Αφηρημένο

Rho ΘΤΡάσες αποτελούν βασικούς ρυθμιστές της εισβολής καρκινικών κυττάρων και επομένως αποτελούν ελκυστικούς στόχους για ο σχεδιασμός των αντικαρκινικών παραγόντων. Αρκετές στρατηγικές έχουν αναπτυχθεί για να διαμορφώσουν αυξημένη δραστηριότητά τους, κατά την πρόοδο του καρκίνου. Είναι ενδιαφέρον ότι, καμία από αυτές τις προσεγγίσεις έλαβε υπόψη την ύπαρξη της γνωστής ανταγωνιστική σχέση μεταξύ RhoA και Rac1. Στην παρούσα μελέτη, συγκρίναμε πρώτα την διεισδυτικότητα της συλλογής των ορθοκολικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές με τις δραστηριότητές τους RhoA, Rac1 και Cdc42. Αξιοσημείωτη μείωση των ενεργών Cdc42 και Rac1 συσχετίζεται με την υψηλή επεμβατική δυναμικό των κυτταρικών σειρών που έχουν καταρτισθεί από μεταστατικές θέσεις του ορθοκολικό αδενοκαρκίνωμα (LoVo, SKCo1, SW620 και ΟοΙο205). Αντίθετα, κανένας συσχετισμός μεταξύ της δραστικότητας RhoA και διεισδυτικότητα ανιχνεύθηκε, ενώ η δραστηριότητα του τελεστή της κινάσης ROCK της ήταν υψηλότερη σε καρκινικές κυτταρικές σειρές με μια πιο επεμβατική φαινότυπο. Επιπλέον, διεισδυτικότητα σε αυτές τις κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου συσχετίστηκε με ένα τυπικό γύρο και μορφολογία διόγκωση. Στη συνέχεια εξετάστηκε εάν η θεραπεία με PDGF για την αποκατάσταση της Cdc42 και Rac1 δραστηριότητες ή /και με Y27632, ένα χημικό αναστολέα της ROCK, θα μπορούσε να μειώσει την ικανότητα εισβολής των κυττάρων SW620. Η ένωση των δύο θεραπείες μειώθηκε ουσιαστικά την επεμβατική δυναμικό των κυττάρων SW620 και αυτή η επίδραση συνοδεύτηκε από απώλεια διόγκωση της μεμβράνης, η αποκατάσταση μιας πιο επιμήκεις κύτταρο μορφολογία και την εκ νέου εγκατάσταση του Ε-καδερίνης εξαρτώμενη ενώσεις προσφύσεως. Η μελέτη αυτή ανοίγει το δρόμο για την ανάπτυξη θεραπευτικών στρατηγικών στην οποία οι διαφορετικοί ρυθμιστές Rho ΟΤΡάσης συνδυάζονται για να διαμορφώσουν το cross-talk μεταξύ Rho ΘΤΡάσες και ειδικά τη συμβολή τους στη μεταστατική εξέλιξη

Παράθεση:. De Toledo M, Anguille C , Roger L, Roux P, Gadea G (2012) Συνεταιρισμός Anti-Επεμβατική Επίδραση της Cdc42 /Rac1 Ενεργοποίηση και ROCK Αναστολή σε SW620 ορθοκολικού καρκίνου κύτταρα με αυξημένα διόγκωση δραστηριότητας. PLoS ONE 7 (11): e48344. doi: 10.1371 /journal.pone.0048344

Επιμέλεια: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 23, 2012? Αποδεκτές: 24 Σεπ 2012? Δημοσιεύθηκε: 7 του Νοέμβρη 2012

Copyright: © 2012 de Toledo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε από την Ligue Nationale contre le Καρκίνο (Équipe labellisée), Σύλλογος pour la Recherche contre le Καρκίνο (contrat 17029), Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, και το Le εθνικό Κέντρο Επιστημονικής Έρευνας της Γαλλίας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Rho ΟΤΡάσες είναι απαραίτητα για πολλές λειτουργίες των κυττάρων, συμπεριλαμβανομένης της εμπορίας μεμβράνη, μεταγραφική ενεργοποίηση, απόπτωση, την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, την κυτταρική πολικότητα, την προσκόλληση και τη μετανάστευση [1], [2], [3], [4]. Πράγματι, η απορρύθμιση τους έχει σημαντικές συνέπειες σε πολλές φυσιο-παθολογικές διεργασίες [5]. Ειδικότερα, Rho ΟΤΡάσες είναι κρίσιμα ρυθμιστές της εξέλιξης του καρκίνου μέσω διαμόρφωσης του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, την απόπτωση, την εισβολή και τη μετάσταση σχηματισμός [6].

Ο ρόλος των τριών Rho GTPases σε διμερείς διαστάσεων μετανάστευση έχει χαρακτηριστεί. Rac1 οδηγεί κινητικότητα με την προώθηση του σχηματισμού lamellipodium και προεξοχές των κυττάρων [7]. RhoA σηματοδότηση ενεργοποιεί την οικογένεια ROCK των κινασών, προωθώντας το σχηματισμό του Actin ινών στρες και την παραγωγή της ακτομυοσίνης συσταλτικής δύναμης που απαιτείται για την απόσυρση του οπίσθιου κυττάρου σε κίνηση μεσεγχυματικά τύπου [8], [9]. Cdc42 ενεργοποιείται στην αιχμή της ελασματοπόδια και απαιτείται για τη συναρμολόγηση ARP2 /3-εξαρτώμενο ακτίνη [10]. Επιπλέον, η ύπαρξη μιας ανταγωνιστικής σχέσης μεταξύ Rac1 και RhoA εξηγεί το πολωμένο μετακίνηση κατά την κατευθυνόμενη μετανάστευση των κυττάρων. Είναι ενδιαφέρον ότι αυτές οι δύο πρωτεΐνες καταστέλλουν το καθένα άλλες δραστηριότητες και φαινοτύπους [11], [12], [13]. Συγκεκριμένα, RhoA και Rac1 δραστηριότητες χωρικά και χρονικά ελεγχόμενη για την προώθηση δυναμικές αλλαγές του κυτταροσκελετού κατά την μετανάστευση. δραστηριότητα Rac1 περιορίζεται στο προπορευόμενο άκρο να εκτείνονται προεξοχές στο μπροστινό μέρος, ενώ RhoA οδηγεί συστολή στο πίσω μέρος του κυττάρου αποδημία. RhoA και Rac1 εντοπισμένη αποτελέσματα είναι προφανώς καθοδηγείται από συγκεκριμένο ρυθμιστικών μηχανισμών. Πράγματι, Wildenberg και συνεργάτες έδειξαν ότι η Rac1 εξαρτώμενη ρύθμιση προς τα κάτω της δραστικότητας RhoA ελέγχεται από ακεραιότητα adherens διασταύρωση [14].

Ωστόσο, οι μηχανισμοί που μεσολαβούν κινητικότητα των καρκινικών κυττάρων είναι διαφορετικά σε πιο πολύπλοκες τρισδιάστατες μήτρες . Στο πλαίσιο αυτό, ορισμένα καρκινικά κύτταρα υιοθετήσει μια amoeboid μορφή κίνησης [15], [16] που χαρακτηρίζεται από ένα στρογγυλεμένο, μορφολογία διόγκωση των κυττάρων, την ανεξαρτησία της από εξωκυττάρια πρωτεάσες και η απαίτηση των υψηλών επιπέδων ακτινομυοσίνης συσταλτικότητας κατάντη του RhoA-ROCK μονοπάτι για να παραμορφώσει το εξωκυτταρικό κίνηση μήτρας και κίνησης των κυττάρων [17], [18], [19], [20]. Μελέτες που χρησιμοποιούν έμβια μικροσκοπία έχουν δείξει ότι η αμοιβαδοειδή μετακίνηση των κυττάρων του όγκου μπορεί να είναι πολύ ταχεία in vivo (~ 5 μm /min [21]). Αντιστρόφως, η κίνηση μεσεγχυματικά τύπου χαρακτηρίζεται από ένα επίμηκες μορφολογία, που προκύπτουν από τη συναρμολόγηση Rac1 εξαρτώμενη ακτίνης στην αιχμή. Αυτοί οι δύο τρόποι μετακίνησης είναι μεταξύ μετατρέψιμα και καρκινικά κύτταρα μπορούν να υποβληθούν σε amoeboid-μεσεγχυματικών και μεσεγχυματικά-amoeboid μεταβάσεις [15], [18], [20] που φαίνεται να ελέγχεται από έναν ανταγωνισμό μεταξύ των οδών σηματοδότησης Rac1 και RhoA. Η ανακάλυψη του ROCK-ρυθμίζονται Rac1 ΟΤΡάσης-ενεργοποίηση πρωτεϊνών (με κενά) βοήθησε την κατανόηση του πώς η οδός RhoA /ROCK μπορεί να καταστείλει Rac1 μεσολάβηση ακτίνης πολυμερισμού [14], [22], [23]. Σε κάθε περίπτωση, αυτή η πλαστικότητα μπορεί να επιτρέψει στα κύτταρα να προσαρμόσουν τη λειτουργία τους της μετανάστευσης στα διαφορετικά περιβάλλοντα και ως εκ τούτου μπορεί να είναι ευεργετικό σε καρκινικά κύτταρα.

Εκτός από το σφιχτό χωροχρονική ρύθμιση των διαφόρων Rho ΟΤΡάσες, επίσης η δραστηριότητα των ανάντη και κατάντη εταίρους τους ελέγχεται αυστηρά. Πράγματι, τα αποτελέσματα Rho ΟΤΡάσης στη συμπεριφορά των κυττάρων μπορεί να διαμορφωθεί και μέσω ειδικών αλληλεπιδράσεων με τις ρυθμιστικές αρχές (π.χ., γουανίνη παράγοντες ανταλλαγής νουκλεοτιδίων, GEFs) για τη ρύθμιση φαινομενικά ασυμβίβαστες διαδικασίες. Για παράδειγμα, DOCK10, ένα Cdc42 GEF, είναι ένας βασικός παράγοντας στην amoeboid μετανάστευσης μέσω μιας DOCK10-Cdc42-ρΑΚ2 σηματοδοτικό μονοπάτι. Κατά συνέπεια, η έκφραση του ενεργοποιημένου Cdc42 επάγει μια μεσεγχυματικά-αμοιβαδοειδή μετάβασης. Ωστόσο, η αναστολή της Cdc42 οδηγεί σε απώλεια των μεσεγχυματικών μορφολογία, γεγονός που υποδηλώνει ότι Cdc42 παίζει ρόλο επίσης σε μεσεγχυματικά τύπου μορφολογία μέσω διαφορετικών οδών που θα μπορούσε να εμπλέξει άλλες GEFs [24]. Επιπλέον, σε δύο διαστάσεων μοντέλα καλλιέργειας, RhoA ενεργοποιείται όχι μόνο σε συσταλτική ουρά, αλλά επίσης και στην αιχμή. Πράγματι, η δραστηριότητα RhoA παραμένει σε υψηλά επίπεδα βολάν μεμβράνη στην εκκολαπτόμενη ελασματοπόδια [25]. Αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν ότι RhoA εμπλέκεται στη ρύθμιση της ruffling Rac1 εξαρτώμενη μεμβράνη. Πράγματι, RhoA συνεργάζεται με Rac1 να προκαλέσει βολάν μεμβράνη μέσω της πρόσληψης ειδικών mDia τελεστή της. Στο σύνολό τους, αυτά τα στοιχεία δείχνουν σαφώς ότι η cross-talk μεταξύ αυτών Rho ΘΤΡάσες αποκλείει την υπόθεση ότι κάθε ένα από αυτά είναι υπεύθυνα για μία μόνο λειτουργία της μετανάστευσης.

Rho ΘΤΡάσες ρυθμίζει επίσης ακτίνη του κυτταροσκελετού οργάνωση και την προσκόλληση των κυττάρων. Ε-καδερίνη, ένα και μόνο ανοιγμάτων trans-μεμβράνης γλυκοπρωτεΐνης, δημιουργεί homophilic αλληλεπιδράσεις με γειτονικά μόρια Ε-καδερίνης που εκφράζονται από γειτονικά κύτταρα, σχηματίζοντας έτσι τον πυρήνα των επιθηλιακών ενώσεις προσφύσεως [26], [27]. Μέσω κυτταροπλασματική περιοχή, Ε-καδερίνης συνεργάτες του με ένα αριθμό πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένων τριών κατενίνες (άλφα, βήτα, και p120), τα οποία συνδέουν Ε-καδερίνης με την ακτίνη κυτταροσκελετό. Το σύμπλοκο Ε-καδερίνη-κατενίνης και η υποκείμενη ακτίνη κυτταροσκελετό υποβληθεί σε μια σειρά από αναδιοργανώσεις που ελέγχονται από το Rho ΘΤΡάσες Rac1 και RhoA και αυτό το αποτέλεσμα στην επέκταση και την ολοκλήρωση της προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου. Κατά την άποψη του ρόλου της στη διατήρηση ενώσεις προσφύσεως και στενό δεσμό της με Rho ΘΤΡάσες, απώλεια E-cadherin θα μπορούσε να προωθήσει τη μετάσταση, ενεργοποιώντας το πρώτο βήμα του μεταστατικού καταρράκτη: την απώλεια των επαφών κυττάρου-κυττάρου. Πράγματι, η μειωμένη Ε-καδερίνης έκφρασης έχει συσχετισθεί με εισβολή όγκου, μεταστατική διάδοση και την κακή κλινική πρόγνωση [28], [29], [30].

Ως εκ τούτου, Rho ΘΤΡάσες φαίνεται να είναι ελκυστικό στόχοι για τη θεραπεία του καρκίνου . Αρκετές στρατηγικές έχουν αναπτυχθεί για την εξουδετέρωση Rho ΟΤΡάσης απορρύθμιση σηματοδότησης κατά την διάρκεια ογκογένεσης, όπως η άμεση στόχευση των δραστηριοτήτων Rho ΟΤΡάσης [31], [32], ή την αναστολή της κατάντη τελεστές, όπως ROCK, με ελπιδοφόρα αποτελέσματα στην πρόληψη της διεισδυτικότητας

in vivo

[33]. Μια εναλλακτική στρατηγική συνίσταται στην στόχευση των ρυθμιστικών αρχών των Rho ΟΤΡάσης ενεργή κατάσταση, όπως GEFs, τα κενά και οι αναστολείς νουκλεοτιδίου γουανίνης διάστασης (GDIs) [32] [34]. Παρά το γεγονός ότι οι αναστολείς Rho ΟΤΡάσης δεν έχουν ακόμη υιοθετηθεί ευρέως για κλινική χρήση, πιθανή αξία τους ως αντικαρκινικά φάρμακα εξακολουθούν να οδηγεί σημαντική φαρμακευτική έρευνα και ανάπτυξη [35]. Ωστόσο, το cross-talk μεταξύ Rho ΘΤΡάσες και λειτουργική δυαδικότητα τους, η οποία αποτελεί βασικό χαρακτηριστικό της ρύθμισης τους, δεν έχουν εξεταστεί από τις στρατηγικές αυτές στοχεύουν.

Στην παρούσα μελέτη, συγκρίναμε την πρώτη της εισβολής μιας συλλογής ορθοκολικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές με τις δραστηριότητές τους RhoA, Rac1 και Cdc42. Αναφέρουμε ότι η υψηλή επεμβατική δυναμικό του ορθοκολικού καρκίνου κυττάρων με αυξημένη δραστικότητα διόγκωση συσχετίζεται τόσο με αυξημένη ενεργοποίηση ROCK και μειωμένη Cdc42 και Rac1 δραστηριότητες. Συνδυασμένη θεραπεία με PDGF για την αποκατάσταση της Cdc42 και Rac1 λειτουργία και με Y27632 να αναστέλλουν ROCK μειωμένη συνεργικά την επιθετική πιθανότητα τέτοιων ορθοκολικού καρκίνου κύτταρα. Αυτό παρέχει νέες ιδέες για την ανάπτυξη αντικαρκινικών παραγόντων που μπορούν να συνδυάζουν την ταυτόχρονη αναστολή της ROCK και την εκ νέου ενεργοποίηση της Cdc42 και Rac1 να ενεργεί για δύο συγκεκριμένες και κοινές πορείες.

Αποτελέσματα

Το επίπεδο της ενεργός Cdc42 και Rac1, αλλά όχι του RhoA, μειώνεται σε μεγάλο βαθμό επεμβατικές ορθοκολικού κυτταρικές σειρές

η μετάβαση σε μια ιδιαίτερα κινητικό φαινότυπο είναι ένα χαρακτηριστικό του διηθητικού καρκίνου κυττάρων και μία ένδειξη ότι ένας όγκος θα μπορούσε μεταστάσεις. Για να ταξινομήσει το διηθητικό τους δυναμικό, συγκρίναμε την ικανότητα μιας συλλογής ορθοκολικού καρκίνου κυτταρικών γραμμών να εισβάλει Matrigel, μια μήτρα τρισδιάστατου που μοιάζει με τη βασική μεμβράνη και μιμείται το σύμπλοκο εξωκυτταρικό περιβάλλον βρίσκεται σε πολλούς ιστούς. έτσι εκτιμήσαμε την διεισδυτικότητα των δύο κανονικά κύτταρο του κόλον γραμμές (FHC και con), του παχέος εντέρου κυτταρική γραμμή καρκινώματος HCT-116, από τις κυτταρικές γραμμές Caco2, LS174T, SW480, ΗΤ29 και WiDr που προήλθαν από ορθοκολικό αδενοκαρκινώματα και των τεσσάρων κυτταρικών γραμμές (LoVo, SKCo1, SW620 και ΟοΙο205) ιδρύθηκε από μεταστατικές θέσεις του παχέος αδενοκαρκίνωμα. Οι τέσσερις κυτταρικές γραμμές που εκδίδονται από μεταστατικές θέσεις εμφάνισαν την υψηλότερη ικανότητα να εισβάλλουν Matrigel, υποδεικνύοντας ότι αυτά τα κύτταρα έχουν διατηρήσει την ικανότητά τους να εισβάλλουν ακόμη και μετά έφτασαν δευτερογενή θέση τους (Σχήμα 1α).

(α) τα αποτελέσματα του δοκιμασία Matrigel εισβολής για τις διαφορετικές κυτταρικές γραμμές καρκίνου του παχέος εντέρου. Τα κύτταρα που είχαν εισβάλει μέσω Matrigel ανιχνεύθηκαν στην κάτω πλευρά του φίλτρου με φθορισμό και μετρήθηκαν όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Οι τιμές είναι οι μέσες +/- SD (ράβδοι σφάλματος) τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (Β) Τα κύτταρα λύθηκαν και το επίπεδο του GTP-δεσμευμένη Cdc42 μετρήθηκε όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Cdc42-GTP καταβυθίστηκε με GST-ΡΑΚ1 και συνολική Cdc42 στα προϊόντα λύσης ανιχνεύθηκαν με ανοσοστύπωμα με αντίσωμα αντι-Cdc42. Οι τιμές είναι οι μέσες +/- SD (ράβδοι σφάλματος) τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (Γ) Τα κύτταρα λύθηκαν και το επίπεδο του GTP-δεσμευμένη Rac1 μετρήθηκε όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Rac1-GTP καταβυθίστηκε με GST-ΡΑΚ1 και συνολική Rac1 στα προϊόντα λύσης ανιχνεύθηκαν με ανοσοστύπωμα με αντίσωμα αντι-Rac1. Οι τιμές είναι οι μέσες +/- SD (ράβδοι σφάλματος) τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (Δ) Τα κύτταρα λύθηκαν και το επίπεδο του GTP-δεσμευμένη RhoA μετρήθηκε όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. RhoA-GTP καταβυθίστηκε με GST-RBD και συνολική RhoA στα προϊόντα λύσης προσδιορίστηκαν με ανοσοστύπωμα με αντίσωμα αντι-RhoA. Οι τιμές είναι ο μέσος όρος +/- SD (ράβδοι σφάλματος) τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Στη συνέχεια, αξιολόγησε κατά πόσο εισβολής και το επίπεδο των ενεργών Rho GTPases, που αποτελούν βασικά συστατικά του επεμβατική μηχανημάτων, συσχετίστηκαν με τη σύγκριση του επιπέδου GTP-δεσμευμένη Cdc42, Rac1 και RhoA στις διάφορες ορθοκολικό καρκίνο κυτταρικές γραμμές. Μια έντονη μείωση στην ενεργό Cdc42 και Rac1 παρατηρήθηκε στις πιο επεμβατική ορθοκολικό καρκίνο κυτταρικές γραμμές (Σχήμα 1β και 1γ). Αντιστρόφως, το επίπεδο της GTP-δεσμευμένη RhoA δεν συσχετιζόταν με κύτταρο διεισδυτικότητα. Ειδικότερα, μια ισχυρή δραστικότητα RhoA παρατηρήθηκε σε HCT-116 κύτταρα, τα οποία χαρακτηρίζονται από χαμηλή ικανότητα να εισβάλλουν Matrigel (Εικόνα 1δ). Οι διακυμάνσεις στο επίπεδο της δραστικής GTPases στις διάφορες κυτταρικές γραμμές δεν οφείλονταν σε μια διαφορά στην έκφραση της πρωτεΐνης τους, καθώς αυτό ήταν σχεδόν ισοδύναμο σε όλες τις κυτταρικές σειρές (δεν φαίνεται). Συμπεραίνουμε ότι, με τις δοκιμαζόμενες ορθοκολικό καρκίνο κυτταρικές γραμμές, το επίπεδο των ενεργών Cdc42 και Rac1, αλλά όχι του RhoA, συσχετίζεται αντίστροφα με την ικανότητα εισβολής των κυττάρων αυτών (τα αντίστοιχα

τιμές ρ

: 0,0008, 0,0003 και 0,134 ).

κοφιλίνη φωσφορυλίωση αυξάνει με την ικανότητα εισβολής των διαφορετικών ορθοκολικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές

το εύρημα ότι η δραστικότητα RhoA δεν ήταν συνδεδεμένη με την ικανότητα εισβολής των διαφορετικών καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές δεν είναι σε συμφωνία με η συχνή εμπλοκή του μονοπατιού RhoA σε καρκινικών κυττάρων εισβολής, ιδίως μέσω της ενεργοποίησης της ROCK τελεστή κινάσης της. Έχουμε έτσι δοκίμασαν την υπόθεση ότι, σε αυτές τις κυτταρικές γραμμές, το επίπεδο ενεργοποίησης ROCK μπορεί να μην αντανακλούν το επίπεδο της GTP-δεσμευμένη RhoA. Για το σκοπό αυτό, αξιολογήσαμε την ενεργοποίηση ROCK στα μελετημένα ορθοκολικό καρκίνο κυτταρικές γραμμές με ποσοτικοποίηση της κατάσταση φωσφορυλίωσης του υποστρώματος ROCK κοφιλίνη, η οποία ελέγχει τον σχηματισμό προσανατολισμένων δέσμες ακτομυοσίνης II στο σώμα κυττάρου [36]. Φωσφορυλιωμένη κοφιλίνη ανιχνεύθηκε με ανοσοστύπωμα με ειδικά αντι φωσφορυλιωμένο αντισώματα κοφιλίνη και η έκφρασή της ομαλοποιήθηκε με εκείνη του συνολικού κοφιλίνη (Σχήμα 2α). Κοφιλίνη ήταν ασθενώς φωσφορυλιωμένο στην κανονική con γραμμή κυττάρων κόλου όπως επίσης και στα ελάχιστα επεμβατική κυτταρικές σειρές HCT-116 και SW480 σε σύγκριση με τα πιο ιδιαίτερα επεμβατική κυτταρικές σειρές LoVo, SW620, ΟοΙο205 και SKCo-1, στο οποίο φωσφορυλιώθηκε κοφιλίνη ήταν πολύ άφθονος. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το επίπεδο της δραστικής ROCK, αλλά όχι του ενεργού RhoA, συνδέεται με τον καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρο διεισδυτικότητα.

Τα κύτταρα λύθηκαν και η ποσότητα φωσφορυλιωμένου κοφιλίνη και της συνολικής κοφιλίνη που υπάρχουν στα προϊόντα λύσης αναλύθηκε με ανοσοκηλίδωση. (Α) Εκπρόσωπο ανοσοαποτύπωση. (Β) Ποσοτικοποίηση της φωσφορυλίωσης κοφιλίνη. Ιστογράμματα αντιπροσωπεύουν τις αναλογίες του σήματος φωσφο-κοφιλίνη επί του συνολικού σήματος κοφιλίνη. Οι τιμές είναι ο μέσος όρος +/- SD (ράβδοι σφάλματος) τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Συνδυασμένη αποκατάσταση της Cdc42 και Rac1 δραστηριότητες και την αναστολή της κυτταρικής διόγκωση μείωση ROCK και επάγουν επιμήκυνση κυττάρου

ROCK-εξαρτώμενη ακτομυοσίνης συσταλτικότητας είναι κρίσιμης σημασίας για τη μορφολογία των κυττάρων. Υψηλή δραστηριότητα ROCK μπορεί επίσης να προκαλέσει δυναμική διόγκωση της μεμβράνης. Για να ελέγξετε αν η ενεργοποίηση ROCK στις διάφορες κυτταρικές σειρές παχέος συσχετίστηκε με τη μορφολογία των κυττάρων, που παρακολουθείται κύτταρα χρησιμοποιώντας διαφορική αντίθεση παρέμβασης μικροσκοπίας time-lapse. Εκτιμώντας ότι HCT-116 και τα κύτταρα SW480 διατηρούνται κάποια επιθηλιακά χαρακτηριστικά (σχήμα επίμηκες, επαφές κυττάρου-κυττάρου), SW620 κύτταρα ήταν σφαιρικά και επέδειξαν έντονη περιφερική δράση διόγκωση (Σχήμα 3α, άνω πάνελ: ακόμα φωτογραφίες από το βίντεο S1, S2, S3, S4, S5, και S6), σε συμφωνία με αυξημένα συσταλτικότητα ακτομυοσίνης λόγω πολύ υψηλότερη δραστικότητα ROCK τους σε σύγκριση με τις άλλες δύο κυτταρικές γραμμές (βλέπε Σχήμα 2β). Για να ελέγξετε αν η παρατηρούμενη μείωση της Cdc42 και Rac1 και αύξηση της δραστηριότητας ROCK και οι δύο εμπλέκονται στην εξέλιξη του όγκου σε πιο προχωρημένα στάδια, θα αντιμετωπίζονται αυτά τα τρία του παχέος εντέρου καρκινικές κυτταρικές σειρές με PDGF να ενεργοποιήσετε ξανά Cdc42 και Rac1 ή /και με Y27632 στο μπλοκ ΒΡΆΧΟΣ. Συνδυασμένη PDGF και Y27632 θεραπεία είχε ως αποτέλεσμα την απόκτηση ενός πιο επιθηλιακών φαινότυπο με επιμήκη κύτταρα, ιδιαίτερα στην κυτταρική σειρά SW620 (σχήμα 3α, κάτω πάνελ). Πράγματι, αυτά τα κύτταρα, τα οποία ήταν στρογγυλά και με αυξημένα διόγκωση της μεμβράνης κατά την έναρξη της συνδυασμένης θεραπείας, σταμάτησε διόγκωση και πεπλατυσμένο έξω (Εικόνα 3b και βίντεο S7). Ποσοτικοποίηση του αριθμού των επιμήκων κυττάρων μετά τις διάφορες θεραπείες αποδεικνύεται σαφώς ότι η συνδυασμένη αποκατάσταση της Cdc42 και Rac1 δραστηριότητες και την αναστολή της ROCK είχε ένα προσθετικό αποτέλεσμα (Σχήμα 3c). Για την παρακολούθηση PDGF-εξαρτώμενη ενεργοποίηση του Cdc42 και Rac1 στις τρεις κυτταρικές γραμμές, μετρήσαμε το επίπεδο της GTP-δεσμευμένη Cdc42 και Rac1 (σχήμα 3d και ε). PDGF δεν επηρέασε σημαντικά την ποσότητα του GTP-δεσμευμένη Cdc42 και Rac1 σε HCT-116 και SW480 κύτταρα, ενώ αυξήθηκε σαφώς στα κύτταρα SW620. Επιπλέον, ελέγξαμε επίσης Y27632 επίδραση στην ελαφριά αλυσίδα μυοσίνης 2 (MLC2) φωσφορυλίωση, ως ένδειξη του ROCK-εξαρτώμενη συσταλτικότητα και διαπίστωσε ότι φωσφορυλιωμένη MLC2 ήταν μειωμένη σε Y27632 επεξεργασμένα SW620 κύτταρα (Σχήμα 3F). Όλα μαζί αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι η συνδυασμένη θεραπεία με PDGF και Y27632 για την αποκατάσταση της δραστηριότητας Cdc42 και Rac1 και αναστέλλουν την ROCK μπορεί να μετατρέψει επεμβατική, κύτταρα διόγκωση SW620 σε μια πιο επιθηλιακά φαινότυπο.

(α) Ακόμα DIC time-lapse εικόνες κύτταρα επεξεργασμένο ή όχι (ελέγχου) με PDGF και Y27632 (από βίντεο S1, S2, S3, S4, S5 και S6). Πλαίσια δείχνουν την αλλαγή στη μορφολογία (από γύρο σε ένα πιο επίμηκες σχήμα) των κυττάρων κατά την έναρξη των ταινιών. Ράβδοι κλίμακας, 10 μm. (Β) DIC time-lapse εικόνες των SW620 κυττάρων πριν και μετά τη θεραπεία με PDGF + Y27632 (από το βίντεο S7). Πλαίσια δείχνουν την αλλαγή στην κυτταρική μορφολογία στους χρόνους που υποδεικνύονται. Ράβδοι κλίμακας, 10 μm. (Β) Ποσοτικοποίηση επιμήκυνση κυττάρου. Ένα κύτταρο κρίθηκε επίμηκες όταν η μεγαλύτερη διάστασή της ήταν δυο φορές η συντομότερη ένα και όταν έδειξε τουλάχιστον μία προεξοχή [23]. Ιστογράμματα αντιπροσωπεύουν το ποσοστό των κυττάρων που επιμηκύνεται SW620 μετά από θεραπεία ή όχι (έλεγχος) με PDGF και /ή Y27632 για 24 ώρες. Οι τιμές είναι ο μέσος όρος +/- SD (ράβδοι σφάλματος) τριών ανεξάρτητων πειραμάτων και η στατιστική σημαντικότητα υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το ζευγαρωμένο t-test. * P ) κίνηση [23]. Ωστόσο, μπορεί επίσης να RhoA μεσολαβούν στην ενεργοποίηση Rac1 και στην συνέχεια σχηματισμό ελασματοπόδια μέσω πρόσληψης mDia, η οποία συνδέεται με βολάν μεμβράνη [43], [46]. Λαμβάνοντας υπόψη αυτό το διπλό ρόλο, η απουσία συσχέτισης μεταξύ της ενεργοποίησης RhoA και κυτταρική εισβολή αναφέρουμε εδώ δεν αποτελεί έκπληξη. δραστηριότητα ROCK είναι πιο πιθανό να συνδέεται με τη διεισδυτικότητα, ενώ η επιρροή της RhoA ταλαντεύεται μεταξύ mDia και ενεργοποίηση ROCK, ανάλογα με τον τύπο κυττάρου. Κατά συνέπεια, τα αποτελέσματα της εξωένζυμο C3, έναν αναστολέα Rho, και του Y27632, ενός αναστολέα ROCK, είναι πολύ διαφορετικά. Σε LPA-διεγερμένα κύτταρα Swiss 3Τ3, Y27632, αλλά δεν C3, θεραπεία αυξημένη δραστηριότητα Rac1 και προκαλείται από το σχηματισμό σούφρα μεμβράνης [43].

Τέλος, ένα από τα κύρια ευρήματα της μελέτης μας είναι ότι ROCK, αλλά δεν RhoA , δραστηριότητα σχετίζεται με διεισδυτικότητα στη συλλογή μας από κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου. Αυτό εγείρει το ερώτημα του μονοπατιού (ες) σηματοδότησης που ενεργοποιεί επιλεκτικά ROCK στις πιο επεμβατική κυτταρικές σειρές. Μπορούμε να υποθέσουμε ότι και άλλοι ενεργοποιητές ROCK μπορεί να ανακουφίσει δραστηριότητα RhoA κατά την απουσία του. Για παράδειγμα, RhoC, το οποίο προωθεί κυρίως διεισδυτικότητα [47], [48], [49], [50], [51], διεγείρει και αλληλεπιδρά με ROCK πιο έντονα από RhoA [52]. Σε συμφωνία με αυτό, η έκφραση και ενεργοποίηση RhoC συμπίπτουν με EMT ορθοκολικού καρκίνου κυττάρων που σχετίζεται με την αυξημένη επιθετικότητα κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης [53]. Όλα μαζί αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι Rho ΘΤΡάσες μπορεί να λειτουργήσει σε μια αντισταθμιστική, αλλά και διαφορετικές, τρόπο [54]. Ωστόσο, οι γνώσεις μας για τη συμμετοχή των Rho GTPases στην εισβολή του καρκίνου εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από την υπερέκφραση ιδιοσυστατικά ενεργοποιημένες μορφές. Αυτό μπορεί να διαταράξει τη φυσική ισορροπία των ρυθμιστικών αρχών και τελεστές Rho ΟΤΡάσης. Για παράδειγμα, η έκθεση των κυττάρων σε υψηλά επίπεδα δραστικού RhoA θα πρέπει να ευνοεί τη σηματοδότηση μέσω ROCK, ενώ τα χαμηλά επίπεδα της RhoA προώθηση σηματοδότησης μέσω mDia [52]. Κατά συνέπεια, η υπερ-έκφραση ενός ιδιοσυστατικά ενεργοποιημένη μορφή του RhoA θα προωθήσει ROCK-εξαρτώμενη διεισδυτικότητα και θα μπορούσε να επισκιάζει την ανταγωνιστική μονοπάτι mDia. Επιπλέον, συσσωρεύοντας στοιχεία δείχνουν ότι το ΟΤΡάσης έκβαση σηματοδότησης δεν εξαρτάται μόνο από τις τελεστές, αλλά και για τα GEFs που θα οδηγούν τα GTPases και τις τελεστές σε στενή εγγύτητα, δημιουργώντας μικρο-περιοχές με υψηλές τοπικές συγκεντρώσεις των τελεστών [55] [56] . Κατά συνέπεια, η δραστηριότητα RhoA δεν μπορούν να εξηγήσουν πλήρως για την ενεργοποίηση ROCK. Επιπλέον, η δραστηριότητα του αργού RhoA μπορεί επίσης να μην είναι πλήρως ενδεικτική των οποίων μονοπάτι σηματοδότησης (δηλαδή, GEFs και συναφείς τελεστές) ασχολείται.

Εν κατακλείδι, η εργασία μας παρέχει σημαντικές πληροφορίες για το πώς Rho ΘΤΡάσες επιπτώσεις ενεργοποίησης του παχέος όγκου εξέλιξης και ακριβέστερα για την ικανότητα εισβολής των κυττάρων του παχέος διόγκωση. κεντρικό εύρημα μας είναι η αλληλεπίδραση μεταξύ ROCK και δραστηριοτήτων Cdc42 και Rac1. Αυτά τα μονοπάτια σηματοδότησης έχουν αντίθετες επιπτώσεις στην εισβολή και τις διακυμάνσεις τους είναι εν μέρει αμοιβαία συναφή, αν και τα δεδομένα μας υποδηλώνουν επίσης την ύπαρξη ανεξάρτητων εγγενή εισφορών. Αυτό θα είχε σημαντικές συνέπειες για τις στρατηγικές για την ανάπτυξη νέων αντικαρκινικών φαρμάκων. Εστιάζοντας μόνο για τα συνολικά αυξημένα επίπεδα έκφρασης του Rho GTPases στον καρκίνο μπορεί να οδηγήσει σε θεραπευτική μειονεκτήματα, αν δεν ληφθούν αντίθετες επιδράσεις τους υπόψη. Πράγματι, το σχεδιασμό εξαιρετικά επιλεκτική Rho ΟΤΡάσης διαμορφωτές σηματοδότησης και συνδυάζοντας τα αποτελέσματά τους θα μπορούσαν να προσφέρουν μεγαλύτερες θεραπευτικές δυνατότητες.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρικής καλλιέργειας και αντιδραστηρίων

Οι φυσιολογικό κύτταρο του παχέος εντέρου γραμμές FHC , con και οι ορθοκολικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές HCT116, Caco2, LS174T, SW480, ΗΤ29, WiDr, LoVo, SKCo1, SW620 και ΟοΙο205 αγοράστηκαν από την ATCC και καλλιεργήθηκαν όπως συνιστάται. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 40 ng /ml ΡϋΟΡ-ΒΒ (Upstate) και 10 μΜ Y27632 (Calbiochem). προϊόντα λύσης πρωτεΐνης ελήφθησαν με σύντομη κατεργασία με υπερήχους των κατεργασμένων κυττάρων σε 2 χ Laemmli ρυθμιστικού διαλύματος.