Abstract

Οι αναδυόμενες στοιχεία δείχνουν ότι DNAM-1 (CD226) διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην αναγνώριση των κυττάρων του όγκου και της λύσης τους από κυτταροτοξικά Τ λεμφοκύτταρα (CTL) και των κυττάρων ΝΚ. Αν και το CD155 συνδέτη DNAM-1 εκφράζεται παντού σε διάφορους ιστούς, πολλούς ανθρώπινους όγκους ρυθμίζει προς τα πάνω σημαντικά την έκφραση του CD155? DNAM-1 επί κυττάρων CTL και ΝΚ μπορεί να εμπλέκεται στην ανοσία όγκου. Ωστόσο, σε αντίθεση με εκείνες στα ποντίκια, τους ανθρώπινους ιστούς εκφράζουν επίσης διαλυτές ισομορφές του CD155 (sCD155) που δεν έχουν την διαμεμβρανική περιοχή. Εδώ, δείχνουμε ότι τα επίπεδα sCD155 ήταν σημαντικά υψηλότερα στους ορούς 262 ασθενείς με πνευμονική, γαστρεντερική, του μαστού, γυναικολογικούς καρκίνους και ό, τι σε ορούς από υγιείς δότες. Επιπλέον, τα επίπεδα sCD155 ήταν σημαντικά υψηλότερα σε ασθενείς με πρώιμο στάδιο (στάδια 1 και 2) γαστρικό καρκίνο σε σύγκριση με υγιείς δότες, και ήταν σημαντικά υψηλότερη σε ασθενείς με προχωρημένο στάδιο (στάδια 3 και 4) της νόσου σε σύγκριση με τους ασθενείς σε αυτούς με πρώιμη το στάδιο της νόσου και υγιείς δότες. Επιπλέον, τα επίπεδα sCD155 μειώθηκαν σημαντικά μετά από χειρουργική εκτομή των καρκίνων. Έτσι, το επίπεδο sCD155 στον ορό μπορεί να είναι δυνητικά χρήσιμο ως βιοδείκτη για την ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου

Παράθεση:. Iguchi-Manaka Α, Okumura G, Kojima Η, Cho Υ, Hirochika R, Bando H, et al. (2016) Η αυξημένη Διαλυτό CD155 στον ορό των ασθενών με καρκίνο. PLoS ONE 11 (4): e0152982. doi: 10.1371 /journal.pone.0152982

Επιμέλεια: Hiroshi Shiku, Mie Πανεπιστημίου Graduate School of Medicine, Ιαπωνία

Ελήφθη: 24, Αυγ του 2015? Αποδεκτές: 22 Μάρ 2016? Δημοσιεύθηκε: 6 Απριλίου 2016

Copyright: © 2016 Iguchi-Manaka et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η έρευνα αυτή χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από τις επιχορηγήσεις που παρέχονται από το Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστημών και Τεχνολογίας της Ιαπωνίας (αριθμός Grant 26861038, 24249021 και 25114701 στο ΑΙ-Μ, AS, και KS). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ανοσολογική παρακολούθηση των όγκων καταστέλλει την ανάπτυξη του καρκίνου για την προστασία του ξενιστή. Βασικά παίκτες στην κυτταρική ανοσία σε όγκους, τα κυτταροτοξικά Τ λεμφοκύτταρα (CTL) και των κυττάρων ΝΚ [1, 2], διαμεσολαβούν την αναγνώριση του όγκου και η ενεργοποίηση μέσω των υποδοχέων αντιγόνου τους και μια ποικιλία από πρόσφυση και συνδιεγερτικών μορίων [2, 3]. Αλληλεπιδράσεις των υποδοχέων κυτταρικής επιφάνειας με τους συνδέτες τους που εκφράζεται σε κύτταρα όγκου επάγει κυτταροτοξική δράση των CTL και ΝΚ κυττάρων κατά των όγκων [4].

DNAM-1 (CD226) είναι ένα μέλος της υπεροικογένειας ανοσοσφαιρίνης και εκφράζεται σε ΝΚ κύτταρα, Τ κύτταρα, μονοκύτταρα, μακροφάγα, και τα αιμοπετάλια [5, 6]. συνδεσμικά σε ανθρώπους και ποντίκια είναι ο υποδοχέας του ιού της πολιομυελίτιδας CD155 και του μέλους της οικογένειας CD112 (PPR-2 [PVR που σχετίζονται με την οικογένεια 2], που ονομάζεται επίσης nectin-2) [7-9]. Ανθρώπινα CD155 και CD112 ευρέως κατανεμημένα σε επιθηλιακά και ενδοθηλιακά κύτταρα σε πολλούς ιστούς [10, 11]? Κυρίως, υπερεκφράζονται σε διάφορους όγκους, συμπεριλαμβανομένων του παχέος [12, 13], γαστρικό [12], και των ωοθηκών [14]? νευροβλάστωμα [15]? μυελοειδείς λευχαιμίες [16]? πολλαπλό μυέλωμα [17]? και μελάνωμα [18]. Οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ CD155 και CD112 σε κύτταρα όγκου και DNAM-1 σε κύτταρα ΝΚ και Τ αυξάνουν κυτταρομεσολαβητική κυτταροτοξικότητα και παραγωγή κυτοκινών [7, 8]? DNAM-1 είναι πιθανόν εμπλέκονται στην ανοσία κατά CD155- και κακοήθεις όγκους CD112 εκφράζουν. Στην πραγματικότητα, σε ένα μοντέλο χημικά επαγόμενων όγκων σε DNAM-1-ανεπαρκή ποντίκια, DNAM-1 είναι σημαντική για το ανοσοποιητικό επιτήρηση κατά CD155 εκφράζουν όγκους [19]. Ως εκ τούτου, CD155 επί όγκων είναι κρίσιμη για DNAM-1 ανοσίας όγκου.

Ωστόσο, εκτός από την δεσμευμένη σε μεμβράνη CD155 (mCD155, CD155α), ανθρώπινους ιστούς (σε αντίθεση με εκείνες στα ποντίκια) εκφράζουν διαλυτό CD155 (sCD155 ) (CD155β και CD155γ) που κωδικοποιείται από ισομορφές ματίσματος του

CD155

που δεν έχουν την διαμεμβρανική περιοχή [20, 21]. Εδώ, εξετάσαμε τα επίπεδα sCD155 ορού σε 262 ασθενείς με μεταβλητό καρκίνους και δείχνουν ότι sCD155 μπορεί να είναι χρήσιμη ως βιοδείκτη για την ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρικές σειρές

Θα χρησιμοποιηθούν τα παρακάτω ανθρώπινες κυτταρικές σειρές που προέρχονται από ATCC: HeLa (τραχηλικό καρκίνωμα), ΕΟΕ (οστεοσάρκωμα), RD (ραβδομυοσάρκωμα), U87MG (γλοίωμα), Jurkat (λευχαιμία κυττάρων Τ), και Colo 205 (ορθοκολικό καρκίνωμα) . MethA (μεθυλοχολανθρένιο επαγόμενη σάρκωμα από ποντικό BALB /c) παρεσχέθη από τον Dr. Eiichi Nakayama (Πανεπιστήμιο Okayama).

Δείγματα

Δείγματα ιστών ελήφθησαν από ασθενείς πρωτοπαθή καρκίνο που υποβλήθηκαν σε χειρουργική εκτομή στο το Πανεπιστήμιο Τσουκούμπα Νοσοκομείο, Ιαπωνία. Ελήφθησαν δείγματα ορού από ασθενείς με πρωτοπαθή καρκίνο του Πανεπιστημίου Tsukuba Νοσοκομείο και Ιμπαράκι Νομαρχιακό Κεντρικό Νοσοκομείο, την Ιαπωνία, και από υγιείς εθελοντές. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς και υγιείς εθελοντές. Η μελέτη αυτή εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας του Πανεπιστημίου Tsukuba και του Ιμπαράκι Νομαρχιακό Κεντρικό Νοσοκομείο (αριθμός έγκρισης 531-5 και 307). το στάδιο της νόσου ήταν κατατάσσονται σύμφωνα με την Ένωση για τη Διεθνή Έλεγχο του Καρκίνου (UICC) ΤΝΜ ταξινόμηση των Κακοήθεις όγκοι.

Ποντίκια

BALB /c ποντίκια αγοράστηκαν από την Charles River (Yokohama, Ιαπωνία). Όλα τα ποντίκια στεγάστηκαν και εκτράφηκαν κάτω από ειδικές συνθήκες άνευ παθογόνου στο Resource Center Ζώων του Πανεπιστημίου Tsukuba. Πειραματικό ποντίκια χρησιμοποιήθηκαν σε 7-10 εβδομάδων. Όλα τα πειράματα με ποντικούς εγκρίθηκαν από την επιτροπή των ζώων πείραμα του Πανεπιστημίου Tsukuba (αριθμός έγκρισης 09-390 και 10-237) και εκτελείται σύμφωνα με τις οδηγίες της Animal Πείραμα Επιτροπής του Πανεπιστημίου Tsukuba.

PCR

Ολικό RNA εκχυλίσθηκε από κυτταρικές σειρές και ιστούς με αντιδραστήριο Isogen (Nippon Gene). Για RT-PCR, χρησιμοποιήσαμε υψηλής χωρητικότητας cDNA Αντίστροφη Μεταγραφή Kits (Applied Biosystems). PCR ανάλυση του

CD155

διεξήχθη παραλλαγές ματίσματος, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21].

Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου

Ολικό RNA εκχυλίστηκε από ιστούς χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Isogen ( Nippon Gene). Ανάλυση qRT-PCR του

CD155

παραλλαγές ματίσματος πραγματοποιήθηκε με TaqMan Gene Expression Αναλύσεις (Applied Biosystems) και Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System. Χρησιμοποιήσαμε τις ακόλουθες δοκιμασίες έκφρασης TaqMan Gene: Hs1050633_m1 (

CD155α

), Hs1050636_m1 (

CD155γ

), και Hs99999903_m1 (

ACTB

). Για

CD155β

, χρησιμοποιήσαμε έθιμο δοκιμασίες έκφρασης TaqMan Gene με τους ακόλουθους εκκινητές και δημοσιογράφος: προς τα εμπρός εκκινητή 5′-AAAGAGGGACCTCCCAGTGA-3 ‘, αντίστροφος εκκινητής 5′-GAATAGGAGACATGCCCATTAGCT-3′, και δημοσιογράφος 5’-CACTCAGGTACAGAGCATG- 3 ‘. Με τη χρήση ενός Agilent 2100 Bioanalyzer, αναλύσαμε την ποιότητα του ολικού RNA για qRT-PCR για έναν αριθμό ακεραιότητα RNA & gt? 7. Όλες οι τιμές προσδιορίστηκαν εις τριπλούν.

ELISA για ανθρώπινο διαλυτό CD155

επίπεδα sCD155 σε ορούς μετρήθηκαν με σάντουιτς ELISA χρησιμοποιώντας ποντικού αντι-ανθρώπινου CD155 mAb (TX24) και κουνελιού αντι-ανθρώπινης CD155 πολυκλωνικό Ab (pAb) ως σύλληψη και ανίχνευση Abs, αντίστοιχα, που ακολουθείται από HRP-συνδεδεμένη αντι-κουνελιού IgG (GE Healthcare) και υποστρώματος υπεροξειδάσης QuantaBlu φθορισμογόνων (Pierce Biotechnology). πλάκες Μαύρο 96 φρεατίων (Greiner Βίο-One) επικαλύφθηκαν με αντι-ανθρώπινο CD155 mAb ποντικού (TX24, mL ρυθμιστικού 2 μg /κλείδωμα, 100 μλ /φρεάτιο) για σύλληψη όλη τη νύκτα στους 4 ° C, αποκλείστηκαν με ρυθμιστικό αποκλεισμού (10% FBS, 200 μί /φρεάτιο) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, και πλένεται τρεις φορές με ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης (0,05% Tween 20). Ανθρώπινη πρωτεΐνη CD155-Fc σύντηξης (ως πρότυπα) και ορού δείγματα απλώθηκαν σε 100 μL /φρεάτιο, επωάστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, και πλύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης. Μετά από επώαση κάτω από τις ίδιες συνθήκες με 100 μι κουνελιού αντι-ανθρώπινης CD155 pAb (5 μg /mL σε ρυθμιστικό αποκλεισμού), πλύθηκε πλάκες επωάζονται υπό τις ίδιες συνθήκες με 100 μΐ αντι-κουνελιού IgG-HRP (1: 2000 σε πλύσιμο ρυθμιστικό), πλύθηκε και αντέδρασε με 100 μL διαλύματος εργασίας QuantaBlu (Pierce Biotechnology) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Σταματήσαμε τις αντιδράσεις με 100 μL QuantaBlu Stop Solution (Pierce Biotechnology) και μετρήσαμε την μονάδα σχετικό φθορισμό (RFU) από κάθε φρεάτιο σε μήκη κύματος 320 nm για διέγερση και 420 nm για εκπομπή χρησιμοποιώντας μια συσκευή ανάγνωσης Spectra Max M2e (Molecular Devices). Όλες οι τιμές προσδιορίστηκαν εις τριπλούν. Το αντίσωμα ποντικού αντι-ανθρώπινο CD155 mAb (TX24) και ανθρώπινη πρωτεΐνη σύντηξης CD155-Fc παράχθηκαν στο εργαστήριο μας όπως έχει περιγραφεί προηγουμένως [8]. Το αντι-ανθρώπινο CD155 κουνελιού pAb παρήχθη στο εργαστήριο μας με πρότυπες μεθόδους.

Καθιέρωση MethA επιμόλυνσης εκφράζουν sCD155 ποντίκι

Το cDNA που κωδικοποιεί εξωκυτταρική περιοχή του ποντικού CD155 υποκλωνοποιήθηκε εντός του ρ3 × FLAG -CMV-13 φορέα έκφρασης (Sigma-Aldrich) και μετάγονται σε κύτταρα MethA να παράγουν επιμόλυνσης εκφράζουν σταθερά sCD155 Flag-tagged χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο επιμόλυνσης DMRIE-C (Invitrogen). Η μορφομετατροπέα επιλέχθηκε από G418 (Sigma-Aldrich) και περάστηκαν στην περιτοναϊκή κοιλότητα των ποντικών.

ELISA για CD155-3 ποντίκι × πρωτεΐνη σύντηξης FLAG

Flag-tagged sCD155 σε ασκίτες ποντικού και ορό μετρήθηκαν με σάντουιτς ELISA χρησιμοποιώντας ένα αντι-ποντικού αρουραίου CD155 mAb (TX56) και ποντικού αντι-FLAG BioM2 mAb (Sigma-Aldrich) ως mAbs σύλληψης και ανίχνευσης, αντίστοιχα, που ακολουθείται από προϊόν σύζευξης στρεπταβιδίνης-ΗΚΡ (GE Healthcare) και QuantaBlu φθορισμογόνων υπόστρωμα υπεροξειδάσης (Pierce). πλάκες Μαύρο 96 φρεατίων (Greiner Βίο-One) επικαλύφθηκαν με αντι-ποντικού αρουραίου CD155 mAb (TX56, 2 μg /mL σε ρυθμιστικό αποκλεισμού (10% FBS σε PBS), 100 μL /φρεάτιο) όλη τη νύκτα στους 4 ° C, κατεργάζεται με το ρυθμιστικό διάλυμα μπλοκαρίσματος (200 μΙ /φρεάτιο) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, και πλένεται τρεις φορές με ένα ρυθμιστικό διάλυμα έκπλυσης (0,05% Tween 20). Τα δείγματα επιστρώθηκαν σε 100 μL /φρεάτιο, επωάστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, και πλύθηκαν με το ρυθμιστικό πλύσης. Μετά από επώαση κάτω από τις ίδιες συνθήκες με 100 μΐ αντι-FLAG BioM2 (Sigma-Aldrich, mL ρυθμιστικού 1 μg /αποκλεισμού), οι πλάκες επωάζονται υπό τις ίδιες συνθήκες με 100 μL στρεπταβιδίνης-HRP (GE Healthcare, 1: ρυθμιστικό 2000 πλύσιμο ), πλύθηκε και αντέδρασε με 100 μL διαλύματος εργασίας QuantaBlu (Pierce Biotechnology) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά τη διακοπή των αντιδράσεων με 100 μL QuantaBlu Stop Solution (Pierce Biotechnology), μετρήσαμε σχετικές μονάδες φθορισμού κάθε βυθίσματος στα μήκη κύματος 320 nm για διέγερση και 420 nm για εκπομπή χρησιμοποιώντας ένα Spectra Max M2e (Molecular Devices). Όλες οι τιμές προσδιορίστηκαν εις τριπλούν. Αντι-ποντικού αρουραίου CD155 mAb (TX56) δημιουργήθηκε στο εργαστήριο μας όπως περιγράφηκε προηγουμένως [8].

Η ανάπτυξη του όγκου δοκιμασία

Ποντίκια εμβολιάστηκαν υποδορίως στο πίσω μέρος με 8 × 10

4 κύτταρα sCD155-MethA. Τα ποντίκια παρακολουθήθηκαν για το μέγεθος του όγκου (η μακρά (L) και βραχέα (S) διαστάσεις) χρησιμοποιώντας παχύμετρο μία φορά την εβδομάδα, και οι όγκοι των όγκων υπολογίστηκαν από την εξίσωση: όγκος = (L χ S

2) /2, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22]. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία με CO2 ή αναισθησία μετά το τέλος του πειράματος.

Στατιστικά

Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του δύο ουρών Mann-Whitney U και η δίπλευρη Student t test .

Αποτελέσματα

η έκφραση της CD155α και CD155β σε ιστούς όγκων ήταν υψηλότερη από ότι σε μη καρκινικούς ιστούς

Αν και sCD155 εκφράζεται έντονα σε καρκίνους του παχέος εντέρου [12], της προφίλ έκφρασης σε άλλους καρκίνους είναι ασαφής. Με RT-PCR, αναλύσαμε την έκφραση του

CD155

mRNA σε αρκετές καρκινικές κυτταρικές σειρές και πρωτογενείς τραχήλου της μήτρας, των ωοθηκών, του ενδομητρίου και των καρκίνων? όλες τις κυτταρικές σειρές και οι καρκίνοι που εκφράζονται τόσο δεσμευμένη στη μεμβράνη (

CD155α

) και διαλυτές (

CD155β

και

CD155γ

)

CD155

mRNA (Εικ 1). Στη συνέχεια, με ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (qRT-PCR), συγκρίναμε την έκφραση του

CD155

ισομορφών μεταξύ ορθοκολικού, γαστρικό, και καρκίνων του μαστού και των παρακείμενων ιστών μη-όγκου τους? οι εκφράσεις του

CD155α

και

CD155β

, αλλά όχι

CD155γ

, ήταν σημαντικά υψηλότερα στους καρκίνους σε σύγκριση με τις μη καρκινικούς ιστούς (P & lt? 0,05) (Εικ 2).

PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση των σετ εναρκτήρα που βρίσκονται σε κάθε πλευρά των διαφόρων θέσεων ματίσματος. Τρεις ζώνες των προβλεπόμενων μεγεθών (α: 273 bp, β: 138 bp, γ: 114 bp) παρατηρούνται στα προϊόντα PCR. mRNA για δεσμευμένο σε μεμβράνη (α) και τα διαλυτά

CD155

(β,

γ

) εκφράστηκε από διάφορες καρκινικές κυτταρικές γραμμές ανθρώπου (Α) και του τραχήλου της μήτρας, των ωοθηκών, του ενδομητρίου και του καρκίνου ιστούς (Β ).

Η

Tumor και των παρακείμενων ιστών μη-όγκου ελήφθησαν από χειρουργικά δείγματα εκτομή του παχέος (αδενοκαρκίνωμα, n = 9), γαστρικό (αδενοκαρκίνωμα, n = 4), και του μαστού (πορογενές διηθητικό καρκίνωμα, n = 3) καρκίνους. qRT-PCR του

CD155

παραλλαγές ματίσματος RNA πραγματοποιήθηκε, και η πτυχή αλλαγή σχετική έκφραση του καρκινικού ιστού έναντι του γειτονικού μη καρκινικό ιστό υπολογίστηκε. Η έκφραση του συνδεδεμένου με μεμβράνη (α) και διαλυτά (β)

CD155

RNA στους ιστούς του όγκου ήταν σημαντικά υψηλότερη από εκείνη των μη καρκινικούς ιστούς (Ρ & lt? 0,05).

Η

επίπεδα sCD155 ήταν υψηλότερα σε ορούς ασθενών με καρκίνο από ότι σε εκείνα των υγιών δοτών

Επειδή η έκφραση

sCD155

σε καρκινικούς ιστούς ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω, ιδρύσαμε ένα σάντουιτς ELISA για τη μέτρηση sCD155 (S1 Σχήμα) και ποσοτικοποιούνται sCD155 στους ορούς 262 ασθενείς με διάφορους καρκίνους, συμπεριλαμβανομένου του πνεύμονα, του οισοφάγου, του στομάχου, του παχέος εντέρου, του χολή-πόρου, του παγκρέατος, του μαστού, των ωοθηκών, του ενδομητρίου, του τραχήλου της μήτρας και καρκίνους (Πίνακας 1). Σε σύγκριση με υγιείς δότες (n = 60), οι οροί των ασθενών με καρκίνο είχαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα sCD155 (μέσος όρος = 15.6 ng /mL και 28.3 ng /mL, αντίστοιχα, Ρ & lt? 0,0001) (Πίνακας 1, Σχήμα 3Α), τα οποία ήταν δεν επηρεάζεται από την ηλικία ή το φύλο του ασθενούς (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ο δέκτης λειτουργεί χαρακτηριστική καμπύλη δείχνει τη δύναμη του επιπέδου sCD155 για τη διάκριση μεταξύ των ασθενών με καρκίνο και υγιείς δότες? η τιμή για το εμβαδόν κάτω από την καμπύλη ήταν 0.718 (Σχ 3Β).

(α) Επίπεδα Διαλυτό CD155 σε ορούς από υγιείς δότες (n = 60) και ασθενείς με καρκίνο (n = 262) αναλύθηκαν με ELISA σάντουιτς . Σε σύγκριση με υγιείς δότες, οι οροί των ασθενών με καρκίνο είχαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα sCD155 (Ρ & lt? 0,0001). Κόκκινη γραμμή: μέση, μαύρη γραμμή: SD. (Β) λειτουργικού χαρακτηριστικού δέκτη-καμπύλη που απεικονίζει τη δύναμη του διαλυτού επίπεδο CD155 σε διακρίσεις μεταξύ υγιείς δότες και ασθενείς με καρκίνο.

Η

Σε σύγκριση με εκείνους σε δείγματα υγιούς ελέγχου, τα επίπεδα sCD155 σε ορούς από ασθενείς με κάθε τύπο καρκίνου, εκτός από τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας ήταν σημαντικά υψηλότερα (πνεύμονα: P & lt? 0,05, του οισοφάγου: P & lt? 0.001, γαστρικό: P & lt? 0,0001, του παχέος εντέρου: P & lt? 0.001, χολή-πόρου: P & lt? 0,0001, παγκρεατική: P & lt? 0,0001, του μαστού: P & lt? 0,05, των ωοθηκών: P & lt? 0,01, ενδομητρίου: P & lt? 0,01) (Πίνακας 1, Σχήμα 4Α). Αξίζει να σημειωθεί ότι, σε σύγκριση με υγιείς δότες, ασθενείς με πρώιμο στάδιο (στάδια 1 και 2) γαστρικό καρκίνο είχαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα sCD155 (P & lt? 0,01). Επιπλέον, τα επίπεδα sCD155 ήταν σημαντικά υψηλότερα σε ασθενείς με προχωρημένο στάδιο (στάδια 3 και 4) από ό, τι γαστρικού καρκίνου σε ασθενείς σε πρώιμα στάδια (Ρ & lt? 0,05) και των υγιών μαρτύρων (Ρ & lt? 0.001) (Σχήμα 4Β). Αν και τα επίπεδα sCD155 δεν άλλαξαν ή ακόμη και να αυξηθεί σε ορισμένους ασθενείς μετά από χειρουργική εκτομή των καρκίνων και αυτό μπορεί να εξαρτάται από κάθε ασθενή με διαφορετικά καρκίνο, στατιστική ανάλυση για το συνολικό πληθυσμό έδειξαν ότι τα επίπεδα sCD155 ήταν σημαντικά μειωμένη (Ρ & lt? 0,05) (Σχ 4C )

(α) επίπεδα Διαλυτό CD155 σε ορούς, σύμφωνα με τους διάφορους τύπους καρκίνου (πνεύμονα:. n = 52, του οισοφάγου: n = 8, γαστρικό: n = 49, ορθοκολικό: n = 12, χολή-πόρου : n = 25, του παγκρέατος: n = 18, του μαστού: n = 32, των ωοθηκών: n = 23, του ενδομητρίου: n = 16, του τραχήλου της μήτρας: η = 15) αναλύθηκαν με ELISA σάντουιτς. Κόκκινη γραμμή: μέση, μαύρη γραμμή: SD. (Β) επίπεδα Διαλυτό CD155 στον ορό των ασθενών με καρκίνο του στομάχου με στρωματοποίηση από το στάδιο της νόσου. Τα στάδια 1 & amp? 2: n = 24, τα στάδια 3 &? 4: n = 25. (Γ) τα επίπεδα Διαλυτό CD155 σε ορούς ασθενών με καρκίνο που υποβλήθηκαν σε χειρουργική επέμβαση (n = 73) αναλύθηκαν για τον καρκίνο πριν και μετά. Διαλυτό επίπεδο CD155 μειώθηκε σημαντικά μετά την επέμβαση. Κόκκινο οικοπέδου: μέση, προεγχειρητική μέση: 26.529 ng /mL, μετεγχειρητική μέση: 22.390 ng /mL, P & lt? 0.05. Μετεγχειρητική ημέρα: 69,30 ± 61,95

Η

επίπεδα sCD155 σε ορούς εξαρτώνταν από το φορτίο του όγκου σε ένα μοντέλο ποντικού

Με βάση τα αποτελέσματα που περιγράφονται παραπάνω, υποθέσαμε ότι τα επίπεδα sCD155 στους ορούς. του καρκίνου ασθενείς συνδέουν με το φορτίο του όγκου. Για την αντιμετώπιση αυτής της υπόθεσης, επιμολύναμε ινοσαρκώματος κυτταρική γραμμή MethA, το οποίο εκφράζεται μόνον ενδογενής mCD155, με ένα φορέα ρετροϊού που περιέχει είτε cDNA που κωδικοποιεί το εξωκυτταρικό τμήμα του ποντικού CD155 ή με ένα ψευδο φορέα ελέγχου. Εμείς εμβολιάστηκαν τις επιμολύνσεων (sCD155-MethA ή ψευδο-MethA) μέσα στην περιτοναϊκή κοιλότητα των ποντικών και, 10 ημέρες αργότερα, συλλέχθηκαν ασκίτες. Για να ποσοτικοποιηθεί το επίπεδο sCD155, ιδρύσαμε ένα σύστημα ELISA. Παρά το γεγονός ότι ήταν σχεδόν sCD155 ανιχνεύθηκε στον ασκίτη ποντικών που είχαν εμβολιαστεί με Mock-MethA με ELISA, εντοπίσαμε ένα σημαντικό ποσό των sCD155 στον ασκίτη ποντικών που είχαν εμβολιαστεί με sCD155-MethA (Σχήμα 5Α). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι sCD155-MethA παράγεται sCD155

in vivo

. Στη συνέχεια υποδορίως εμβολιάζονται ποντίκια με sCD155-MethA και μετρώνται δύο επίπεδα sCD155 ορό και το μέγεθος του όγκου. Παρατηρήσαμε ότι τα επίπεδα sCD155 στους ορούς συσχετίστηκαν με sCD155-MethA το μέγεθος του όγκου (Σχήμα 5Β). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα επίπεδα sCD155 ορού συνδέσει με το φορτίο του όγκου.

(Α) MethA επιμόλυνσης εκκρίνουν sCD155 (sCD155-MethA) ή πρωτεΐνη ελέγχου (Mock-MethA) εμβολιάστηκαν σε περιτοναϊκή κοιλότητα και στη συνέχεια συλλέχθηκε ασκίτης. επίπεδα sCD155 σε ασκίτη ποντικών που είχαν εμβολιαστεί με αυτά transfectantss μετρήθηκαν με ELISA. ποντίκια (Β) BALB /c εμβολιάσθηκαν υποδορίως με sCD155-MethA επιμόλυνσης. επίπεδα μεγέθους του όγκου και sCD155 στον ορό μετρήθηκαν και ο συντελεστής συσχέτισης υπολογίστηκε.

Η

Συζήτηση

Αν και sCD155 εντοπίστηκαν πριν από 25 χρόνια [20], λίγα είναι γνωστά για την έκφραση του και λειτουργία. Εδώ, δείξαμε ότι η έκφραση του sCD155 (

CD155β

), καθώς και mCD155 (CD155

α

) mRNA σε ιστούς όγκων ήταν σημαντικά υψηλότερη από ό, τι σε μη καρκινικούς ιστούς. Επιπλέον, οι ασθενείς με διάφορους τύπους καρκίνων έδειξαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα sCD155 ορού, σε σύγκριση με τα δείγματα υγιή έλεγχο. Επιπλέον, τα επίπεδα στον ορό sCD155 συσχετίστηκαν με την εξέλιξη της νόσου σε ασθενείς με καρκίνο του στομάχου και του μεγέθους του όγκου σε ποντίκια. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι τα επίπεδα sCD155 στους ορούς των ασθενών με καρκίνο είναι πιθανώς εξαρτώνται από το φορτίο του όγκου. Προηγούμενη έκθεση έδειξε ότι πάνω ρύθμιση CD155 ποντικού διαμεσολαβείται από την οδό σηματοδότησης Raf-MEK-ERK-AP-1 [23], υποδηλώνοντας ότι η έκφραση τόσο mCD155 και sCD155 ρυθμίζεται προς τα πάνω μέσω αυτής της οδού επίσης σε ανθρώπινο, αν και περαιτέρω οι μελέτες που απαιτούνται για να καθορίσουν τον τρόπο sCD155 υπερεκφράζεται σε καρκίνους. Παρ ‘όλα αυτά, τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι το επίπεδο sCD155 ορό είναι δυνητικά χρήσιμο ως βιοδείκτη για την εξέλιξη του καρκίνου.

Αν και mCD155 εκφράζεται σε όγκους έχει θεωρηθεί ότι εμπλέκεται σε DNAM-1 ανοσίας όγκου, αντιφατικά αποτελέσματα έχουν αναφερθεί . Για παράδειγμα, η υπερέκφραση του mCD155, όπως προσδιορίζεται από ανοσοϊστοχημική μελέτη με τη χρήση αντι-CD155 αντίσωμα, σε αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα και το μελάνωμα συσχετίστηκε με κακή πρόγνωση [24, 25]. Ωστόσο, οι μελέτες αυτές δεν εισάγουν διακρίσεις μεταξύ mCD155 και sCD155. Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε ότι η έκφραση και των δύο mCD155 (

CD155α

) και sCD155 (

CD155β

) έχουν ρυθμίζεται προς τα πάνω σε καρκίνους, συμπεριλαμβανομένου του παχέος εντέρου, του στομάχου και του μαστού, σε σύγκριση με μη καρκινικών ιστούς. Παρά το γεγονός ότι, λόγω του περιορισμένου αριθμού κάθε τύπου καρκίνου, δεν θα μπορούσε να αξιολογηθεί η συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης των sCD155 (

CD155β

) mRNA σε καρκινικούς ιστούς ή τα επίπεδα CD155 ορό και την εξέλιξη της νόσου και την πρόγνωση, υψηλότερα επίπεδα sCD155 στους ορούς συνδέθηκε με προχωρημένο στάδιο του γαστρικού καρκίνου και του μεγέθους του όγκου σε ποντίκια.

Προηγούμενες εκθέσεις κατέδειξαν το ρόλο του διαλυτή μορφή των υποδοχέων μεμβράνης σε διαφυγή του όγκου. Οι δεσμευμένες σε μεμβράνη μόρια όπως NKG2D συνδέτες MHC τάξης Ι συνδέονται με μόριο (MIC) και UL16-δεσμευτικές πρωτεΐνες (ULBPs) και Fas, οι οποίες συμμετέχουν σε κύτταρα ΝΚ και CTL διαμεσολαβούμενη κυτταροτοξικότητα κατά των όγκων, έχει αποδειχθεί ότι θα κυκλοφορήσει ως διαλυτά μορφές στους ορούς των διαφόρων ασθενείς με καρκίνο [26-30]. Σε αντίθεση με CD155, διαλυτό MIC και ULBPs δημιουργούνται από όγκους από πρωτεολυτική ρίχνοντας [26, 31, 32]. Οι όγκοι μπορεί να αποφύγει από NKG2D ανοσολογική επιτήρηση από διάφορους μηχανισμούς? ένας από αυτούς είναι ότι η διαλυτή MIC ρυθμίζει αρνητικά NKG2D έκφραση [31, 33]. Προηγούμενη έκθεση έδειξε ότι τα υψηλά επίπεδα του διαλυτού ULBP2 σε ορούς συνδέεται με κακή πρόγνωση της νόσου σε ασθενείς με μελάνωμα [27], υποδηλώνοντας ότι οι διαλυτές ULBP2 εμπλέκεται στην ογκοάνοση απάτης.

Σε αντίθεση με NKG2D συνδετήρες, η λειτουργική σημασία της sCD155 στην ανοσία όγκου παρέμεινε ασαφής. Πρόσφατες μελέτες αποκάλυψαν ότι DNAM-1 μοιράζεται το CD155 συνδέτη με Τ κυττάρων ανοσοϋποδοχέα με Ig και τομείς ΙΤΙΜ (TIGIT) ή CD96 [34, 35]. Cross-linking CD96 με πλάκα δεσμευμένη πρωτεΐνη σύντηξης CD155-Fc ανέστειλε την παραγωγή της IFN

γ

από ΝΚ κύτταρα [36]. Επιπλέον, CD96-ανεπαρκή ποντίκια έδειξαν μειωμένη πειραματική μετάσταση όγκου [36], γεγονός που υποδηλώνει ότι CD96 και DNAM-1 εναντιωθεί ο ένας τον άλλον στην ανοσία όγκου. Ομοίως, TIGIT έχει το αντίθετο αποτέλεσμα από DNAM-1 σχετικά με την ασυλία του όγκου [37, 38]. Για να διευκρινιστεί η λειτουργική σημασία της sCD155 στην ανοσία όγκου, απαιτούνται περαιτέρω μελέτες πώς η αλληλεπίδραση των sCD155 με την ενεργοποίηση του (DNAM-1) και ανασταλτικές (CD96 και TIGIT) υποδοχείς τους και η σηματοδότηση μέσω αυτών ενεργοποίηση και ανασταλτικούς υποδοχείς ρυθμίζονται.

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 Εικ. Ίδρυση σάντουιτς ELISA για sCD155.

(Α) Πρότυπη καμπύλη της ανθρώπινης πρωτεΐνης σύντηξης CD155-Fc. (Β) Σε μία 12-φρεατίων, 1 × 10

6 HeLa καλλιεργήθηκαν ανά 1 ml μέσου? υπερκείμενα καλλιέργειας συλλέχθηκαν μετά από 24 και 48 ώρες για διαλυτή ανίχνευση πρωτεΐνης CD155

doi:. 10.1371 /journal.pone.0152982.s001

(EPS)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Tochihara S και Nomura Υ για γραμματειακή υποστήριξη.