Αφηρημένο

Αν και απόπτωση των ενδοθηλιακών κυττάρων συμμετέχει στην συρρίκνωση του όγκου μετά από εφάπαξ ακτινοθεραπεία υψηλή δόση, λίγα είναι γνωστά σχετικά με την αγγειακή απάντηση μετά συμβατικά κλασματοποιήθηκαν ακτινοθεραπεία. Ως εκ τούτου, αξιολογήσαμε υποξία, αιμάτωσης και αλλαγές αγγειακής μικροπεριβάλλον σε ένα ορθοτοπικό μοντέλο καρκίνου του προστάτη από συμβατικά κλασματοποιημένη ακτινοθεραπεία σε κλινικά σχετικές δόσεις (2 κλάσματα Gy, 5 κλάσματα /εβδομάδα). Πρώτον, συμβατικά κλασματοποιήθηκαν ακτινοθεραπεία μειωμένο πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και την αυξημένη κυτταρικό θάνατο με κινητική παρόμοια με την ανθρώπινη ραδιοθεραπεία καρκίνου του προστάτη. Δεύτερον, η έγχυση του Hoechst 33342 ή φθορίζοντα-δεξτράνες έδειξαν αυξημένη αιμάτωση του όγκου εντός 14 ημερών σε ακτινοβολημένα όγκους, η οποία συσχετίζεται με μία σαφή μείωση της υποξίας. Βελτιωμένη αιμάτωσης και μειώθηκε υποξία δεν εξηγείται από την αύξηση της πυκνότητας των αιμοφόρων αγγείων, το μέγεθος ή τη μορφολογία του δικτύου. Ωστόσο, ένας όγκος αγγειακή ωρίμανση που ορίζεται από περιαγγειακή + /SMA + κυττάρων δεσμίνης κάλυψη ήταν σαφώς παρατηρήθηκε μαζί με μια αύξηση στην ενδοθηλιακή, Οοοίιιάεηδ zonula (ΖΟ) -1 θετική, μεσοκυττάρια κόμβους. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι, εκτός από την θανάτωση των καρκινικών κυττάρων, αγγειακή ωρίμανση παίζει μια ακάλυπτη ρόλο στην επανοξυγόνωση του όγκου κατά τη διάρκεια της κλασματοποιημένη ακτινοθεραπεία

Παράθεση:. Potiron VA, Abderrahmani R, Clément-Colmou Κ, Marionneau-Lambot S, Oullier Τ, Παρίσι F, et al. (2013) βελτιωμένη λειτουργικότητα των αγγείων κατά τη διάρκεια Συμβατικά ακτινοθεραπείας θεραπεία του καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 8 (12): e84076. doi: 10.1371 /journal.pone.0084076

Επιμέλεια: Zhaozhong Χαν, Alexion Pharmaceuticals, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 17 Ιούνη του 2013? Αποδεκτές: 20, Νοεμβρίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 31 Δεκεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 Potiron et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Institut National du Cancer (INCA ΖΕΥΓΟΣ-προστάτη του 2010), ο Σύνδεσμος pour la Recherche sur le Cancer, η Ligue Nationale Καρκίνου Contre le και την περιοχή Pays de Loire. Η πηγή χρηματοδότησης δεν συμμετείχε στη συλλογή, ανάλυση και ερμηνεία των δεδομένων, την προετοιμασία του χειρογράφου και την απόφαση να δημοσιεύσει

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Αν και η ευαισθησία των όγκων σε ραδιοθεραπεία (RT) εξαρτάται από την εγγενή ραδιοαντοχή των καρκινικών βλαστικών κυττάρων [1] σε μεγάλο βαθμό, και άλλα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η ευαισθησία της ενδοθήλιο παίζει επίσης σημαντικό ρόλο [2] . Ως αποτέλεσμα της υπερβολικής παραγωγής αγγειογόνων μορίων, τα αιμοφόρα αγγεία σε συμπαγείς όγκους εμφανίζουν χαρακτηριστικά όπως διεσταλμένες μικροαγγείων, ατελής ενδοθηλιακή επένδυση, συμπίεση από τα καρκινικά κύτταρα, η υπερβολική διακλάδωση και εξαιρετικά ακανόνιστη αρχιτεκτονική. Σε κυτταρικό επίπεδο, μια ατελής ωρίμανση των τριχοειδών σημειώνεται με απουσιάζει ή αποκολλημένα κύτταρα περιαγγειακή, απουσιάζει ή πολύ παχιά βασική μεμβράνη και την έλλειψη σύνδεσης των ενδοθηλιακών κυττάρων. Αυτή η ανώμαλη αγγείωση προκαλεί υποξία που περαιτέρω επιπτώσεις η αποτελεσματικότητα της ακτινοβόλησης επειδή 1) έλλειψη οξυγόνου μειώνει την ποσότητα αντιδραστικών ειδών οξυγόνου που προκαλείται από ακτινοβολία και 2) υποξία επιλέγει ραδιοανθεκτικά μεταλλαγμένων κυττάρων [3]. Κατά τη διάρκεια της κλασματοποιημένη ραδιοθεραπεία, η αναλογία των υποξικών κυττάρων αυξάνει γρήγορα μετά το κλάσμα θεραπεία αφού νορμοξικά κύτταρα κατά προτίμηση και ταχέως θανατώνονται με ακτινοβολία. Στις επόμενες ώρες, λόγω της μειωμένης κατανάλωσης οξυγόνου από κατεστραμμένα κύτταρα, βελτιωμένη αιμάτωση, και μειωμένη πυκνότητα κυττάρων, υποξικών κυττάρων όγκου μπορεί να αποκτήσουν μια ευκολότερη πρόσβαση στην οξυγόνωση, και ως εκ τούτου γίνονται πιο ευαίσθητα στην επακόλουθη κλάσμα της ακτινοβολίας. Αυτή η διαδικασία της επανοξυγόνωση πιστεύεται ότι προσδίδουν ένα θεραπευτικό πλεονέκτημα σε CFRT μέσω μιας προοδευτικής μείωσης του ορθοξικές καρκινικών κυττάρων και ευκολότερη πρόσβαση των υποξικών κυττάρων σε οξυγόνο [3].

Τα αιμοφόρα αγγεία επηρεάζονται σε μεγάλο βαθμό από RT ανάλογα με τον αριθμό των κλασμάτων, ρυθμός δόσης, ολική δόση ακτινοβολίας και το μέγεθος κλάσματος [4], [5]. Single υψηλή δόση ακτινοβολίας μπορεί να επάγει την ταχεία απόπτωση των αγγείων [6], [7]. Επιπλέον, τόσο ενιαίο υψηλής δόσης και ακτινοβόληση υποκαταμερισμένη επάγει απόπτωση των ενδοθηλιακών κυττάρων, μειώνοντας έτσι την αγγειακή πυκνότητα [8], με επιζώντα σκάφη άνω διεσταλμένα [9], [10]. Ωστόσο, η σημασία της αγγειακής βλάβης σε όγκους που έλαβαν συμβατικά κλασματοποιημένη ακτινοθεραπεία (CFRT: 1.8-2 Gy ανά κλάσμα) είναι πιο αμφιλεγόμενη [11], [12]. Σε κανονική αιμοφόρα αγγεία του εγκεφάλου, πολύ πρόσφατες πληροφορίες δείχνουν ότι, αντίθετα με τις μεγαλύτερες δόσεις, μία 2 Gy ακτινοβολίας επάγει ελάχιστη απόπτωση ενδοθηλιακού κυττάρου που ακολουθείται από μια μεταγενέστερη αύξηση στη διάμετρο των αγγείων, την πυκνότητα και μικροαγγειακή διαρροή σκάφος [13]. Ωστόσο, αδρανή ενδοθηλιακά κύτταρα είναι πιο ανθεκτικά στην ακτινοβολία από πολλαπλασιαζόμενα ενδοθηλιακά κύτταρα [14], [15]. Ως εκ τούτου, οι συνέπειες της CFRT στο ενδοθήλιο του όγκου μπορεί να διαφέρουν από την κανονική ενδοθήλιο. Επιπλέον, για να κατανοήσουν τις επιπτώσεις της κλινικής ακτινοθεραπείας, ειδικές μελέτες σχετικά με τα αιμοφόρα αγγεία του όγκου πρέπει να διεξαχθεί σε ορθοτοπική μοντέλα από την έκταση της υποξίας και αγγείωση επηρεάζεται σε μεγάλο βαθμό από την ιστοσελίδα της μεταμόσχευσης του όγκου [16], [17].

για να μελετηθούν οι επιδράσεις του CFRT στο αγγειακό σύστημα του όγκου και υποξία, επιλέξαμε ένα μοντέλο καρκίνου του προστάτη, επειδή CFRT μέχρι συνολικού δόσεις 74-80 Gy παίζει σημαντικό ρόλο σε ασθενείς με εντοπισμένο καρκίνο του προστάτη [18], και επειδή η απόκριση των όγκων του προστάτη σε ακτινοβολία είναι ιδιαίτερα ευαίσθητη σε υποξία [19], [20]. Επιπλέον, οι καρκίνοι του προστάτη εμφανίζουν τερματικό χαρακτηριστικά σύλληψη ανάπτυξης ως του κυρίαρχου τρόπου κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από ακτινοβολία [21], [22], και αυτή η αργή κινητική του κυτταρικού θανάτου μετά από RT μπορεί σε μεγάλο βαθμό να επηρεάσει επανοξυγόνωση του όγκου. Αναλύσαμε την εξέλιξη του όγκου και αγγείωση δομικές και λειτουργικές αλλαγές και τις επιπτώσεις τους στο μικροπεριβάλλον του όγκου χρησιμοποιώντας ένα κλινικά σχετικό σύστημα κλασματοποίησης (2 Gy × 5 κλάσματα /εβδομάδα κατά τη διάρκεια 2 εβδομάδες) σε ένα ορθοτοπικό μοντέλο καρκίνου του προστάτη. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι αντίθετα με υποκαταμερισμένη ακτινοθεραπεία, CFRT δεν επηρεάζει την πυκνότητα του σκάφους, αλλά αναδιαμορφώνει αγγείωσης του όγκου, αυξάνοντας περιαγγειακή κάλυψης, βελτίωση αιμάτωσης σκάφους και οδηγεί σε μειωμένη υποξία.

Αποτελέσματα

Συμβατικά ακτινοθεραπείας ελέγχους θεραπεία όγκων του προστάτη ανάπτυξης

Για να μελετήσουμε τις αλλαγές του όγκου και μικροπεριβάλλον του κατά τη διάρκεια μιας κλινικά σχετικό πρωτόκολλο της θεραπείας με ακτινοβολία, που προκαλείται από ορθοτοπική καρκίνου του προστάτη σε ποντίκια. Δύο εβδομάδες μετά τα κύτταρα εγχύθηκαν, ζώα που φέρουν όγκο έλαβαν ημερήσια δόση από 2 Gy ακτινοβολίας με επίκεντρο κάτω κοιλιακή χώρα, κάθε ημέρα της εβδομάδας για δύο εβδομάδες (συμβατικά κλασματοποιημένη ραδιοθεραπεία, CFRT? Εικ. 1Α). Αυτό το πρωτόκολλο μιμείται τις δύο πρώτες εβδομάδες της θεραπείας με ακτινοβολία για ασθενείς με καρκίνο του προστάτη. Τα ζώα θανατώθηκαν και αναλύθηκαν σε 0 (μη ακτινοβολημένα), 1 (2 Gy), 3 (6 Gy), 7 (10 Gy) και 14 ημέρες (20 Gy) κατά τη διάρκεια της θεραπείας. Όπως ήταν αναμενόμενο, η ακτινοβόληση οδήγησε σε σημαντική μείωση του βάρους του όγκου σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα ζώα (ακτινοβολημένα: 237 ± 37 mg σε σχέση με μη ακτινοβολημένα: 777 ± 135 mg, ρ & lt? 0,01, Σχήμα 1Β.). Επίσης, η ακτινοβολία είχε προτιμησιακή επίδραση επί πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα όγκου, σε σύγκριση με παρακείμενες υγιείς ιστούς (Εικ. 1 C). Μείωση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού ήταν ορατή από την ημέρα 1, και πιο έντονη με το χρόνο (-54% σε Τ14 έναντι t0, ρ & lt? 0,01, Σχήμα 1ϋ, Ε.). Παράλληλα, ο κυτταρικός θάνατος αυξήθηκε ταχέως κατά την ημέρα 3 (+ 109%, ρ & lt? 0,05) και παρέμεινε μη σημαντικά υψηλότερη από την αρχική τιμή μετά (Σχήμα 1 D, F.). Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα είναι σύμφωνα με τις αργή κινητική αντιδράσεων που παρατηρήθηκε για τους ασθενείς με καρκίνο του προστάτη.

(Α) Σχέδιο του συμβατικού πρωτοκόλλου κλασματοποιημένη ακτινοθεραπεία (CFRT) που χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία των εγκατεστημένων όγκων του προστάτη. (Β) Βάρος αποκόπηκαν όγκων μετά τον υποδεικνυόμενο χρόνο της CFRT. Τιμές = μέσος όρος των n≥6 ± SEM. Στατιστική σύγκριση εναντίον Τ14 ακτινοβοληθεί. (Γ) Παράδειγμα ενός όγκου αγωγή για μία εβδομάδα, που δείχνει τα καρκινικά κύτταρα TUNEL + ( «Τ») και φυσιολογική γειτονικούς ιστούς ( «Ν»), κυρίως TUNEL-. Όγκου και φυσιολογικών ιστών προσδιορίστηκαν με DAPI βασίζονται σε πυρήνες μορφολογία, μέγεθος, ένταση χρώσης και χωροταξική οργάνωση των κυττάρων. (D) Ψευδο-συνεστιακή εικόνες των όγκων κατά τη διάρκεια CFRT, βάφονται για Ki-67 /TUNEL /CD31. (Ε, F) Εικόνα ποσοτικοποίηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού (Ki-67 index, E) και τον κυτταρικό θάνατο (δείκτης TUNEL, F). Στατιστικές συγκρίσεις εναντίον t0.

Η

CFRT μειώνει υποξία και αυξάνει την αιμάτωση του όγκου

Η υποξία αποτελέσματα από την υπερκατανάλωση οξυγόνου από τα κύτταρα του όγκου, καθώς και ανωμαλία του όγκου των αιμοφόρων αγγείων. Για να προσδιοριστεί το πρότυπο της υποξίας, ένας σημαντικός παράγοντας ραδιοαντοχή, κατά τη διάρκεια CFRT, χρησιμοποιήσαμε το EF5 εξωγενή δείκτη [23], η οποία τονίζει σοβαρή. (& Lt? 0,2% O

2), radiobiologically-σχετική υποξία (Σχ S1 Α-Γ ). EF5-θετικά επιφάνεια μετρίως αυξημένη κατά την ημέρα 1 (+ 45%), αν και όχι σημαντικά, με κάποιες υποξικές περιοχές κοντά των αιμοφόρων αγγείων, γεγονός που υποδηλώνει ότι δεν είναι όλα τα σκάφη διαχύθηκαν (Σχ. 2Α-Β). Ωστόσο, υποξία μειώθηκε σε όλα τα επόμενα χρονικά σημεία, για να φθάσει μόνο 11,4% των t0 στις 2 εβδομάδες (ρ & lt?. 0.05, Σχήμα 2Α-Β).

(Α) Ψευδο-συνεστιακή εικόνες των όγκων κατά τη διάρκεια CFRT, χρωματίστηκαν για υποξία (EF5) και ενδοθηλιακά κύτταρα (CD31). (Β) την ποσοτικοποίηση Εικόνα του EF5 + επιφάνειας σε όγκους κατά τη διάρκεια CFRT. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο των n≥13 ανά σημείο ± sem. (C) Ψευδο-συνεστιακή εικόνες των όγκων διάχυση με Hoechst 33342 και 10 kDa /2 δεξτράνες MDa πριν (t0) ή μετά από 2 εβδομάδες CFRT (Τ14). SYBR πράσινο χρησιμοποιήθηκε ως αντιχρώση του συνολικού κυτταρικών πυρήνων. (D, E, F) ποσοτικοποίηση Εικόνα Hoechst + (Δ), και μέσο (Ε) και μεγάλες (F) δεξτράνη + επιφάνειες σε όγκους κατά την διάρκεια CFRT (n = 6). (B, D, E, F). Στατιστικές συγκρίσεις εναντίον t0.

Η

Για να αξιολογηθεί η λειτουργικότητα του σκάφους, φθορίζοντα μόρια διαφορετικών μεγεθών χορηγείται με ενδοφλέβια ένεση. Μεγάλες (2 MDa δεξτράνη) μόρια που παραμένουν ενδαγγειακή υπόψη για την αιμάτωση, μέσο (10 kDa δεξτράνη) για διάμεση διάχυσης και μικρό (Hoechst 33342, 616 Da) για την διαπερατότητα. Ενώ σε μη ακτινοβολημένα όγκων, μόνο διακριτές περιοχές είχαν θετική χρώση, η επιφάνεια διανομή όλων των μορίων ήταν σε μεγάλο βαθμό αυξημένη μετά από 2 εβδομάδες CFRT και ήταν πιο ομοιογενής (Σχ. 2C-F). Κατανομή των Hoechst φθάσει σε τιμή κοντά σε αυτή του κανονικού προστάτη (t0: 0,10 vs. T14: 0.33, ρ & lt? 0,01, Σχήμα 2C-D? Κανονικό:. 0.41, Σχήμα S2.). Η συνολική επιφάνεια του μέσου (10 kDa) και μεγάλες (2 MDA) δεξτράνες αυξήθηκε επίσης (t0: 0.011 vs. T14: 0.029, ρ & lt? 0,05, Σχήμα 2C, Ε και t0: 0,0054 vs. T14:. 0,010, ρ & lt? 0.05, Σχ. 2C, F), αν και δεν είναι συγκρίσιμα με φυσιολογικούς ιστούς (0.12 και 0.02, Σχ. S2) ως πυκνότητα μικροαγγείων (MVD) είναι ≈ 3 φορές χαμηλότερη σε όγκους (Σχ. S3A-C). Και οι δύο δεξτράνες παρέμεινε Διακοπτόμενης, δείχνει κανένα σημάδι σημαντικής διάχυσης που θα αντιπροσωπεύουν διαρροή δοχείο (2 MDA) ή μη φυσιολογική διαπερατότητα (10 kDa). Η παρόμοια αύξηση ανεξαρτήτως του μορίου μέγεθος είναι σύμφωνο με την αύξηση της αιμάτωσης (π.χ. αυξημένη ροή αίματος). Είναι ενδιαφέρον, καμία σημαντική αύξηση της αιμάτωσης παρατηρήθηκε στην κανονική acini προστάτη (Σχ. S4A-D). Έτσι, CFRT βελτιώνει προτίμηση αιμάτωσης σκάφος στο πλαίσιο του μικροπεριβάλλοντος του όγκου.

CFRT δεν επάγει αλλαγές στην πυκνότητα σκάφος, το μέγεθος ή τη διανομή

Βελτιωμένη αιμάτωσης στα πλαίσια της χημειοθεραπείας του όγκου έχει συσχετιστεί με αγγειακή εξομάλυνση, και ενισχύει την ακτινοθεραπεία [24]. Ωστόσο, οι αλλαγές του όγκου που σχετίζεται με αγγειακό σύστημα κατά την διάρκεια CFRT δεν έχουν μελετηθεί. Ως εκ τούτου, ερευνήθηκε πυκνότητα και τη δομή μικροαγγείων σε όγκους ακτινοβολούνται σε διαφορετικούς χρόνους. MVD ήταν σταθερό κατά την διάρκεια της χρονικής πορείας του πειράματος, από 51 ± 8 μικροαγγείων /mm

2 σε t0 έως 54 ± 7 σε Τ14 (Σχ. 3Α), σε αντίθεση με μη ακτινοβολημένα όγκους, οι οποίοι παρουσίασαν σημαντική αύξηση (από 47 ± 7 σε 80 ± 8, ρ & lt?. 0.01, Σχήμα S5A, Β). Αξίζει να σημειωθεί ότι αυτό είναι πολύ χαμηλότερο εκείνο που παρατηρήθηκε στο φυσιολογικό προστάτη με ένα MVD 166 ± 6 (Σχ S3C, ρ & lt?. 0,01 vs. όγκου κατά t0), η οποία μπορεί να εξηγήσει την υποξία ανιχνεύθηκε σε μη επεξεργασμένα όγκους. Η διατήρηση της MVD μας ώθησε να καθορίσει αν ενδοθηλιακών κυττάρων θάνατος επέρχεται κατά τη διάρκεια CFRT. Ως εκ τούτου, μετρήθηκε το δείκτη TUNEL σε CD31 + κύτταρα. CFRT δεν προκάλεσε θάνατο ΕΚ (Σχ. 3C, D), παρά την τάση κατά την ημέρα 1 (+ 28%, ρ = 0,37), η οποία ήταν συνεπή με την μη σημαντικές ελάχιστο MVD την ημέρα 3 (Εικ. 3Α). Επιπλέον, το ποσό της χρώσης TUNEL + δεν ήταν σύμφωνη με τη μαζική βλάβη των ενδοθηλιακών κυττάρων. Στη συνέχεια, στο λογαριασμό για ετερογένεια διανομή των αιμοφόρων αγγείων, προσδιορίσαμε την απόσταση των κυττάρων (που προσδιορίζονται από DAPI) προς το πλησιέστερο σκάφος. Χρησιμοποιώντας αυτή την ανάλυση, η ελαφρά και παροδική μείωση MVD παρατηρήθηκαν την ημέρα 3 (Εικ. 3Α) είχε ως αποτέλεσμα ένα ήπιο αλλά unsignificant μετατόπιση των κυττάρων προς ένα θεωρητικά υποξικό περιβάλλον (& gt? 100 μm από το πλησιέστερο σκάφος, Σχήμα 3Β.). Ωστόσο, κατά τη χρονική στιγμή όπου η υποξία ήταν απούσα και διάχυση επαυξημένη (Τ14), το προφίλ απόσταση των κυττάρων των αιμοφόρων αγγείων ήταν ταυτόσημη με μη ακτινοβολημένα όγκους (t0: 21,3 εναντίον T14: 24,9% των κυττάρων σε περισσότερα από 100 μm). Επιπλέον, οι τιμές ήταν σε μεγάλο βαθμό μακρύτερα από αυτές που συναντώνται στο κανονικό προστάτη (S3A, F). Έτσι, η αύξηση της παράδοσης των Hoechst /δεξτρανών που παρατηρείται μετά από ακτινοβολία μπορεί να οφείλεται στην ποιότητα σκάφος και όχι στην ποσότητα. Ως εκ τούτου, αναλύσαμε τη μορφολογία του δικτύου σκάφους σαρώνοντας τους ιστούς πάνω από ένα πάχος 100 μm. Παρ ‘όλα αυτά, σε σύγκριση με μη ακτινοβολημένα όγκους, όγκους που συγκομίζονται την ημέρα 14 κατά τη διάρκεια της CFRT δεν έδειξε καμία διαφορά στην αγγείο διακλάδωσης (t0: 8,9 υποκατάστημα /mm εναντίον Τ14: 7,6, ρ = 0,32? Σχ 3Ε, F.), Διάμετρος (t0: 9,5 μm εναντίον t14: 8,6 μm, p = 0.21). Συνολικά, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η μειωμένη υποξία /επαυξημένης αιμάτωση κατά τη διάρκεια CFRT δεν συσχετίζεται με καλύτερη αγγειακή πυκνότητα, την τοπογραφία ή τη μορφολογία.

(Α) μικροαγγειακή πυκνότητα σε όγκους κατά τη διάρκεια CFRT. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο των n≥13 ανά σημείο ± sem. (Β) προφίλ Απόσταση μεταξύ των κυττάρων και του πλησιέστερου αιμοφόρο αγγείο, από όγκους κατά την διάρκεια CFRT. Τα προφίλ με βάση n≥13. Στατιστικές συγκρίσεις εναντίον t0. (C) Ψευδο-συνεστιακή εικόνες σχετίζονται με τον όγκο αιμοφόρων αγγείων (CD31 +) βάφτηκαν για TUNEL διάρκεια CFRT. Βέλη: TUNEL + /CD31 + κύτταρα. (D) ποσοτικοποίηση Εικόνα του CD31 + /TUNEL + επιφάνεια. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο των n≥13 ανά σημείο ± sem. (Ε) Αντιπροσωπευτικές εικόνες Z-στοίβα 100 τομές μm πάχους όγκου πριν (t0) ή μετά από 2 εβδομάδες CFRT (t14) και βάφτηκαν για τα αιμοφόρα αγγεία (CD31 + /Fli-1 +). (F) Η ανάλυση εικόνας του δικτύου αιμοφόρων αγγείων από 100 τμήματα μm πάχους όγκου. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο η = 9 ανά σημείο ± sem.

Η

CFRT επάγει την ωρίμανση του

αγγειακού τοιχώματος

Ανώμαλη καρκινικά αγγεία συχνά εμφανίζουν μη συνεχή ενδοθηλιακού τοιχώματος, με αποτέλεσμα επιδεινωμένο διαπερατότητα και διαρροή. Για να εκτιμήσουμε τα ενδοθηλιακά συνοχής τοίχο, θα βάφονται για zonula-Οοοίιιάεηδ (ZO) -1, μια πρωτεΐνη που εμπλέκεται στην σφιχτό κόμβους. Τα ενδοθηλιακά (CD31 +) – συγκεκριμένο δείκτη ΖΟ-1 ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω μετά από 2 εβδομάδες CFRT (+ 38% του t0, ρ & lt?. 0,05? Σχήμα 4Α, Β). Το πιο σημαντικό, αυτό συνδέθηκε με αύξηση της κάλυψης των ενδοθηλιακών κυττάρων με άλφα λείου μυός ακτίνη (SMA) θετικά κύτταρα (+ 111% του t0, ρ & lt? 0,05? Σχ. 4Α, C). Με συνεστιακή μικροσκοπία και ανάλυση ιστόγραμμα, ΖΟ-1 επιβεβαιώθηκε να είναι ενδοθηλιακά (στο εσωτερικό των κυττάρων CD31 εκφράζουν) και εκφράζεται συνεχώς, ειδικά μετά την ακτινοβόληση (Σχ. S6a-Β). Στο αντίθετο, η SMA ήταν μη-ενδοθηλιακά και αντιπαρατίθεται στην ενδοθηλιακή τοίχο. Για ακριβή η φύση των περιαγγειακών κυττάρων, ιστοί συν-χρώση για δεσμίνη, ένας δείκτης περικύτταρο [25]. Εκτός από το ευρετήριο SMA, δεσμίνης + περιαγγειακά κύτταρα αυξήθηκαν επίσης (t0: 0.034 vs. T14: 0.065, ρ & lt? 0,01? Σχήμα 4D.). Επιπλέον, SMA και δεσμίνης συν-εκφράζεται από τα ίδια κύτταρα (Σχ. 4Ε, F). Επίσης, η συχνότητα της δεσμίνης + /SMA + καλύπτονται σκαφών διπλασιάστηκε μεταξύ ημέρα 0 και την ημέρα 14 της CFRT (t0: 20.0 έναντι T14: 39.4, p & lt? 0,05). Της σημείωσης, SMA και δεσμίνη ήταν επίσης συν-εκφράζεται σε σπάνιες καλυμμένα μη ακτινοβολημένα αγγεία (Εικ. S7). Στον κανονικό προστάτη, δεσμίνη εκφράστηκε τόσο από μικρο (ενδο-acini) και μακρο (μεταξύ acini) -vessels, αν SMA ήταν αυστηρά περιορισμένη σε μακρο-σκάφη (Fig.S3A, D-Ε, Εικ. S8A-Β). Επιπλέον, καμία αυξορρύθμιση του SMA ανιχνεύθηκε σε ακτινοβολημένα κανονική μικροαγγεία (Σχ. S9A, C), ούτε σε μη ακτινοβολημένα μικροαγγείων του όγκου (Σχ. S5c, D). Έτσι, η αύξηση του περιαγγειακή + /SMA + κυττάρων δεσμίνης είναι ειδικό ακτινοβολημένων μικροαγγείων του όγκου.

(Α) Ψευδο-συνεστιακή εικόνες των αιμοφόρων αγγείων του όγκου κατά τη διάρκεια CFRT και χρωματίστηκαν για ΖΟ-1 /CD31 (επάνω) ή SMA /CD31 (κάτω). (Π.Χ). ποσοτικοποίηση της εικόνας της ΖΩ-1 + /CD31 + (Β) και περι-CD31 + SMA επιφάνειες (C). Οι τιμές αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο των n≥13 ανά σημείο ± sem. (D) ποσοτικοποίηση Εικόνα του περι-CD31 + επιφάνεια δεσμίνη και η συχνότητα των σκαφών δεσμίνης + /SMA +. (Β, Ε, D) Στατιστικές συγκρίσεις εναντίον t0. (Ε) Αντιπροσωπευτικές εικόνες συνεστιακού ενός αιμοφόρου αγγείου από έναν όγκο αγωγή 14-ημερών χρωματίστηκαν για CD31 /δεσμίνη /SMA. (F) ανάλυση ιστόγραμμα CD31 /δεσμίνης /SMA προφίλ ψευδόχρωμα της ομοεστιακό εικόνα διατομής.

Η

Συζήτηση

Αν και αρκετές μελέτες δείχνουν ότι η ακτινοβολία οδηγεί σε καταστροφή του σκάφους, το αποτέλεσμα της συμβατικά κλασματοποιημένη ακτινοβολία έχει σε μεγάλο βαθμό ανεξερεύνητη. Χρησιμοποιήσαμε ένα ορθοτοπικό μοντέλο καρκίνου του προστάτη με κλινικά σχετικό σύστημα κλασματοποίησης, προκαλώντας μέτρια θάνατο των κυττάρων, αυξάνοντας τη σύλληψη του πολλαπλασιασμού με τη δόση και διαφορετική επίδραση μεταξύ των φυσιολογικών κυττάρων /όγκου. Θεωρούμε ότι CFRT καταργηθεί σχεδόν υποξία του όγκου μετά από 2 εβδομάδες θεραπείας, σε συνδυασμό με αυξημένη αιμάτωση. Απροσδόκητα, αυτές οι επιδράσεις δεν σχετίστηκαν με σημαντικές αλλαγές στη μορφολογία σκάφος ή πυκνότητα, αλλά μάλλον με φαινοτυπική ωρίμανση του αγγειακού τοιχώματος, συμπεριλαμβανομένων των ενδοθηλιακών κυττάρων (CD31 + /ΖΩ-1 +) και περικύτταρα (δεσμίνη + /SMA +). Συνολικά, αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι η αγγειακή προσαρμογή παίζει μια ακάλυπτη ρόλο στην επανοξυγόνωση του όγκου κατά τη διάρκεια της κλασματοποιημένη ακτινοθεραπεία.

Εμείς δεν παρατηρήσαμε μια δραστική αύξηση των αποπτωτικών ενδοθηλιακά κύτταρα 24 ώρες μετά την καθημερινή 2 προσπίπτουσα ακτινοβολία Gy, και MVD παρέμεινε σταθερή, συνεπή με πρόσφατες πληροφορίες σε φυσιολογικό αιμοφόρα αγγεία του εγκεφάλου [13]. Αυτά τα αποτελέσματα έρχονται σε αντίθεση με προηγούμενες μελέτες που χρησιμοποιούν υψηλότερη δόση ακτινοβολίας, όπου τα ενδοθηλιακά κυτταρικό θάνατο και μείωση της πυκνότητας των αγγείων αναφέρθηκαν, αν και σε προηγούμενα χρονικά σημεία [2], [4]. Ιδιαίτερα, κλάσματα 4 και 12 Gy για 2-3 εβδομάδες οδήγησε σε αύξηση των ενδοθηλιακών κυττάρων και του θανάτου μειώθηκε MVD σε υποδόριους όγκους [8], [9], [10]. Αυτό είναι εκπληκτικό αφού απόπτωση των ενδοθηλιακών πιστεύεται ότι συμβαίνει μόνο σε εφάπαξ δόσεις ≥ 10-15 Gy [2], [4]. Ωστόσο, ΕΚ θάνατος μπορεί να εξαρτάται από τη ρύθμιση του όγκου, δεδομένου ότι μόνο μικρές αγγειακές αλλοιώσεις παρατηρήθηκαν 24 ώρες μετά από μία απλή δόση 15 Gy σε άλλο μοντέλο καρκίνου του προστάτη [26]. Διαφορετικές ενδοθηλιακών κυττάρων μέλη μεταξύ των μελετών μπορεί να ευθύνεται για τις διαφορές στο ακτινοευαισθησία, αφού ηρεμίας ενδοθηλιακά κύτταρα είναι πιο ανθεκτικά σε βλάβη του DNA που προκαλείται από ακτινοβολία, αλλά όχι σε βραχυπρόθεσμη κυτταρικό θάνατο μεμβράνη που προκαλείται [14] [15]. Αυτό μπορεί να εξηγήσει ότι οι παρατηρούμενες αυξήσεις pericytic κάλυψη και αιμάτωσης ήταν σημαντικές μόνο στο διαμέρισμα ακτινοβολημένα όγκου, όπου το περιβάλλον μικροαγγειακή μπορεί να ανταποκρίνεται περισσότερο /ανεκτική. Αυτά τα αποτελέσματα απεικονίζουν την πολυπλοκότητα της αγγείωσης του όγκου και ετερογενείς απάντησή της σε θεραπείες. Ίσως η σημασία μιας ορθοτοπική ρύθμιση είναι συχνά κάτω-εκτιμήθηκε από τα αιμοφόρα αγγεία εμφανίζουν ισχυρή ετερογένεια μεταξύ οργάνων (π.χ. ανδρογόνων έκφραση του υποδοχέα για το ενδοθήλιο του προστάτη, το φράγμα αίματος-εγκεφάλου κλπ ..). Πράγματι, οι όγκοι PC3 προερχόμενο αναπτύχθηκαν υποδορίως έχουν ουσιαστικά μεγαλύτερη μέγεθος του σκάφους και την πυκνότητα (≈ x3, τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Το πιο σημαντικό, πρόσφατες μελέτες με τη χρήση υψηλότερων δόσεων κλάσμα είναι σε συμφωνία με την εργασία μας για τη μείωση των όγκων υποξία και την αύξηση της αιμάτωσης μαζί με την κάλυψη περικύτταρο [9], [10], εκτός από μία αναφορά χρησιμοποιώντας πολύ υψηλή (30 Gy) εφάπαξ δόση ακτινοβολίας [ ,,,0],27]. Συλλογικά, οι μελέτες αυτές δείχνουν ότι η αυξημένη περιαγγειακή κάλυψης μπορεί να διαδραματίσει ουσιαστικό ρόλο στην αιμάτωση των πλοίων και επανοξυγόνωση μετά κλασματοποιημένη ακτινοβολία.

Η διατήρηση του αγγειακού συστήματος θεωρείται πλέον θετικά για τη θεραπεία του καρκίνου, λόγω της έννοιας της αγγειακής κανονικοποίησης. Η έννοια πέρα ​​από αυτή την παρατήρηση ήταν ότι καταστρέφουν το αγγειακό σύστημα θα παρήγαγε υποξία που καθιστά ακτινοβολία λιγότερο αποτελεσματική. Η αρχική παρατήρηση ήταν ότι η αναστολή της αγγειογένεσης υπερπαραγωγικοΧυ με ένα αντίσωμα αντι-VEGFR2 στρατολογεί περικύτταρα προσωρινά και ρυθμίζει προς τα κάτω την υποξία του όγκου [24]. Δεδομένου ότι η ανεξέλεγκτη βλάστηση ΕΚ έχει συσχετιστεί με μη λειτουργικές αγγειογένεση, ακτινοβολία επαγόμενη κλάδεμα των αγγειακών λάχανα μπορεί να οδηγήσει σε μειωμένη πολυπλοκότητα του δικτύου και τη βελτίωση της αιμάτωσης [15]. Ωστόσο, δεν βρήκαμε βασικά χαρακτηριστικά που χαρακτηρίζουν ομαλοποιημένη αιμοφόρα αγγεία από την διακλάδωση, MVD, στρεβλότητα και διαμέτρου των αγγείων παρέμειναν αμετάβλητες. Αν και διάχυσης ήταν παρόμοια σε κάποιες πλευρές με εκείνη του φυσιολογικού προστάτη, φαινότυπος σκάφος ήταν διακριτά, με υψηλότερες ΖΟ-1 σε ακτινοβολημένα σκάφη από ό, τι συνήθως. Επιπλέον, στο κανονικό προστάτη, η περίμετρος της μικρο-σκαφών ήταν σταθερά δεσμίνης + /SMA-, ενώ η έκφραση SMA ήταν αυστηρά περιορισμένη σε μεγάλες, μεταξύ acini σκαφών. Αυτή η αγγειακή ιεραρχία βρίσκεται επίσης σε ανθρώπινα δείγματα [28]. Σε αντίθεση, τα ακτινοβολημένα όγκου μικρο-αγγείων (≈ 10 μm διάμετρο) κέρδισε περιαγγειακή έκφραση της SMA. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι το τοίχωμα του αγγείου θα μπορούσε να διαφοροποιήσει μοναδικά μετά από ακτινοβόληση, σε συμφωνία με άλλες αναφορές σχετικά με περιαγγειακή κυτταρική απόκριση σε φλεγμονώδη στρες (TGFb, PDGFb).

Η ανώμαλη έκφραση των ενδοθηλιακών συνδετική πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένης ΖΟ-1, μπορεί να προκύψει σε περίπτωση απουσίας του ενδοθηλιακού κυττάρου πόλωση [29] ή λίγο (π.χ. min.) μετά την ακτινοβόληση [30]. Ωστόσο, η αυξημένη ενδοθηλιακή ΖΟ-1 που παρατηρείται εδώ μετά από 2 εβδομάδες είναι πιθανόν σχετίζεται με σταθεροποίηση σκάφος από το 1) δεδομένα αιμάτωσης μας δείχνουν ότι τα περισσότερα σκάφη αποτελεσματικά lumenized και 2) το σχέδιο των ΖΟ-1 είναι μεμβρανώδη, γραμμική και συνεχής. Όσο για την περιαγγειακή ωρίμανση, η στενή συνεργασία με τα ενδοθηλιακά κύτταρα CD31-αντιχρωματίζεται και η παρουσία των δύο δεικτών (δεσμίνη /SMA) εντοπίζουν τα γύρω κύτταρα και περικύτταρα [25]. Περιαγγειακή κύτταρα είναι σημαντικοί ρυθμιστές των αγγειακών σχηματισμό, τη σταθεροποίηση, την αναδιαμόρφωση και λειτουργούν για να δημιουργήσει μια ώριμη, ηρεμίας αγγειακό σύστημα [31]. Ωρίμανση των πλοίων γίνεται μέσω αμοιβαίων παρακρινούς σηματοδότησης, όπου ΕΚ που προέρχονται από παράγοντες που προσελκύουν περικύτταρα και αργότερα υπέρ η δημιουργία κόμβων των ενδοθηλιακών κυττάρων [32]. Σπουδαιότητας, περικύτταρο-εκκρίνεται συνθήματα προστασία ECS από την ακτινοβολία που προκαλείται από το θάνατο

in vitro

[33]. Αυτό υποδηλώνει ότι τα πλοία χωρίς κάλυψη περικύτταρο θα είναι πιο ευάλωτα σε ακτινοβολία, όπως υπέθεσαν πρόσφατα από Chen et al [9]. Ως εκ τούτου, κλασματοποιημένα αγωγές ακτινοβολίας, οι οποίες επιτρέπουν την αγγειακή ωρίμανση, μπορεί να βελτιώσει όγκου αγγειακή λειτουργία.

Τα στοιχεία μας δείχνουν μια μείωση του υποξικού κλάσματος μετά από δύο εβδομάδες θεραπείας και είναι σε συμφωνία με πρόσφατα δεδομένα στον υποδόριο όγκους [9 ], [10], [34]. Tumor επανοξυγόνωση ορίστηκε ως η ιδέα ότι χρονίως υποξικά νεοπλασματικά κύτταρα να αποκτήσουν μια καλύτερη πρόσβαση σε οξυγόνο κατά τη διάρκεια της κλασματοποιημένη ραδιοθεραπεία επειδή τα αερόβια κύτταρα όγκου απομακρύνονται από τα προηγούμενα κλάσματα [35]. Στο μοντέλο μας, επανοξυγόνωση του όγκου συνέβη όχι μόνο στο πλαίσιο της μειωμένο πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και την αυξημένη κυτταρικό θάνατο, αλλά επίσης με ένα βελτιωμένο λειτουργικότητα του αγγειακού συστήματος αποδεικνύεται από αιμάτωσης και διάχυση των μικρών μορίων. Αυτό σημαίνει ότι επανοξυγόνωση του όγκου οφείλεται όχι μόνο στην αυξημένη θανάτωση των καρκινικών κυττάρων και λιγότερη κατανάλωση οξυγόνου, αλλά επίσης σε μια καλύτερη κατανομή του οξυγόνου από τα αιμοφόρα αγγεία. Σε πειραματικά μοντέλα όγκων, καθώς και σε κλινικές μελέτες, intertumoral ετερογένεια στην κινητική της οξυγόνωσης κατά την διάρκεια κλασματοποιημένα δείχθηκε [36], [37], [38], [39]. Για παράδειγμα, σε καρκινώματα πλακωδών κυττάρων, υποξία μειώθηκαν κατά CFRT στην πλειονότητα των γραμμών του όγκου, ενώ σε μερικές κυτταρικές γραμμές όγκου παρατηρήθηκε μια χρονική αύξηση ή καμία αλλαγή και κλάσμα διαποτίστηκαν σκαφών και αγγειακή περιοχή έδειξε μόνο μικρές αλλαγές [34]. Επιπλέον, τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι κατά τη διάρκεια CFRT, σταθεροποίηση των σκαφών είναι απαραίτητη, έτσι ώστε οι 2

ου κλάσματα εβδομάδας να γίνει πιο αποτελεσματική. Ενώ υπάρχει αυξανόμενο ενδιαφέρον για υποκαταμερισμένη πρωτόκολλα υψηλή δόση, ιδιαίτερα σε ασθενείς με καρκίνο του προστάτη [40], τα στοιχεία αυτά εγείρουν το ερώτημα κατά πόσον τα εν λόγω πρωτόκολλα διατηρηθεί το πλεονέκτημα της αύξησης των επιπέδων οξυγόνου και έτσι το θεραπευτικό δείκτη [41]. Σε άλλα μοντέλα όγκων ωστόσο, υποκαταμερισμένη (3 Gy /κλάσμα ακτινοθεραπεία) βελτίωσε οξυγόνωση μόνο κατά την αρχική φάση της θεραπείας, αλλά οδήγησε σε σημαντική μείωση της οξυγόνωσης του όγκου στην μετέπειτα φάση της ακτινοβολίας (& gt? 45 Gy) [42]. Έτσι, απαιτείται περισσότερη γνώση σχετικά με την επίδραση των αγγειακών ωρίμανσης για την ραδιοευαισθησία των καρκινικών κυττάρων.

Περιληπτικά, βρήκαμε ότι συμβατικά κλασματοποιημένο ακτινοβόληση επάγει αγγειακή ωρίμανση, μαζί με αυξημένη αιμάτωση /μειώνεται υποξία. Τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν ότι η αγγειακή μικροπεριβάλλον παίζει ένα ρόλο στην επανοξυγόνωση του όγκου, εκτός από τα γνωστά αποτελέσματα επί κυττάρων όγκου. Δεν είναι σαφές αν υποκαταμερισμένη πρωτόκολλα μπορούν να επιτρέπουν αγγειακή ωρίμανση ή αντί να οδηγήσει σε αγγειακή αποστείρωση και υποξία. Ο αντίκτυπος των εν λόγω πρωτοκόλλων στα αιμοφόρα αγγεία του όγκου και για την κλινική έκβαση θα πρέπει να είναι η προοπτική της περαιτέρω μελέτες.

Υλικά και Μέθοδοι

ορθοτοπική ογκογένεση του προστάτη και συλλογή ιστών

Επτά -Εβδομάδα παλιά αρσενικά NMRI-nude ποντίκια (Janvier, Άγιος Berthevin, Γαλλία) αναισθητοποιούνται χρησιμοποιώντας κεταμίνη /ξυλαζίνη (50/15 mg /kg) και 2 × 10

6 PC3-Luc κύτταρα (δαγκάνα Life Sciences, Villepinte, Γαλλία ) εγχύθηκαν στον αριστερό πλαγιοπίσθιο λοβό του προστάτη με χειρουργική επέμβαση. Μετά από δύο εβδομάδες, η πρόσληψη του όγκου επιβεβαιώθηκε με φωταύγεια χρησιμοποιώντας μια PhotonImager (BiospaceLab, Παρίσι, Γαλλία) και ομάδες με παρόμοια σήμα βιοφωταύγεια όγκου σχηματίστηκαν. Τα πειράματα άρχισαν 3 ημέρες αργότερα. Όταν θυσιάστηκαν περίπτωση, τα ζώα, ιστοί αποκόπηκαν και σταθμίζονται εάν είναι απαραίτητο, και καταψύχθηκαν (-80 ° C) ενσωματωμένα σε μέσο OCT (Sakura Finetek, Villeneuve D’Ascq, Γαλλία). Τα δείγματα συλλέχθηκαν κατά τη στιγμή της επόμενης CFRT κλάσμα, να αναλύσει κατάσταση του όγκου κατά τη χρονική στιγμή όπου θα πρέπει να αντιμετωπίζονται.

Όλα τα ζωικά πειράματα διεξήχθησαν σύμφωνα με την οδηγία του Ευρωπαϊκού Συμβουλίου 2010/63 /UE και που εγκρίθηκε από την τοπική επιτροπή φροντίδα των ζώων και τη χρήση (Comité d’en Ethique πειραματισμό Animale des Pays-de-la Loire, C2EA-06).

In vivo

υποξία και αιμάτωσης

υποξία και αιμάτωσης προσδιορίστηκαν με χρήση ειδικών δεικτών που χορηγήθηκαν IV σε φυσιολογικό ορό ρυθμιστικού. Για υποξία, 300 μΙ των 3 mg /ml EF5 (hypoxia-imaging.org) εγχύθηκαν 2 ώρες πριν να θυσιάζει [23], [43], ενώ 300 μΙ μικτών δεικτών αιμάτωσης (1,6 mg /ml Hoechst 33342, 0,6 mg /ml Alexa

647-10 δεξτράνη kDa και 3 mg /ml ροδαμίνης-2 MDa δεξτράνη? Life Technologies, Saint Aubin, Γαλλία) ενέθηκαν 3 min πριν από τη συλλογή των ιστών [44] οι ιστοί καταψύχθηκαν, cryosected, αντίθετα με SYBR Green (Fisher Scientific, Illkirch, France) για το σύνολο των κυτταρικών πυρήνων και τοποθετούνται σε Prolong Gold χωρίς DAPI (Life Technologies).

Ακτινοθεραπεία

οι ακτινοβολήσεις διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας ακτινοβολητή CP-160 X-ray (Faxitron, Lincolnshire, IL) με ένα φίλτρο Cu 0,3 mm, μια επιταχυνόμενη τάση των 160 kV και ένα ρυθμό δόσης 1,3 Gy /min. Τα ζώα έλαβαν μια δόση (κλάσμα) των 2 Gy καθημερινά από Δευτέρα έως Παρασκευή για δύο εβδομάδες, επικεντρώνεται σε μια κάτω κοιλιακή χώρα στον τομέα των 2 cm × 2 εκατοστά χρησιμοποιώντας ασπίδες μολύβδου που αποσκοπούν στην ελαχιστοποίηση της ακτινοβολίας σε φυσιολογικούς ιστούς και τα οστά (γοφούς). Το σύστημα αυτό (που ορίζεται εδώ ως συμβατικά κλασματοποιημένη ακτινοθεραπεία, CFRT) είναι καθιερωμένη κλινική πρακτική για τον καρκίνο του προστάτη

Η ανοσοϊστοχημεία

ιστοί cryosected σε πάχος 5 μm. (Εκτός από την ανάλυση του δικτύου: 100 μm) , μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη και κατέστησαν διαπερατά με 0,05% Triton-Χ100. IHC έγινε χρησιμοποιώντας πρότυπες χρώσης και οι διαδικασίες πλύσεως [45]. Για πολλαπλές χρώση, τα αντισώματα επωάστηκαν διαδοχικά: το πρώτο, όλη τη νύκτα ακολουθούμενο από δευτερογενή και τον καθορισμό, τότε CD31 ως δεύτερο και SMA ως το τρίτο. Τα ακόλουθα πρωτογενή αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν: αντι-ποντικού CD31 (BD Biosciences, Le Pont-de-Claix, Γαλλία), αντι-ΖΩ-1 (Life Technologies), αντι-δεσμίνης κουνέλι (Ozyme, St-Quentin-en-κουνέλι αρουραίος Yvelines, Γαλλία), κουνελιού αντι-Κί67 (Dako, Les Ulis, Γαλλία), κουνελιού αντι-Fli1 (Fisher Scientific) αντι-EF5, Cy3-συζευγμένο αντίσωμα αντι-άλφα λείου μυός ακτίνη ποντικού Alexa488-συζευγμένο ποντικού (Sigma, Saint-Quentin Fallavier, France). Τα δευτερεύοντα αντισώματα ήταν: Alexa

647-συζευγμένο γίδινο αντι-κουνελιού, Alexa

488-συζευγμένο γίδινο αντι-αρουραίου (Life Technologies). TUNEL πραγματοποιήθηκε όπως συνιστάται από τον κατασκευαστή (Roche, Boulogne-Billancourt, Γαλλία) ως τελευταίο βήμα χρώσης. Τα πλακίδια τοποθετούνται σε Prolong Gold με DAPI (Life Technologies) για πυρήνες αντιχρωματισμός (εκτός για προσδιορισμό διάχυσης).

Τα πλακίδια παρατηρήθηκαν υπό Axiovert 200Μ ApoTome ( «ψευδο-ομοεστιακό») μικροσκόπιο, με Axiovision 4,8 λογισμικό ( carl Zeiss, Le Pecq, Γαλλία). Ψηφιδωτά πεδίων έως 4 mm

2 καταγράφηκαν στο στόχο 63x πετρελαίου, και τέσσερις Ζ-βήματα του 1 μm ήταν στοιβάζονται σε μία εικόνα. Φέτες πάχους 100 μm συνήθως καταγράφονται σε ≈ 60 Ζ-βήματα του 1 μm, λόγω ιστός ισοπέδωση μετά την αφυδάτωση. Ομοεστιακό μικροσκόπιο έγινε με A1R (Nikon Instruments, Champigny-sur-Marne, Γαλλία) με το λογισμικό Νις-Elements, ένα αριθμητικό άνοιγμα των 1 και φέτα σάρωση του μέσου όρου της 4.

Ανάλυση εικόνας

αναλύσεις έγιναν στην ασυμπίεστη αρχική εικόνες 16-bit των ψηφιδωτών υψηλής ανάλυσης (ψευδο-συνεστιακή), εκτός από την κατανομή του χρώματος κατά μήκος των σκαφών διατομές (συνεστιακή? «ανάλυση ιστόγραμμα», βλέπε παρακάτω). καταγράφηκαν δύο τύποι τιμές: οι τιμές για τις αναλύσεις επιφανείας με βάση αντιστοιχούν σε επιφάνειες χρώση (μm

2) θεωρείται θετική για την χρώση των τόκων (ex, περιοχή CD31) διαιρούμενο με την επιφάνεια της περιοχής ενδιαφέροντος (ROI? ex , το σύνολο των ιστών)? τιμές για τις αναλύσεις που βασίζονται σε αντικείμενα αντιστοιχεί στον απόλυτο αριθμό των στοιχείων θεωρείται θετικό (πρώην, αριθμός σκαφών) διαιρούμενο με την επιφάνεια του ROI (πρώην, σύνολο ιστού).

αναλύσεις επιφανείας βασίζονται πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση ImageJ λογισμικού 1.46r (National Institutes of Health, USA).