ανθρώπινων καρκινικών ξενομοσχευμάτων. Ξενομοσχεύματα της U87 γραμμή γλοιοβλαστώματος κυτταρική υποβλήθηκαν σε θεραπεία με τον αναστολέα VEGF Avastin (Bevacizumab), ή με έλεγχο του οχήματος. Ανοσοϊστοχημεία αυτών των όγκων αποδεικνύεται Avastin προκαλούμενη νέκρωση, η έκφραση των HIF1α και HIF γονιδίων στόχων CA9 και VEGF (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αναλύσαμε το mRNA από τους όγκους και διαπίστωσε σημαντική προς τα πάνω ρύθμιση του miR-210 και αμοιβαία ρύθμιση προς τα κάτω των ISCU mRNA (Σχήμα 4D).

Τα μόνα διαθέσιμα στοιχεία για τη σύγκριση του miR-210 με ISCU RNA σε δείγματα ανθρώπινου όγκου είναι από το στήθος και το κεφάλι μας και σειρές στο λαιμό. Υπήρξε μια πολύ σημαντική αντίστροφη σχέση του miR-210 να ISCU έκφραση σε 216 ασθενείς με καρκίνο του μαστού (rho = -0,39, ρ & lt? 0.001) (Σχήμα 5Α,

αριστερά

). Υπήρξε μια πολύ σημαντική αντίστροφη συσχέτιση του ISCU με περισσότερο επιθετικούς όγκους υψηλού βαθμού (p = 0.008) και μια φτωχή υποτροπή επιβίωσης χωρίς (Σχήμα 5Α,

δεξιά

). Σε μια πολυπαραγοντική ανάλυση, ISCU παρέμεινε σημαντική (p = 0,028), μαζί με τους κόμβους, το βαθμό και την ηλικία (Στήριξη Πίνακας S2). Σε 2 άλλες σειρές του καρκίνου του μαστού (Rotterdam [26], 286 περιπτώσεις: Uppsala [27]? 235 περιπτώσεις) χαμηλή ISCU ήταν κακό προγνωστικό παράγοντα για την πολυμεταβλητή ανάλυση (Βάθρα S3 και S4) (p = 0,038 και 0,015 αντίστοιχα). Στη σειρά Uppsala [27] θα μπορούσαμε να εκτιμήσει τον πρόδρομο miR-210 με τη χρήση των ιχνηλατών Affymetrix (Affymetrix U133b, 230710_at) και αυτό έδειξε επίσης μία αντίστροφη σχέση του προδρόμου για ISCU και φτωχή επιβίωση (Σχήμα 5Β). Στη σειρά του καρκίνου μας κεφαλής και λαιμού [25], υπήρξε μια αντίστροφη σχέση αυτών των μεταβλητών (Σχήμα 5C,

αριστερά

). Σε μια σειρά με τις δημοσιευμένες συνέχεια, Chung et al [28], υπήρχε μια ισχυρή συσχέτιση των καταστέλλεται ISCU με κακή έκβαση (Σχήμα 5C,

δεξιά

). Ανάλυση της έκφρασης σε φυσιολογικούς ιστούς έναντι καρκινικών ιστών σε σύνολα δεδομένων 9 όγκου χρησιμοποιώντας Oncomine έδειξε σε όλα τα καταστολή μελέτες σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς (Υποστήριξη Εικόνα S4).

Μια

, miR-210 qPCR έκφρασης (DDCT) παρίσταται ως συνάρτηση της έκφρασης ISCU mRNA (συστοιχίες Illumina) στη σειρά καρκίνου του μαστού Οξφόρδη (

αριστερά

), και, χωρίς υποτροπή επιβίωση για δείγματα με υψηλή ISCU και low split ISCU από διάμεση στην Οξφόρδη σειρά καρκίνου του μαστού (

δεξιά

).

B

, η έκφραση του mRNA της μεταγραφής που φιλοξενεί τον πρόδρομο miR-210 χαράσσεται ως συνάρτηση του μέτρου έκφρασης ISCU mRNA με Affymetrix U133b και U133a αντίστοιχα στη σειρά καρκίνου του μαστού Ουψάλα (

αριστερά

), και υποτροπής επιβίωση ελεύθερη για δείγματα με υψηλή ISCU και χαμηλή ISCU χωρίσει από την μέση της σειράς καρκίνου του μαστού Ουψάλα (

δεξιά

).

C

, έκφραση miR-210 qPCR (DDCT) παρίσταται ως συνάρτηση της έκφρασης ISCU mRNA (συστοιχίες Affymetrix) στη σειρά καρκίνου του Oxford-Μάντσεστερ HNSCC όπου ISCU αρχικά βρέθηκε να συνδέεται σε υποξία (

αριστερά

), και της υποτροπής επιβίωση ελεύθερη για δείγματα με υψηλή ISCU και χαμηλή ISCU χωρίσει από την μέση τιμή στο Chung et al. σειρά HNSCC (

δεξιά

).

Η

Συζήτηση

Οι μελέτες μας δείχνουν σαφώς miR-210 ρυθμίζει την έκφραση των ISCU RNA και πρωτεϊνών χρησιμοποιώντας την μιμούνται σε φυσιολογική οξυγόνωση στον καρκίνο κυτταρικές γραμμές. ISCU mRNA και η πρωτεΐνη κατεστάλησαν υπό υποξία και το αποτέλεσμα αυτό ήταν σημαντικά αντιστράφηκε με αντι-210. Η ελλιπής αναστροφή συνεπάγεται άλλοι μηχανισμοί εμπλέκονται επίσης στην ISCU ρύθμιση προς τα κάτω και είναι γνωστό ότι η μετάφραση του RNA μειώνεται κατά την υποξία μέσω του εκτυλίχθηκε απάντηση πρωτεΐνη [29].

Μια μείωση στην ISCU θα επηρεάσει την ικανότητα των κυττάρων να δημιουργούν συμπλέγματα Fe-S και στη συνέχεια θα επηρεάσει τη δραστηριότητα των ενζύμων που απαιτούν αυτά τα τμήματα συν-παράγοντα. Δείξαμε ότι ακονιτάση, ένα ένζυμο κλειδί της ενδιάμεσο μεταβολισμό που απαιτεί συστάδες Fe-S, είχαν μειωμένη δραστηριότητα μετά από μείωση ISCU. Ιδιαίτερη σημασία για τον καρκίνο είναι ο διπλός ρόλος του ακονιτάση ως IRP1 όταν στερείται σύμπλεγμα του Fe-S. IRP1 ρυθμίζει τη σταθερότητα και τη μετάφραση του mRNA για τρανσφερρίνης και η φερριτίνη [24]. Οι επιπτώσεις της απώλειας της ακονιτάση θα ήταν η τροποποίηση του μεταβολισμού του σιδήρου και να αυξήσουν την πρόσληψη του, η οποία είναι κρίσιμη για την ανάπτυξη του όγκου. Πράγματι, παρατηρήσαμε μια συσσώρευση ενδοκυτταρικού σιδήρου κατά την επιμόλυνση των κυττάρων με μιμούνται-210 ή siISCU.

Οι μεταλλάξεις στο ISCU να προκαλέσει γαλακτική οξέωση σε άτομα μετά από μέτρια άσκηση, παρέχοντας ισχυρή απόδειξη για τη σημασία αυτού του στόχου διατηρώντας αποτελεσματική δραστηριότητα κύκλο του Krebs [30], [31]. Μια σχετική επίδραση από τα μειωμένα επίπεδα ISCU και την επακόλουθη μείωση της δραστηριότητας κύκλο του Krebs ήταν ένας διακόπτης για γλυκόλυση και την αυξημένη παραγωγή γαλακτικού οξέος. Αυτό προκλήθηκε σε φυσιολογική οξυγόνωση με miR-210 και ως εκ τούτου είναι παρόμοια με την επίδραση Warburg. Αυτό μπορεί να είναι ενδιαφέρον σε καταστάσεις όπου miR-210 προς τα πάνω ρύθμιση εμφανίζεται στην φυσιολογική οξυγόνωση. Για παράδειγμα, αυτό έχει αποδειχθεί σε ασθενείς με νεφρική καρκινικές κυτταρικές γραμμές με μεταλλάξεις στην πρωτεΐνη νοη Hippel Lindau [14]. Αντίθετα, στην υποξία, αντι-210 μείωσε την παραγωγή γαλακτικού, αντιστρέφοντας το αποτέλεσμα Pasteur (διακόπτης να γλυκόλυση σε υποξία).

συμπλέγματα σιδήρου-θείου είναι αναπόσπαστο για την αποτελεσματική δράση του μιτοχονδριακή αλυσίδα μεταφοράς ηλεκτρονίων. Δείξαμε ότι συγκρότημα Ι δραστηριότητα μειώνεται κάτω από υποξία και κατόπιν την επιμόλυνση των μιμούνται-210 σε νορμοξία. Εκτός συγκρότημα Ι, Συγκροτήματα ΙΙ και ΙΙΙ περιέχουν επίσης συστάδες Fe-S και εμείς εικάζουν ότι οι δραστηριότητες των τριών συγκροτημάτων θα μπορούσε να μειωθεί κατά τρόπο που εξαρτάται από το miR-210. Μια εξασθενημένη αλυσίδα μεταφοράς ηλεκτρονίων θα οδηγήσει σε αύξηση της παραγωγής ελευθέρων ριζών, ως συνέπεια της διαρροής ηλεκτρονίων. Ειδικότερα, συγκρότημα III είναι ο κύριος συντελεστής για ROS στα υποξία [32] και συμπλόκου Ι και II συνεισφέρουν περίπου το 30% του ROS [33]. Σε ορθοξικές συνθήκες, επιμόλυνση μιμούνται-210 οδήγησε σε αυξημένη παραγωγή ελευθέρων ριζών. Επιπλέον, η ορθοξικές παραγωγή ROS που παρατηρούνται με μιμητικές-210 ήταν σχεδόν εντελώς προληφθούν με μια ανθεκτική κατασκευή ISCU miR-210. Αντίθετα, στην υποξία, παρατηρήσαμε ότι η επαγωγή του miR-210 συνδέθηκε με μια αύξηση στην ROS, και αυτό θα μπορούσε να αντιστραφεί σχεδόν πλήρως από αντι-210. Αυτό παρέχει μία σημαντική νέα σύνδεση για να εξηγήσει τον μηχανισμό της επαγωγής ROS σε υποξία, η οποία έχει αναφερθεί από διάφορες ομάδες [33] και μπορεί να ευθύνεται για την πλειοψηφία των υποξικών επαγωγή ROS. Η ROS απελευθερώνεται σε υποξία έχουν δείξει να λειτουργούν ως O

2 αισθητήρες, που ενεργούν ως παράγοντες που ενεργοποιούν HIF [32] σηματοδότησης, μεσολαβούν την ανάπτυξη του όγκου in vivo μέσω ενός HIF εξαρτώμενο μηχανισμό [5] και παρατείνει τη διάρκεια ζωής των κυττάρων [34] .

σε αντίθεση με την υποξική διέγερση των ROS και την ανακούφιση με αντι-210 που παρατηρήθηκε στη μελέτη μας, Chan et al. δεν θα μπορούσε να μετρήσει καμία σημαντική αλλαγή στην παραγωγή ROS μετά από έκθεση σε υποξία, και έδειξε ένα ανεστραμμένο τάση όταν miR-210 ανεστάλη [20]. Ο λόγος για αυτή τη διαφορά είναι ασαφές, αλλά μπορεί ενδεχομένως να αντανακλά μια υποκείμενη διαφορά στον καρκίνο σε σύγκριση με φυσιολογικά ενδοθηλιακά κύτταρα.

Τέλος, αναλύσαμε το αν υπήρχε κάποια συσχέτιση της ISCU αρνητική ρύθμιση στην πρωτοβάθμια ανθρώπινους καρκίνους με υποξία και το αποτέλεσμα, και βρέθηκε ένα επιθετικό φαινότυπο συνδέθηκε με αυτή την αλλαγή σε μελέτες πάνω από 1000 ασθενείς, και προς τα κάτω ρύθμιση σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς σε πολλούς τύπους όγκων.

εν κατακλείδι, έχουμε βρει ένα σημαντικό νέο μηχανισμό για την απόκριση των καρκινικών κυττάρων να υποξία, συντονίζεται από το miR-210 καταστολή της ISCU και την επακόλουθη μείωση της δραστηριότητας των πρωτεϊνών σύμπλεγμα σιδήρου-θείου (Στήριξη Εικόνα S5). Εκτός από ακονιτάση, πολλά μεταβολικά ένζυμα απαιτούν συσπειρώσεις Fe-S για τη δραστηριότητά τους που υποδηλώνει ότι η προς τα κάτω ρύθμιση των ISCU θα έχει εκτεταμένες συνέπειες για το μεταβολισμό των κυττάρων. Μεταλλάξεις σε πολλά από αυτά τα ένζυμα συμπλέγματος Fe-S συμπεριλαμβανομένων ηλεκτρικό αφυδρογονάση υπομονάδων SDHD, SDHB και SDHC [35] και φουμαρικά υδρατάσης [36] εμπλέκονται σε υπερπολλαπλασιαστικές διαταραχές και καρκίνος, επιδεικνύοντας έναν σημαντικό σύνδεσμο μεταξύ του κυτταρικού μεταβολισμού και την επακόλουθη μετατροπή και αναδεικνύει ένα ρόλο για HIF, μέσω ενός άξονα miR-210-ISCU σε αυτές τις διαδικασίες. Εκτός από τα μεταβολικά ένζυμα, διάφορα ένζυμα επιδιόρθωσης του DNA [37] με συμπλέγματα Fe-S είναι δυνητικά στόχους. Δείξαμε προηγουμένως miR-210 μπορεί να ανιχνευθεί σε ένα αυξημένο επίπεδο στον ορό ασθενών με καρκίνο [38] και επομένως θα είναι ενδιαφέρον αν αντανακλούν την μεταβολική κατάσταση του πρωτογενούς καρκίνου τους και ως εκ τούτου θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν σε μελλοντικές επιλογή θεραπείας. Η ρύθμιση των διακριτών βιολογικών οδών από ISCU μειορύθμιση υποδεικνύει μία πιθανή θεραπευτική προσέγγιση των συνθετικών θνησιμότητας σύμφωνα με την οποία τα φάρμακα που διαμεσολαβούν βλάβη του DNA επισκευάστηκε με το σύμπλεγμα σιδήρου-θείου περιέχει ελικάσες Rad3 [39] ή αναιμία Fanconi [37] θα μπορούσε να είναι η χρήση σε συνέργεια με τους αναστολείς PARP , ή αναστολείς της γλυκόλυσης [36] και glutaminolysis στην υποομάδα των ασθενών με υψηλότερα επίπεδα miR-210.

Αν και το έργο αυτό ήταν στο πλαίσιο της προετοιμασίας, τρεις νέους στόχους miR-210 έχουν επικυρωθεί, δηλαδή HOXA1, HOXA9 και FGFRL1 , και η ανάλυση των ξενομοσχευμάτων όγκου που προέρχεται από καρκίνο κυτταρικές σειρές που υπερεκφράζουν το miR-210 προτείνεται μια πιθανή συμμετοχή των miR-210 στην έναρξη της ανάπτυξης του όγκου [40].

Υλικά και Μέθοδοι

κυττάρων πολιτισμού

η έκθεση των κυττάρων σε υποξία (1%, ή 0,1% ή 0,01% οξυγόνο) διεξήχθη σε έναν επωαστήρα υποξία (MiniGalaxy Α, RS Biotech, Σκωτία, Ηνωμένο Βασίλειο), χρησιμοποιώντας μια συνεχή ροή από έναν υγροποιημένο ενός μίγματος 95% N

2 και 5% CO

2.

miRNA μιμούνται ή αναστολέας επιμόλυνση

η επιμόλυνση διεξήχθη με Dharmacon αντι-210, miR-210 μιμούνται, ή ολίγο ελέγχου (Thermo Scientific, CO, USA), σε μια τελική συγκέντρωση 20 ηΜ, με χρήση Optimem μέσο ελεύθερο ορού και αντιδραστηρίου Oligofectamine (αμφότερα από την Invitrogen, Paisley, UK) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

Επιμόλυνση και λουσιφεράση δοκιμασίες

λουσιφεράσης πλασμίδια αναφοράς που περιέχει 3 ‘αμετάφραστες περιοχές (UTR) του ISCU ή τυχαία γονιδιωματική αλληλουχία (έλεγχος) ελήφθησαν από τον ηλεκτρικό πίνακα Genomics (Menlo Park, CA. Ένα πλασμίδιο έκφρασης λουσιφεράσης Renilla (φορέας pRL-ΤΚ, Promega, Southampton, UK) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος επιμόλυνσης.

δοκιμασίες δραστηριότητας Enzyme

ακονιτάση δραστικότητα χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία Bioxytech ακονιτάση-340 (Oxis International Inc, Beverly Hills, CA). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως% της δραστικότητας σε σύγκριση με το μάρτυρα.

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε δοκιμασία για δραστικότητα συγκρότημα Ι με τη χρήση του Mitoprofile συγκρότημα Ι Rapid Elisa Kit (MitoSciences, Eugene, OR, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως% της δραστικότητας σε σύγκριση με το μάρτυρα.

γαλακτικά και πυροσταφυλικό μετρήσεις

γαλακτικά και πυροσταφυλικού προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας κιτ από Instruchemie (Delfzijl, Ολλανδία).

MitoSOX χρώση

μιτοχονδριακή υπεροξειδίου προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας MitoSOX Red (Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Οι εικόνες ελήφθησαν με ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο (Radiance 2000, Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, Herts, UK), και αναλύθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [41].

Η γονιδιακή έκφραση εξόρυξης δεδομένων

έχουμε προηγουμένως προέρχεται ένα metagene υποξίας στην πρωτοβάθμια καρκίνου κεφαλής και τραχήλου ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα [HNSCC] [25]. Συστάδες γονίδια αντι-συσχετίζεται με την έκφραση miR-210 σχηματίστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25]? Spearman συσχέτιση χρησιμοποιήθηκε για τον εντοπισμό γονιδίων σημαντικά αντι-συσχετιζόμενων miR-210 και ψευδείς ρυθμό ανακάλυψης (FDR) εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας μια μέθοδο μετάθεση με βάση [42]. Γονίδια με FDR & lt? Επιλέχθηκαν 0.05. Χρησιμοποιήσαμε επίσης 5 αλγόριθμους πρόβλεψης στόχο: – TargetScanHuman (https://www.targetscan.org/)? Pictar [43]? Miranda (https://microrna.sanger.ac.uk/)? DianaLab (https://diana.cslab.ece.ntua.gr/), miRDB (https://mirdb.org/miRDB/).

Επιβίωση αναλύσεις και άλλες στατιστικές αναλύσεις

Spearman συσχέτιση χρησιμοποιήθηκε για τις συνεχείς μεταβλητές και δοκιμή Wilcox για τις κατηγορικές μεταβλητές.