Abstract

μακροφάγων παράγοντα διέγερσης αποικιών (MCSF) ρυθμίζει την ανάπτυξη, πολλαπλασιασμό και διαφοροποίηση των αιμοποιητικών κυτταρικών γραμμών. Πολλοί καρκίνοι είναι γνωστό ότι εκκρίνουν υψηλά επίπεδα MCSF, που προσλαμβάνουν μακροφάγα εντός του όγκου μικρο-περιβάλλον, υποστηρίζοντας την ανάπτυξη του όγκου. Στο παρόν, δεν αναφέρουν την κλωνοποίηση του MCSF και μετέπειτα γενιά των U87MG εκφράζουν MCSF σταθερή κυτταρική γραμμή (U87-MCSF). Η κυτταροτοξικότητα του αντικαρκινικού φαρμάκου 5-φθοριοουρακίλη (5-FU) αξιολογήθηκε και στις δύο κύτταρα U87MG και U87-MCSF. Είναι ενδιαφέρον ότι, ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων U87-MCSF ήταν μικρότερη (ρ & lt? 0,001) από εκείνη των κυττάρων U87MG και μόνο, μετά από θεραπεία με 5-FU. Σημαντική μείωση στα επίπεδα έκφρασης της κυκλίνης Ε και Α2 ποσοτικά με ανάλυση PCR πραγματικού χρόνου ενισχύεται η μειωμένη πολλαπλασιασμός του 5-FU επεξεργασμένα κύτταρα U87-MCSF. Ωστόσο, χρώση JC-1 δεν αποκάλυψε καμία απόπτωση κατά την αγωγή με 5-FU. Notch-1 προς τα πάνω ρύθμιση που επάγεται μια πιθανή επιθηλιακά μεσεγχυματικά μετάβαση σε κύτταρα U87-MCSF, που αντιπροσώπευαν την αύξηση του ποσοστού των CD24

υψηλή /CD44

λιγότερο καρκινικά βλαστικά κύτταρα σε κύτταρα U87-MCSF μετά από 5-FU κατεργασία . Η υπερυψωμένη αντίσταση των κυττάρων U87-MCSF προς 5-FU οφείλεται στην αύξηση των εκφράσεων (10,2 και 6 φορές) του ABCB1 και mdm2, αντίστοιχα. Επιπλέον, αύξηση των εκφράσεις ABCG1, mdm2 και CD24 παρατηρήθηκε επίσης σε κύτταρα U87MG και μετά από παρατεταμένη επώαση με 5-FU. Οι μελέτες μας παρέχονται μηχανιστικές γνώσεις σχετικά με ανθεκτικότητα στα φάρμακα των κυττάρων U87MG και περιγράφονται, επίσης, τον κεντρικό ρόλο που διαδραματίζουν οι MCSF στην αυξάνοντας την αντίσταση των κυττάρων U87MG σε 5-FU

Παράθεση:. Chockalingam S, Ghosh SS (2013) Βελτίωση της Καρκίνος βλαστικών κυττάρων σε παράγοντα διέγερσης αποικίας μακροφάγου-εκφράζουν U87MG-ανθρώπινου γλοιοβλαστώματος μετά 5-φθοροουρακίλη Therapy. PLoS ONE 8 (12): e83877. doi: 10.1371 /journal.pone.0083877

Επιμέλεια: Rajesh Agarwal, Πανεπιστήμιο του Κολοράντο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 19 Σεπτεμβρίου του 2013? Αποδεκτές: 8 Νοέμβρη 2013? Δημοσιεύθηκε: 31 Δεκεμβρίου, 2013

Copyright: © 2013 Chockalingam, Ghosh. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η χρηματοδότηση που προβλέπεται από το Τμήμα Βιοτεχνολογίας Νο BT /49 /NE /TBP /2010 και BT /01 /NE /PS /08. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

μακροφάγων παράγοντα διέγερσης (MCSF) αποικία, που αναφέρεται επίσης ως διέγερσης αποικίας παράγοντας-1 (CSF-1), είναι ένας αυξητικός παράγοντας που ευθύνεται για την επιβίωση, τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των κυττάρων των αιμοποιητικών γραμμώσεων [1]. Έξω από το αιμοποιητικό σύστημα, MCSF έχει ένα σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και ρύθμιση του πλακούντα, μαστικού αδένα, τον εγκέφαλο και φυσιολογία των οστών [2] – [4]. MCSF κωδικοποιείται από ένα μοναδικό γονίδιο, όμως, μέσω εναλλακτικού ματίσματος mRNA και διαφορικής μετα-μεταφραστική τροποποίηση, τρεις διαφορετικές μορφές του MCSF, όπως, μία εκκρινόμενη γλυκοπρωτεΐνη, μία εκκρινόμενη πρωτεογλυκάνη και ένα δεσμευμένο ισομορφή μικρή μεμβράνη βρίσκονται [1]. MCSF δρα μέσω ενός τύπου III υποδοχέα τυροσίνης κινάσης, 1 υποδοχέα παράγοντα διέγερσης αποικιών (CSF1R), το οποίο είναι το προϊόν του c-fms πρωτο-ογκογονιδίου.

MCSF είναι γνωστό για να διεισδύσει περιοχές του τραυματισμού και της φλεγμονής με μονοπύρηνα φαγοκύτταρα . Τα ομόζυγα μηδενική μετάλλαξη του CSF-1 σε ποντίκια δείχνει εξαντληθέντος πληθυσμός μακροφάγων στον καρκίνο του μαστού, με αποτέλεσμα τη μειωμένη κακοήθεια και μετάσταση [5]. Η παρουσία των μονοκυττάρων και μακροφάγων προάγει την αγγειογένεση και μετάσταση όγκου σε αυξάνοντας το επίπεδο της έκκρισης του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF). MCSF δρα ως μεταγραφικός ρυθμιστής για την παραγωγή του VEGF [6]. Παρ ‘όλα αυτά, MCSF έχει ένα δυνητικό ρόλο στην πρόκληση απόκριση κατά του όγκου. έχουν μονοκύτταρα και μακροφάγα έχουν αναφερθεί να σκοτώσουν τα καρκινικά κύτταρα με paraptosis, με υπερέκφραση μορφή μεμβράνης του MCSF [7], [8]. Η προσθήκη του καθαρισμένου MCSF στα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών έχει τεκμηριωθεί ότι επάγει εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση αναστολή της ανάπτυξης in vitro [9]. Ως εκ τούτου, όπως εκθέσεις που αποδεικνύουν τις δραστηριότητες αντι-όγκου των MCSF λειτουργούν χέρι-χέρι με εναλλακτικές εκθέσεις που δείχνουν τις προ-καρκινικές ιδιότητες των MCSF.

Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε διευκρινιστεί ο ρόλος που διαδραματίζουν οι MCSF στην αύξηση της ιδιότητες αντίστασης φαρμάκων ανθρώπινης κυτταρικής γραμμής γλοιοβλαστώματος, U87MG. Βρήκαμε επίσης το μηχανισμό της αντίστασης 5-FU σε κύτταρα U87MG. Τα αποτελέσματά μας απεικονίζονται ότι η έκφραση της Notch-1 ενισχύθηκε σε μη επεξεργασμένα κύτταρα U87-MCSF, η οποία επάγεται επιθηλιακά μεσεγχυματικά μετάβασης. Μια αύξηση της CD24

υψηλή /CD44

χαμηλή καρκινικά βλαστικά κύτταρα και προς τα πάνω ρύθμιση των βασικών γονιδίων μεταφορέα ABC (ABCG1 και ABCB1) μεταδίδεται αντίσταση σε 5-FU σε κύτταρα U87-MCSF. Τα δεδομένα μας παρέχει στοιχεία για την ανθεκτική στα φάρμακα φαινότυπο που αναδύεται μέσα από το σχηματισμό των καρκινικών βλαστικών κυττάρων σε MCSF εκφράζουν γλοιοβλάστωμα.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές

ACHN, ανθρώπινο νεφρικό καρκίνωμα και U87MG, ανθρώπινες κυτταρικές σειρές γλοιοβλαστώματος που προμηθεύονται από το Εθνικό Κέντρο για την Επιστήμη Cell, Pune διατηρήθηκαν σε μέσο Dulbecco Τροποποιημένο Eagle (DMEM) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, πενικιλλίνη (50 U /ml) -Streptomycin (50 mg /ml) σε 5% CO

2 σε υγροποιημένο επωαστή στους 37 ° C.

απομόνωση RNA και RT-PCR

RNA από καλλιεργημένα κύτταρα θηλαστικών απομονώθηκε χρησιμοποιώντας GenElute κιτ συνολική απομόνωση RNA θηλαστικών ( Sigma) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ολικό RNA (1 μ§) μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας κιτ σύνθεσης cDNA (Fermentas). Ενίσχυση της γονιδιακής έκφρασης διεξήχθη με ειδικές αντίστοιχο γονίδιο εκκινητές (Πίνακας S1 σε S1 File).

κηλίδωση Western

κύτταρα αναπτύσσονται προς 70-80% συρροή λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα RIPA που περιέχει 1 mM PMSF . Συνολική περιεκτικότητα πρωτεΐνης στα κυτταρολύματα ποσοτικοποιήθηκε με τη μέθοδο Lowry, της εκτίμησης πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας BSA ως πρότυπο. SDS-PAGE έγινε φόρτωση ίση ποσότητα πρωτεΐνης σε κάθε φρεάτιο. Τα δείγματα κηλιδώθηκαν επί μεμβράνης PVDF και ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας αντισώματα για β-ακτίνη (BD Transduction Laboratories) και MCSF (Sigma). Οι κηλίδες αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας χημειοφωταύγειας υποστρώματος υπεροξειδάσης-1 κιτ (Sigma) και απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα τεκμηρίωσης τζελ (ChemiDoc XRS + σύστημα εικόνα Μοριακής σύστημα απεικόνισης, Bio-Rad).

Η βιωσιμότητα των κυττάρων δοκιμασία

Η βιωσιμότητα των κυττάρων ήταν μετράται με τη χρήση Σε κιτ προσδιορισμού Vitro Τοξικολογίας, ΧΤΤ βάση (Sigma). Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 96 φρεατίων μικροπλάκα σε πυκνότητα 1,5 × 10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο αφέθηκαν να αναπτυχθούν όλη τη νύκτα και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις της 5-FU για διαφορετικά χρονικά διαστήματα. ΧΤΤ (2, 3-δις [2-μεθοξυ-4-νιτρο-5-σουλφοφαινυλ] -2Η-τετραζολίου-5-καρβοξυανιλιδίου εσωτερικό άλας) δοκιμασία διεξήχθη στο τέλος της περιόδου θεραπείας χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Το διαλυτό πορτοκαλί προϊόντος φορμαζάνης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας αναγνώστη πολλαπλών δίσκων (Tecan, άπειρη M200) στα 450 nm και η μέτρηση υποβάθρου στα 690 nm. Η βιωσιμότητα των κυττάρων (%) υπολογίστηκε σε σχέση με τα μη επεξεργασμένα 100% βιώσιμα κύτταρα.

MCSF τοπική προσαρμογή μελέτη

Εν συντομία, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και σταθεροποιήθηκαν με διάλυμα παραφορμαλδεΰδης 3,7% (με ή χωρίς 0,1% Triton Χ-100) στους 37 ° C για 30 λεπτά. Μετά την πλύση με PBS τρεις φορές, τα κύτταρα αποκλείσθηκαν με διάλυμα αποκλεισμού BSA 1% για 30 λεπτά. Στη συνέχεια, τα κύτταρα επωάστηκαν με αντι-MCSF (Sigma) πρωτογενές αντίσωμα και στη συνέχεια με FITC δευτερογενές αντίσωμα επισύναψη (BD Transduction Laboratories). Μετά από χρώση με FITC δευτερογενές αντίσωμα ετικέτα, τα κύτταρα επωάστηκαν με μέσα που περιέχουν 300 ηΜ DAPI για 3 λεπτά, τελικά πλύθηκαν και παρατηρήθηκαν κάτω από μικροσκόπιο φθορισμού (Nikon ECLIPSE T

i

-U, Japan) με ένα φίλτρο διέγερσης 480 /15 nm (για FITC) και 360/20 nm (για DAPI).

Trypan μπλε χρωστική αποκλεισμού δοκιμασία

Cells σε έξι φρεάτων υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5-FU για 120 ώρες. Μετά την αγωγή, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, αναμίχθηκαν με ίσο όγκο 0,4% trypan blue (Invitrogen) και φορτώθηκε πάνω ένα θάλαμο καταμέτρησης. Τα υγιή και βιώσιμα κύτταρα με ανέπαφη μεμβράνη αποκλείεται η χρωστική ουσία, ενώ μειωμένη κύτταρα βάφονται με τη χρωστική ουσία και μετρήθηκαν ως νεκροί. Το ποσοστό (%) της βιωσιμότητας των κυττάρων υπολογίστηκε με τη χρήση κόμισσα-αυτοματοποιημένο μετρητή κυττάρων (Invitrogen).

CFSE τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων δοκιμασία

Τα κύτταρα (1 × 10

6 κύτταρα /ml) σε PBS που περιέχει 0,1% BSA επωάστηκαν με 10 μΙ 0,5 mM CFDA-SE στους 37 ° C για 10 λεπτά και στη συνέχεια πλύθηκε με 5 όγκους παγωμένου μέσων για τη σβέση οποιοδήποτε ελεύθερο χρωστικής. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση και πλύθηκαν δύο φορές με φρέσκο ​​μέσο. Βαμμένα κύτταρα αναλύθηκαν αμέσως με κυτταρόμετρο ροής (μηδέν χρονικό σημείο) και το υπόλοιπο των κυττάρων σπάρθηκαν για μετέπειτα χρονικές περιόδους. Τα δεδομένα που αποκτήθηκαν αναλύθηκαν σε Cell Quest Pro λογισμικού. Ο χρόνος διπλασιασμού υπολογίστηκε σύμφωνα με τον τύπο Τ

d = T /log

2 (F

0 /F

T), όπου F

0 είναι η γεωμετρική μέση ένταση φθορισμού σε 0 h και F

Τ είναι η γεωμετρική μέση ένταση φθορισμού στα Τ h [10]. Στα πειράματά μας Τ ήταν 72 ώρες.

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε έξι φρεατίων σε πυκνότητα 5 χ 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο. Μετά από ολονύκτια προσκόλληση, τα κύτταρα κατεργάστηκαν με διαφορετικές συγκεντρώσεις της 5-FU. Στο τέλος των κυττάρων περιόδου αγωγής τρυψινοποιήθηκαν, πλύθηκαν και στερεώθηκαν με διάλυμα αλκοόλης 70% για 15 λεπτά σε πάγο. Τα σταθεροποιημένα κύτταρα βάφτηκαν με διάλυμα χρώσης ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) (50 μg /ml ΡΙ, 0,1 mg /ml ΚΝάση Α και 0,05% Triton Χ-100) στους 37 ° C για 30 λεπτά σε σκοτάδι. Τουλάχιστον 10.000 συμβάντα ανά δείγμα αποκτήθηκαν με κυτταρομετρητή ροής και το ποσοστό των κυττάρων που κατανέμεται σε διάφορες φάσεις του κυτταρικού κύκλου υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό ModFit LT.

ανάλυση CD24 /CD44 με κυτταρομετρία ροής

Cells μετά την επεξεργασία διαχωρίστηκαν με θρυψινοποίηση, πλύθηκαν δύο φορές με PBS και επωάστηκαν με 10% ανθρώπινο ορό για 20 λεπτά επί πάγου για να εμποδίσει Fc υποδοχείς. FITC ποντικού κατά ανθρώπινης CD24 και ΡΕ ποντικού κατά ανθρώπινης CD44 (και τα δύο από την BD Pharmingen) αντισώματα προστέθηκαν και επωάστηκαν για 20 λεπτά επί πάγου στο σκοτάδι. Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS, τελικά επαναιωρήθηκαν σε PBS και αναλύθηκαν με ένα κυτταρόμετρο ροής (FACSCalibur, Βϋ Biosciences, NJ).

Ανάλυση

Η γονιδιακή έκφραση με πραγματικού χρόνου PCR

Ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο πραγματοποιήθηκε με τη χρήση SYBR πράσινο ως χρωστική αναφοράς (Power SYBR Green PCR κύριο μείγμα, της Applied Biosystems) και 7500 Real time σύστημα PCR (Applied Biosystem). Πρώτες δεδομένα αναλύθηκαν και της αποτελεσματικότητας της κάθε αντίδρασης υπολογίστηκε από το λογισμικό LinRegPCR. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως το ενδογενές ελέγχου και της πτυχής αλλαγή στην έκφραση των γονιδίων υπολογίστηκε με τη μέθοδο ΔΔCt.

μεθυλενίου μπλε χρώση

Κύτταρα κατεργασμένα με διάφορες συγκεντρώσεις της 5-FU για διαφορετικά χρονικά διαστήματα, πλύθηκαν με παγωμένο PBS, μονιμοποιήθηκαν με 50% παγωμένη αιθανόλη. 0,2% (W /V) διαλύματος μπλε του μεθυλενίου χρώσης προστέθηκε στη πλάκα και χρώση διεξήχθη για 30 δευτερόλεπτα. Το διάλυμα αναρροφήθηκε και τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές με παγωμένο νερό. Τα δείγματα στέγνωσαν στον αέρα και παρατηρήθηκαν υπό μικροσκόπιο φωτός.

Actin κυτταροσκελετού χρώση

κύτταρα καλλιεργούνται σε έξι τρυβλία υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5-FU. Στο τέλος της περιόδου θεραπείας, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και σταθεροποιήθηκαν με διάλυμα παραφορμαλδεύδης 3,7% που περιέχει 0,1% Triton Χ-100 στους 37 ° C για 30 λεπτά. Μετά την πλύση με PBS τρεις φορές, τα κύτταρα αποκλείσθηκαν με διάλυμα αποκλεισμού BSA 1% για 30 λεπτά. Στη συνέχεια, τα κύτταρα επωάστηκαν με αντι πρωτογενές αντίσωμα β-ακτίνης (BD Transduction Laboratories) και ακολούθως με FITC δευτερογενές αντίσωμα επισύναψη (BD Transduction Laboratories). Μετά από χρώση με FITC δευτερογενές αντίσωμα ετικέτα, τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές και επωάστηκαν με μέσα που περιέχουν 300 ηΜ DAPI για 3 λεπτά. Τα κύτταρα πλύθηκαν καλά, τελικά επαναιωρήθηκαν σε PBS και κατέστησαν ορατά κάτω από μικροσκόπιο φθορισμού (Nikon ECLIPSE T

i

-U, Japan) με ένα φίλτρο διέγερσης 480/15 nm (για FITC) και 360/20 nm (για ϋΑΡΙ).

Στατιστική ανάλυση

Οι τιμές για όλα τα πειράματα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SEM τριών ή περισσοτέρων επιμέρους πειράματα. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με δοκιμασία t του Student ή με ANOVA ανάλογα με την περίπτωση, με τη χρήση GraphPad Prism 5.01. Οι στατιστικά σημαντικές τιμές συμβολίζεται με * (p & lt? 0.05), ** (p & lt? 0,01) και *** (p & lt? 0.001).

Αποτελέσματα

Δημιουργία κύτταρα U87-MCSF και ευαισθησία προς 5-FU

Σχήμα 1Α απεικονίζεται η στρατηγική για την παραγωγή των U87-MCSF σταθερή κυτταρική γραμμή. Το 0.771 kb PCR ενισχυμένο γονίδιο που αντιστοιχεί σε δεσμευμένη μεμβράνη ισομορφή του MCSF κλωνοποιήθηκε διαδοχικά σε pGEMT-easy και ρΕΟΡΡ-Ν1 φορείς. Οι κλώνοι ελέγχθηκαν με ανάλυση περιορισμού στο Σχήμα 1Β (λωρίδα 2 και 4). Μία σταθερή κυτταρική γραμμή (U87-MCSF), που υπερεκφράζουν MCSF ιδρύθηκε με επιμόλυνση κυττάρων U87MG με pEGFP-Ν1-MCSF. Ένα μικτό πληθυσμό κλώνων U87-MCSF επιλέχθηκε με G418 (400 μg /ml) για να αποκλείσει τον πιθανό ρόλο κάθε άλλης αντισταθμιστικής διαδικασίας που απορρέουν από την επιμόλυνση σε ένα μόνο κλωνικό πληθυσμό. Η έκφραση του διαγονιδίου MCSF επιβεβαιώθηκε με ημι-ποσοτική RT-PCR (Σχήμα 1 C). Η υπερέκφραση του MCSF πρωτεΐνης επιβεβαιώθηκε με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας αντι-MCSF αντίσωμα, με την οποία, μια 1,8 φορές αύξηση στην έκφραση MCSF σημειώθηκε σε κύτταρα U87-MCSF (Εικόνα 1D). Μία μείωση στην έκφραση του υποδοχέα MCSF, CSF1R σημειώθηκε σε κύτταρα U87-MCSF (0,16 φορές έκφραση σε κύτταρα U87-MCSF σε σύγκριση με κύτταρα U87MG) (Σχήμα 1 C).

A. Σχηματική για την παραγωγή της κυτταρικής σειράς U87-MCSF. Β Επιβεβαίωση των κλώνων με πέψη περιορισμού Lanes 1 και 3: σκάλα DNA 1 kb, λωρίδα 2: pGEMT-MCSF πέψη με EcoR Ι, λωρίδα 4: ρΕΟΡΡ-Ν1-MCSF πέψη με EcoR Ι και Αρα IC RT-PCR ανάλυση για έκφραση του MCSF και CSF1R στην U87MG και κύτταρα U87-MCSF. ανάλυση κηλίδος Δ Western του MCSF πρωτεΐνης. Ένα 28 kD ζώνη επιβεβαιώθηκε η υπερέκφραση μεμβράνη δεσμεύεται MCSF σε κύτταρα U87-MCSF.

Η

ευαισθησία των κυττάρων U87-MCSF ελέγχθηκε με δοκιμασία ΧΤΤ μετά από επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις της 5-FU που κυμαίνεται από 5- 100 μΜ, για 72 ώρες. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων U87-MCSF ήταν σημαντικά μειωμένη με 5-FU πάνω από 10 μΜ όπως φαίνεται από τις μειωμένες τιμές απορρόφησης (Σχήμα 2Α). Η αντίστοιχη μείωση της ανάπτυξης δεν παρατηρήθηκε σε κυτταρική γραμμή U87-GFP με θεραπεία 5-FU, όπου ο πολλαπλασιασμός ήταν σχεδόν παρόμοια με εκείνη των επεξεργασμένων U87MG κύτταρα. Επιπλέον, καμία ένδειξη απόπτωσης παρατηρήθηκε σε αγωγή U87MG ή επεξεργασμένα κύτταρα U87-MCSF μετά JC-1 χρώση (Σχήμα S1 στο αρχείο S1). Τα αποτελέσματα τεκμηριώθηκαν με ποσοτική δοκιμασία εξαίρεσης κυανούν τρυπανίου οποία έδειξε υγιείς πληθυσμούς κυττάρου με μεμβράνη ακέραιο κύτταρο μετά από 120 ώρες θεραπείας (Σχήμα 2Β). Ερευνήσαμε την έκφραση ορισμένων από τις προ-αποπτωτικών και αντι-αποπτωτικών γονιδίων όπως κασπάση-3, Βαχ και Bcl-XL. Όπως φαίνεται στο Σχήμα S2 σε File S1, η έκφραση των προ-αποπτωτικών γονιδίων, Bax αυξήθηκε στα επεξεργασμένα δείγματα τόσο U87MG (1,90 φορές) και τα κύτταρα U87-MCSF (1,29 φορές). Η έκφραση των αντι-αποπτωτικών γονιδίων, Bcl-xL ήταν επίσης αυξημένη σε αγωγή U87MG και τα επεξεργασμένα κύτταρα U87-MCSF. Ωστόσο, η αύξηση στην έκφραση Bcl-xL ήταν 2,11 φορές σε αγωγή U87-MCSF κύτταρα σε σύγκριση με την αύξηση 1,25 φορές σε αγωγή U87MG κύτταρα. Κασπάσης-3 έκφραση παρέμεινε αμετάβλητη στα επεξεργασμένα δείγματα U87MG και τα κύτταρα U87-MCSF.

Α. Επίδραση της 5-FU στην ανάπτυξη και τη βιωσιμότητα των U87MG, U87-MCSF και τα κύτταρα U87-GFP υπολογίστηκε με δοκιμασία ΧΤΤ μετά από 72 ώρες θεραπείας 5-FU. δοκιμασία αποκλεισμού μπλε χρωστική Β Trypan έδειξε υγιείς πληθυσμούς μετά από 120 ώρες θεραπείας 5-FU. Η στατιστική σημαντικότητα συμβολίζεται με * (ρ & lt? 0,05), ** (ρ & lt? 0,01) και *** (ρ & lt? 0.001).

Η

Επίδραση της 5-FU επί του κυτταρικού κύκλου και κυκλίνες

Ο κυτταρικού κύκλου κατά την κατεργασία με 5-FU μελετήθηκε με χρώση ιωδιούχου προπιδίου χρησιμοποιώντας κυτταρομετρητή ροής. Αρχικά, τα δύο κύτταρα U87MG και U87-MCSF συγχρονίστηκαν σε G0 /G1 φάση με ασιτία ορού για 48 ώρες και στη συνέχεια το πρότυπο του κυτταρικού κύκλου παρατηρήθηκε σε πλήρες μέσο που περιέχει ορό σε τακτά χρονικά διαστήματα. Ο ρυθμός προόδου του κυτταρικού κύκλου μεταξύ δύο κυτταρικών γραμμών ήταν ίδια (Σχήμα S3 σε File S1). Αυτό επιβεβαιώθηκε και από CFSE δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων (Εικόνα 3Α) με την οποία διαπιστώθηκε ότι ο χρόνος διπλασιασμού των δύο κυτταρικές σειρές να είναι 12 ώρες.

Α. CFSE δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων έδειξε ότι ο ρυθμός πολλαπλασιασμού των μη επεξεργασμένων U87MG και U87-MCSF κύτταρα παρέμειναν αμετάβλητες. B. Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου των κυττάρων U87MG και U87-MCSF μετά από θεραπεία με 5-FU για 24 ώρες. Πλειονότητα των κυττάρων συσσωρεύτηκαν κατά τη φάση G0 /G1 στη θεραπεία του πληθυσμού των κυττάρων U87-MCSF. Η στατιστική σημαντικότητα συμβολίζεται με * (ρ & lt? 0,05), ** (ρ & lt? 0,01) και *** (ρ & lt? 0.001).

Η

Στη συνέχεια, προ-συγχρονισμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 25 μΜ 5 -FU σε μέσο που περιείχε ορό για 24 ώρες. Το πρότυπο κατανομής του κυτταρικού κύκλου αναλύθηκαν με κυτταρόμετρο ροής έδειξε σημαντικά υψηλότερο ποσοστό (90%) των επεξεργασμένων κυττάρων U87-MCSF σε φάση G0 /G1 από εκείνη των κατεργασμένων κυττάρων U87MG (69%) (Σχήμα 3Β). Αυτό συνοδεύτηκε από αντίστοιχη μείωση στην αναλογία των κυττάρων σε S και G2 /M φάσεις. Συγκριτικά, το 75% των κυττάρων U87-GFP είχαν συσσωρευτεί στο Ο0 /Ο1 φάση κατά την κατεργασία με 5-FU (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Οι κυκλίνες που εμπλέκονται στην μετάπτωση φάσης G1 και G1-S εξετάστηκαν με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR ανάλυση μετά την κατεργασία συγχρονισμένα κύτταρα (σε G0 /G1 φάση) με 5-FU για 18 ώρες. Ομοίως, οι κυκλίνες που εμπλέκονται στην όψιμη φάση S και G2 /M φάση ποσοτικοποιήθηκαν μετά από 24 ώρες θεραπείας 5-FU. έκφραση της κυκλίνης D1 παρέμειναν αμετάβλητα μεταξύ αντιμετωπίζονται U87MG και τα επεξεργασμένα κύτταρα U87-MCSF. Μετά από 18 ώρες θεραπείας 5-FU, η έκφραση της κυκλίνης Ε μειώθηκε σημαντικά σε αγωγή U87-MCSF κύτταρα αλλά όχι σε αγωγή U87MG κύτταρα (Σχήμα 4). Ωστόσο, μετά από 24 ώρες θεραπείας 5-FU, κάτω ρύθμιση της έκφρασης κυκλίνης Ε παρατηρήθηκε σε επεξεργασμένα δείγματα τόσο U87MG και κύτταρα U87-MCSF (Σχήμα S4 στο S1 File). Αυτό υποδηλώνεται ότι η απόκριση των κυττάρων U87-MCSF σε θεραπεία 5-FU ήταν ταχύτερη από ό, τι τα κύτταρα U87MG. Μια ελαφρά μείωση στην έκφραση της κυκλίνης Α2 παρατηρήθηκε επίσης σε 5-FU επεξεργασμένα κύτταρα U87-MCSF σε σύγκριση με 5-FU επεξεργασμένα κύτταρα U87MG μετά από 24 ώρες θεραπείας 5-FU. Οι εκφράσεις της κυκλίνης Β1 και κυκλίνης Β2 ήταν λιγότερο στα δύο επεξεργασμένα δείγματα, συσχετίζοντας με λιγότερο αριθμό των κυττάρων προχωρήσει σε G2 /M φάση. Η έκφραση του ρ21, ενός αναστολέα κινάσης που εξαρτάται από κυκλίνη, αυξήθηκε στα επεξεργασμένα δείγματα και των δύο κυττάρων U87MG και U87-MCSF. Ετσι, η διαφορική έκφραση των κυκλινών και τον αναστολέα cdk, ρ21 σε διάφορα στάδια του κυτταρικού κύκλου επιβεβαιώνεται με την καθυστέρηση της ανάπτυξης των κυττάρων σε 5-FU επεξεργασμένα κύτταρα U87-MCSF.

Μια σημαντική μείωση στην έκφραση της κυκλίνης Ε και μια μικρή μείωση στην έκφραση της κυκλίνης Α2 παρατηρήθηκε σε επεξεργασία U87-MCSF κύτταρα, τα οποία συσχετίζονται με την αυξημένη συσσώρευση G0 /G1 κυττάρων δει σε ανάλυση του κυτταρικού κύκλου. Η έκφραση του p21, ο αναστολέας κινάσης εξαρτώμενος από κυκλίνη αυξήθηκε στα επεξεργασμένα δείγματα και των δύο κυττάρων U87MG και U87-MCSF. Η στατιστική σημαντικότητα συμβολίζεται με * (ρ & lt? 0,05), ** (ρ & lt? 0,01) και *** (ρ & lt? 0.001).

Η

επιθηλιακά μεσεγχυματικά μετάβασης (ΕΜΤ) κυττάρων U87-MCSF

Εκτός από καθυστέρηση της ανάπτυξης των κυττάρων, μορφολογικές αλλαγές ήταν ορατές σε μπλε του μεθυλενίου προετοιμασμένα κύτταρα U87-MCSF κατεργάζεται με καν χαμηλή δόση της 5-FU. Εμφάνιση του επιμήκη, ατρακτοειδή μορφολογία με χρονοβόρες διαδικασίες παρατηρήθηκε σε κύτταρα U87-MCSF με 25 μΜ θεραπεία 5-FU για 72 ώρες, αλλά όχι σε κύτταρα U87MG (Σχήμα 5Α). Ωστόσο, επιμήκη μορφολογία παρατηρήθηκε σε δύο κύτταρα με 50 μΜ θεραπεία 5-FU. Περαιτέρω, η χρώση κυτταροσκελετού των μη επεξεργασμένων και επεξεργασμένων δειγμάτων U87MG και κύτταρα υ87-MCSF έγινε χρησιμοποιώντας αντι β-ακτίνης αντίσωμα (Σχήμα 5Β). Τα αποτελέσματα που ελήφθησαν ενίσχυσε τις μορφολογικές αλλαγές που παρατηρούνται σε μεθυλενο κυανή χρώση. Επίμηκες και μεσεγχυματικά κύτταρα παρατηρήθηκαν σε 25 μΜ 5-FU επεξεργασμένα κύτταρα U87-MCSF αλλά όχι σε 25 μΜ 5-FU επεξεργασμένα κύτταρα U87MG μετά τη θεραπεία 72 ώρες. Όμως, επιμήκη κύτταρα παρατηρήθηκαν και στα δύο κύτταρα U87MG και U87-MCSF όταν υφίσταται κατεργασία με 50 μΜ 5-FU για 72 ώρες. Επιπλέον, μικροσκοπική εξέταση των ϋΑΡΙ χρώση κυττάρων με 25 και 50 μΜ 5-FU θεραπεία μετά από 120 ώρες έδειξε άθικτα πυρήνες, και ο calceinAM χρωματισμένα κύτταρα υπό τις ίδιες συνθήκες, ανατίθενται επιμήκους σχήματος ατράκτου μορφολογίες (Εικόνα S5 σε S1 αρχείων), η οποία ήταν παρόμοια με την παρατήρηση σε μεθυλενο κυανή χρώση. Η έκφραση του αστροκυτταρικών δείκτης διαφοροποίησης, γλοιακή ινιδική όξινη πρωτεΐνη (GFAP) απουσίαζε και η έκφραση των hTERT ήταν σημαντικά μειωμένη σε αμφότερες κύτταρα U87MG και U87-MCSF μετά από θεραπεία 5-FU, που δικαιολογούν την καταστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων (Σχήμα 6C).

Α. Μεθυλενίου μπλε χρώση για την ανίχνευση της μορφολογίας των κυττάρων μετά από θεραπεία 5-FU. B. ακτίνη κυτταροσκελετό χρώση των κυττάρων σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας αντι β-ακτίνης αντισώματος. Οι μορφολογικές εικόνες έδειξαν την παρουσία επιμήκη και μεσεγχυματικών κυττάρων σε κύτταρα U87-MCSF αγωγή με 25 μΜ 5-FU αλλά όχι σε κύτταρα U87MG που έλαβαν θεραπεία με 25 μΜ 5-FU. Μετά 50 μΜ θεραπεία 5-FU, επιμήκη κύτταρα παρατηρήθηκαν τόσο αγωγή U87MG και τα επεξεργασμένα κύτταρα U87-MCSF. μπαρ κλίμακα:. 50 μm

Η

Α. Μορφολογία των ανεπεξέργαστων U87MG και U87-MCSF κύτταρα. κύτταρα U87-MCSF έδειξε ατρακτοειδή, μεσεγχυματικά κύτταρα που μοιάζουν με (υποδεικνύονται με βέλη). Μελέτες Β Μικροσκοπική χρησιμοποιώντας αντίσωμα αντι-MCSF αποκάλυψε την κυτταροπλασματική θέση του MCSF. Triton Χ-100 χρησιμοποιήθηκε ως μεμβράνη παράγοντα διάτρησης για τον καθορισμό διάλυμα. Nucleus χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ είχαν επίσης δείξει. Γ Ημι ποσοτική ανάλυση RT-PCR του hTERT, GFAP, Ν-cadherin, βιμεντίνη, ινονεκτίνη και Notch-1. Η έκφραση των δεικτών μεσεγχυματικών κυττάρων, Ν-cadherin, βιμεντίνη και Notch-1 αυξήθηκαν σε κύτταρα U87-MCSF. bar Κλίμακα: 50 μm

Η

Η παρουσία της ατράκτου σε σχήμα με περισσότερα μεσεγχυματικά κύτταρα που εμφανίζονται σε μη επεξεργασμένα κύτταρα U87-MCSF (Εικόνα 6Α) έδειξε την πιθανή εμφάνιση επιθηλιακής-μεσεγχυματικής μετάβασης.. Η έκφραση των επιθηλιακών κυττάρων δείκτη Ε-καδερίνης και μεσεγχυματικών κυττάρων δεικτών βιμεντίνη, Ν-καδερίνης, φιμπρονεκτίνη αναλύθηκε με ημι-ποσοτική RT-PCR. έκφραση Ε-καδερίνης δεν παρατηρήθηκε σε μη επεξεργασμένα και επεξεργασμένα κύτταρα και των δύο κυττάρων U87MG και U87-MCSF (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ωστόσο, υπήρξε μια σημαντική αύξηση στην έκφραση μεσεγχυματικών κυττάρων δεικτών βιμεντίνη (~ 2 φορές τόσο μη επεξεργασμένα και επεξεργασμένα δείγματα) και Ν-καδερίνης (1,98 και 3,32 πτυχώσεις σε μη επεξεργασμένα και επεξεργασμένα δείγματα, αντίστοιχα) σε κύτταρα U87-MCSF (Εικόνα 6C). Το επίπεδο έκφρασης της φιμπρονεκτίνης ήταν αμετάβλητη σε αμφότερες αγωγή κυτταρικούς τύπους. Επιπλέον, η έκφραση του Notch-1, ο επαγωγέας της μεταβάσεως επιθηλίου-μεσεγχύματος (ΕΜΤ), βρέθηκε να ρυθμίζεται προς τα πάνω σημαντικά (2,14 φορές) σε κύτταρα U87-MCSF. Η μικροσκοπική εξέταση των κυττάρων U87-MCSF, μετά τον καθορισμό με διάλυμα παραφορμαλδεΰδης 3,7% που περιέχει Triton Χ-100, αποκάλυψε την κυτταροπλασματική θέση του MCSF (Σχήμα 6Β). Ωστόσο, με την απουσία του Triton Χ-100 στο διάλυμα στερέωσης δεν παρατηρήθηκε φθορισμός (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα) υποδεικνύοντας την απουσία του MCSF στην κυτταρική μεμβράνη.

εμφάνισης καρκίνου βλαστικών κυτταρικού πληθυσμού και αυξορρύθμιση των ABC μεταφορέων

Η μειωμένη πολλαπλασιασμός, αλλαγή στην κυτταρική μορφολογία και οι ενδείξεις για την παρουσία του ΕΜΤ πρότεινε την πιθανή πρόκληση καρκίνου του βλαστικών κυττάρων σε κύτταρα U87-MCSF κατά την αγωγή με 5-FU. Αναλύσαμε την έκφραση των δεικτών για καρκίνο βλαστικών κυττάρων, CD24 και CD44 με κυτταρομετρία ροής και σε πραγματικό χρόνο PCR. Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής έδειξε ότι η έκφραση του CD24 αυξήθηκε κατά 6,93% και 33,37% σε κύτταρα U87MG και κύτταρα υ87-MCSF αντίστοιχα, όταν υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 25 μΜ 5-FU (Σχήμα 7Α). Καμία αύξηση στην έκφραση CD44 σημειώθηκε στα επεξεργασμένα δείγματα και των δύο κυττάρων U87MG και U87-MCSF. Ποσοτική ανάλυση έκφρασης με πραγματικού χρόνου PCR αποκάλυψε επίσης την αύξηση της έκφρασης CD24 κατά περίπου 4 φορές σε αγωγή U87-MCSF κύτταρα, ενώ μόνο 2 φορές αύξηση στην έκφραση CD24 παρατηρήθηκε σε αγωγή U87MG κύτταρα. έκφραση CD44 παρέμειναν αμετάβλητες σε κατεργασμένα κύτταρα τόσο U87MG και U87-MCSF (Σχήμα 7Β).

A. Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής για την έκφραση των CD24 και CD44 στα επεξεργασμένα κύτταρα. Β ανάλυση PCR πραγματικού χρόνου της έκφρασης των CD44, CD24, ABCB1, mdm2, ABCG1 και ABCG2. Τα δεδομένα παρίστανται γραφικώς ως η αναλογία της γονιδιακής έκφρασης σε κατεργασμένο δείγμα να μη επεξεργασμένο δείγμα για τα αντίστοιχα κύτταρα. Η στατιστική σημαντικότητα συμβολίζεται με * (p & lt? 0.05), ** (p & lt? 0,01) και *** (p & lt? 0.001).

Η

Τα γονίδια μεταφορέα ABC έχουν συσχετιστεί με την εκδίωξη των ναρκωτικών σε πολλούς τύπους καρκίνων. Αναλύσαμε την έκφραση της ABCG1, ABCG2 και ABCB1 από ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR. Σχήμα 6Β έδειξε ότι η έκφραση του ABCG1 και ABCB1 αυξήθηκε τόσο αγωγή U87MG και τα επεξεργασμένα κύτταρα U87-MCSF. Ωστόσο, η έκφραση του ABCB1 αυξήθηκε κατά 10,2 φορές σε αγωγή U87-MCSF κύτταρα σε σύγκριση με την αύξηση κατά 2 φορές στην αγωγή U87MG κύτταρα. Ομοίως, η έκφραση της mdm2 ογκογονιδίου αυξήθηκε επίσης κατά 6 φορές σε αγωγή U87-MCSF κύτταρα σε σύγκριση με το 3,3 φορές αύξηση βρέθηκε στα επεξεργασμένα U87MG κύτταρα. Εξετάσαμε επίσης το επίπεδο έκφρασης της RALBP1gene, ενός μεταφορέα μη ABC σχετίζεται με MDR (αντίσταση σε πολλά φάρμακα). Βρήκαμε μια οριακή αύξηση στην έκφραση του RALBP1 σε μη κατεργασμένα κύτταρα U87-MCSF (1,29 φορές) σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα U87MG (Εικόνα S6 σε File S1). Ωστόσο, κατά την αγωγή με 5-FU, δεν αυξητική ρύθμιση σε RALBP1 παρατηρήθηκε σε δείγματα που κατεργάζονται σε σχέση με τις αντίστοιχες μη επεξεργασμένα δείγματα.

Συζήτηση

γλοιοβλάστωμα παραμένει μια από τις πιο διαδεδομένες κακοήθων όγκων με την κακή θεραπευτική απάντηση [11]. Η έκφραση των διαφόρων ανθεκτικών πρωτεΐνες πολυ-φαρμάκου έχει συμβάλει κυρίως με την ικανότητα των κυττάρων γλοιώματος για την ανάπτυξη στη χημειοθεραπεία φαινότυπο [12], [13]. Στην παρούσα μελέτη, MCSF κύτταρα γλοιοβλαστώματος U87MG εκφράζουν επέδειξαν μειωμένη ανάπτυξη και σημαντική καθυστέρηση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων χωρίς να υφίστανται απόπτωση μετά τη χορήγηση 5-FU. Μια ισορροπία στην έκφραση των προ και αντι-αποπτωτικών γονιδίων καθορίζουν την τύχη των κυττάρων στην είσοδο αποπτωτικό μονοπάτι [14]. Ανάλυση της έκφρασης των προ και αντι-αποπτωτικών γονιδίων αποκάλυψε ότι προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης των προ-αποπτωτικών γονιδίων, Bax, αντισταθμίζεται από την προς τα άνω ρύθμιση της έκφρασης των αντι-αποπτωτικών Bcl-xL τόσο αγωγή U87MG και τα επεξεργασμένα κύτταρα U87-MCSF . Εντούτοις, επεξεργασμένα κύτταρα U87-MCSF είχαν μικρότερη έκφραση των προ-αποπτωτικών γονιδίων Βαχ και υψηλότερη έκφραση αντι-αποπτωτικών Bcl-xL σε σύγκριση με αγωγή U87MG κύτταρα. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι, αν και επεξεργασμένα δείγματα και των δύο κυττάρων U87MG και U87-MCSF δεν υφίστανται απόπτωση, 5-FU επεξεργασμένα κύτταρα U87-MCSF είχε μεγαλύτερη αντίσταση σε απόπτωση από 5-FU επεξεργασμένα κύτταρα U87MG.

Παρατηρήσαμε ότι MCSF βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα και όχι στην κυτταρική μεμβράνη. Επιπλέον, η έκφραση του υποδοχέα για MCSF, CSF1R ήταν κάτω ρυθμίζονται σε κύτταρα U87-MCSF, η οποία ήταν σε συμφωνία με την προηγούμενη έκθεση [15] για ρύθμιση προς τα κάτω του mRNA της CSF1R από MCSF στην πρωτοβάθμια μακροφάγα. CSF1R πιστεύεται ότι λειτουργούν σε μεμβράνη πλάσματος, αλλά πρόσφατα στοιχεία έδειξαν την παρουσία λειτουργικού υποδοχέα για MCSF στον πυρηνικό φάκελο των διαφόρων καρκινικών κυττάρων και των μακροφάγων [16]. Αυτό εγείρει την πιθανότητα ότι οι παρατηρούμενες επιδράσεις του MCSF σε κύτταρα U87-MCSF κατά την κατεργασία με 5-FU μπορεί να διαμεσολαβείται μέσω του υποδοχέα που βρίσκεται στον πυρηνικό φάκελο.

EMT είναι μια συντηρημένη δια-κυτταρική διαδικασία που προσδίδει τα χαρακτηριστικά των μεσεγχυματικών κύτταρα κατά τη διάρκεια των βασικών επιθηλιακών κυττάρων, αυξάνοντας επεμβατική ιδιότητες και τη μετάσταση [17] τους, [18]. έκφραση MCSF σε κύτταρα U87MG είχε ως αποτέλεσμα την εμφάνιση της ατράκτου σε σχήμα, περισσότερο μεσεγχυματικά κύτταρα τύπου υποδεικνύει την εμφάνιση EMT. Μια αντίστοιχη ρύθμιση προς τα πάνω στην έκφραση των δεικτών μεσεγχυματικών όπως Ν-cadherin και βιμεντίνη (1,98 και 2,18 φορές αντίστοιχα) παρατηρήθηκε επίσης σε κύτταρα U87-MCSF. έκφραση Ε-καδερίνης βρέθηκε να απουσιάζει σε όλα τα δείγματα που αναλύθηκαν (τα δεδομένα δεν φαίνονται) που συσχετίζεται με την προηγουμένως αναφερθείσα δεδομένα που δείχνουν έλλειψη έκφρασης Ε-καδερίνης σε γλοιοβλάστωμα [19]. Επιπλέον, μια αύξηση στην έκφραση του Notch-1 παρατηρήθηκε σε κύτταρα U87-MCSF. Προς τα πάνω ρύθμιση του Notch-1 εμπλέκεται στην επαγωγή επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ), το οποίο έχει προηγουμένως αναφερθεί ότι αυξάνει τις ιδιότητες των επεμβατική παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα [20].

Με 5-FU κατεργασία, η έκφραση του ο δείκτης μεσεγχυματικά, Ν-καντερίνης αυξήθηκε περαιτέρω σε αγωγή U87-MCSF κύτταρα με 3.32 φορές, ενώ η έκφραση του βιμεντίνη παρέμεινε αμετάβλητη. Στην αγωγή U87MG κύτταρα, σημειώθηκε μόνο μια οριακή αύξηση στην έκφραση του Ν-καντερίνης και βιμεντίνη (1,26 και 1,41 φορές αντίστοιχα). 5-FU θεραπεία επαγόμενης ιδιότητες μεσεγχυματικά κύτταρα και στα δύο U87MG και U87-MCSF όπως φαίνεται στο Σχήμα 5 και το Σχήμα 6. Ωστόσο, η συγκέντρωση του 5-FU που απαιτείται για την επαγωγή αυτών των αλλαγών κυμαίνεται μεταξύ U87MG και κύτταρα υ87-MCSF. Ενώ επιμήκη και σχήματος ατράκτου μεσεγχυματικά κύτταρα παρατηρήθηκαν σε αγωγή U87-MCSF όταν υφίσταται κατεργασία με 25 μΜ 5-FU για 72 ώρες, τα μεσεγχυματικά μορφολογία μπορεί να δει σε αγωγή U87MG κύτταρα μόνο όταν υποβάλλεται σε επεξεργασία με 50 μΜ 5-FU για 72 ώρες. Αλλά όταν η θεραπεία με 25 μΜ 5-FU παρατάθηκε για 120 ώρες, επιμήκη κύτταρα τύπου μεσεγχυματικά παρατηρήθηκαν στα επεξεργασμένα δείγματα και των δύο κυττάρων U87MG και U87-MCSF (Σχήμα S5 στο S1 αρχείου).

Πρόσφατες εκθέσεις διαπιστώνεται ότι EMT θα μπορούσε να προκαλέσει την απόκτηση των ιδιοτήτων του στελέχους-όπως στα κύτταρα του όγκου [21]. Μια υπο πληθυσμός κυττάρων εντός μερικών όγκων εμφανίζουν (CSC) ιδιότητες του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων με εξαιρετικά αργό ρυθμό πολλαπλασιασμού, αυξημένη έκφραση των γονιδίων αντοχής πολυφαρμάκου και θεωρείται ότι είναι η κύρια αιτία για την υποτροπή του όγκου μετά από αγωγή [22], [ ,,,0],23]. Καθυστέρηση στον πολλαπλασιασμό, εμφάνιση ΕΜΤ και την αντίσταση στη θεραπεία φάρμακο πρότεινε την παρουσία του ΚΕΠ ή των προδρόμων τους σε επεξεργασία κυτταρικών πληθυσμών. Ανάλυση των δεικτών βλαστική ικανότητα που σχετίζεται επιφάνεια, CD24 και CD44 στα κατεργασμένα κύτταρα με κυτταρομετρία ροής απεικονίζεται μια αύξηση στην CD24

υψηλή /CD44

χαμηλό πληθυσμό κυττάρων τόσο αγωγή U87MG και τα επεξεργασμένα κύτταρα U87-MCSF. Εντούτοις, επεξεργασμένα κύτταρα U87-MCSF έδειξε υψηλότερο ποσοστό (33,37%) του CD24

υψηλή /CD44

χαμηλή κύτταρα σε σύγκριση με 6,93% στα επεξεργασμένα U87MG κύτταρα. Επιπλέον, η ποσοτική ανάλυση της έκφρασης με PCR σε πραγματικό χρόνο αποκάλυψε ότι η έκφραση CD44 ήταν ομοιόμορφη σε 5-FU επεξεργασμένα δείγματα και των δύο κυττάρων, αλλά η έκφραση CD24 ήταν σημαντικά υψηλότερη σε αγωγή U87-MCSF κύτταρα. Προηγούμενες εκθέσεις έδειξαν ότι η ΚΕΠ απομονωθεί από καρκίνο του μαστού ήταν κυρίως CD44

υψηλή /CD24

χαμηλή κύτταρα [21]. Σε αντίθεση με αυτό, κύτταρα καρκίνου του μαστού με CD44

χαμηλή /CD24

υψηλή φαινότυπο αναφέρθηκε επίσης να έχουν κακή πρόγνωση με τη θεραπεία [24]. Πίνακας S1. Εικόνα S1. Εικόνα S2. Εικόνα S3. Εικόνα S4. Εικόνα S5. Εικόνα S6. Πίνακας S1.