Αφηρημένο

Νόσος προσανατολισμένη λειτουργική ανάλυση των επιγενετικών παραγόντων και των ρυθμιστικών μηχανισμών τους σε παρεκκλίνουσα αποσιώπηση αποτελεί προϋπόθεση για την καλύτερη διάγνωση και θεραπεία. Ωστόσο, οι ακριβείς μηχανισμοί είναι ακόμα ασαφείς και περίπλοκες, που περιλαμβάνει την αλληλεπίδραση πολλών δραστών, συμπεριλαμβανομένων νουκλεοσώματος τοποθέτηση, μεθυλίωση του DNA, οι παραλλαγές της ιστόνης και τροποποιήσεις των ιστονών. Διερευνήθηκε η επιγενετικό πολυπλοκότητα σίγηση στο ογκοκατασταλτικό γονίδιο

Cadm1

σε προγονικά κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα ποντικού, που εμφανίζουν υπερμεθυλίωση προαγωγού που συνδέονται με την καταστολή της μεταγραφής, αλλά ως επί το πλείστον δεν ανταποκρίνεται στις θεραπείες απομεθυλίωσης φάρμακο. Μετά την πρόβλεψη νουκλεοσώματος θέσεις και θέσεις πρόσδεσης μεταγραφικού παράγοντα κατά μήκος του

Cadm1

υποστηρικτής, θα πραγματοποιηθεί χαρτογράφηση ένα μόνο μόριο με DNA μεθυλοτρανσφεράση

M.Sss

Ι, η οποία αποκάλυψε σε σιωπηλή υποστηρικτές υψηλής νουκλεοσώματος πληρότητας και απόφραξη των θέσεων σύνδεσης παράγοντα μεταγραφής. Επιπλέον,

M.Sss

χάρτες Ι υποστηρικτές ποικίλλει εντός και μεταξύ των διαφόρων κυτταρικών σειρών καρκίνου του πνεύμονα. ανάλυση χρωματίνης με μικροκοκκική νουκλεάση αναφέρεται επίσης παραλλαγές στην νουκλεοσώματος τοποθέτησης να έχουν επιπτώσεις στην πρόσδεση των παραγόντων μεταγραφής κοντά νουκλεοσώματος σύνορα. Χρωματίνης ανοσοκατακρήμνισης έδειξε ότι οι παραλλαγές των ιστονών (H2A.Z και Η3.3), και αντιπαρατιθέμενων σημάτων τροποποίηση των ιστονών (H3K4me3 και H3K27me3) όλα colocalized στις ίδιες θέσεις νουκλεοσώματος που θυμίζει επιγενετικών πλαστικότητας σε εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα. Συνολικά, επιγενετική αποσιώπηση πολυπλοκότητα στην περιοχή του υποκινητή του

Cadm1

δεν προσδιορίζεται μόνο από υπερμεθυλίωση του DNA, αλλά υψηλής νουκλεόσωμα πληρότητας, μεταβάλλεται τοποθέτηση νουκλεοσώματος και «δισθενή» τροποποιήσεις των ιστονών, ενδέχεται να συνέβαλαν επίσης στη μεταγραφική καταστολή αυτού του γονιδίου στα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Τα αποτελέσματά μας θα βοηθήσει στον καθορισμό των στρατηγικών θεραπευτικής παρέμβασης με τη χρήση επιγενετικών φαρμάκων στον καρκίνο του πνεύμονα

Παράθεση:. Reamon-Buettner SM, Borlak J (2012) Τεμαχίζοντας Επιγενετική κατασιγάσει Πολυπλοκότητα στην Καταστολή του καρκίνου του πνεύμονα Ποντίκι Gene

Cadm1

. PLoS ONE 7 (6): e38531. doi: 10.1371 /journal.pone.0038531

Επιμέλεια: Javier Σ Castresana, Πανεπιστήμιο της Ναβάρα, Ισπανία

Ελήφθη: 22 Σεπτέμβρη, 2011? Δεκτές: 7 Μάη του 2012? Δημοσιεύθηκε: 6 του Ιούνη 2012 |

Copyright: © 2012 Reamon-Buettner, Borlak. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Υπουργείο Επιστήμης και Πολιτισμού, Κάτω Σαξονία, Γερμανία 25A 5-7251-99 /00. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα παραμένει η κύρια αιτία θανάτου, αλλά οι μοριακοί μηχανισμοί της νόσου είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστη. Πολλές μελέτες δείχνουν τώρα ότι οι γενετικές και επιγενετικές αλλοιώσεις ως ενόχους [1]. Επιγενετικές γεγονότα είναι κληρονομικές αλλαγές στην έκφραση γονιδίων, χωρίς αλλαγές στην πρωτοταγή αλληλουχία του DNA. Είναι σημαντικό στην κανονική ανάπτυξη και διαφοροποίηση, αλλά όταν λάθος κατεύθυνση οδηγούν σε ασθένειες, ιδίως του καρκίνου [2]. Παρ ‘όλα αυτά, πολλές από τις διεργασίες που προκύπτουν στην γονιδιακή σίγηση μπορεί να αντιστραφεί με επιγενετικές φάρμακα, προσφέροντας μια ελπίδα για θεραπεία και θεραπεία [3]. Η επιγενετική τοπίο του σίγασης είναι, ωστόσο, σύμπλοκο που περιλαμβάνει την αλληλεπίδραση των μεγάλων τελεστών, συμπεριλαμβανομένων νουκλεοσώματος τοποθέτηση, μεθυλίωση του DNA, παραλλαγές ιστόνης, τροποποιήσεις των ιστονών και μη-κωδικοποίησης [4] RNAs. Πώς αυτά τελεστές αλληλεπιδρούν μεταξύ τους για να επηρεάζουν την έκφραση του γονιδίου και να προκαλέσουν ασθένεια παραμένει ασαφής.

Το DNA συσκευάζεται σε ένα σύνθετο δομή νουκλεοπρωτεΐνης στον πυρήνα ενός κυττάρου που ονομάζεται χρωματίνη, και η βασική επαναλαμβανόμενη μονάδα της χρωματίνης είναι γνωστές όπως νουκλεοσώματος, τη δομή και τη λειτουργία των οποίων εξακολουθούν να διασαφηνιστεί [5]. Κάθε νουκλεοσώματος αποτελείται από ένα οκταμερική πυρήνα των ιστονών (δύο αντίτυπα της Η2Α, Η2Β, Η3 και Η4), γύρω από τα οποία περίπου 147 bp του DNA που είναι τυλιγμένο σε 1,65 υπερελικοειδή στροφές. Νουκλεοσώματος τοποθέτηση διαδραματίζει κρίσιμο ρόλο στη χρωματίνη υψηλότερο αναδίπλωση της τάξης και στη ρύθμιση των γονιδίων [6] – [8]. Νουκλεοσώματα μπορεί να επηρεάσει τη μεταγραφή διαμορφώνοντας την προσβασιμότητα του DNA για ρυθμιστικές πρωτεΐνες και μεταγραφικό μηχανισμό, οδηγώντας σε ενεργοποίηση γονιδίου ή καταστολή. Νουκλεοσώματος τοποθέτηση μπορεί, με τη σειρά τους, να επηρεαστεί από διάφορους παράγοντες, συμπεριλαμβανομένων των προτιμήσεων DNA αλληλουχία, μεθυλίωση του DNA, παραλλαγές ιστόνης, και μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις των ιστονών [6]. Επιπλέον, νουκλεοσώματος τοποθετήσεως διαφέρει από νουκλεοσώματος πληρότητα, η οποία δεν λαμβάνει υπόψη νουκλεοσώματος αρχίζει την προϋπόθεση ότι ένα δεδομένο ζεύγος βάση είναι μέσα σε ένα νουκλεοσώματος [7].

Τροποποίηση από DNA μεθυλίωση λαμβάνει χώρα από την ομοιοπολική προσθήκη μιας ομάδας μεθυλίου στην θέση 5 του δακτυλίου κυτοσίνης, δημιουργώντας την 5-μεθυλκυτοσίνη. Μεθυλίωση του DNA είναι ένα πολύ γνωστό επιγενετική μηχανισμός σίγηση και σχετίζεται σε διάφορες βιολογικές διαδικασίες και ασθένειες (κριτικές, [4], [9]). Tet (δέκα έντεκα μετατόπιση) των πρωτεϊνών μπορεί να μετατρέψει 5-μεθυλκυτοσίνη (5mC) σε 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) [10], [11], και, πρόσφατα, σε 5-formylcytosine (5FC) και 5-carboxylcytosine (5caC) [12] . Μεθυλίωσης του DNA μπορεί να αναστέλλει την έκφραση του γονιδίου με την πρόληψη μεταγραφικοί ενεργοποιητές από πρόσδεση του DNA στόχο ή με πρόσληψη μεθυλο-CpG-πεδίο σύνδεσης (MBD) πρωτεϊνών, οι οποίες με τη σειρά τους στρατολογούν ιστόνης τροποποιητικό και σύμπλοκα χρωματίνη αναδιαμόρφωση σε μετουσιωμένο θέσεις [4]. CpG μεθυλίωση μπορεί επίσης να συμβάλει στην καταστολή του γονιδίου επάγοντας μια πιο συμπαγή και άκαμπτη νουκλεοσώματος διάπλαση [13].

Η μηχανήματα μεθυλίωσης του DNA των θηλαστικών μεσολαβείται από τα μεθυλοτρανσφεράσες DNA (DNMTs), τα οποία δημιουργούν και διατηρούν μεθυλίωσης DNA μοτίβα. DNMT1 απαιτείται για τη διατήρηση μοτίβα μεθυλίωσης του DNA, ενώ η

de novo

μεθυλτρανσφεράσες Dnmt3a και DNMT3B στοχεύσετε νέα μη μεθυλιωμένο περιοχές του DNA (για ανασκόπηση, [14]). Νουκλεοσώματα μπορεί να επηρεάσει μεθυλίωσης του DNA, αλλά μέχρι στιγμής έρευνες δείχνουν αντιφατικά αποτελέσματα. Είτε μεθυλοτρανσφεράσες DNA στοχεύουν επιλεκτικά νουκλεοσώματος δεσμευμένο DNA [15], ή νουκλεοσώματα καθιστούν προστασία έναντι μεθυλίωση [16]. Επιπλέον, νουκλεοσώματα που περιέχει μεθυλιωμένο DNA σταθεροποίηση de novo DNA μεθυλτρανσφεράσες 3Α /3Β (Dnmt3a /3Β) που επιτρέπει λίγο ελεύθερο Dnmt3a /3B να υπάρχουν στον πυρήνα [17]. Σταθεροποίηση της Dnmt3a /3Β για νουκλεοσώματα σε μετουσιωμένο περιοχές προωθεί την περαιτέρω διάδοση της μεθυλίωσης του DNA και έτσι εξασφαλίζει πιστή επιγενετικής κληρονομικότητας. CpG μεθυλίωσης μπορεί επίσης να έχει μια ξεχωριστή επίδραση στη σύνδεση με τις πρωτεΐνες όταν είναι παρόν εντός ενός νουκλεοσώματος φόντο [18].

νουκλεοσωματική ιστονών μπορούν να ανταλλάσσονται με παραλλαγές ιστόνης, και η ενσωμάτωσή τους μπορεί να επηρεάσει νουκλεοσώματος τοποθέτηση, και έτσι γονιδιακή δραστηριότητα (αναθεωρηθούν [19]). Η σύνθεση της κανονικής ιστόνες είναι συζευγμένο με την αντιγραφή του DNA σε φάση S, ενώ οι παραλλαγές ιστόνης συντίθενται σε όλο τον κυτταρικό κύκλο. Επιπλέον, σε αντίθεση με κανονικό ιστόνες του οποίου η λειτουργία είναι κατά κύριο λόγο στη συσκευασία γονιδιώματος και γονιδιακή ρύθμιση, μη κανονικά ιστόνες έχουν κρίσιμους ρόλους σε μια σειρά από διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης χρωμόσωμα διαχωρισμού, μεταγραφική ρύθμιση και επιδιόρθωση του DNA. Μεταξύ αυτών των παραλλαγών ιστόνη Η2Α είναι η παραλλαγή H2A.Z, το οποίο διατηρείται σε υψηλό βαθμό κατά τη διάρκεια της ευκαρυωτικής εξέλιξης [20], [21]. παραλλαγή ιστόνης H2A.Z διαφέρει σημαντικά από Η2Α από διάφορα αμινοξέα και κατά προτίμηση εντοπίζεται σε υποκινητές γονιδίων σε κύτταρα θηλαστικών, όπου απλώνεται σε αρκετές νουκλεοσώματα ανάντη και κατάντη της περιοχής έναρξης μεταγραφής [22]. Μία άλλη καλά διατηρημένη παραλλαγή ιστόνη Η3.3 είναι, μια παραλλαγή που διαφέρει από κανονική Η3 από λίγους υποκαταστάσεις αμινοξέων, και βρέθηκε να εμπλουτιστεί σε όλο το σώμα του γονιδίου μεταγράφονται γονιδίων, περιοχές προαγωγού σε ενεργό και ανενεργό γονίδια, και σε ρυθμιστικά στοιχεία. Αυτή η παραλλαγή συσσωρεύεται επίσης σε σιωπηλή loci σε μικρή περικεντρική χρωματίνη και τελομερή [23].

Εκτός αντικατάσταση των παραλλαγών ιστόνης, υπολείμματα αμινοξέων στην Ν-τερματικό ουρές των ιστονών (κανονικό, καθώς και παραλλαγές), μπορούν να τροποποιηθούν από διάφορους ομοιοπολική μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις (PTMs) και αποτελούν τη βάση για την επιγενετική ρύθμιση της δομής της χρωματίνης και της λειτουργίας των γονιδίων [24]. Πιο σημαντικό, δεν υπάρχει διαφωνία μεταξύ των τροποποιήσεων ιστονών με άλλες επιγενετικές ρυθμιστικές αρχές να ενισχύσουν ή να αντιστρέψει τις λειτουργίες των τροποποιήσεων. Τέτοια PTMs, οι οποίες περιλαμβάνουν μεταξύ άλλων την ακετυλίωση, μεθυλίωση, φωσφορυλίωση, παίζουν άμεσο ρόλο επηρεάζοντας τη δομή της χρωματίνης, ή μπορεί να αντιπροσωπεύουν σήματα ή σήματα να αναγνωρίζονται από τους αναγνώστες των τροποποιήσεων ιστονών, για να καθορίσετε ένα χαλαρό ή συμπαγές χρωματίνης [25]. Οι διαταραχές του τροποποιήσεων ιστονών σε κανονικές ρυθμιστικές διεργασίες έχουν βρεθεί σε ασθένειες, συμπεριλαμβανομένης της ανάπτυξης και εξέλιξης [26] του καρκίνου.

CADM1

(μόριο κυτταρικής προσκόλλησης 1) είναι ένα ογκοκατασταλτικό γονίδιο που προσδιορίζονται στο μη -μικρό καρκίνος του πνεύμονα (NSCLC), αλλά επίσης ενοχοποιηθεί σε άλλες ανθρώπινες ασθένειες του καρκίνου [27], [28]. Δείξαμε προηγουμένως ότι

Cadm1

είχε κατασταλεί στον καρκίνο προγονικών κυτταρικών σειρών πνεύμονα ποντικού, και την έκφραση του γονιδίου σχετίζεται σε μεγάλο βαθμό με υπερμεθυλίωση υποκινητή [29]. Αλλά μετά από θεραπεία με τον παράγοντα απομεθυλίωσης 5-αζα-2-δεοξυκυτιδίνη (5-αζα-dC), οι περισσότερες από τις κυτταρικές σειρές δεν ήταν αποκριτικά υποδηλώνοντας τη συμμετοχή των πρόσθετων επιγενετικών γεγονότων σίγηση. Αυτή η παρούσα μελέτη προσπάθησε να κατανοήσει επιγενετικών τοπία που οδηγεί σε μεταγραφική καταστολή του

Cadm1

στις ίδιες καρκίνου του πνεύμονα ποντικού προγονικά κύτταρα, και τελικά να αποκτήσουν μηχανιστικές γνώσεις σχετικά με τη επιγενετική αποσιώπηση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων, γενικά, και η απόκριση στη επιγενετικές ναρκωτικά. Χρησιμοποιώντας εργαλείων βιοπληροφορικής, είχαμε προβλέψει νουκλεοσώματος θέσεις και τοποθεσίες κατά μήκος του

Cadm1

υποστηρικτής δεσμευτικό παράγοντα μεταγραφής. Πραγματοποιήσαμε μια αυστηρή χαρτογράφηση και μόνο μόριο της χρωματίνης με την μεθυλτρανσφεράση DNA,

M.Sss

μπορώ να καθορίσει νουκλεοσώματος πληρότητα και την απόφραξη των θέσεων δέσμευσης μεταγραφικού παράγοντα. Με ένα πάνελ εναρκτήρων να ανακρίνει τη μέση, καθώς και τα αριστερά και δεξιά σύνορα των προβλεπόμενων νουκλεοσώματα, αναλύσαμε για απόκλιση νουκλεοσώματος τοποθέτησης MNase χωνεμένο χρωματίνη και το DNA ChIPed με κανονική ιστόνη Η2Α, ιστόνης παραλλαγές H2A.Z και Η3.3, καθώς επίσης και για τις τροποποιήσεις των ιστονών, H3K4me3 και H3K27me3. Συνολικά, τα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα εμφανίζεται αρκετές επιγενετικές γεγονότα αποσιώπηση που θα σας βοηθήσουν να καθορίσουν θεραπευτικών στρατηγικών παρέμβασης.

Αποτελέσματα

Cadm1

Ανάδοχος υπερμεθυλίωση συσχετίζεται με μεταγραφική καταστολή

Αυτή και η προηγούμενη μελέτη [29], διαπίστωσε ότι

Cadm1

υποστηρικτής CpG υπερμεθυλίωση συσχετίζεται με μεταγραφική καταστολή σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα ιδρύθηκε από ενιαίο, αυθόρμητα μετασχηματισμένα κύτταρα των όγκων του πνεύμονα του

c-Myc

και

c-Raf

διπλά διαγονιδιακά ποντίκια. CpG μεθυλίωσης σε ξεχωριστούς κλώνους ήταν ετερογενής εντός και μεταξύ των 10 διαφορετικών κυτταρικών γραμμών καρκίνου του πνεύμονα. Ότι η προηγούμενη μελέτη έδειξε επίσης ότι η μεθυλίωση του CpGs στην sites των μεταγραφικών παραγόντων Sp1, SP3, και Zf5 κατήργησε δέσμευσης του DNA-δεσμευτική πρωτεΐνη πυρήνα. Επιπλέον, η θεραπεία με τον παράγοντα απομεθυλίωσης, 5-αζα-2-δεοξυκυτιδίνη (5-αζα-dC) αποκαθίσταται

Cadm1

γονιδιακή έκφραση, αλλά μέχρι στιγμής μόνο σε δύο κυτταρικές γραμμές, γεγονός που υποδηλώνει επιπλέον επιγενετικές γεγονότα σίγηση. Πράγματι, συγκρίνοντας μεθυλίωση του DNA σε μη επεξεργασμένα και σε επεξεργασμένα αζα πνεύμονα κυτταρική σειρά καρκίνου A2C12 με αντίστοιχα επανέκφραση του

Cadm1

έδειξε ότι οι περισσότεροι από τους 69 που αναλύθηκαν CpGs στην περιοχή προαγωγού εξακολουθούσαν μεθυλιωμένη στην αζα επεξεργασμένο A2C12. Έτσι, η θεραπεία με 5-αζα-dC από μόνη της δεν ήταν σε θέση να αποκαταστήσει την έκφραση του γονιδίου σε όλες τις κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα ή απομεθυλίωση την περιοχή προαγωγέα του

Cadm1

και αυτές οι παρατηρήσεις μας οδήγησε να υποπτεύεται για επιπλέον στρώματα των επιγενετικών σίγηση στη θέση του. Ερευνήσαμε περαιτέρω το

Cadm1

υποκινητή και έτσι να αποκτήσουν γνώσεις σχετικά με την έκταση των επιγενετικών αποσιώπηση πολυπλοκότητα στις διάφορες καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικών σειρών.

νουκλεοσώματος Προγνωστικά θέσης και σχολιασμοί κατά μήκος του

Cadm1

Ανάδοχος Περιφέρεια

για να καθοριστεί εάν CpG μεθυλίωσης θα μπορούσε να επηρεάσει νουκλεοσώματος πληρότητας που οδηγεί σε επιγενετικές αποσιώπηση, όπως φαίνεται στο παρελθόν [30], χρησιμοποιήσαμε εργαλείων βιοπληροφορικής για την πρόβλεψη νουκλεοσώματος θέσεις και να σχολιάσετε το

Cadm1

περιοχή προαγωγέα. Χρησιμοποιώντας ένα νουκλεοσώματος πρόβλεψη τοποθέτησης με βάση την γενωμική αλληλουχία DNA (Segal, βλέπε Υλικά και Μέθοδοι), θα βρίσκεται τουλάχιστον πέντε πιθανές θέσεις νουκλεοσώματος περίπου 1000 bp προς τη θέση έναρξης μεταγραφής (TSS) και την θέση έναρξης μετάφρασης (ATG). Η REFSEQ TSS (NM_001025600.1) βρίσκεται στο -21 από ATG. Οι προβλεπόμενες νουκλεοσώματα ορίζονται αυθαίρετα σε σχέση με το ATG, καθώς Nuc 1 (-1,011 έως -865), Nuc 2 (-697 έως -551), Nuc 3 (-417 έως -271), Nuc 4 (-230 έως -84 ) και ηυο 5 (-41 έως 106). Οι θέσεις σύνδεσης των μεταγραφικών παραγόντων προβλεπόμενης αλληλουχίας-ειδική βρίσκονται στα σύνορα ή εντός αυτών νουκλεοσώματα, και υψηλό βαθμό συγκέντρωσης στα νουκλεοσώματα πλέον δίπλα στο TSS (Σχήμα 1Α). Πολλά CpGs βρεθεί μέσα νουκλεοσώματα, ειδικά εκείνες που εμπίπτουν στο νησί CpG στην περιοχή προαγωγού του

Cadm1

(Σχήμα 1Β). Το 1000 bp περιοχή καλύπτεται από πέντε θραύσματα μεγεθών 124-349 bp που χρησιμοποιούνται για την ανάλυση CpG μεθυλίωση σε κατεργασμένου με όξινο θειώδες γονιδιωματικό DNA, ιδιαίτερα σε συνδυασμό με DNA μεθυλοτρανσφεράση που βασίζεται χρωματίνη single-μόριο (MAP-IT) δοκιμασίας (Σχήμα 1C , Πίνακας S1). Κατά τη διάρκεια της μελέτης, εκτός νουκλεοσώματος αλγόριθμοι εντοπισμού θέσης έγινε διαθέσιμη (π.χ. NuPOP, ICM, βλέπε Υλικά και Μέθοδοι) και η σύγκριση έδειξε επικάλυψη στις προβλέψεις μεταξύ των τριών μεθόδων που χρησιμοποιούνται (Εικόνα 1D). Παρ ‘όλα αυτά, η θέση των τριών νουκλεοσωμάτων (ορίζεται Nuc 1, 3, 4) φάνηκε να είναι λιγότερο ή περισσότερο συνεπής.

(Α) Θέση πέντε αναλύθηκαν νουκλεοσωμάτων (μπλε ορθογώνια) και θέσεις πρόσδεσης παραγόντων μεταγραφής. Νουκλεοσώματα τα αυθαίρετα αριθμούνται ξεκινώντας από την πιο μακρινή (π.χ. ηυο 1) προς το χώρο της μεταγραφής REFSEQ έναρξης (TSS) και την θέση έναρξης μετάφρασης ATG, που είναι και οι δύο βρίσκονται σε νουκλεοσώματος 5 (Nuc 5). Οι νουκλεοτιδικές αρίθμηση με 1 αντιστοιχεί στο Α του ATG. (Β) Προβλεπόμενη νουκλεοσώματα και τη θέση του CpGs (κάθετες ρίγες) και το νησί CpG κατά μήκος του

Cadm1

υποκινητή. (C) Πέντε θραύσματα που καλύπτουν αναλύονται CpGs σε κατεργασμένου με όξινο θειώδες γονιδιωματικό DNA και προβλεπόμενη νουκλεοσώματα. (D) Πιθανές θέσεις νουκλεοσώματος από τρεις διαφορετικούς αλγορίθμους.

Η

Single-μόριο χρωματίνης Χαρτογράφηση του

Cadm1

Ανάδοχος Περιφέρεια με το

M.SssI

Αποκαλύπτει Υψηλή νουκλεοσώματος Πληρότητα σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα

επόμενο πραγματοποίησε μια χαρτογράφηση της χρωματίνης ένα μόνο μόριο του

Cadm1

περιοχή του υποκινητή. Χρησιμοποιήσαμε μια στρατηγική πατημασιάς που επιτρέπει τη χαρτογράφηση δομή χρωματίνης σε μη μεθυλιωμένο CpG νησίδες με κατεργασία απομονωμένων πυρήνων με μεθυλτρανσφεράσες DNA, κυρίως το CpG-ειδική μεθυλτρανσφεράση DNA (

M.Sss

Ι), ακολουθούμενη από γονιδιωματική αλληλούχιση όξινο θειώδες μεμονωμένων απογόνων μόρια του DNA [31], [32]. Η διαδικασία αυτή ονομάζεται ως ανάλυση ενιαία υποστηρικτής μεθυλίωσης-based (Μ-SPA), περιγράφεται επίσης ως πρωτόκολλο μεθυλοτρανσφεράση της προσβασιμότητας για τα επιμέρους πρότυπα (MAP-IT) [33]. Ουσιαστικά, CpGs θα μεθυλιωθεί με

M.Sss

Ι, ένα βακτηριακό κυτοσίνη C5 μεθυλτρανσφεράση, εκτός αν οι CpGs αποκλειστεί από νουκλεοσώματα ή πρωτεΐνες σύνδεσης DNA. Για το σκοπό αυτό, νουκλεοσώματος εντοπισμό ορίζεται ως μια περιοχή περίπου 147 bp που είναι απρόσιτες για

M.Sss

Ι

Οι CpGs μέσα στο

Cadm1

περιοχή του υποκινητή σε φυσιολογικό πνεύμονα είναι ουσιαστικά μη μεθυλιωμένες και το γονίδιο εκφράζεται. Εμείς αντιμετωπίζεται η χρωματίνη του φυσιολογικού πνεύμονα με

M.Sss

Ι και αναλύθηκαν προστατευμένο (μη μεθυλιωμένο) CpGs κατά μήκος της περιοχής του υποκινητή του

Cadm1

, ειδικά εκείνες εντός των αναμενόμενων νουκλεοσώματα ή θέσεις δέσμευσης παράγοντα μεταγραφής. Χρησιμοποιήσαμε διθειώδες εκκινητές που ενισχύουν πέντε θραύσματα, τρία από τα οποία επικαλύπτονται και καλύπτουν 69 CpGs από -944 έως +41, σε σχέση με την θέση έναρξης της μετάφρασης, ATG (βλέπε Εικόνα 1 C, Πίνακας S1).

M.Sss

Ι αντιμετώπιση των «γυμνό» γονιδιακό DNA χρησίμευσε ως μάρτυρας. Χρησιμοποιώντας το πρότυπο μεθυλίωσης του DNA σε «γυμνό» γονιδιωματικό DNA και φυσιολογικό πνεύμονα ως αναφορά, αναλύσαμε χρωματίνη από όγκου πνεύμονα, κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα, και ένα 5-αζα-άΟ-αγωγή κυτταρικής σειράς καρκίνου του πνεύμονα με ελαφρές γονίδιο επανέκφραση. Για να αποκτήσουν γνώσεις από διαφορετικά στιγμιότυπα από το

Cadm1

υποκινητή, συγκρίναμε τα πρότυπα μεθυλίωσης του DNA των ανεξάρτητων

M.Sss

Ι θεραπείες ίδιες κυτταρικές σειρές.

αποτελεσματικότητα μεθυλίωση του Μ .SssI κατά μήκος της περιοχής του υποκινητή Cadm1 στη «γυμνή» γονιδιωματικής ελέγχους DNA.

αποτελεσματικότητα μεθυλίωση του

M.Sss

ήμουν πρώτη προσδιορίζεται γονιδιακό DNA «γυμνή» του ποντικιού. Η απόδοση της μεθυλίωσης της μέσης 21 κλώνοι για κάθε τεμάχιο κυμάνθηκε από 51-91% (Σχήμα S1). Η υψηλότερη απόδοση λήφθηκε σε δύο πλησιέστερων θραύσματα γύρω από την TSS, δηλ MFRA και TSFR1 κατά 91%. Μη μεθυλιωμένα CpGs σε αυτά τα θραύσματα περισσότερο ή λιγότερο τυχαία. Αυτή η αποτελεσματικότητα διαφορική μεθυλίωση θα μπορούσε να είναι μια ένδειξη ότι η περιοχή υποκινητή στην περιοχή του TSS ήταν πιο ευαίσθητα σε μεθυλίωση ΟΝΑ. Στην προηγούμενη ανάλυσή μας, ο δείκτης μεθυλίωση στο κομμάτι TSFR1 που περιλαμβάνει το TSS έδωσε τη σαφέστερη συσχέτιση με μεταγραφική καταστολή. Συνολικά μεθυλίωση σε πέντε τμήματα, 106 κλώνους και 1.478 CpGs ήταν 76%. Χρησιμοποιώντας το ίδιο πρωτόκολλο, προσδιορίσαμε επίσης την αποδοτικότητα μεθυλίωση του «γυμνού» γονιδιωματικού DNA που απομονώθηκε από ένα καρκίνο του πνεύμονα κυτταρική γραμμή (A2Cl2), το οποίο περιείχε ήδη πριν μεθυλίωση CpG. Συνολικά μεθυλίωση σε πέντε τμήματα, 31 κλώνους και 416 CpGs ήταν 98%, υποδεικνύοντας ευρωστία της δοκιμασίας.

M.SssI χρωματίνης χάρτη του φυσιολογικού πνεύμονα.

Αναλύσαμε το χάρτη M.SssI στην χρωματίνης έχουν απομονωθεί από εννέα συγκεντρωμένα φυσιολογικούς πνεύμονες. Για το θραύσμα BFR (255 bp, 6 CpGs -944 -837 να), οι περισσότεροι κλώνοι έδειξαν ένα τέντωμα του μη μεθυλιωμένων CpGs (Σχήμα S1), ιδιαίτερα εκείνα τα οποία βρίσκονται μέσα σε μια προβλεπόμενη νουκλεοσώματος (Nuc 1) (Σχήμα S2). Για το θραύσμα 1FR (279 bp, 10 CpGs, -682 έως -531), αρκετοί κλώνοι έδειξε επίσης ένα τέντωμα των μη μεθυλιωμένα CpGs, πολλοί πέφτουν μέσα σε μια προβλεπόμενη νουκλεοσώματος (Nuc 2) (Σχήμα S3). Αυτά τα αποτελέσματα είναι ενδεικτικά της νουκλεοσώματος πληρότητας.

Για τα επόμενα τρία επικαλυπτόμενα τμήματα γύρω από το TSS (MFR1, MFRA, TSFR1) και στην περιοχή όπου θα μπορούσε να βρεθεί παράγοντας αρκετές μεταγραφής θέσεις δέσμευσης (βλέπε Εικόνα 1Α), η μοτίβα στις περισσότερες κλώνους έδειξε απουσία του νουκλεοσώματος πληρότητας, αλλά μάλλον ενδεικτικά της δέσμευσης των παραγόντων μεταγραφής ή άλλες πρωτεΐνες που απαιτούνται για ρύθμιση. Θραύσμα MFR1 (124 bp, 14 CpGs, -456 -341 να) ενισχύεται με μεθυλίωση ειδικούς εκκινητές (με τρία CpGs τόσο εμπρόσθιοι και αντίστροφοι εκκινητές). Αυτό το θραύσμα περιέχει προβλεπόμενες θέσεις δέσμευσης για παράγοντες μεταγραφής, για παράδειγμα PPARg, ER, ETF, στην οποία οι CpGs μέσα σε αυτές τις θέσεις πρόσδεσης ήταν ως επί το πλείστον μη μεθυλιωμένα σε αρκετές κλώνους, να προτείνει δεσμευτική τους και μια πιθανή ρόλο στη ρύθμιση της μεταγραφής

Cadm1

. Η προβλεπόμενη θέση ETF είναι μέσα σε ένα νουκλεοσώματος (Nuc 3), ενώ το PPARg βρίσκεται στα σύνορα της ηυο 3, και θα μπορούσε να επηρεαστεί άμεσα από αλλαγές που αφορούν την νουκλεοσώματος πληρότητα και συρόμενες (Σχήμα S4).

Θραύσμα MFRA (222 bp, 27 CpGs, -396 -180 να) είναι επίσης ενισχύεται με ειδική της μεθυλίωσης εναρκτήρες (με 5 CpGs σε προς τα εμπρός εκκινητή, 6 CpGs σε αντίστροφο εκκινητή). Αυτό το θραύσμα καλύπτει μια προβλεπόμενη νουκλεοσώματος (Nuc 3), και εν μέρει ενός άλλου (Nuc 4) (Σχήμα S5). Περιέχει δύο θέσεις πρόσδεσης για Sp1 που βρίσκονται εντός ή στο αριστερό άκρο της ηυο 4. Οι CpGs στις θέσεις δέσμευσης Sp1 σε -224 και -211 ασχολούνταν με πολλούς κλώνους που έχουν νουκλεοσώματος ελεύθερο σχέδιο. Αυτό το αποτέλεσμα υποστηρίζει περαιτέρω ότι Sp1 μπορεί πράγματι να διαδραματίσει έναν ρόλο στη ρύθμιση του

Cadm1

. Υπήρχαν 2 από 15 κλώνους, ωστόσο, η οποία έδειξε ένα μεγάλο τμήμα της προστασίας CpG μέσα σε ένα προβλεπόμενο νουκλεοσώματος (Nuc 3), υποδεικνύοντας σχηματισμό νουκλεοσώματος σε αυτό το μέρος του υποκινητή του

Cadm1

.

θραύσμα TSFR1 (345 bp, 37 CpGs, -302 41) ενισχύεται με εκκινητές που περιέχουν τρία CpGs στο πρόσθιο εκκινητή, και δύο CpGs στο αντίστροφο εκκινητή (Σχήμα 2). προηγούμενα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι ο δείκτης μεθυλίωση που λαμβάνεται από αυτό το θραύσμα σχετίζεται ιδιαίτερα με μεταγραφική καταστολή σε σύγκριση με τα άλλα θραύσματα αναλύθηκαν στην

Cadm1

περιοχή προαγωγού. Περιέχει θέσεις σύνδεσης για Sp1, Zf5, και άλλους παράγοντες μεταγραφής προβλεφθεί. Επίσης, περιλαμβάνονται η θέση έναρξης της μεταγραφής REFSEQ (TSS), η θέση έναρξης της μετάφρασης, ATG καθώς και τουλάχιστον δύο προβλεπόμενη νουκλεοσώματα (Nuc 4 και nuc 5). Δεν υπήρχε μεγάλη έκταση μη μεθυλιωμένων CpGs, εκτός από 3 15 κλώνους στην οποία η πλειονότητα των προστατευόμενων CpGs εμπίπτουν σε μια προβλεπόμενη νουκλεοσώματος (Nuc 4). Σε αυτούς τους κλώνους χωρίς εμφανή πληρότητας του Nuc 4, μια προβλεπόμενη νουκλεοσώματος (Nuc 5), όπου ο REFSEQ TSS καθώς και οι θέσεις ATG βρίσκονται, φάνηκε να μην παρουσιάσει επίσης, συνεπής μιας ανοικτής χρωματίνης που σχετίζεται με μεταγραφή. Επιπλέον, η -224 CpG στη θέση σύνδεσης του Sp1 και ο -192 CpG σε Zf5, ήταν συχνά μη μεθυλιωμένα, για να υποστηρίξει δεσμευτικές τους στην περιοχή του υποκινητή του

Cadm1.

Η

(Α) μοτίβα μεθυλίωσης σε κλώνους μετά από θεραπεία με CpG-ειδική μεθυλτρανσφεράση DNA (

M.Sss

Ι) και βαθμολόγησης των 32 CpGs (-271 έως 24 CpGs, TSFR1 κομμάτι) στο «γυμνό» γονιδιακού DNA του ποντικιού ουρά, και χρωματίνη από εννέα συγκεντρωμένο φυσιολογικό πνεύμονες, τρία ομαδοποιήθηκαν συμπαγείς όγκους του πνεύμονα, και επτά διαφορετικές καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικές σειρές με μικρή ή καθόλου

Cadm1

γονιδιακής έκφρασης. Τα πρότυπα ελήφθησαν με Bisma όπου μπλε κουτιά που εκπροσωπούν μη μεθυλιωμένα CpGs (= προστατευόμενη), ενώ κόκκινα κουτιά, μεθυλιωμένα CpGs. Σε όγκους του πνεύμονα και κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα, CpG μεθυλίωση μπορεί να είναι ενδογενής και /ή από το

M.Sss

Ι θεραπείας. (Β) Σχολιασμός αναλύθηκαν

Cadm1

περιοχή υποκινητή (CpGs, υποθετικές θέσεις πρόσδεσης παραγόντων μεταγραφής πνεύμονα ειδικά, προέβλεψε νουκλεοσώματα), και τα αντίστοιχα μοτίβα μεθυλίωσης του DNA αλληλουχία-πλαίσιο που φαίνεται στο (Α). Ένα τμήμα των προστατευόμενων CpGs ειδικότερα εντός της προβλεπόμενης νουκλεοσώματος 4 ήταν συχνή σε πολλούς από τους 84 κλώνους που λαμβάνονται σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα.

Η

Για να συνοψίσουμε, η

M.Sss

Ι μεθυλίωσης χάρτης παρατηρήθηκε σε κλώνους του φυσιολογικού πνεύμονα πρότεινε το σχηματισμό των προβλεπόμενων πέντε νουκλεοσώματα κατά μήκος της περιοχής του υποκινητή του

Cadm1

. Τα μοτίβα που βρέθηκαν στα τρία θραύσματα (MFR1, MFRA, και TSFR1) γύρω από την TSS, στην οποία τρία νουκλεοσώματα (Nuc 3, Nuc 4, και 5, nuc) βρίσκονται, έδειξε την απουσία του νουκλεοσώματος πληρότητας σε πολλούς κλώνους. Ωστόσο, οι θέσεις πρόσδεσης παραγόντων μεταγραφής όπως Sp1 και Zf5 έδειξε προστασία, υποδηλώνοντας το ρόλο τους στη ρύθμιση της μεταγραφής του

Cadm1

. Αντίθετα, για τις δύο νουκλεοσώματα πιο μακριά από το TSS (NUC 1 και Nuc 2), δεν υπάρχει εμφανής νουκλεοσώματος αναδιαμόρφωση φαίνεται να λαμβάνουν χώρα, όπως οι περισσότεροι κλώνοι παρουσίασαν μόνο μεγάλα τμήματα της μη μεθυλιωμένα CpGs.

M.SssI χρωματίνης χάρτης όγκου του πνεύμονα.

Αναλύσαμε το

M.Sss

Ι χάρτης της χρωματίνης που απομονώθηκαν από τρεις συγκεντρώθηκαν συμπαγείς όγκους πνεύμονα γ

-Raf

διαγονιδιακά ποντίκια.

Cadm1

εξακολουθούσε να εκφράζεται σε αυτούς τους όγκους (δεν φαίνεται). Λόγω της ενδογενούς μεθυλίωση CpG στους όγκους του πνεύμονα, προκύπτει μόνον από μη μεθυλιωμένα CpGs (δηλαδή προστατευμένη) μετά από

M.Sss

θεραπεία που ερμηνεύτηκαν. Παρ ‘όλα αυτά, τα πρότυπα σε κλώνους πρότεινε το σχηματισμό τουλάχιστον τρία νουκλεοσώματα (NUC1, Nuc 2, Nuc 3) (Σχήματα S1, S2, S3, S5). Στο κομμάτι TSFR1, όπου ηυο 4 και 5 ηυο κατοικούν, δεν υπήρχε μεγάλο τμήμα των μη μεθυλιωμένα CpGs κατά μήκος του κομματιού για να δείξει νουκλεοσώματος πληρότητα, αλλά 18 μεμονωμένες θέσεις CpG έδειξε προστασίας (Σχήμα 2). Πράγματι, 13 από 19 κλώνους επέδειξαν το ίδιο μοτίβο. Μεταξύ των χαρακτηριστικών αυτών των κοινών προτύπων περιλαμβάνουν σχεδόν καθόλου μεθυλίωση σε δύο θέσεις δέσμευσης Sp1 (-224, -164 CpGs), καθώς και εκείνη του Zf5 (-192, -190, -188 CpGs). Θεραπεία της χρωματίνης που προέρχεται από το δείγμα όγκου του πνεύμονα δεν έδειξε την παρουσία του νουκλεοσώματος πληρότητας σε αναλύθηκαν κλώνοι στο θραύσμα TSFR1. Ωστόσο, το αποτέλεσμα αυτό βασίζεται σε συγκεντρωτικά όγκων του πνεύμονα που εξακολουθούν να εκφράζονται σε κάποιο βαθμό

Cadm1

. Επιπλέον, όγκου του πνεύμονα αποτελείται από πολλούς τύπους κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των μη-καρκινικές αυτά που μπορούν να έχουν συμβάλει στις διαπιστώσεις που φαίνεται στο Σχήμα 2. Ωστόσο, στο επίπεδο των επιμέρους κυτταρικών γραμμών όγκου, σημειώνονται διαφορές στο νουκλεοσωμικών τοποθέτηση παρατηρήθηκαν όπως συζητείται παρακάτω.

M.SssI χρωματίνης χάρτες διαφορετικών καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικών σειρών.

Πραγματοποιήσαμε

M.Sss

χαρτογράφηση μου για τον καρκίνο κυτταρικές σειρές 10 πνεύμονα με διάφορους βαθμούς

Cadm1

υπερμεθυλίωση προαγωγού και μεταγραφική καταστολή, καθώς και μια κυτταρική σειρά καρκίνου του πνεύμονα που έλαβαν θεραπεία με 5-αζα-dC. Παρόμοια με όγκου πνεύμονα, λόγω της ενδογενούς μεθυλίωσης CpG στις κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα,

M.Sss

I αγωγή θεωρήθηκαν μόνο πρότυπα από μη μεθυλιωμένα CpGs (δηλαδή προστατευμένη) μετά. Αναλύσαμε χάρτες των επιμέρους κυτταρικών γραμμών (σχήμα S6, S7), καθώς και συλλογικά. Όπως αναφέρθηκε νωρίτερα, αναλύσαμε επίσης μοτίβα σε «γυμνό» γενωμικού DNA από ένα καρκίνο του πνεύμονα κυτταρική γραμμή (A2C12), το οποίο ενδογενώς μεθυλιώθηκε (βλέπε Σχήμα S1c). Επιπλέον, για να επιβεβαιώσει τα αποτελέσματα και να καθορίσει τα πρότυπα των διαφορετικών στιγμιότυπα του

Cadm1

υποκινητή, έχουμε αναλάβει δύο μελέτες θεραπείας σε ορισμένες κυτταρικές σειρές (Σχήμα S6). Εδώ, περιγράφουμε τη συλλογική

M.Sss

έχω χάρτες που βρέθηκαν στα καρκίνο του πνεύμονα κυτταρικές σειρές με μικρή ή καθόλου

Cadm1

γονιδιακής έκφρασης.

Για το θραύσμα BFR, ένα τέντωμα τουλάχιστον τριών μη μεθυλιωμένο CpGs παρατηρήθηκαν σε πολλούς κλώνους. Οι τρεις αυτές περιοχές σε -944, -924, -903 CpGs, βρίσκονται μέσα ηυο 1 και ως εκ τούτου, προτείνοντας την πληρότητα αυτού του νουκλεοσώματος (Εικόνα S2). Για το θραύσμα 1FR, αν και υπήρχαν κλώνοι που επέδειξαν μια επιμήκυνση τουλάχιστον τρία μη μεθυλιωμένα CpGs να υποδηλώνουν νουκλεοσώματος χωρητικότητα (Nuc 2), οι περισσότεροι κλώνοι ήταν εξαιρετικά μεθυλιωμένες CpGs και η πηγή αυτής της μεθυλίωσης θα μπορούσε να είναι τόσο ενδογενείς και λόγω

M .sss

Ι αγωγή (Σχήμα S3).

για θραύσμα MFR1, οι περισσότεροι από τους 98 κλώνους ήταν εξαιρετικά μεθυλιωμένες, εκτός από τις δύο CpGs σε -423 και -408. Αυτές οι δύο CpGs είναι εντός της προβλεπόμενης αλληλουχίας πρόσδεσης παραγόντων μεταγραφής (PPARg, ER), και είναι στα σύνορα του Nuc 3 (σχήμα S4). Προστασία των δύο αυτών τόπων CpG θα μπορούσε να είναι τόσο από δεσμευτικές μεταγραφής και νουκλεοσώματος ολίσθηση. αποτελέσματα EMSA πρότεινε ότι PPARg δεσμεύουν

in vitro

με το

Cadm1

υποκινητή με πυρηνικά εκχυλίσματα από τον καρκίνο του πνεύμονα κυτταρική σειρά (A2C12), αλλά όχι σε φυσιολογικό πνεύμονα (Σχήμα S8), και θα μπορούσε να παίξει ένα ρόλο στον καρκίνο του πνεύμονα.

για το θραύσμα MFRA, υπήρχαν πέντε κλώνοι μεταξύ 86 κλώνων με σχεδόν καμία μεθυλίωση να προτείνουν νουκλεοσώματος χωρητικότητα (Nuc 3) (Σχήμα S5). Υπήρχαν επίσης μεμονωμένες θέσεις CpG που παρουσίασαν χαμηλή μεθυλίωσης, ιδιαίτερα τις θέσεις δέσμευσης Sp1 σε -224 και -211, που βρίσκεται στα σύνορα του νουκλεοσώματος (Nuc 4) (Σχήμα S5). Έτσι, η προστασία στις κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα σε -224 και -211 θα μπορούσε να οφείλεται σε δύο δεσμευτικές Sp1 και νουκλεοσώματος πληρότητας.

Για θραύσμα TSFR1, οι περισσότεροι από τους 84 κλώνους που εμφανίζονται μεγάλα τμήματα του μη μεθυλιωμένα CpGs που να υποδηλώνουν υψηλή νουκλεοσώματος πληρότητας (Nuc 4 και 5 nuc) γύρω από το TSS (Σχήμα 2). Ένα επίθεμα προστασίας ήταν εμφανής στις θέσεις CpG -224 έως -188? ένα άλλο έμπλαστρο ήταν σε -174 με -90. Οι θέσεις δέσμευσης για Sp1 και Zf5 είναι μέσα σε ένα μπάλωμα των μη μεθυλιωμένα CpGs δείχνει απόφραξη λόγω νουκλεοσώματος πληρότητας. Για να υποστηρίξει αυτήν την υπόθεση ενός νουκλεοσώματος πληρότητας, η ίδια έκταση unmethylation βρέθηκε μετά τη θεραπεία της χρωματίνης του καρκίνου του πνεύμονα κυτταρική σειρά (GA 7) με

M.Cvi

PI (GPC μεθυλασης), και στην οποία η μεθυλίωση των περιοχών CpG (= ενδογενές μεθυλίωση CpG) βαθμολογήθηκε (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

πνεύμονα καρκινική κυτταρική γραμμή (A2C12) μετά από θεραπεία με 5-αζα-dC.

Η κυτταρική γραμμή A2C12 αποκρίνεται σε θεραπεία 5-αζα-dC με αποτέλεσμα

Cadm1

επανέκφραση. Ωστόσο, ο βαθμός της επανέκφραση ποικίλλει από θεραπεία σε θεραπεία. Αναλύσαμε το

M.Sss

Ι χάρτης της 5-αζα-ΟΟ-θεραπεία A2C12 που παρουσίασαν ελαφρά

Cadm1

γονίδιο επανέκφραση και σε σύγκριση με το μη επεξεργασμένο A2C12 και φυσιολογικό πνεύμονα (Σχήμα 3 ). Για το θραύσμα BFR, μερικοί κλώνοι τώρα έδειξε επιμήκυνση των μη μεθυλιωμένα CpGs, και το αποτέλεσμα αυτό πρότεινε νουκλεοσώματος χωρητικότητα (ηυο 1). Για το θραύσμα 1FR, τρεις κλώνους έδειξε επίσης τμήματα της μη μεθυλιωμένα CpGs να δείξει νουκλεοσώματος χωρητικότητα (Nuc 2).

(Α) Θέση των πέντε τεμαχίων που αναλύθηκαν στο

Cadm1

περιοχή του υποκινητή, που καλύπτουν 69 CpGs -944 έως +41, σε σχέση με την θέση έναρξης μετάφρασης, ATG. Οι CpGs εκπροσωπούνται από ρίγες. (Β-Δ) χάρτες μεθυλίωση του φυσιολογικού πνεύμονα και A2C12? μπλε κουτιά αντιπροσωπεύει μη μεθυλιωμένα CpGs (= προστατευόμενη), ενώ κόκκινα κουτιά, μεθυλιωμένα CpGs. Τα θραύσματα που παρουσιάζονται σε σχέση με τη θέση τους δηλαδή από BFR να TSFR1. Οι CpGs στην αλληλουχία πυρήνα θέσεων δέσμευσης Sp1 και Zf5 υποδεικνύονται με βέλη. (Δ) Μετά τη θεραπεία και μικρή γονίδιο επανέκφραση 5-αζα-dC, μερικοί κλώνοι μοιάζουν με σχέδια που βρίσκονται σε φυσιολογικό πνεύμονα (π.χ. σε TFSR1, κλειστό), να προτείνει νουκλεοσώματος αναδιαμόρφωση (έξωση) στην έκφραση των γονιδίων.

Η

στα επόμενα τρία θραύσματα προς το TSS (MFR1, MFRA, TSFR1), μερικοί κλώνοι εμφανίζονται μοτίβα παρόμοια με φυσιολογικό πνεύμονα, που είναι ενδεικτικό των προτύπων που σχετίζονται με έξωση νουκλεοσώματα και ενεργό μεταγραφή. Για το θραύσμα MFR1, έξι κλώνους έμοιαζε με τα πρότυπα της πληρότητας και της μεταγραφής μη νουκλεοσώματος παράγοντες δέσμευσης όπως φαίνεται στο φυσιολογικό πνεύμονα. Για το θραύσμα MFRA, υπήρχαν μόνο τέσσερα μοτίβα που παρατηρήθηκαν: 7/21 πλήρης απουσία της μεθυλίωσης? 12/21 με το ίδιο μοτίβο και οι κλώνοι φαίνεται να είναι στη διαδικασία της αναδιαμορφώνεται ή νουκλεοσώματος που έξωση? και 2/21 στο μεταξύ. Οι δύο θέσεις Sp1 ασχολούνταν σε όλους τους κλώνους. Έτσι, SP1 είναι δεσμευτικός ως προς όλα αυτά τα κλώνους με έξωση νουκλεοσώματα, ένα εύρημα που συμφωνεί και με τα προηγούμενα αποτελέσματα EMSA μας [29]. Για το θραύσμα TSFR1, αρκετοί κλώνοι έμοιαζε με μοτίβο που βρέθηκαν στο κανονικό πνεύμονα δείχνει απουσία νουκλεοσώματος αλλά δέσμευσης παράγοντα μεταγραφής. Αυτό το αποτέλεσμα πρότεινε αναδιαμόρφωσης χρωματίνης μετά από 5-αζα-dC θεραπεία.

Συνολικά αποτελέσματα M.SssI χαρτογράφησης.

Για να συνοψίσουμε,

M.Sss

έχω χαρτογράφηση σε κανονική στηρίγματα του πνεύμονα ο σχηματισμός τουλάχιστον πέντε νουκλεοσώματα στις προβλεπόμενες θέσεις κατά μήκος της περιοχής του υποκινητή του

Cadm1.

Υπήρχαν κλώνοι να δείξουν μεγάλα τμήματα μη μεθυλιωμένων CpGs σε αυτές τις θέσεις, ειδικά στις δύο νουκλεοσώματα (Nuc 1, Nuc 2)