Αφηρημένο

σιμβαστατίνη και λοβαστατίνη οι στατίνες χρησιμοποιούνται παραδοσιακά για τη μείωση των επιπέδων χοληστερόλης του ορού . Ωστόσο, υπάρχει στοιχεία που υποδεικνύουν το δυναμικό χημειοθεραπευτικών χαρακτηριστικά τους στον καρκίνο. Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε βιοπληροφορική ανάλυση των διαθέσιμων στο κοινό δεδομένων προκειμένου να προσδιοριστούν συστηματικά τα γονίδια που εμπλέκονται στην αντοχή σε κυτοτοξικά αποτελέσματα αυτών των δύο φαρμάκων στο NCI60 πίνακα κυτταρική γραμμή. Χρησιμοποιήσαμε τα διαθέσιμα φαρμακολογικά δεδομένα για όλες τις κυτταρικές σειρές NCI60 να χαρακτηρίσει σιμβαστατίνη ή λοβαστατίνη ανθεκτικά και ευαίσθητα κυτταρικές σειρές, αντίστοιχα. Στη συνέχεια, θα πραγματοποιηθεί σε ολόκληρο το γονιδίωμα δοκιμές ενιαίο δείκτη περίπτωση ελέγχου ένωση για την λοβαστατίνη και η σιμβαστατίνη ανθεκτικά και ευαίσθητα κύτταρα χρησιμοποιώντας διαθέσιμα στο κοινό Affymetrix 125K SNP γονιδιωματική των δεδομένων τους. Τα αποτελέσματα στη συνέχεια αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας μεθοδολογία RNAi. Μετά τη διόρθωση του

ρ

τιμές για πολλαπλές δοκιμές χρησιμοποιώντας False Discovery Rate, τα αποτελέσματά μας εντοπίστηκαν τρία γονίδια (

NRP1

,

COL13A1

,

MRPS31

) και έξι γονίδια (

EAF2

,

ANK2

,

AKAP7

,

STEAP2

,

LPIN2

,

PARVB

) που σχετίζονται με την αντίσταση στη σιμβαστατίνη και λοβαστατίνη, αντίστοιχα. Λειτουργική επικύρωση χρήση RNAi επιβεβαίωσε ότι η αποσιώπηση του

EAF2

έκφραση διαμορφώνεται η ανταπόκριση των HCT-116 κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου σε δύο στατίνες. Εν ολίγοις, έχουμε χρησιμοποιηθεί με επιτυχία τα δημόσια διαθέσιμα στοιχεία για τις κυτταρικές σειρές NCI60 να εκτελέσει μελέτες σύνδεσης ολόκληρου του γονιδιώματος για σιμβαστατίνη και λοβαστατίνη. αποτελέσματά μας έδειξαν τα γονίδια που εμπλέκονται στην κυτταρική απάντηση σε αυτές τις στατίνες και μελέτες siRNA επιβεβαίωσε τον ρόλο του

EAF2

ως απάντηση σε αυτά τα φάρμακα σε HCT-116 κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου

Παράθεση:. Σάββας S , Azorsa DO, Jarjanazi Η, Ιμπραήμ-Zada Ι, Γκονζάλες IM, Arora S, et al. Πάνελ (2011) Cancer NCI60 Κυτταρικής Γραμμής Δεδομένων και RNAi Βοήθεια Ανάλυση Προσδιορίστε EAF2 ως διαμορφωτής της σιμβαστατίνης και λοβαστατίνης Response σε HCT-116 κύτταρα. PLoS ONE 6 (4): e18306. doi: 10.1371 /journal.pone.0018306

Συντάκτης: Eric Bernhard, Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 27, Ιούλ, 2010? Αποδεκτές: τρίτης Μαρτίου 2011? Δημοσιεύθηκε: 4 του Απρ 2011

Copyright: © 2011 Σάββας et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από θεσμικούς ερευνητικά κονδύλια ΓΤΕ και επιχορήγηση από την ίδρυση του καρκίνου του προστάτη (H. Ozcelik). Υ.Η. Choi υποστηρίζεται από μια υποτροφία από την καναδική Μαστού Ίδρυμα Καρκίνου – Οντάριο κεφάλαιο. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

σιμβαστατίνη και λοβαστατίνη είναι δύο στατίνες χρησιμοποιούνται παραδοσιακά για τη μείωση των επιπέδων χοληστερόλης του ορού. Οι στατίνες είναι αναστρέψιμοι αναστολείς του ενζύμου μικροσωματικής HMG-CoA αναγωγάσης, που μετατρέπει HMG-CoA σε μεβαλονικό οξύ. Αυτό είναι ένα περιοριστικό του ρυθμού στάδιο στη βιοσύνθεση νωρίς χοληστερόλης. Στους ανθρώπους, η αναστολή της HMG-CoA αναγωγάσης με στατίνες μειώνει την ενδοκυτταρική βιοσύνθεση της χοληστερόλης, η οποία οδηγεί στη συνέχεια σε μεταγραφικά προς τα πάνω ρυθμισμένη παραγωγή του μικροσωματικής HMG-CoA αναγωγάσης και κυτταρικής επιφάνειας υποδοχείς LDL. Ωστόσο, η σιμβαστατίνη και λοβαστατίνη διαφέρουν σε ορισμένες σημαντικές πτυχές σχετικά με το βαθμό του μεταβολισμού και του αριθμού των ενεργών και ανενεργών μεταβολιτών [1]. Πιο πρόσφατα, οι στατίνες έχουν αποκτήσει σημαντική σημείωση ως αντικαρκινικοί παράγοντες με βάση προκλινικά στοιχεία αντιπολλαπλασιαστική τους, προ-αποπτωτικών, αντι-επεμβατική και ραδιοευαισθητοποίησης ιδιότητες [2], [3], [4], [5], [6]. Ο ρόλος των στατινών στο μεταβολισμό της χοληστερόλης μπορούν να εξηγήσουν το δυναμικό κυτταροτοξική χαρακτηριστικά τους.

Η χοληστερόλη είναι ένα βασικό λιπίδιο που συσσωρεύεται στην μεμβράνη μικρο-περιοχών ονομάζονται λιπίδια σχεδίες. Λιπιδικές σχεδίες παίζουν ένα σημαντικό ρόλο στη μεταγωγή σημάτων που ενεργοποιεί την κυτταρική ανάπτυξη, την επιβίωση και πολλές άλλες διεργασίες που συσχετίζονται με τον καρκίνο. συσσώρευση της χοληστερόλης σε όγκους έχει αποδειχθεί από πολλές μελέτες στο παρελθόν [7], [8], [9], [10]. Συσσώρευση χοληστερόλης εντός λιπιδικών σχεδιών μικρο-τομείς της μεμβράνης του πλάσματος μπορεί να παίξει ένα ρόλο στην διέγερση οδούς μεταγωγής σήματος. Freeman και του Σολομώντα (2004) έχουν προτείνει ότι η αύξηση της χοληστερόλης σε μεμβράνη των καρκινικών κυττάρων του προστάτη, η οποία μπορεί να προκύψει από την αύξηση των επιπέδων κυκλοφορίας ή από την απορρύθμιση της ενδογενούς σύνθεσης, να οδηγήσει στη συγχώνευση των τομέων σχεδία [7]. Αυτό με τη σειρά του θα μπορούσε να έχει συνέπειες για το διαχωρισμό των θετικών ρυθμιστών των ογκογόνων σηματοδότησης εντός σχεδίες, διατηρώντας αρνητικές τις ρυθμιστικές αρχές στο ρευστό κλάσμα μωσαϊκό μεμβράνης [7]. Προτάθηκε επίσης ότι η μελέτη της λειτουργίας των λιπιδικών σχεδιών σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη θα μπορούσε να παράσχει κατανόηση του ρόλου των κυκλοφορούντων χοληστερόλης σε κακοήθη ανάπτυξη και για το δυναμικό σχέση μεταξύ διατροφής και επιθετική ασθένεια. Ως εκ τούτου, ο χαρακτηρισμός των πρωτεϊνών εντός μικρο πεδία πλούσια σε χοληστερόλη μπορεί να χρησιμεύσει για την καλύτερη αποσαφήνιση των σηματοδοτικών μονοπατιών, το οποίο θα οδηγήσει στην ταυτοποίηση νέων βιολογικών δεικτών για την εξέλιξη της νόσου και νέους στόχους για τη θεραπεία του καρκίνου.

Μεταβλητή ανταπόκριση στη θεραπεία φαρμάκου , όπως η αντίσταση, είναι ένα σοβαρό πρόβλημα υγείας. Διάφοροι παράγοντες, όπως η ηλικία και η διατροφή, εμπλέκονται σε χημειοθεραπευτικά αντίσταση επηρεάζοντας την προσρόφηση του φαρμάκου, τη μεταφορά, μεταβολισμό, και φυσιολογικές δράσεις τους. Γενετικοί παράγοντες εμπλέκονται επίσης στην αντοχή φαρμάκου. Για παράδειγμα, οι γενετικές παραλλαγές που προκαλούν μεταβολές στην λειτουργία του γονιδίου και έκφραση εμπλέκεται στην αντίσταση στο φάρμακο [11], [12]. Ως εκ τούτου, για τη βέλτιστη αποτελεσματικότητα της θεραπείας, πρέπει να γνωρίζουμε τα γονίδια που σχετίζονται με την αντοχή στα φάρμακα, καθώς και τα προφίλ τους σε κάθε ασθενή (εξατομικευμένη ιατρική). Σε αυτό το πλαίσιο, η NCI60 πίνακα κυτταρική γραμμή αποτελεί ένα πολλά υποσχόμενο εργαλείο για να ανακαλύψουν νέα φάρμακα κατά του καρκίνου. Ο πίνακας NCI60 κυτταρική γραμμή είναι εγκατεστημένος από μία ποικιλία όγκων, προκειμένου να προσδιοριστούν οι ενώσεις που μπορεί να σκοτώσει τα καρκινικά κύτταρα [13]. Μέχρι στιγμής, αυτό το πάνελ κυτταρική γραμμή έχει εκτεθεί σε πάνω από 100.000 διαφορετικές ενώσεις και τις κυτταρικές αποκρίσεις με τη μορφή των ρυθμών ανάπτυξης έχουν μετρηθεί. Χρησιμοποιώντας κυτταρικές γραμμές NCI60, L-ασπαραγινάση ταυτοποιήθηκε ως αποτελεσματικό στη θανάτωση ένα υποσύνολο των καρκινωμάτων των ωοθηκών [14]. Η ομάδα αυτή χρησιμοποιείται επίσης στην ανάπτυξη της βορτεζομίμπης για την αγωγή του μυελώματος [13].

Τα πειραματικά αποτελέσματα που ελήφθησαν στις κυτταρικές σειρές NCI60 συγκεντρώνονται στην ιστοσελίδα της Αναπτυξιακής Therapeutics Program (DTP) [13]. Εκτός από τα φαρμακολογικά δεδομένα που αναφέρονται παραπάνω, άλλα στοιχεία για κυτταρικές γραμμές NCI60 είναι διαθέσιμο στην ιστοσελίδα DTP, όπως τους γονότυπους των Affymetrix 125K τσιπ πολυμορφισμών μονού νουκλεοτιδίου (SNPs). Affymetrix 125K SNP πλατφόρμα τσιπ έχει ένα πυκνό σύνολο των SNPs (~124,000) και χρησιμοποιείται για να προσδιορίσει τις περιοχές του γονιδιώματος που σχετίζονται με προδιάθεση της νόσου και μεταβλητή ανταπόκριση στη θεραπεία. Προηγουμένως, έχουμε χρησιμοποιήσει τα δεδομένα κυτταρική γραμμή NCI60 να ερευνήσει τα γονίδια αντοχής φαρμάκου στο ανθρώπινο γονιδίωμα [15], [16], [17]. Σε αυτή τη μελέτη, πήραμε πλεονέκτημα τόσο των διαθέσιμων φαρμακολογικών και γονιδιώματος στοιχεία για τις κυτταρικές σειρές NCI60 για τον εντοπισμό των γονιδίων που σχετίζονται με κυτταροτοξική αντίσταση στην σιμβαστατίνη και λοβαστατίνη λειτουργικό μελέτες με τη χρήση siRNA για την επικύρωση

EAF2

ως διαμορφωτής δραστηριότητας στατίνη.

Υλικά και Μέθοδοι

η λοβαστατίνη και η σιμβαστατίνη Ανθεκτικό και ευαίσθητο κυτταρικό Lines NCI60

Έχουμε ακολουθήσει μια προηγουμένως αναπτύξει προσέγγιση για να εκτελέσει το σύνολο του γονιδιώματος ασθενών-μαρτύρων μελέτη σύνδεσης [15], [16], [17]. Εν συντομία, έχουμε χρησιμοποιηθούν τα δημόσια διαθέσιμα δεδομένα σχετικά με την NCI60 πίνακα κυτταρική σειρά αναρτηθεί στην ιστοσελίδα της Αναπτυξιακής Therapeutics Program (DTP) του NCI /ΝΙΗ (https://dtp.nci.nih.gov/index.html). Κατ ‘αρχάς, θα κατεβάσει το GI

50 στοιχεία (η ποσότητα των φαρμάκων που απαιτούνται για την αναστολή της ανάπτυξης κατά 50%) σε δόση 10

-4.5 Μ για τις κυτταρικές σειρές. Στη συνέχεια, θα κατηγοριοποιούνται τα κύτταρα ως σχετικώς ανθεκτικά ή ευαίσθητα μετά την ομαλοποίηση της καταγραφής

10 της GI

50 για να ληφθεί ένα μέσο μηδέν και τυπική απόκλιση ενός όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15], [16], [17] . Η τυποποιημένη GI

50 τιμές αναλύθηκαν στη συνέχεια από το SAS 9.1 (PROC μονοπαραγοντική) με ένα τεστ διανομής μη-παραμετρική (πυκνότητα εκτίμηση του πυρήνα) με εκτιμώμενο εύρος ζώνης των 0,2476 και 0,2896, καθώς και ασυμπτωτική μέση ολοκληρωμένη σφαλμάτων στο τετράγωνο (AMISE) της 0,0224 και 0,0172, για σιμβαστατίνη και λοβαστατίνη, αντίστοιχα. Τα οπτικά antimodes χρησιμοποιήθηκαν ως τιμή αποκοπής στο -0,2 για τη σιμβαστατίνη και -0.3 για λοβαστατίνη να καθορίσει ευαίσθητα (έλεγχοι) και ανθεκτικά (περιπτώσεις) κύτταρα NCI60 (Σχήμα 1). Στην περίπτωση της σιμβαστατίνης, υπήρχαν 19 ευαίσθητες και 32 ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές στον πίνακα (Πίνακας S1). Υπήρχαν 16 ευαίσθητες και 41 ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές στον πίνακα NCI60 για λοβαστατίνη (Πίνακας S2).

Η συνάρτηση πυκνότητας έδειξε δύο κύριες λειτουργίες για κάθε φάρμακο. Τα οπτικά antimodes χρησιμοποιήθηκαν ως τιμή αποκοπής στο -0,2 για τη σιμβαστατίνη και -0.3 για λοβαστατίνη να καθορίσει ευαίσθητων και ανθεκτικών κυτταρικών σειρών NCI60.

Η

Ολόκληρο-Γονιδιώματος case-control μελέτη Συλλόγου

Θα κατεβάσει τα δεδομένα Affymetrix 125K SNP (που είχε περίπου 124.000 SNPs απόσταση με διάμεση απόσταση intermarker 8,5 κιλοβάσεις) από την ιστοσελίδα του DTP (https://dtp.nci.nih.gov/mtargets/download.html) [ ,,,0],18]. Ολόκληρο-γονιδίωμα ενιαίο τεστ συσχέτισης δείκτη περίπτωση-ελέγχου για τη λοβαστατίνη και η σιμβαστατίνη ανθεκτικά και ευαίσθητα κύτταρα διεξήχθη από το λογισμικό plink [19] χρησιμοποιώντας το πρότυπο τεστ chi-square. Μόνο οι SNPs που έχουν γονότυπος σε τουλάχιστον 75% των κυττάρων και είχε μια ελάχιστη ελάσσονα συχνότητα αλληλίου του 2% (n = 79.622) συμπεριλήφθηκαν σε αυτή τη μελέτη και χρησιμοποιήθηκαν για τη δοκιμή σύνδεσης. Για να μειώσετε την πιθανότητα για ψευδώς θετικές συσχετίσεις, μια διόρθωση για πολλαπλές δοκιμές,

δηλαδή

. η False Discovery Rate (FDR) προτείνει Benjamini και Hochberg (FDR_BH) [20] πραγματοποιήθηκε επίσης από το λογισμικό plink. Αποτελέσματα με

σ

τιμές & lt?. 0.05 θεωρήθηκαν σημαντικές

Πληροφορίες σχετικά με γενωμική θέσεις (γονιδιακή

έναντι

διαγονιδιακές) των SNPs είτε ανακτώνται από τη βάση δεδομένων dbSNP [21 ] ή με την ανατίναξη των SNP-πλευρικές αλληλουχίες από το ανθρώπινο γονιδίωμα και με την απεικόνιση χρησιμοποιώντας την επιλογή NCBI Χάρτης Viewer [22].

επίστασης (Αλληλεπίδραση SNP-SNP) Ανάλυση

Λογιστική μοντέλα παλινδρόμησης ήταν που χρησιμοποιούνται για την ανάλυση αμφίδρομη αλληλεπίδραση μεταξύ των SNPs που συνδέεται ξεχωριστά με σιμβαστατίνη ή λοβαστατίνη αντίσταση, υποθέτοντας ένα μοντέλο πρόσθετης ύλης για κάθε SNP. Για τη δοκιμή των αλληλεπιδράσεων SNP-SNP, χρησιμοποιήσαμε την προσέγγιση δοκιμής λόγου πιθανοφάνειας συγκρίνοντας την τακτοποίηση των δύο μοντέλων, ένα μόνο με τις SNP κύριες επιδράσεις και από την άλλη με τις κύριες επιδράσεις και αμφίδρομη δράση αλληλεπίδραση. Οι αντίστοιχες τιμές ρ ρυθμίστηκαν για πολλαπλές δοκιμές του [20] μέθοδος FDR_BH.

Cell Culture

Οι ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές HCT-116 και ΗΤ-29 αποκτήθηκαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA). HCT-116 είναι ένα ογκογόνο ορθοκολικού κυτταρική γραμμή καρκινώματος καθιερωμένη από έναν πρωτοπαθή όγκο [23]. ΗΤ-29 είναι ένα αδενοκαρκίνωμα κόλου κυτταρική σειρά βαθμού II διατίθενται από πρωτογενή κύτταρα όγκου [24]. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (DMEM) συμπληρωμένο με 10% FBS, 2 mM L-γλουταμίνη, 100 IU /ml πενικιλλίνη G, και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη. Όλα τα αντιδραστήρια media ελήφθησαν από την Invitrogen (Carlsbad, CA). Οι κυτταρικές γραμμές συνήθως διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη 5% CO

2 ατμόσφαιρα.

Λειτουργική επικύρωσης για λοβαστατίνη και η σιμβαστατίνη ευαισθητοποίηση

Για siRNA και μελέτες του φαρμάκου, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με siRNA με αντίστροφη διαμόλυνση σε πλάκες 384-φρεατίων όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25]. Εν συντομία, siRNA τυπώθηκε πάνω σε πλάκες 384-φρεατίων σε 2 μΙ όγκο. Το αραιωμένο αντιδραστήριο siLentFect (BioRad, Hercules, CA) σε OptiMEM (Invitrogen) προστέθηκε στα φρεάτια και αφέθηκε να συγκρότημα με siRNA για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. HCT-116 ή ΗΤ-29 κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε μέσο ανάπτυξης χωρίς αντιβιοτικά και προστίθενται σε πλάκες σε μια τελική συγκέντρωση 1000 κυττάρων /φρεάτιο. Οι πλάκες επωάστηκαν στους 37 ° C με 5% CO

2. Μετά από 24 ώρες, διάφορες συγκεντρώσεις που κυμαίνονται από 12 ηΜ έως 667 μΜ είτε λοβαστατίνη ή σιμβαστατίνη προστέθηκαν στις πλάκες δοκιμασίας και επωάστηκαν για επιπλέον 72 ώρες. Συνολικός αριθμός βιώσιμων κυττάρων προσδιορίστηκε με την προσθήκη κυττάρων Titer Glo (Promega, Madison, WI) και σχετικές μονάδες φωταύγειας (RLU) μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας μία συσκευή ανάγνωσης πλάκας EnVision (Perkin-Elmer, Wellesley, ΜΑ). αποτέλεσμα φαρμάκου υπολογίστηκε διαιρώντας το μέσο όρο των τιμών RLU για τα φρεάτια έλαβαν φάρμακο με το μέσο όρο των τιμών RLU για τα φρεάτια έλαβαν όχημα. Οι GI

50 τιμές προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA) και οι τιμές εμφανίζονται όπως υπολογίζεται GI

50 +/- 95% διάστημα εμπιστοσύνης. Η στατιστική ανάλυση των δεδομένων έγινε με τη χρήση δύο ουρές ζεύγη

t

test του Student.

P

& lt?. 0.05 θεωρήθηκε σημαντική

Επικύρωση γονιδιακή σίγηση από ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR (qPCR)

Το συνολικό RNA από τις κυτταρικές γραμμές απομονώθηκε χρησιμοποιώντας RNeasy της Qiagen Kit από Qiagen Inc. (Valencia, CA). Η συγκέντρωση του RNA προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας NanoDrop-1000 σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. iScript cDNA Synthesis Kit από τη Bio-Rad Inc. (Hercules, CA) χρησιμοποιήθηκε για την παρασκευή cDNA από 500 ng του κάθε δείγματος. έκφρασης σε σχέση mRNA μετρήθηκε χρησιμοποιώντας TaqMan Gene Expression Αναλύσεις από την ΑΒΙ Inc. (Foster City, CA) υπό τις συνιστώμενες συνθήκες του κατασκευαστή σχετικά με την Opticon 2 PCR System (Bio-Rad Inc., Hercules, CA). Σχετική ποσοτικοποίηση της γονιδιακής έκφρασης πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν. Αντιδράσεις qPCR παρασκευάστηκαν σε 96-πηγαδιών πλάκες διαμορφωμένη qPCR από την Bio-Rad (Hercules, CA). Οι αντιδράσεις παρασκευάσθηκαν σε singleplexes, εις τριπλούν από κάθε δείγμα με τριπλότυπα ενδογενούς ελέγχου, και οι έλεγχοι μη-πρότυπο (NTC). Η κανονικοποίηση πραγματοποιήθηκε με την παρουσία ενός γονιδίου αναφοράς, GAPDH, και η σχετική ποσοτικοποίηση των αλλαγών γονιδιακής έκφρασης αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ΔΔCt [26], [27].

Αποτελέσματα

Genome ευρύ ενώσεις μελέτες του πίνακα NCI60 για λοβαστατίνη και η σιμβαστατίνη απάντηση

Χρησιμοποιώντας τα δεδομένα του καρκίνου του προσυμπτωματικού ελέγχου NCI60 για σιμβαστατίνη και λοβαστατίνη, κυτταρικές σειρές είχαν χαρακτηριστεί ως σχετικά ευαίσθητα ή ανθεκτικά (Σχήμα 1). Τα αποτελέσματα που ελήφθησαν από τις μελέτες σύνδεσης-μαρτύρων ολόκληρου γονιδιώματος για σιμβαστατίνη και λοβαστατίνη συνοψίζονται στους Πίνακες 1 και 2, αντίστοιχα. Οκτώ SNPs συνδέθηκαν με αντίσταση σε σιμβαστατίνη. Αυτοί οι SNPs βρίσκονται στα χρωμοσώματα 8q, 9p (δύο SNPs), 10p, 10q, 13q (δύο SNPs) και 14p. Πέντε από τους SNPs βρίσκονταν σε διαγονιδιακές περιοχές, ενώ οι υπόλοιπες τρεις SNPs βρίσκονταν σε εσώνια γνωστών γονιδίων (Πίνακας 3), δηλαδή, ιντρόνιο 6 του

NRP1

(νευροφιλίνης), ιντρόνιο 37 του

COL13A1

(τύπος XIII κολλαγόνο, άλφα 1), και ιντρόνιο 6 του

MRPS31

(μιτοχονδριακή ριβοσωμική πρωτεΐνη S31). Δύο διαγονιδιακές SNPs, rs4129864 και rs1343844 βρίσκονταν πολύ κοντά (7387 ζεύγη βάσεων μακριά από το άλλο), γεγονός που υποδηλώνει ότι ήταν πιθανό να συνδέονται μεταξύ τους.

Η

Η

Στην περίπτωση λοβαστατίνης, συνολικά 25 SNPs συσχετίστηκαν με την αντίστασή του. Έξι από αυτά τα SNPs βρίσκονταν σε γνωστή ή προβλεπόμενη γονίδια (Πίνακες 2 και 3): στο ιντρόνιο 5 του

EAF2

(ELL σχετίζεται παράγοντας 2), στο ιντρόνιο 2 του

ANK2

(νευρωνικά ανκυρίνης 2), στο ιντρόνιο 1 του

AKAP7

(πρωτεϊνική κινάση Α πρωτεΐνης άγκυρα 7), στο ιντρόνιο 4 του

LPIN2

(Lipin 2), στο ιντρόνιο 2 του

STEAP2

(αντιγόνο επιθηλιακής έξι διαμεμβράνης του προστάτη 2), και στο ιντρόνιο 11 της

PARVB

(Parvin beta).

Μελετήσαμε περαιτέρω μια πιθανή SNP-SNP αλληλεπίδρασης για τη σιμβαστατίνη και λοβαστατίνη αντίσταση SNP σύνολα χρησιμοποιώντας λογιστική ανάλυση παλινδρόμησης και δεν εντόπισε καμία στατιστικά σημαντική γενετική αλληλεπίδραση υποθέτοντας προσθετικό γενετικό μοντέλο μετά τις προσαρμογές FDR_BH. Ωστόσο, λαμβάνοντας υπόψη το μικρό μέγεθος του δείγματος, θα πρέπει επίσης να σημειωθεί ότι η μελέτη μας δεν έχουν επαρκή δύναμη, έτσι, τα αποτελέσματα αυτά θα πρέπει να ερμηνεύονται με προσοχή. Ανάλυση μονοπατιού δεν προσδιοριστούν οι άμεσες αλληλεπιδράσεις μεταξύ των πρωτεϊνικών προϊόντων των γονιδίων στα σιμβαστατίνη ή λοβαστατίνη λίστες.

Λειτουργικές μελέτες προσδιορίζει EAF2 ως διαμορφωτή των λοβαστατίνη και η σιμβαστατίνη

Για να ελεγχθεί η εγκυρότητα των θετικών αποτελεσμάτων GWAS, πραγματοποιήσαμε λειτουργικές μελέτες. Εμείς επικεντρώθηκε στις SNPs βρίσκονται σε (ιντρονικές περιοχές) γονιδίων που εμπλέκονται στην σιμβαστατίνη (3 SNPs) και λοβαστατίνη (6 SNPs) αντίσταση (Πίνακες 1 και 2). Μια εκτεταμένη βιβλιογραφική έρευνα δεν αποκάλυψε γνωστές λειτουργικές συνέπειες αυτών των SNPs στη γονιδιακή έκφραση ή λειτουργία της πρωτεΐνης. Έτσι, οι βιολογικές άμεσες σχέσεις μεταξύ αυτών των SNPs και αντοχή σε σιμβαστατίνη και λοβαστατίνη παρέμεινε άγνωστη. Ωστόσο, δεδομένου ότι τα αποτελέσματά μας GWAS έχουν δείξει τη σύνδεση αυτών των γονιδίων με αντοχή στην σιμβαστατίνη ή λοβαστατίνη, υποθέσαμε ότι οι λειτουργίες των γονιδίων αυτών ήταν κατά κάποιο τρόπο συνδέονται με ανθεκτικότητα στα φάρμακα. Σύμφωνα με αυτή την υπόθεση, κάτω ρύθμιση της έκφρασης γονιδίου αντιστρέφει την παρατηρούμενη αντοχή και καθιστά αυτά τα κύτταρα ευαίσθητα σε αυτά τα φάρμακα και πάλι, με αποτέλεσμα αυξημένη κυτταρική τοξικότητα και το θάνατο (Εικόνα 2). Ως εκ τούτου, εκτελέσαμε απόκριση φαρμάκου και γονιδιακή σίγηση χρησιμοποιώντας μελέτες μεθοδολογία RNAi για καρκινικές κυτταρικές σειρές δύο κόλον HCT-116 και ΗΤ-29, τα οποία επελέγησαν από τη στιγμή που περιλαμβάνονται στον NCI60 οριστεί, καθώς και για την καλή αποτελεσματικότητα επιμόλυνσης τους και την ανταπόκριση τους σε οι δύο στατίνες. Με βάση τα δεδομένα απόκρισης φαρμάκου DTP, η ανάλυσή μας κατατάσσεται HCT-116 και σχετικά ανθεκτική σε σιμβαστατίνη (Πίνακας S1)? Ωστόσο, τα δεδομένα λοβαστατίνη δεν ήταν διαθέσιμα για αυτή την κυτταρική γραμμή. Από την άλλη πλευρά, ΗΤ-29 βρέθηκε να είναι σχετικά ανθεκτικά σε αμφότερες τις σιμβαστατίνη και λοβαστατίνη (Πίνακες S1 και S2). Αρχικά, αμφότερες οι κυτταρικές σειρές υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με siRNA που στοχεύει τα γονίδια που προσδιορίζονται στην ανάλυση μας που ακολουθείται από κατεργασία με δύο χαμηλές δόσεις είτε σιμβαστατίνη ή λοβαστατίνη, η οποία έδειξε τέσσερα από τα γονίδια,

MRPS31

,

COL13A

,

EAF2

,

AKAP7

ως δυνητικοί διαμορφωτές της απόκρισης φαρμάκου (δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

αριθ βιολογική σχέση μεταξύ της ανθεκτικότητας στα φάρμακα και τα γονίδια /SNPs που εντοπίζονται στην GWAS μελέτη είχε προηγουμένως εντοπιστεί. Ως εκ τούτου, στο παρόν υποθέτουμε ότι εάν οι λειτουργίες αυτών των γονιδίων που απαιτούνται για την αντίσταση σε αυτά τα φάρμακα, τότε, να χτυπήσει τα κάτω την έκφραση του γονιδίου τους χρησιμοποιώντας siRNAs θα διαταράξει τη λειτουργία των γονιδίων, τα οποία θα αντιστρέψει την ανθεκτικότητα και να κάνει τα κύτταρα ευαίσθητα σε αυτά τα φάρμακα και πάλι. (Α) Η κυτταρική γραμμή όγκου είναι ανθεκτικά κατά την έκθεση στο φάρμακο. (Β) Κατά την επεξεργασία με siRNA σε στόχους υποψήφιο γονίδιο εκτός από τα ναρκωτικά, προβλέπουμε ότι η κυτταρική γραμμή όγκου θα γίνει ευαισθητοποιηθεί στο φάρμακο που οδηγεί σε αυξημένο κυτταρικό θάνατο. Το μοντέλο αυτό βασίζεται στην υπόθεση ότι απαιτείται η συγκεκριμένη λειτουργία γονίδιο για την ανθεκτικότητα στα φάρμακα.

Η

μελέτες απόκρισης περαιτέρω δόση του φαρμάκου έγιναν με τη χρήση siRNA διπόλων που στοχεύουν

MRPS31

και

COL13A

, οι οποίες σχετίζονται με την αντίσταση στην σιμβαστατίνη, και

EAF2

και

AKAP7

, οι οποίες σχετίζονται με την αντίσταση στην λοβαστατίνη. Τα γονίδια αυτά σιγήσει από siRNA και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διάφορες δόσεις είτε σιμβαστατίνη ή λοβαστατίνη που κυμαίνονται από 12 ηΜ έως 667 μΜ. Αποσιώπηση του

MRPS31

,

AKAP7

και

COL13A

δεν επηρέασε την απόκριση σε κάθε φάρμακο κάτω από τις πειραματικές συνθήκες που εφαρμόζονται (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται), ενώ η φίμωση του

EAF2

μείωσε σημαντικά τον GI

50 σιμβαστατίνης και λοβαστατίνης-επεξεργασμένα κύτταρα HCT-116, και έτσι μειώνεται η αντίσταση αυτής της κυτταρικής γραμμής σε αυτά τα φάρμακα (Σχήμα 3). Για HCT-116 κύτταρα που υπέστησαν αγωγή με σιμβαστατίνη και siRNA, το GI

50 (με όρια εμπιστοσύνης 95%) μετατοπίζεται από 8,6 +/- 0,3 μΜ για τη μη φίμωση siRNA (αρνητικός έλεγχος) στα 2.5 +/- 0.2 μΜ και 3.3 +/- 0.3 μΜ για EAF2_1 και EAF2_4 siRNA, αντίστοιχα. Ομοίως, για HCT-116 κύτταρα που υπέστησαν αγωγή με λοβαστατίνη την GI

50 μετατοπίζεται από 20,1 +/- 0,9 μΜ για τη μη φίμωση siRNA στο 4,3 +/- 0,5 μΜ και 6,5 +/- 0,5 μΜ για EAF2_1 και EAF2_4 siRNA, αντίστοιχα . Επιπλέον, αποδοτική διαμόλυνση siRNA καταδείχθηκε σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές από την έλεγχο θανατηφόρος siRNA μειωμένη βιωσιμότητα κατά περισσότερο από 98% σε όλες τις δοκιμασίες (Σχήμα S1). Ωστόσο, αποσιώπηση του

EAF2

δεν ευαισθητοποιεί κύτταρα ΗΤ-29 είτε σιμβαστατίνη ή λοβαστατίνη (Σχήμα 1). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι τα κάτω ρύθμιση

EAF2

έκφραση μπορεί να ρυθμίσουν την κυτταρική απόκριση σε αμφότερα τα φάρμακα που μειώνουν τη χοληστερόλη σε HCT-116 κύτταρα καρκίνου κόλου

ΗΟΤ-116 κύτταρα (amp A &?. C ) και ΗΤ-29 κύτταρα (Β & amp? D) επιμολύνθηκαν με στόχευση siRNA

EAF2

με αντίστροφη διαμόλυνση. Στις 24 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με διάφορες δόσεις είτε σιμβαστατίνης (Α & amp? Β) ή λοβαστατίνη (C & amp? D) που κυμαίνονται από 12 ηΜ έως 667 μΜ. Ο αριθμός των κυττάρων προσδιορίστηκε σε 72 ώρες από την έκθεση του φαρμάκου με τη χρήση κυττάρων Titer Glo. Αποσιώπηση του

EAF2

με συγκεκριμένα siRNA επηρέασε σημαντικά την απόκριση των HCT-116 κυττάρων σε σύγκριση με τον έλεγχο μη φίμωση siRNA (

p & lt? 0.0002

τόσο για EAF2_1 και EAF2_4 siRNA που εμφανίζονται με *) σε δόσεις 2,7 μΜ και 8,2 μΜ.

Η

Η αποτελεσματικότητα της γονιδιακής σίγησης με siRNAs EAF2_1 και EAF2_4 επιβεβαιώθηκε με τη χρήση των πειραμάτων qPCR και φαίνεται στο Σχήμα 4Α. Ακόμα κι αν HCT-116 κύτταρα έδειξαν ευαισθητοποίηση στο συνδυασμό του

EAF2

σίγηση και στατίνης θεραπεία, ενώ κύτταρα ΗΤ-29 δεν είχε, και οι δύο κυτταρικές σειρές έδειξαν παρόμοια επίπεδα έκφρασης του

EAF2

αποδεικνύουν ότι η διαφορά στην ανταπόκριση δεν ήταν λόγω της διαφοράς στο βασικό επίπεδο

EAF2

έκφρασης (Σχήμα 4Β). Επιπλέον, siRNA αποσιώπηση

EAF2

σε δύο κυτταρικές σειρές είχαν ελάχιστη επίδραση στη βιωσιμότητα του κυττάρου σε σύγκριση με χωρίς θεραπεία ελέγχους και το μη φίμωση ελέγχου siRNA (Εικόνα 5). Στο σύνολό τους, αυτά τα δεδομένα και τη μετατόπιση στις καμπύλες δόσης-απόκρισης που παράγεται από

EAF2

αποσιώπηση σε HCT-116 κύτταρα δείχνουν ότι η φίμωση

EAF2

ενισχύει τη δράση που προκαλείται στατίνης κυτταροτοξικότητα.

(Α) Ολικό RNA απομονώθηκε από HCT-116 κύτταρα επιμολυσμένα για 48 ώρες με siRNA που στοχεύει

EAF2

(EAF2_1 και EAF2_4), μη-φίμωση siRNA ή μη επεξεργασμένα κύτταρα. Οι διαφορές σε σχέση φορές σε

EAF2

επίπεδα mRNA σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα και μη φίμωση κύτταρα επεξεργασμένα siRNA φαίνεται. (Β) σε σχέση ανάλυση έκφρασης qPCR του EAF2 σε HCT-116 και ΗΤ-29 κυττάρων δείχνει παρόμοια έκφραση.

Η

HCT-116 κύτταρα και κύτταρα ΗΤ-29 (1000 κύτταρα /φρεάτιο) επιμολύνθηκαν με αντίστροφη ελέγχου siRNA και

EAF2

στόχευση siRNA. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε σε 96 ώρες χρησιμοποιώντας Κυττάρου Titer Glo και διαβάστε για φωταύγειας. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως ποσοστό βιωσιμότητας σε σύγκριση με μη siRNA επεξεργασμένα κύτταρα.

Η

Συζήτηση

Η μελέτη μας αποτελεί την πρώτη μελέτη σύνδεσης με βάση συστηματική και ολόκληρου του γονιδιώματος για σιμβαστατίνη και λοβαστατίνη, δύο στατίνες ότι είναι πολλά υποσχόμενοι υποψήφιοι ως κυτταροτοξικά φάρμακα στον καρκίνο. Σε αυτή τη μελέτη, πήραμε πλεονέκτημα των ελεύθερα προσβάσιμο και ολοκληρωμένο φαρμακολογικών και γενετικών δεδομένων στο NCI60 πίνακα κυτταρική γραμμή για τον εντοπισμό υποψήφιων γονιδίων τα οποία σχετίζονται με την αντίσταση σε σιμβαστατίνη και λοβαστατίνη στο ανθρώπινο γονιδίωμα. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν την ένωση των διακριτών συνόλων γονιδίων με αντίσταση σε αυτά τα δύο φάρμακα. Έχουμε περαιτέρω λειτουργικά επικυρωθεί ένα γονίδιο στόχο,

EAF2

, χρησιμοποιώντας siRNAs να δείξει ότι η έκφραση του μπορεί να ρυθμίσουν την κυτταρική απόκριση σε αυτά τα δύο φάρμακα σε κυτταρική σειρά HCT-116.

Μια ολόκληρη γονιδιώματος SNP -με βάση τη μελέτη σύνδεσης εντοπίστηκαν τρία γονίδια που σχετίζονται με σιμβαστατίνη αντίστασης (Πίνακας 3). Ένα από αυτά τα γονίδια,

NRP1

κωδικοποιεί για έναν υποδοχέα συνδεδεμένου με μεμβράνη που έχει ρόλους στην αγγειογένεση, την καθοδήγηση νευράξονας, κυτταρική επιβίωση, μετανάστευση, εισβολή και ανοσολογική απόκριση. NRP1 συνδέεται επίσης με SEMA3, των οποίων η δραστηριότητα διαμορφώνεται από λιπιδίων σχεδίες [28]. Ένα άλλο γονίδιο που συνδέεται με σιμβαστατίνη αντίσταση ήταν

COL13A1

, το οποίο κωδικοποιεί για την άλφα αλυσίδα ενός μη ινώδους κολλαγόνου που βρίσκεται στη μεμβράνη του πλάσματος. Αν και ακριβής βιολογικός ρόλος του δεν έχει χαρακτηριστεί ακόμα, COL13A1 πρωτεΐνη βρίσκεται στην κόλλα δομές των ιστών και πιστεύεται ότι εμπλέκεται στην κυτταρική προσκόλληση, η μετανάστευση και την ανάπτυξη των οστών [29]. Τέλος,

MRPS31

κωδικοποιεί για μία μιτοχονδριακή ριβοσωμική πρωτεΐνη που εμπλέκεται στην σύνθεση των πρωτεϊνών στα μιτοχόνδρια και συνδέεται με το διαβήτη τύπου Ι [30].

Στην περίπτωση της λοβαστατίνης αντίσταση, η ανάλυση μας έδειξε η ένωση των έξι γονιδίων (Πίνακας 3). Ένα από αυτά τα γονίδια ήταν

EAF2

, το οποίο είναι ένα γονίδιο ανδρογόνα απόκριση που σχετίζεται με τα μεταγραφικά ΜΕΝ παράγοντα επιμήκυνσης /ELL και απαιτείται για μια ποικιλία κυτταρικών λειτουργιών, όπως η ανάπτυξη των ματιών και της καταστολής της ανάπτυξης και επαγωγή απόπτωσης [31], [32]. Πρόσφατα,

Eaf2

knockout σε ένα μοντέλο ποντικού συνδέθηκε με νεοπλασία του πνεύμονα, του ήπατος και του προστάτη, καθώς και Β-κυττάρου λέμφωμα [33]. Είναι ενδιαφέρον, τα αποτελέσματά μας δείχνουν σαφώς ότι η φίμωση του

EAF2

μειώνει την GI

50 τιμές των HCT-116 κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου όχι μόνο λοβαστατίνη, αλλά και σιμβαστατίνη. Αυτή η δράση δεν παρατηρήθηκε στα άλλα καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρική γραμμή ΗΤ-29 και αυτό θα μπορούσε να οφείλεται στην γενετική ετερογένεια μεταξύ των δύο κυτταρικών σειρών. Ένα άλλο γονίδιο που συνδέεται με λοβαστατίνη αντίσταση ήταν

ANK2,

το οποίο κωδικοποιεί για μία από τις τρεις ανκυρίνες που εμπλέκονται στην εντοπισμό των πρωτεϊνών στη μεμβράνη.

ANK2

είναι κρίσιμης σημασίας για την κανονική λειτουργία της καρδιάς και των μεταλλάξεων του είναι μία από τις αιτίες των συγγενών αρρυθμίας [34].

AKAP7

κωδικοποιεί για ένα μέλος της Α-κινάσης αγκύρωσης πρωτεΐνης οικογένεια (ΑΚΑΡ) που αγκιστρώνει το cAMP-εξαρτώμενη κινάση πρωτεΐνης Α σε συγκεκριμένα υποκυτταρικά διαμερίσματα [35]. Από την άλλη πλευρά,

LPIN2

είναι ένα από τα τρία γονίδια Lipin. Lpin 1 εμπλέκεται στην ανάπτυξη του λιπώδους ιστού [36]. Αν και ο ακριβής βιολογικός ρόλος αυτού του γονιδίου δεν είναι γνωστή, όταν μεταλλάσσονται, το γονίδιο αυτό προκαλεί το σύνδρομο Majeed, μια διαταραχή αυτοφλεγμονώδους [37]. Επιπλέον,

STEAP2

, το οποίο κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη μεμβράνης multi-pass που εντοπίζεται στο σύμπλεγμα Golgi, της πλασματικής μεμβράνης, και τα φυσαλιδώδη σωληνοειδείς δομές στο κυτταρόπλασμα, συσχετίστηκε επίσης με αντίσταση στην λοβαστατίνη στη μελέτη μας. Πρόσφατα ένας χαλκού αναγωγάσης και ferrireductase ρόλο για STEAP2 πρωτεΐνη αναφέρθηκε [38]. Αυτό το γονίδιο εμπλέκεται επίσης σε καρκίνο προστάτη [39]. Τέλος,

PARVB

, ένα μέλος μιας οικογένειας εστιακής προσκόλλησης πρωτεΐνη [40] που προσδένεται στο ιντεγκρίνη-συνδεδεμένη κινάση [41] έχει επίσης βρεθεί ότι σχετίζονται με λοβαστατίνη αντίσταση. Είναι ενδιαφέρον να σημειωθεί ότι οι δύο κατάλογοι γονίδια ήταν πολύ διαφορετική μεταξύ των δύο στατίνες, οι οποίες είναι και οι δύο αναστολείς της HMG-CoA αναγωγάσης. Ωστόσο, τα δύο φάρμακα δεν είναι ταυτόσημες και διαφέρουν ως προς τους μεταβολίτες τους [42] και κυτταροτοξικές επιδράσεις τους [43], [44], η οποία μπορεί να εξηγήσει αυτά τα αποτελέσματα. Η κυτταροτοξική δράση που προκαλείται από τους στατίνες θα μπορούσε να περιλαμβάνει άλλους στόχους εκτός της HMG-CoA αναγωγάσης, όπως το μονοπάτι μορφογόνο πρωτεΐνη οστού (ΒΜΡ) όπως περιγράφεται από Kodach και συνεργάτες [43].

Πραγματοποιήσαμε πειράματα απόκριση γονιδιακή σίγηση και ναρκωτικών για να ελεγχθεί η εγκυρότητα των αποτελεσμάτων μας GWAS. Στην περίπτωση των τριών γονιδίων,

MRPS31

,

COL13A

, και

AKAP7,

τα αποτελέσματά μας δεν επιβεβαίωσαν ότι οι βιολογικές λειτουργίες τους σχετίζονται άμεσα με την αντίσταση στην σιμβαστατίνη και λοβαστατίνη σύμφωνα με την υπόθεσή μας και τις πειραματικές συνθήκες που εφαρμόζονται. Αυτή η ασυμφωνία μεταξύ της GWAS και λειτουργικές μελέτες μπορεί να εξηγηθεί από την πιθανότητα ότι αυτά τα γονίδια μπορεί να αντιπροσωπεύουν ψευδώς θετικά αποτελέσματα της ανάλυσης GWAS, ή τις συνθήκες και την υπόθεση που εφαρμόζεται δεν ήταν η βέλτιστη για την ανίχνευση τα αναμενόμενα αποτελέσματα. Εναλλακτικά, αυτές οι SNPs μπορούν να βρίσκονται σε μία γονιδιωματική περιοχή που επηρεάζει τη λειτουργία των μακρινών γονιδίων, τα οποία δεν μπορούν να ελεγχθούν χρησιμοποιώντας την προσέγγισή μας. Από την άλλη πλευρά, γονιδιώματος μεγάλη ένωση μας έδειξε την συσχέτιση των

EAF2

δείκτη 1840275 (rs2332056, rs4339143) με αντίσταση μόνο λοβαστατίνη μετά τη διόρθωση με το FDR. Στην περίπτωση της σιμβαστατίνης, ο δείκτης αυτός συνδέθηκε με την αντίστασή του (μη προσαρμοσμένη

ρ

& lt? 0,01), ωστόσο, μετά από διόρθωση για πολλαπλές δοκιμές, αυτή η σημαντικότητα χάθηκε. Ωστόσο, λειτουργική εκτίμηση μας χρησιμοποιώντας siRNA έδειξε ότι αποσιώπηση του

EAF2

δεν ήταν μόνο σε θέση να διαμορφώνουν απόκριση σε λοβαστατίνη, αλλά και να σιμβαστατίνη σε HCT-116 καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρική γραμμή κάτω από τις πειραματικές συνθήκες που εφαρμόζονται (Σχήμα 3). Αυτή η διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων της μελέτης σύνδεσης ευρείας γονιδιώματος και λειτουργικά πειράματα αξιολόγησης μπορεί να εξηγηθεί είτε από μια ψευδώς αρνητική συσχέτιση του

EAF2

δείκτη σε σιμβαστατίνη σύνολο, ή με τη χρησιμοποίηση των διαφορετικών πειραματικών συνθηκών (π.χ. δόση του φαρμάκου) σε πειράματα siRNA μας. Επιπλέον, τα αποτελέσματα μας επίσης έδειξαν ότι το

EAF2

σίγηση δεν ευαισθητοποιεί άλλη κόλου κυτταρική σειρά καρκίνου, ΗΤ-29 (το οποίο θεωρήθηκε σχετικά ανθεκτική τόσο σιμβαστατίνη και λοβαστατίνη), υποδηλώνοντας την παρουσία μιας πιθανής ετερογένειας στην γενετική και μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται στην αντοχή στην στατίνες. Είναι ενδιαφέρον, HCT-116 είναι γνωστό ότι φέρουν ένα

K-RAS

μετάλλαξη, ενώ ΗΤ-29 δεν κάνει [45]. Δεδομένου ότι οι στατίνες είναι αναστολείς της HMG-CoA αναγωγάσης που μπορεί να οδηγήσει σε μπλοκάρισμα farneslyation του K-RAS και έτσι την ενεργοποίηση K-RAS, είναι πιθανό ότι φέρει ένα μεταλλαγμένο

K-RAS

μπορεί να συνεισφέρει στην κατασκευή HCT-116 κύτταρα πιο ευαίσθητα στο συνδυασμό του

EAF2

αποσιώπηση και στατίνη θεραπεία. Περαιτέρω μελέτες θα απαιτούνται για την αντιμετώπιση αυτής της δυνατότητας.

κατάταξη μας τόσο του ΗΤ-29 και HCT-116 είναι σχετικά ανθεκτικά βασίζεται στη σύγκριση με όλες τις κυτταρικές σειρές στον πίνακα NCI60. Προηγούμενες μελέτες για απόκριση σε σιμβαστατίνη και λοβαστατίνη αρκετών από τις κυτταρικές σειρές NCI60 έχουν αναφερθεί. Η κυτταρική σειρά λευχαιμίας HL-60 είχε προηγουμένως βρεθεί να είναι σχετικά ανθεκτικά σε σιμβαστατίνη (με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο) από το all-trans ρετινοϊκό οξύ ανθεκτική παράγωγο κυτταρική γραμμή του, HL-60-R2 [46]. Επιπλέον, Martirosyan

et. al.

έδειξαν ότι η κυτταρική σειρά καρκίνου των ωοθηκών, SKOV-3, όταν έλαβαν θεραπεία με λοβαστατίνη παρουσίασαν μια απάντηση, αλλά όχι τόσο όσο άλλες κυτταρικές γραμμές που περιλαμβάνονται στις μελέτες τους, γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτή η κυτταρική σειρά δεν είναι ιδιαίτερα ευαίσθητη σε λοβαστατίνη θεραπεία υπό τους όρους που εφαρμόζονται [47], η οποία είναι σε συμφωνία με τα αποτελέσματα μας. Τέλος, Kodach

et.