Αφηρημένο

Χρυσότιλος είναι ένας από τους έξι τύπους αμιάντου, και είναι η μόνη που μπορεί ακόμα να εμπορευματοποιηθεί σε πολλές χώρες. Η έκθεση σε άλλους τύπους αμιάντου έχει συσχετιστεί με σοβαρές ασθένειες, όπως καρκινώματα του πνεύμονα και του υπεζωκότα μεσοθηλίωμα. Η ένωση του χρυσοτίλη έκθεσης με τη νόσο είναι αμφιλεγόμενη. Ωστόσο,

in vitro μελέτες δείχνουν

μεταλλαξιογόνο δυνατότητα του χρυσοτίλη, η οποία μπορεί να προκαλέσει το DNA και την κυτταρική βλάβη. Η παρούσα εργασία στοχεύει να αναλύσει μεταβολές σε πνεύμονα καλλιέργειες μικροκυτταρικό καρκίνωμα μετά από 48 ώρες από την έκθεση χρυσότιλου, που ακολουθείται από 2, 4 και 8 ημέρες ανάκαμψης σε ίνες χωρίς μέσο καλλιέργειας. Ορισμένες τροποποιήσεις, όπως σχηματισμός ανευπλοειδές κυττάρων, αυξημένο αριθμό κυττάρων σε G2 /M φάση και κύτταρα σε μίτωση πολυπολικό παρατηρήθηκαν ακόμη και μετά από 8 ημέρες ανάκαμψης. Η παρουσία των ινών χρυσότιλου στις κυτταρικές καλλιέργειες ανιχνεύτηκε και η μορφολογία των κυττάρων παρατηρήθηκε με σάρωση με λέιζερ συνεστιακή μικροσκοπία. Μετά από 4 και 8 ημέρες ανάκαμψης, μόνο λίγα χρυσότιλου θραύσματα ήταν παρούσες σε ορισμένα κύτταρα, και η κυτταρική μορφολογία ήταν παρόμοια με εκείνη των κυττάρων ελέγχου. Κύτταρα επιμολυσμένα με το GFP-tagged α-τουμπουλίνης πλασμιδίου υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με χρυσότιλου για 24 ή 48 ώρες και τα κύτταρα σε μίτωση πολυπολικό παρατηρήθηκαν με μικροσκοπία time-lapse. ιδρύθηκαν μοίρα αυτών των κυττάρων: διατήρηση σε μετάφαση, κυτταρικό θάνατο, την εξέλιξη μέσω φάση Μ παράγουν περισσότερα από δύο θυγατρικά κύτταρα ή σύντηξη των κυττάρων κατά τη διάρκεια της τελόφασης ή κυτοκίνηση. Κάποιοι από αυτούς είχαν σχέση με το σχηματισμό της ανευπλοειδικών κυττάρων και κυττάρων με ανώμαλο αριθμό κεντροσωμάτων

Παράθεση:. Cortez BDA, Quassollo G, Caceres Α, Machado-Santelli GM (2011) Η μοίρα της Χρυσότιλος-Induced πολυπολικό μίτωση και ανευπλοειδικών Πληθυσμός σε καλλιεργημένα κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα. PLoS ONE 6 (4): e18600. doi: 10.1371 /journal.pone.0018600

Συντάκτης: Robert Qi, το Χονγκ Κονγκ Πανεπιστήμιο Επιστήμης και Τεχνολογίας, το Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 30, Νοέμ 2010? Δεκτές: 7, Μάρ, 2011? Δημοσιεύθηκε: 5 Απρ, 2011

Copyright: © 2011 Cortez et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από Fundação de Amparo ένα Pesquisa κάνει Estado de São Paulo – FAPESP και Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Τεχνολογικό – CNPq, τη Βραζιλία και από επιχορηγήσεις από Agencia Κόρδοβα Επιστημών και MINCyT (PICT 815 και PME), Αργεντινή. BAC ήταν υπότροφος από το Red de MacroUniversidades de America Latina y el Caribe, κατά τη διάρκεια της παραμονής της στην Αργεντινή. GQ είναι μια διδακτορική υπότροφος του FONCyT (Αργεντινή). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο αμίαντος είναι ένα πυριτικό ορυκτό χωρίζονται σε δύο μεγάλες ομάδες – σερπαντίνες και amphiboles. Αμφιβολικό ίνες που χρησιμοποιούνται συνήθως σε εμπορικές εφαρμογές μέχρι τη σύνδεση των αμφιβολικό έκθεσης με αρκετές σοβαρές ασθένειες, όπως η αμιάντωση, ο καρκίνος των βρόγχων και κακόηθες μεσοθηλίωμα του υπεζωκότα και του περιτοναίου [1], [2]. Επί του παρόντος, αμφιβόλου ίνες δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε πολλές χώρες και έχουν αντικατασταθεί από χρυσοτίλη, ένα αμιάντου σερπεντίνη που θεωρείται λιγότερο επιβλαβής για την ανθρώπινη υγεία.

Χρυσότιλος αποτελείται από καμπύλο μεταξένια ίνες με ένα μικρό εγκάρσιο τμήμα (80 έως 130 α) και ένα σωληνοειδή δομή. κάθαρση του από πνευμονικό ιστό είναι ταχύτερη από εκείνη του αμφιβολικό ίνες, και χρυσότιλου δεν συσσωρεύεται στον πνεύμονα, λόγω ενός μηχανισμού που περιλαμβάνει τον κατακερματισμό των ινών σε μικρά κομμάτια [3].

Οι μηχανισμοί που οδηγούν στην ανάπτυξη της ασθένειες όπως καρκινώματα και μεσοθηλίωμα μετά την έκθεση στον αμίαντο δεν είναι καλά κατανοητοί. Ωστόσο, οι μεταλλαξιογόνες και κυτταροτοξικά αποτελέσματα του αμιάντου έχει αποδειχθεί σε μελέτες με καλλιεργημένα κύτταρα που εκτίθενται σε διαφορετικές ίνες αμιάντου για περιόδους που κυμαίνονται από 1 ώρα έως 72 ώρες.

Η έκθεση των καλλιεργημένων κυττάρων σε αμίαντο οδηγεί στο σχηματισμό του οξυρίζες και τις ελεύθερες ρίζες που βλάπτουν το DNA [4], [5], [6]. Έχει δειχθεί ότι η έκθεση των καλλιεργημένων κυττάρων σε χρυσότιλο μπορεί να προκαλέσει σπασίματα διπλό κλώνου στο DNA μετά από 3 και 24 ώρες [7], [8], και μπορεί επίσης να προκαλέσει ενδοχρωμοσωμική διαγραφές και μεταλλάξεις του DNA [9]. Χρυσοτίλης προκαλούμενη βλάβη του DNA μπορεί να προκαλέσουν απόπτωση σε διάφορους τύπους κυττάρων μετά από 3 έως 4 ώρες έκθεσης [8], [10].

Μικροπυρήνες παρατηρούνται επίσης μετά χρυσοτίλη αγωγή [11]. Αυτές χρωματίνη όργανα, τα οποία περιέχουν ένα άκεντρων θραύσμα χρωμοσώματος ή ένα ολόκληρο χρωμόσωμα που αποσπάται από την πλάκα μετάφασης, μπορεί να δημιουργηθεί μετά θραύση των χρωμοσωμάτων και μιτωτική διαταραχές, όπως πολυπολικό ατράκτους. Ως εκ τούτου, τα στοιχεία δείχνουν ότι χρυσοτίλη μπορεί να προκαλέσει διάσπαση της έλικας του DNA και να διαταράξουν τις μιτωτικές ατράκτους.

διαταραχές του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα που εκτίθενται σε χρυσότιλο ερευνήθηκαν με κυτταρομετρία ροής, και παρατηρήθηκαν πολύπλοκες αλλαγές. Τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με χρυσοτίλη για 4 έως 48 ώρες έδειξε G2 /M συγκράτηση και μείωση του αριθμού των κυττάρων S-φάσης, που προσδιορίζονται από την ενσωμάτωση BrdU [12].

Η μιτωτική διαίρεση μετά από την έκθεση στον αμίαντο παρατηρήθηκε επίσης από time-lapse και συνεστιακής μικροσκοπίας. Ορισμένες αλλαγές βρέθηκαν, όπως ελαττώματα στην άτρακτο σχηματισμό και την αποτυχία της κυτοκίνησης παρουσία εσωτερικεύονται ινών. Αυτά τα πειράματα δείχνουν ότι μακριές ίνες μπορούν να βρίσκονται ανάμεσα στα θυγατρικά κύτταρα κατά την διάρκεια telophase και να οδηγήσει σε αποτυχία την κυτοκίνηση, δημιουργώντας πολυπύρηνα και ανευπλοειδικών κυττάρων [13], [14]. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε κύτταρα που εκτίθενται σε νανοσωλήνες άνθρακα. Αυτά τα κύτταρα έδειξαν διαταραχές του κεντροσωμάτια και μιτωτικών ατράκτων, γεγονός που υποδηλώνει ότι οι νανοσωλήνες θα μπορούσαν να επηρεάσουν με μικροσωληνίσκους και πρωτεΐνες κινητήρα [15].

Τα ανευπλοειδικών κύτταρα χαρακτηρίζονται από ανώμαλη περιεχόμενο DNA οφείλεται σε απώλεια ή αύξηση των ολόκληρα χρωμοσώματα ή τμημάτων χρωμοσωμάτων, και η πλειοψηφία των στερεών όγκων περιέχουν ανευπλοειδικών κυττάρων [16], [17], [18]. Η ανευπλοειδία μπορεί να προκύψει από σφάλματα στον κυτταρικό κύκλο, τα σφάλματα σε μιτωτικά σημεία ελέγχου που επιτρέπουν βλάβη του DNA ή αντιγραφή λάθη να μετακυλίεται σε θυγατρικά κύτταρα, τα σφάλματα σε χρωμόσωμα διαχωρισμού και κυτταροκίνηση, που μπορεί να συμβεί λόγω κεντρόσωμα ενίσχυση και τον σχηματισμό του πολυπολικού ατράκτων [19 ].

το 1914, αναφέρθηκε Boveri ανευπλοειδία ως αιτία του καρκίνου, αλλά η επακόλουθη ανακάλυψη των ογκογονιδίων και γονιδίων καταστολής όγκων οδήγησε σε μια νέα θεωρία, όπου η συσσώρευση μεταλλάξεων σε τέτοια γονίδια ήταν η αιτία της κακοήθους εξαλλαγής [20]. Η συζήτηση συνεχίστηκε, και αυτή τη στιγμή ανευπλοειδία θεωρείται ότι εμπλέκονται στην εξέλιξη του όγκου, καταστολή ή την έναρξη [21], [22], [23]. Ωστόσο, είναι σαφές ότι η ανευπλοειδία μπορεί να εισάγει μεταλλάξεις που οδηγούν σε κακοήθη μετασχηματισμό και να οδηγήσει σε γενετική αστάθεια [24].

Η παρούσα εργασία επικεντρώνεται στη διαμόρφωση της ανευπλοειδικών κυττάρων μετά από έκθεση σε τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις ινών χρυσότιλου , που ακολουθείται από μεγάλους χρόνους αποκατάστασης σε φυτικές ίνες χωρίς μέσο. Αναλύσαμε επίσης διαταραχές του κυτταρικού κύκλου που θα μπορούσαν να εμπλέκονται στο σχηματισμό ανευπλοειδικές κυττάρων, με σύγκριση των μεταβολών που βρέθηκαν σε φυσιολογικά και καρκινικά κύτταρα που εκτίθενται σε χρυσοτίλη. Πολυπολικό μιτώσεις επίσης παρακολουθούνται για να καθορίσει την τύχη αυτών των κυττάρων και τη συμβολή τους στο σχηματισμό ανευπλοειδές κυττάρων.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture

Τα κύτταρα ΚΘ2 (μια κυτταρική γραμμή εγκατεστημένος από ανθρώπινο καρκίνωμα μη-μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα) [25] και τα κύτταρα VERO (μια επιθηλιακή γραμμή που λαμβάνεται από νεφρού πράσινου πιθήκου – ATCC αριθμός CCL-81) καλλιεργήθηκαν σε Τροποποιημένο Ελάχιστο Απαραίτητο Μέσο Dulbecco Eagle (Sigma), συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα με 5% CO2 στους 37 ° C.

Χρυσότιλος Θεραπεία

Χρυσότιλος 5R (Κεμπέκ Standard) που λαμβάνεται από SAMA Mineração de Amianto Ltda (Minaçu, GO, Βραζιλία) ευγενικά από τον Dr. Flavia Μ Cassiola. Οι ίνες πλύθηκαν με νερό της βρύσης και ενεργοποιούνται με επεξεργασία με υπερήχους σε ελεγχόμενο ρΗ (7.4) όπως περιγράφεται αλλού [26]. Για τη θεραπεία, τα κύτταρα ενζυματικά απομακρύνθηκαν από τις φιάλες και καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία διαμέτρου 35 mm (2,10

5 κύτταρα /δίσκο). Μετά από 24 ώρες σε καλλιέργεια, το μέσο άλλαξε σε 2 ml φρέσκου μέσου με ίνες χρυσότιλου σε μία κατά προσέγγιση τελική συγκέντρωση 250 μg /ml, 125 μg /ml ή 62.5 μg /ml, εύρος μικρότερο από τα περισσότερα

in vivo

μελέτες (10-17 mg /m

3). Οι ίνες παρέμειναν σε επαφή με τα κύτταρα για περιόδους 24 ώρες ή 48 ώρες, μετά την οποία άλλαξε το μέσο. Μετά από πρόσθετες περιόδους των 2, 4 ή 8 ημέρες σε κανονικό μέσο κύτταρα πλύθηκαν με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBSA) και σταθερό. Κατά τη διάρκεια όλων τη θεραπεία το μέσο καλλιέργειας συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, και αλλάζονται κάθε 2 ημέρες κατά τη διάρκεια του χρόνου αποκατάστασης.

DNA ποσοτικοποίηση

Το περιεχόμενο πυρηνικού DNA των κυττάρων HK2 χρυσότιλου αγωγή και τον έλεγχο ποσοτικά με ανάλυση εικόνας με τις Cires λογισμικού (Cell ανάκτησης εικόνων και Σύστημα αξιολόγησης-Kontron Eletronik) που έχουν εγκατασταθεί στο Axioskop μικροσκόπιο (Zeiss). Για την ανάλυση, οι πυρήνες χρωματίστηκαν με αντίδραση Feulgen του [16]. θεραπείες Χρυσοτίλης έγιναν χρησιμοποιώντας τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις ινών (250 μg /ml, 125 μg /ml, 62,5 μg /ml), και μετά από 48 ώρες αγωγής χρησιμοποιήθηκαν τρεις διαφορετικές χρονικές στιγμές της ανάκαμψης στην ίνα ελεύθερο μέσου καλλιέργειας: 2, 4 και 8 ημέρες. Τετρακόσια πυρήνες των μονοπύρηνα, διπύρηνα και τα πολυπύρηνα ήταν ανεξάρτητα αναλύονται στον έλεγχο και κύτταρα επεξεργασμένα χρυσοτίλη. καρκινικά κύτταρα έχουν συνήθως γενετικές μεταβολές και οι περισσότεροι από αυτούς είναι hyperdiploid. Δεδομένου HK2 είναι ένα

in vitro

καθιερωμένη κυτταρική σειρά, η διπλοειδή ομάδα ορίστηκε σύμφωνα με την κορυφή του G0 /G1 στα ιστογράμματα, και ο τετραπλοειδούς ομάδα προσδιορίστηκε με διπλό περιεχόμενο DNA.

κυτταρομετρία ροής

το κυτταρικού κύκλου αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας το Σύστημα γκουάβα. Αναλύθηκαν ελέγχου και χρυσότιλου (125 μg /ml) κατεργασμένα κύτταρα για 48 ώρες και ανακτήθηκε σε κανονικό μέσο για 2, 4 και 8 ημέρες. Για τα κύτταρα ανάλυση υποβλήθηκαν σε αγωγή με θρυψίνη, περιστρέφονται προς τα κάτω (1000 rpm για 10 λεπτά), πλύθηκε με PBSA και σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη: PBSA (3:01) για 1 ώρα στους 4 ° C. Στη συνέχεια, τα κύτταρα περιδινήθηκαν, πλύθηκαν με PBSA και επωάστηκαν με ένα διάλυμα 200 μΙ PBSA, 20 μΐ ΚΝΑάσης και 20 μΐ ιωδιούχου προπιδίου για 1 ώρα. Αναλύθηκε 5.000 κύτταρα για κάθε πειραματική κατάσταση

Immunoflurescence:. Μιτωτικός δείκτης, μορφολογία κυττάρων και παρουσία ινών

HK2 κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 125 μg /ml του χρυσοτίλη για 24 ώρες και 48 ώρες , και επίσης σε θεραπεία για 48 ώρες και ανακτώνται για 2, 4 και 8 ημέρες σε κανονικό μέσο? και τα κύτταρα VERO υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 125 μ /ml χρυσότιλου για 48 ώρες και ανακτήθηκε σε κανονικό μέσο για 24 ώρες. Έλεγχος και επεξεργασμένα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με φορμαλδεΰδη 3,7% για 30 λεπτά και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με Triton Χ-100 0,1% για 10 λεπτά. Στη συνέχεια, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε ανοσοφθορισμό με αντι-α και β-τουμπουλίνης αντισώματα (Sigma, αραιωμένο 1:200) και με την CY5 αντι-ποντικού δεύτερο αντίσωμα (Invitrogen, αραιωμένο 1:200). Μετά από αυτό, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ΚΝΑάση για 30 λεπτά, οι πυρήνες χρωματίστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο και τα νημάτια ακτίνης με ΡΙΤΟ-φαλλοϊδίνη. Η μορφολογία των κυττάρων και η παρουσία των ινών χρυσοτίλη φωτογραφήθηκε με λέιζερ ομοεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης (LSM 510, Carl Zeiss). Αυτά τα παρασκευάσματα χρησιμοποιήθηκαν επίσης για να προσδιοριστεί ποσοτικά η παρουσία του μικροπυρήνες, πολυπύρηνα και μιτωτικά κύτταρα: τα παρασκευάσματα παρατηρήθηκαν με μικροσκοπία φθορισμού. Τουλάχιστον 1000 κύτταρα /πλάκα και 100 μιτωτικά κύτταρα μετρήθηκαν σε τρεις διαφορετικές πλάκες για κάθε επεξεργασία και έλεγχο.

Time-Lapse Μικροσκοπία

HK2 επιμολύνθηκαν με το GFP-tagget αλφα-τουμπουλίνης πλασμίδιο για να επιτραπεί η παρακολούθηση των μικροσωληνίσκων κατά τη μίτωση. Η επιμόλυνση πραγματοποιήθηκε με Lipofectamine 2000 Invitrogen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο κατασκευής. Μετά από 24 h επιμόλυνσης, το μέσο αλλάχθηκε σε μέσο με ίνες χρυσοτίλη. Τα κύτταρα παρέμειναν με ίνες για 24 ή 48 ώρες, και στη συνέχεια να παρατηρηθεί από time-lapse περιστρεφόμενο δίσκο συνεστιακή μικροσκοπία χρησιμοποιώντας ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο ΜΕΔ X-81 (Όλυμπος), που είναι εξοπλισμένα με φωτισμό MT20 και τα συστήματα απόκτησης OSIS, μία κάμερα CCD (Hamamatsu, ORCA AG), και ένας θάλαμος θέρμανσης (Συσκευή Harvard). Κυττάρων τοποθετήθηκαν σε ειδικούς θαλάμους που περιέχει 2 ml του μέσου εγγραφής (5% Hanks ισορροπημένο διάλυμα άλατος, 0,5% γλυκόζη, 1% εμβρυϊκό βόειο ορό, 20 mM Hepes, και 2 mM Glutamax, ρΗ 7.3) και απεικονίστηκαν με το σύστημα ΜΕΔ χρησιμοποιώντας 60x 1,42 NA αντικειμενικό φακό λαδιού. Η μέγιστη εικόνες προβολής ελήφθησαν και επεξεργασία χρησιμοποιώντας το λογισμικό Metamorph και το Adobe Photoshop

Στατιστικές αναλύσεις

Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με χ2 τεστ και P & lt?.. 0.05 θεωρήθηκε σημαντική

Αποτελέσματα

χρυσότιλος εξαρτάται από τη συγκέντρωση ανευπλοειδία παρακάτω ανάκαμψη σε φυτικές ίνες χωρίς μέσο

τα καλλιεργημένα κύτταρα HK2 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις του χρυσοτίλη, και στη συνέχεια αφήνεται να ανακάμψει σε φυτικές ίνες χωρίς μέσο για 2, 4 και 8 ημέρες. περιεχόμενο πυρηνικό DNA προσδιορίστηκε ποσοτικά με ανάλυση εικόνας και οι πυρήνες ομαδοποιούνται στις εξής πέντε κατηγορίες: υποδιπλοειδή (περιεχόμενο DNA ≤1.49 C), διπλοειδή (περιεχόμενο DNA μεταξύ 1,5 C και 2,39 C), hyperdiploid (περιεχόμενο DNA μεταξύ 2,4 C και 3,59 C) , τετραπλοειδείς (περιεχόμενο DNA μεταξύ 3.6C και 5.1γ) και hypertetraploid (περιεχόμενο DNA & gt? 5.1c). (Πίνακας 1)

Η

θεραπεία Χρυσότιλος οδήγησε σε μια εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση σχηματισμό hypertetraploid πυρήνων (επίσης ονομάζεται ανευπλοειδικών πυρήνες). Μετά από 48 ώρες θεραπείας χρυσότιλου που ακολουθείται από 2 ημέρες ανάκαμψης στην ίνα μέσο άνευ, μετρήθηκε η συχνότητα της ανευπλοειδίας. Σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με τη συγκέντρωση υψηλότερη χρυσότιλου (250 μg /mL), το 7% των κυττάρων ήταν ανευπλοειδικών, ενώ εκείνοι που έλαβαν θεραπεία με την ενδιάμεση συγκέντρωση του χρυσότιλου (125 μg /ml) που εμφανίζεται 4,5% ανευπλοειδία? η χαμηλότερη συγκέντρωση χρυσότιλου (62,5 μg /ml) οδήγησε σε 3,5% ανευπλοειδία, η οποία ήταν μεγαλύτερη από την συχνότητα του ανευπλοειδίας σε κύτταρα ελέγχου (0.25%). Όταν αναλύθηκαν μετά μεγαλύτερους χρόνους ανάκτησης, η συχνότητα των ανευπλοειδικών πυρήνων αυξήθηκε, φθάνοντας το 10,5% σε κύτταρα κατεργασμένα με 250 μg /ml του χρυσότιλου ακολουθούμενη από 8 ημέρες ανάκαμψης. Τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με 125 μg /ml και 62.5 μg /ml χρυσότιλου και αφέθηκαν να ανακάμψουν για 8 ημέρες παρουσίασαν ποσοστά ανευπλοειδία από 5,9% και 4,67% αντίστοιχα (Πίνακας 1, Σχ. 1). Περιεκτικότητα

πυρηνικό DNA του έλεγχος ΚΘ2 και χρυσότιλου (250 μg /ml, 125 μg /ml ή 62.5 μg /ml) κύτταρα κατεργασμένα (για 48 ώρες) αφέθηκε να ανακάμπτει από το ίνα μέσο ελεύθερο για 2, 4 ή 8 ημέρες ποσοτικοποιήθηκε, και οι πυρήνες με περιεχόμενο DNA & gt? 5.1 C θεωρήθηκαν ανευπλοειδικών. Τα ποσοστά που παρουσιάζονται είναι το υπόβαθρο (το ποσοστό των ανευπλοειδίας στα κύτταρα ελέγχου, 0,25%) – αφαιρείται. επεξεργασία χρυσοτίλη οδήγησε σε ανευπλοειδισμών που επέμενε μετά από 8 ημέρες ανάκαμψης (P & lt? 0.001).

Η

Μετά από 48 ώρες χρυσοτίλη έκθεσης που ακολουθείται από 2 ημέρες από την ανάκτηση, η ανευπλοειδικών πληθυσμός αποτελείται κυρίως από bi και πολυπύρηνων κύτταρα. Ωστόσο, μετά από μεγαλύτερο χρόνο αποκατάστασης σε μέσο χωρίς ίνες (4 και 8 ημέρες), ανευπλοειδικών πυρήνες ήταν ως επί το πλείστον σε μονοπύρηνα κύτταρα (Πίνακας 2).

Η

μεταβολές του κυτταρικού κύκλου μετά τη θεραπεία χρυσοτίλη

Η κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα ελέγχου HK2 και σε κύτταρα επεξεργασμένα με χρυσότιλου για 48 ώρες ακολουθούμενη από 2, 4 και 8 ημέρες ανάκαμψης στην ίνα ελεύθερο μέσο αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής. Οι αγωγές έγιναν με μία μόνο συγκέντρωση χρυσότιλου (125 μg /ml).

γεγονότα κυτταρικού κύκλου ταξινομήθηκαν ως υποδιπλοειδή /αποπτωτικά, G1, S, G2 /M και hypertetraploid κύτταρα. Παρομοίως με τα πειράματα με το DNA ποσοτικοποίηση, η διπλοειδή ομάδα προσδιορίστηκε σύμφωνα με την κορυφή των κυττάρων G0 /G1 στα ιστογράμματα.

Στα ιστογράμματα, η πρώτη αξιοσημείωτη χρυσότιλου επαγόμενη μεταβολή στον κυτταρικό κύκλο ήταν μια αύξηση στην /σχηματισμό υποδιπλοειδή αποπτωτικών κυττάρων. Ωστόσο, η συχνότητα αυτών των κυττάρων μειώθηκε μετά από μια μακρά περίοδο ανάκαμψης, φθάνοντας την τιμή ελέγχου μετά από 8 ημέρες ανάκαμψης (Πίνακας 3).

Η

Χρυσότιλος κατεργασμένα κύτταρα παρουσίασαν 12% μικρότερο αριθμό G1 κυττάρων σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου, και επίσης έδειξε ένα 5% μεγαλύτερο αριθμό G2 Μ κύτταρα /από ό, τι τα κύτταρα ελέγχου (Πίνακας 3). Οι διαφορές αυτές εμφανίστηκαν ανεξάρτητα από τη διάρκεια της περιόδου ανάκτησης, και ήταν περισσότερο έντονη μετά μεγαλύτερες περιόδους ανάκαμψης. Όταν ο αριθμός των κυττάρων σε S-φάση αξιολογήθηκε, δεν παρατηρήθηκε διαφορά μεταξύ ελέγχου και χρυσότιλου επεξεργασμένα κύτταρα (Σχ. 2, Α).

Κύτταρα κατεργασμένα με χρυσότιλου και αφέθηκαν να αναρρώσουν για 2, 4 ή 8 ημέρες σε ίνα μέσο άνευ αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής και με ανοσοφθορισμό. Α) Τα ιστογράμματα σε γραμμικές (κόκκινο) και log (έγχρωμο) κλίμακες από ροή δείχνουν κυτταρομετρίας τις επιπτώσεις της chysotile επί του κυτταρικού κύκλου, συγκεκριμένα την αύξηση του αριθμού των G2 /M και hypertetraploid κύτταρα? Β) χρυσότιλου επεξεργασμένα κύτταρα ανακτώνται για 2 και 4 ημέρες δείχνουν αύξηση στον αριθμό των κυττάρων σε μετάφαση και μείωση σε κύτταρα στα ανάφαση και τελόφασης σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Ρ & lt? 0,01 για 48 ώρες και Ρ & lt? 0,001 για 4 ημέρες) .

η

μιτωτικό δείκτη ελέγχου και χρυσοτίλη-επεξεργασμένα κύτταρα HK2 προσδιορίστηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας ανοσοφθορισμού. Ανάλυση μιτωτικό δείκτη έδειξε ότι ο συνολικός αριθμός των κυττάρων σε φάση Μ ήταν παρόμοια σε έλεγχο και τα κύτταρα χρυσότιλου αγωγή. Ωστόσο, σε κύτταρα ελέγχου, ο αριθμός των κυττάρων σε ανάφαση και τελόφασης ήταν μεγαλύτερος από τον αριθμό των κυττάρων σε μετάφαση, ενώ μετά από 48 ώρες θεραπείας χρυσότιλου που ακολουθείται από 2 έως 4 ημέρες της ανάκτησης, ο αριθμός των κυττάρων σε μετάφαση ήταν μεγαλύτερη από ό, τι ο αριθμός κυττάρων σε ανάφαση και τελόφαση. Μετά από 8 ημέρες ανάκαμψης, ο αριθμός των κυττάρων σε μετάφαση ήταν παρόμοια σε χρυσότιλου επεξεργασμένα και ελέγχου κύτταρα (Σχ. 2, Β).

HK2 και κυτταρική μορφολογία VERO και παρουσία ινών χρυσότιλου

Έλεγχος και χρυσοτίλη επεξεργασμένα κύτταρα HK2 αναλύθηκαν με σάρωση με λέιζερ ομοεστιακό μικροσκόπιο, μετά την επισήμανση ανοσοφθορισμού των μικροσωληνίσκων, νημάτια ακτίνης και πυρήνες. ίνες χρυσοτίλη έγιναν ορατά με αυτοφθορισμό τους (βλέπε λεπτομέρειες στο [13]). Η παρουσία πολυπύρηνων και μικροπυρήνες κύτταρα, ανώμαλη μίτωση και ίνες αναλύθηκε και ποσοτικά

Μετά από 24 ώρες και 48 ώρες χρυσοτίλη θεραπείας, μακριές ίνες παρατηρήθηκαν αλληλεπιδρά με την επιφάνεια HK2 κυττάρων και η ακτίνη νημάτων.? μερικά μικρά θραύσματα ινών ανιχνεύθηκαν επίσης στο εσωτερικό των κυττάρων (Εικ. 3, Α). Μεταβολές στην κυτταρική καλλιέργεια παρατηρήθηκαν, όπως αύξηση του αριθμού των διμερών και πολυ-πυρηνικών, μικροπυρήνες και αποπτωτικά κύτταρα. Ο αριθμός των κυττάρων με πολυπολικού μίτωση αυξήθηκε επίσης, φθάνοντας 7,23% του συνόλου των διαιρούμενων κυττάρων μετά από 48 ώρες χρυσοτίλη έκθεσης (στον έλεγχο 2,37% του συνόλου των κυτταρικών διαιρέσεων ήταν πολυπολικό) (Εικ. 3, Β).

Cells υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ανοσοφθορισμό για να απεικονίσει πυρήνες, νημάτια ακτίνης και μικροσωληνίσκους, και ίνες χρυσοτίλη παρατηρήθηκαν από αυτοφθορισμό τους. Α) Ομοεστιακή εικόνες HK2 κύτταρα κατεργασμένα με χρυσότιλου για 24 ώρες ή 48 ώρες που εμφανίζουν μεγάλο, παχύ ίνες που αλληλεπιδρούν με τα κύτταρα και πολυπολικό μίτωση? Β) οι μεταβολές στην κυτταρική μορφολογία αναλύθηκαν, και μετά από 24 ώρες ή 48 ώρες της θεραπείας χρυσότιλου, ο αριθμός των διπύρηνα και πολυπύρηνων αυξηθεί, καθώς και τον αριθμό των κυττάρων με μικροπυρήνες, αποπτωτικά κύτταρα και κύτταρα σε πολυπολικό μίτωση (Ρ & lt? 0.001) .

η

Μετά από 48 ώρες θεραπείας χρυσοτίλη ακολουθείται από μια παρόμοια περίοδο ανάκαμψης, πολυπύρηνα κύτταρα, ανώμαλη μίτωση και παρατηρήθηκαν μεγάλες και μικρές ίνες χρυσοτίλη στο εσωτερικό των κυττάρων (Εικ. 4, Α). Περαιτέρω ανάλυση έδειξε ότι τα κύτταρα αφέθηκαν να ανακάμψουν για μεγάλες χρονικές περιόδους που περιέχονται λιγότερες ίνες? ινών χρυσότιλου και θραύσματα μικρών ινών παρατηρήθηκαν στην περιπυρηνική περιοχή των κυττάρων μετά από 4 ημέρες ανάκαμψης, ενώ μετά από 8 ημέρες ανάκαμψης δεν υπήρχαν μακριές ίνες και μερικά μικρά θραύσματα ινών εντός των κυττάρων (Σχ. 4, Α). Μετά από 4 ημέρες ανάκαμψης, ο αριθμός των bi /πολυπύρηνων μειώθηκαν αλλά ήταν ακόμη υψηλότερο σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου, ωστόσο ο αριθμός των κυττάρων σε μίτωση και πολυπολικού μικροπυρήνες αυξήθηκαν (Σχ. 4, Β). Μετά από 8 ημέρες ανάκαμψης, η κυτταρική μορφολογία των κυττάρων χρυσοτίλη επεξεργασμένο έμοιαζε με εκείνη των κυττάρων ελέγχου, η οποία αποτελείται μονοπύρηνα κύτταρα, κύτταρα σε διπολική μίτωση και λίγες μικροπυρήνες και αποπτωτικά κύτταρα. Ο αριθμός των κυττάρων σε μίτωση πολυπολικού μειώθηκε σε σύγκριση με εκείνη των κυττάρων αφέθηκαν να αναρρώσουν για 4 ημέρες? Ωστόσο, στα κύτταρα χρυσότιλου αγωγή, υπήρχαν περισσότερες περιπτώσεις πολυπολικού μίτωσης ό, τι υπήρχαν στα κύτταρα ελέγχου (Σχ. 4, Β).

Τα κύτταρα εξετάστηκαν με τη χρήση ανοσοφθορισμού για να απεικονίσει πυρήνες, νημάτια ακτίνης και μικροσωληνίσκους και ίνες χρυσοτίλη παρατηρήθηκαν από αυτοφθορισμό τους. Α) Ομοεστιακή εικόνες των κυττάρων HK2 ελέγχου και κύτταρα επεξεργασμένα με χρυσότιλου για 48 ώρες και αφέθηκαν να ανακάμψουν για 2 ημέρες, 4 ημέρες ή και 8 ημέρες, δείχνοντας μορφολογία των κυττάρων και την παρουσία ινών χρυσότιλου. Μετά από 2 ημέρες ανάκαμψης, μακριές ίνες παρατηρήθηκαν να αλληλεπιδρά με την επιφάνεια των κυττάρων? Ωστόσο, μετά από 4 και 8 ημέρες ανάκαμψης, παρατηρήθηκαν μόνο θραύσματα ινών? Β) οι μεταβολές στην κυτταρική μορφολογία προσδιορίστηκαν ποσοτικά, και μετά από 48 ώρες θεραπείας χρυσότιλου και 4 ημερών της ανάκτησης, ο αριθμός των bi /πολυπύρηνα κύτταρα και αποπτωτικά κύτταρα μειώθηκε, αλλά ήταν ακόμα υψηλότερη από τους ελέγχους (Ρ = 0,30 για bi /πολυπύρηνα μετά 4 ημέρες και Ρ = 0,05 για αποπτωτικά κύτταρα). Ο αριθμός των κυττάρων με μικροπυρήνες στην ομάδα χρυσότιλου επεξεργασμένο παρέμεινε μεγαλύτερη ότι στην ομάδα ελέγχου (Ρ & lt? 0,001 μετά από 4 ημέρες), και ο αριθμός των κυττάρων σε μίτωση πολυπολικού ήταν μεγαλύτερη (Ρ & lt? 0.001). Μετά από 8 ημέρες ανάκαμψη, ο αριθμός των κυττάρων σε πολυπολικό κύτταρα μίτωση παρέμειναν υψηλότερες σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου (P = 0,02).

Η

Για να καθοριστεί εάν τα φυσιολογικά κύτταρα θα ανταποκρίνονται παρόμοια με χρυσοτίλη, καλλιέργειες κυττάρων VERO εκτέθηκαν σε ίνες χρυσοτίλη για 48 ώρες και αφέθηκαν να ανανήψουν για 24 ώρες σε φυτικές ίνες χωρίς μέσο, ​​και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τη χρήση ανοσοφθορισμού για την ανάλυση μορφολογίας των κυττάρων. Τα κύτταρα ελέγχου αποτελείται μονοπύρηνα κυρίως κύτταρα (99,29%), με σπάνια μικροπυρήνες κύτταρα (1,55%) και καμία ανώμαλη μίτωση. Μετά χρυσότιλου θεραπεία, bi /πολυπύρηνα και μικροπυρήνες κύτταρα παρατηρήθηκαν σε μεγαλύτερους αριθμούς από ότι στα κύτταρα ελέγχου (6.34% και 3.89% αντίστοιχα), και πολυπολικό μίτωση και κυτοκίνηση καταλήγοντας σε τρία θυγατρικά κύτταρα παρατηρήθηκαν επίσης (7,18% του συνόλου των διαιρέσεων κυττάρου) ( Σχ. 5, Α και Β).

τα κύτταρα εξετάστηκαν με τη χρήση υποβληθεί σε ανοσοφθορισμό για να απεικονίσει τους πυρήνες, νημάτια ακτίνης και μικροσωληνίσκους, και ίνες χρυσοτίλη παρατηρήθηκαν από αυτοφθορισμό τους. Α) Ομοεστιακή εικόνες των κυττάρων ελέγχου και κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με χρυσότιλου για 48 ώρες και αφέθηκαν να αναρρώσουν για 24 ώρες, δείχνοντας μορφολογία των κυττάρων και την παρουσία ινών χρυσότιλου. Μετά την ανάκτηση, μακριές ίνες παρατηρήθηκαν να αλληλεπιδράσουν με τα κύτταρα, και πολυπύρηνα, παρατηρήθηκαν μικροπυρήνες κύτταρα και κύτταρα σε μίτωση πολυπολικό? Β) οι μεταβολές στη μορφολογία των κυττάρων ήταν ποσοτικά, και τη θεραπεία χρυσοτίλη οδήγησε στην αύξηση του αριθμού των κυττάρων με μικροπυρήνες, bi /πολυπύρηνα κύτταρα, αποπτωτικών κυττάρων και κυττάρων σε πολυπολικό μίτωση (P & lt?. 0.001)

Η

Time- Λήξη μικροσκοπία: τύχες των ανώμαλων μιτωτικών κυττάρων και ο σχηματισμός των πολλαπλών κεντροσωμάτων

Για time-lapse περιστρεφόμενο δίσκο συνεστιακή μικροσκοπία, HK2 κύτταρα επιμολύνθηκαν με GFP-tagged α-τουμπουλίνης. Παρατηρήθηκε Κάθε επιμολυσμένο κύτταρο για μια περίοδο 2-3 ωρών. Όταν ένα κύτταρο ελέγχου σε μετάφαση βρέθηκε, ότι προχώρησαν σε ανάφαση και έφθασε τελόφασης σε 30 έως 100 λεπτά. Όλα τα τμήματα που παρατηρούνται σε κύτταρα ελέγχου ήταν διπολική (Εικ. 6, Α). Αντίθετα, όταν παρατηρήθηκαν κύτταρα χρυσοτίλη-θεραπεία, περίπου 40% των μεταφάσεων ήταν πολυπολικού. Ανάλυση για την τύχη των 30 αυτών των κυττάρων αποκάλυψε διαφορετικά πρότυπα? καθένα από αυτά παρατηρήθηκε τουλάχιστον δύο φορές.

Κύτταρα μετεμβολιασμένα με GFP-tagged α-τουμπουλίνης υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με χρυσότιλου για 24 ή 48 ώρες και στη συνέχεια παρατηρήθηκε από time-lapse περιστρεφόμενο δίσκο συνεστιακή μικροσκόπηση. Τα κύτταρα σε μετάφαση παρατηρήθηκαν για 2 έως 3 ώρες. Α) Μια χρονική σειρά της μέγιστης εικόνες προβολής δείχνει μια διπολική μίτωσης που παράγεται μόνο δύο θυγατρικά κύτταρα μετά από 1 ώρα σε μια κουλτούρα ελέγχου? Β) μια χρονική σειρά της μέγιστης εικόνες προβολής δείχνει ένα τριπολικό μίτωσης από χρυσοτίλη επεξεργασμένο κουλτούρα που δεν προχωρήσει μέσα φάση Μ? Γ) χρονοσειρά της μέγιστης εικόνες προβολής δείχνει μια χρυσοτίλη επεξεργασμένο κύτταρο που διοργάνωσε πόλους της ατράκτου σε ένα τριπολικό μόδας και προχώρησε στην ανάφαση και τελόφασης δημιουργία τριών θυγατρικών κυττάρων? Δ) μια χρονική σειρά της μέγιστης εικόνες προβολής δείχνει κυτοκίνηση σε ένα κύτταρο χρυσότιλου επεξεργασμένο, δημιουργώντας τρία θυγατρικά κύτταρα που αποκτώνται μεσόφαση μορφολογία? Ε) η χρονοσειρά της μέγιστης εικόνες προβολής ενός κυττάρου χρυσοτίλη αγωγή που τέθηκε ανάφαση παράγει τέσσερα θυγατρικά κύτταρα? Ωστόσο, τα κύτταρα συγχωνεύτηκαν κατά τη διάρκεια της τελόφασης και σχηματίζονται μόνο δύο θυγατρικά κύτταρα.

Η

Περίπου το ήμισυ των κυττάρων σε πολυπολικό μετάφαση δεν προχωρήσει στην ανάφαση κατά τη διάρκεια της περιόδου παρατήρησης, παραμένοντας σε μετάφαση με ψευδο-διπολική, τριπολικό ή ατράκτους τετραπολικό (Εικ. 6, Β). Σε αυτές τις περιπτώσεις, οι μικροσωληνίσκοι ήταν δυναμική, και οι πόλοι της ατράκτου ήταν πιο δυναμική όταν ομαδοποιούνται σε ψευδο-διπολική ατράκτους. Κύτταρα σε πολυπολικό μετάφαση υποβλήθηκαν επίσης κυτταρικό θάνατο, όπως αποδεικνύεται από τη διαρροή του κυτταροπλάσματος που παρατηρείται στο μεταδιδόμενο κανάλι φωτός.

Μερικά κύτταρα στον πολυπολικό μετάφαση μετά τη θεραπεία χρυσοτίλη προχώρησε επίσης στην ανάφαση, τελόφασης και κυτοκίνηση. Τριπολικό μεταφάσεις που δημιουργούνται τρία θυγατρικά κύτταρα που συνδέονται με δύο midbodies με οργάνωση των μικροσωληνίσκων παρόμοια με αυτή που παρατηρήθηκε σε κύτταρα μάρτυρες (Εικ. 6, C). Τα τρία θυγατρικά κύτταρα είτε παρέμειναν διαχωρίστηκε και απέκτησε ενδιάμεση μορφολογία 100 λεπτά μετά την έναρξη της κυτοκίνηση (Εικ. 6, D), ή να συντηχθούν διάρκεια κυτοκίνηση. Σε αυτές τις περιπτώσεις, δύο από τα τρία θυγατρικά κύτταρα συντήχθηκαν και συνδέεται με το μεσοκυττάριο γέφυρα με δύο δομές μικροσωληνίσκων. Η κυτταρική σύντηξη συνέβη και κατά τη διάρκεια της τελόφασης μέχρι το σχηματισμό μεσοκυττάρια γέφυρας, έτσι ώστε δύο θυγατρικά κύτταρα συνδέονται με ένα μόνο μέσου σώματος (Σχήμα 6, Ε.)

Ο σχηματισμός του πολυπολικού άξονες ή δεν παρατηρήθηκε κατά τη διάρκεια της μίτωσης πολλαπλές κεντροσωμάτια.? όλες οι περιπτώσεις μετάφασης ήταν ανώμαλη από την αρχή της παρατήρησης. Έτσι, μεσόφαση κύτταρα παρατηρήθηκαν για τον εντοπισμό αλλοιώσεων που θα μπορούσαν να σχετίζονται με πολλαπλασιασμό κεντροσωμάτων, η οποία ήταν υπεύθυνη για το σχηματισμό του πολυπολικού ατράκτων στην επόμενη φάση Μ.

παρατηρήθηκαν κύτταρα σε μεσόφαση με δύο κεντροσωμάτια, και οι κεντροσωμάτια πλησίασαν ο ένας τον άλλο, αντί να μεταναστεύουν σε αντίθετους πόλους. Επίσης, το δίκτυο μικροσωληνίσκων των κυττάρων αυτών παρέμεινε παρόμοια με μεσόφαση κύτταρα και δεν σχηματίζουν ατράκτους. Μια άλλη κατάσταση που παρατηρήθηκε μετά την αγωγή χρυσοτίλη ήταν η παρουσία μεσόφαση με δύο σώματα κεντρόσωμα-όπως – δομές που βρίσκονται σε περιπυρηνική περιοχή του κυττάρου όπου συμπυκνώθηκαν μικροσωληνίσκων. Αυτές οι δομές φάνηκε να σχηματίζεται από πολύ μικρές κουκκίδες που μετακινούνται κατά τη διάρκεια όλης της περιόδου καταγραφής. Επίσης, το κύτταρο παρέμεινε στη μεσόφαση και δεν προχώρησαν σε φάση Μ (Εικ. 7, Α).

Μεταβολές που θα μπορούσαν να σχετίζονται με μια ανώμαλη αριθμό κεντροσωμάτων παρατηρήθηκαν σε HK2 κύτταρα κατεργασμένα με χρυσότιλου για 24 ή 48 h. Α) Μια χρονική σειρά εικόνων που δείχνει ένα κύτταρο με δύο κεντροσωμάτων like-δομές που δεν είχε φθάσει στο στάδιο Μ όπως αναμενόταν για ένα κύτταρο με δύο κεντροσωμάτια? Β) μία φορά σειρά από εικόνες που δείχνουν δύο μεσόφαση κύτταρα που συνδέονται με ένα ενδοκυτταρικό γέφυρα χωρίς οργάνωση μέσου σώματος. Τα κύτταρα προσέγγισαν ο ένας τον άλλο κατά τη διάρκεια της περιόδου παρατήρησης, αντανακλώντας μια υποχώρηση των κυτταροκίνηση.

Η

Ένας άλλος μηχανισμός που είναι υπεύθυνος για το σχηματισμό των επιπλέον κεντροσωμάτων σε κύτταρα είναι η αποτυχία κυτοκίνηση. Αυτή η διαδικασία διαρκεί πάρα πολύ καιρό που πρέπει να τηρούνται κατά τη διάρκεια των πειραμάτων time-lapse που διεξάγεται. Ωστόσο, μεσόφαση κύτταρα συνδέονται με ένα ενδοκυτταρικό γέφυρα χωρίς οργάνωση μέσου σώματος μικροσωληνίσκων παρατηρήθηκαν, και τα κύτταρα προσέγγισαν ο ένας τον άλλο κατά τη διάρκεια της περιόδου παρατήρησης (Σχ. 7, Β).

Συζήτηση

Χρυσοτίλης είναι θεωρείται λιγότερο επιβλαβής για την ανθρώπινη υγεία από τους άλλους τύπους αμιάντου, λόγω της έλλειψης μιας ισχυρής σύνδεσης μεταξύ της έκθεσης των ινών χρυσότιλου και την ανάπτυξη των καρκινωμάτων και μεσοθηλίωμα. Παρ ‘όλα αυτά, μερικές μελέτες έχουν δείξει τις δυνατότητες του χρυσοτίλη να προκαλέσει βλάβες στο DNA και την κυτταρική μετατροπές

in vitro

, και οι τραυματισμοί των πνευμόνων

in vivo

. Η παρούσα εργασία αναλύθηκαν κυτταρικές αλλοιώσεις που σχετίζονται με ανευπλοειδίας και του κυτταρικού κύκλου αναστάτωση, και επαλήθευσε το οποίο αλλοιώσεις επιμένουν στον πολιτισμό μετά από 2, 4 και 8 ημέρες ανάκαμψη σε φυτικές ίνες χωρίς μέσο. Επίσης, αλλαγές στην κυτταρική μορφολογία σχετίζονταν με την παρουσία των ινών σε καλλιέργεια κατά τη διάρκεια των πρώτων 24 ώρες και 48 ώρες της θεραπείας χρυσότιλου, αλλά και μετά από μακρές περιόδους ανάρρωσης. Αναλύσαμε επίσης πολυπολικό μίτωση και πολλαπλασιασμό κεντροσωμάτων, τα οποία είναι πρόσθετα χαρακτηριστικά της θεραπείας χρυσοτίλη που συνδέονται στενά με ανευπλοειδία.

Η ανάλυση των HK2 κύτταρα με συνεστιακή μικροσκοπία αποκαλύφθηκε ότι οι ίνες χρυσοτίλη δεν επιμένουν σε καλλιέργεια κυττάρων μετά από 8 ημέρες ανάκαμψης, και μετά από 4 ημέρες ανάκαμψης μόνο θραύσματα και μικρές ίνες ήταν παρόντες στην περιπυρηνική περιοχή κάποιων κυττάρων. Επίσης, μετά από 4 και 8 ημέρες ανάκαμψης, κυτταρική μορφολογία έμοιαζε εκείνη των κυττάρων ελέγχου σε σχέση με την παρουσία του bi /πολυπύρηνα και κυττάρων με μικροπυρήνες. Ωστόσο, ο πληθυσμός ανευπλοειδές επέμενε σε κυτταρική καλλιέργεια μετά από 4 και 8 ημέρες ανάκαμψης σε ίνες μέσο ελεύθερο, και τα ποσοστά των πυρήνων ανευπλοειδικών ήταν πάντα περίπου το 10% του συνολικού πληθυσμού. Τα στοιχεία που παρέχονται από το DNA ποσοτικοποίηση έδειξε επίσης ότι ανευπλοειδικών πυρήνες ήταν ως επί το πλείστον σε μονοπύρηνα κύτταρα μετά από 4 και 8 ημέρες ανάκαμψης, ενώ κατά τη διάρκεια των πρώτων ημερών της ανάκαμψης οι ανευπλοειδικών πυρήνες ήταν σε bi /πολυπύρηνα κύτταρα. Όλες αυτές οι παρατηρήσεις είναι σε συμφωνία με τα δεδομένα που παρέχονται με κυτταρομετρία ροής, η οποία έδειξε ότι χρυσοτίλη επεξεργασμένα κύτταρα HK2 έδειξαν αυξημένη hipertetraploidy ακόμα και μετά από 8 ημέρες της ανάκαμψης.

Η παρουσία ανευπλοειδικών κυττάρων είναι μια συνέπεια της θεραπείας χρυσοτίλη παρατηρηθεί μετά από 48 ώρες από την έκθεση, η οποία επιμένει ακόμα και μετά από 72 ώρες ανάκτησης μετά την αγωγή [11], [13]. Αυτά τα κύτταρα θα μπορούσαν να σχετίζονται με την ανάπτυξη του καρκίνου, επειδή η απώλεια ή το κέρδος του ενός χρωμοσώματος – ή ένα τμήμα αυτής – μπορεί να εισαγάγει μεταλλάξεις που απαιτούνται για κακοήθη εξαλλαγή. Δείχνουμε σε αυτή τη μελέτη ότι η επαγωγή της ανευπλοειδίας στα κύτταρα εξαρτάται από τη συγκέντρωση χρυσότιλου, και όπως περιγράφεται παραπάνω, ότι το ποσοστό των ανευπλοειδικών κύτταρα παρέμειναν υψηλά σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου μετά 8 ημέρες ανάκαμψης σε ίνες χωρίς μέσο καλλιέργειας.