Αφηρημένο

Ιστορικό

Η σεληνοένζυμο θειορεντοξίνη αναγωγάση 1 έχει μια σύνθετη ρόλος που σχετίζονται με την κυτταρική ανάπτυξη. Είναι επάγεται ως συστατικό της κυτταρικής απόκρισης σε δυνητικά μεταλλαξιογόνος οξειδωτικά, αλλά επίσης φαίνεται να παρέχει πλεονεκτήματα ανάπτυξης σε μετασχηματισμένα κύτταρα με αναστολή απόπτωσης. Επιπλέον, selenocysteine ​​ανεπάρκεια ή αλκυλιωμένη μορφές θειορεδοξίνης αναγωγάσης 1 απέδειξαν επίσης οξειδωτική, προ-αποπτωτική δραστικότητα. Ως εκ τούτου, μια καλύτερη κατανόηση του ρόλου των θειορεδοξίνης αναγωγάσης σε οξειδοαναγωγική κινηθεί αποπτωτικές διεργασίες είναι δικαιολογημένη.

Μεθοδολογία

Ο ρόλος της θειορεδοξίνης αναγωγάσης 1 σε κύτταρα RKO αξιολογήθηκε με εξασθένηση ενδογενή έκφραση θειορεδοξίνης αναγωγάσης 1 με siRNA και, στη συνέχεια, είτε την επαγωγή ανεπάρκειας σεληνίου θειορεδοξίνης αναγωγάσης ή θεραπεία με ξεχωριστές προκλήσεις οξειδοαναγωγής συμπεριλαμβανομένων, υπεροξείδιο του υδρογόνου, ένα οξειδωμένο λιπίδιο, 4-υδροξυ-2-nonenol, και το μονοξείδιο του αζώτου δωρεά προφάρμακο. Θειορεδοξίνη οξειδοαναγωγική κατάσταση, κυτταρική βιωσιμότητα, και δραστηριότητα τελεστή κασπάσης μετρήθηκαν.

Συμπεράσματα /σημαντικότητα

Σε κύτταρα με εξασθενημένο ενδογενή αναγωγάσης θειορεδοξίνης 1, ένα σταθερά ενσωματωμένο σεληνοκυστεΐνης ανεπάρκεια μορφή του ενζύμου που επάγεται αλλά δεν μετέβαλε ούτε την ιδιότητα θειορεδοξίνης οξειδοαναγωγική ή τα κυτταρικά κινητική ανάπτυξη. Το οξειδωμένο λιπίδιο και ο δότης νιτρικού οξειδίου αποδειχθεί ενισχυμένη κυτταροτοξικότητα όταν θειορεντοξίνη αναγωγάση 1 χτυπήθηκε-κάτω? Ωστόσο, η επίδραση ήταν εντονότερη με το προφάρμακο του νιτρικού οξειδίου. Τα αποτελέσματα αυτά συμφωνούν με την υπόθεση ότι η εξασθένιση της θειορεδοξίνης-σύστημα μπορεί να προωθήσει την απόπτωση σε μονοξείδιο του αζώτου με τρόπο που εξαρτάται

Παράθεση:. ΕΔΕΣ Κ, Cassidy Ρ, Shami PJ, Moos PJ (2010) JS-K , οξειδίου του αζώτου προφάρμακο, έχει ενισχύσει την κυτταροτοξικότητα στον Καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα με Νοκ ντάουν της αναγωγάση της θειορεδοξίνης 1. PLoS ONE 5 (1): e8786. doi: 10.1371 /journal.pone.0008786

Επιμέλεια: Μιχαήλ Β Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 18 Σεπτέμβρη 2009? Αποδεκτές: 30 Δεκ, 2009? Δημοσιεύθηκε: 20 Ιανουαρίου 2010

Copyright: © 2010 ΕΔΕΣ et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από μια USPHS Grant CA115616 (PJM). Πρέπει επίσης να αναγνωρίσουμε τη χρήση των βασικών εγκαταστάσεων που υποστηρίζονται από Ρ30 CA042014 ανατέθηκε στο Ινστιτούτο Καρκίνου Huntsman. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, η συλλογή και ανάλυση δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Δρ. Moos υποστηρίζεται από το NIH, αλλά ο σχεδιασμός και η εκτέλεση είναι δική του. Ο Δρ Shami είναι ένας από τους ιδρυτές της και κατέχει απόθεμα στο JSK Therapeutics, Inc. Δρ Cassidy και η κα ΕΔΕΣ δηλώνουν κανένα πιθανές συγκρούσεις συμφερόντων.

Εισαγωγή

Το σύστημα θειορεδοξίνης θηλαστικών αποτελείται από το σεληνοπρωτεϊνης θειορεδοξίνης αναγωγάση (TR), θειορεδοξίνη (Τγχ), και NADPH δότη ηλεκτρονίων. Το σύστημα TR-Τγχ συμμετέχει σε διάφορες αντιδράσεις οξειδοαναγωγής στα κύτταρα [1], από την υποστήριξη της σύνθεσης του DNA [2] για να οξειδοαναγωγής που εξαρτώνται από μονοπάτια κυτταρικής σηματοδότησης [3] – [6]. Τγχ και TR μπορεί να διευκολύνει την ανάπτυξη και /ή επιβίωση των κακοηθών κυττάρων, όπως η έκφραση τους είναι αυξημένη σε μερικούς όγκους [7], [8]. Θειορεδοξίνη ενζυματική δραστηριότητα αναγωγάσης δεν περιορίζεται σε θειορεδοξίνη, αντ ‘αυτού, έχουν πολλά υποστρώματα έχουν ταυτοποιηθεί, συμπεριλαμβανομένων? selenocompounds, ασκορβικό, Λιποϊκός, και οξειδωμένων λιπιδίων [9] – [11]. Ωστόσο, ορισμένα οξειδωμένα λιπίδια λειτουργία να αναστέλλουν τη δράση TR1 αντιδρώντας με την πυρηνόφιλη Ο-άκρο που περιλαμβάνει το υπόλειμμα Sec [12] – [14].

Το διπλανό σεληνοκυστεΐνης (SEC) και κυστεΐνη (Cys) κατάλοιπα σε το ο-άκρο του TRs θηλαστικών απαιτούνται για αναγωγάσης δραστικότητα όταν Τγχ είναι το υπόστρωμα? Ωστόσο, Sec ανεπάρκεια TR1 μπορεί να έχει βιοχημική [15] και της βιολογικής [16] δραστηριότητες διαφορετικές από Sec-επαρκή TR1 που μπορεί να σχετίζονται με τον καρκίνο ή άλλες ασθένειες. Sec-ανεπαρκή TR1 απέδειξε προ-αποπτωτική δραστικότητα σε μελέτες που αξιολογούν το ρόλο του TR1 σε ιντερφερόνη και την απόπτωση ρετινοϊκού οξέος που προκαλείται από [17], καθώς και πιο πρόσφατα δεδομένα που υποστηρίζουν το οποίο έχει αποδείξει Sec-ανεπαρκή είδη TR1 (ορίζεται SecTRAPs) είναι κατά ίδιοι ισχυροί διεγέρτες απόπτωσης σε ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές [16]. Η απόπτωση σε αυτές τις περιπτώσεις είχαν υποτίθεται ότι προκαλείται από αυξημένο οξειδωτικό στρες στα κύτταρα. Αυτά τα παραδείγματα δείχνουν ότι η διάσπαση του Ο-άκρου του TR1 οδηγεί σε μία πρωτεΐνη κέρδος-of-λειτουργία που θα μπορούσε να είναι ένα χρήσιμο προ-αποπτωτικών παράγοντα εάν μπορούσε να στοχεύσουν σε κακοήθη κύτταρα.

Σε αυτή τη μελέτη έχουμε εξέτασε τις επιπτώσεις για τον καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα από δύο σενάρια στα οποία κανονική δραστηριότητα TR1 (δηλαδή η ικανότητα να μειώσει Trx) έχει μετριαστεί είτε με επεξεργασία siRNA ή μετάλλαξη των C-τερματικών Sec και Cys υπολείμματα. Ξεκινήσαμε με την αξιολόγηση της κατάστασης οξειδοαναγωγής του Trx σε RKO κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου, όπου τα επίπεδα της ενδογενούς TR1 εξασθένησαν με siRNA. Σε αυτά τα ίδια κύτταρα ανεπαρκή σε άγριου τύπου TR1, μπορούμε στη συνέχεια προκάλεσε την εξέφρασαν Sec-ανεπαρκή TR1 και διαπίστωσε ότι αυτή η πρωτεΐνη δεν άλλαξε ούτε το καθεστώς οξειδοαναγωγική Τγχ ούτε τα κυτταρικά κινητική ανάπτυξης. Μόνο σε κύτταρα κάτω από το οξειδωτικό στρες από τη θεραπεία με διαμιδίου δεν βρίσκουμε διαφορές στην TR1-comprimised κύτταρα. Αυτό μας οδήγησε να εξετάσει τα αποτελέσματα του TR1 knockdown σε μια ποικιλία οξειδωτικών παραγόντων πίεσης συμπεριλαμβανομένων ειδών ενεργού οξυγόνου, ενός ηλεκτρόφιλου λιπίδιο και το μονοξείδιο του αζώτου (ΝΟ) -prodrug. Τα αποτελέσματα της εξάντλησης TR1 ήταν πιο έντονη σε συνδυασμό με την τελευταία θεραπεία.

ΝΟ έχει ένα ευρύ φάσμα φυσιολογικών αποτελεσμάτων, συμπεριλαμβανομένων προφέρεται επιδράσεις στο αγγειακό και το νευρικό σύστημα [18], [19]. Είναι επίσης ελπιδοφόρα ως αντινεοπλασματικός φαρμακολογικό παράγοντα λόγω της κυτταροτοξικότητας του? Ωστόσο, η βέλτιστη κλινική απόκριση απαιτεί νέους μηχανισμούς παράδοση του ΝΟ στον όγκο μάλλον παρά συστηματική χορήγηση για να αποφευχθούν οι αγγειακές δυσμενείς επιπτώσεις [20].

O

2- (2,4-δινιτροφαινυλ) 1 – [(4-αιθοξυκαρβονυλο) πιπεραζιν-1-υλ] diazen-1-ιο-1,2-diolate (JS-K) είναι ένα προφάρμακο σχεδιασμένη να απελευθερώνει ΝΟ ενδοκυτταρικά [21] Ως εκ τούτου, αποφεύγοντας γενικευμένες επιδράσεις στο αγγειακό σύστημα. Η απελευθέρωση του ΝΟ από JS-K εξαρτάται από τον μεταβολισμό της γλουταθειόνης S-τρανσφεράσες (GSTs) και αυτή η εξάρτηση μπορεί να παρέχει πρόσθετα νεοπλασματικών εκλεκτικότητα δεδομένου GSTs συχνά υπερεκφράζονται στον καρκίνο [22]. JS-K απέδειξε αντινεοπλαστική αποτελεσματικότητα σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές ανθρώπινου καρκίνου, καθώς και συστήματα ζωικών μοντέλων [23].

ΝΟ μπορεί να έχει διαφορετικές επιδράσεις στα κύτταρα. Λειτουργώντας ως οξειδωτικό, μπορεί να αντιδράσει με μεταλλικά ιόντα, ή να τροποποιούν άμεσα πρωτεΐνες για τα υπολείμματα κυστεΐνης που σχηματίζουν δ-Νιτροδοθειολών. Αυτή η τροποποίηση μπορεί να ρυθμίζουν τη λειτουργία της πρωτεΐνης [24]. Η κυτταρική διαχείριση οξειδοαναγωγής του νιτροσυλίωση κυστεΐνη είναι ένα ενεργό τομέα της έρευνας, και το σύστημα TR-Τγχ έχει ταυτοποιηθεί ως ρυθμιστής του φαινομένου αυτού [25]. Ειδικότερα, οι αποπτωτικών πρωτεϊνών έχουν ταυτοποιηθεί ως πρωτεΐνες-στόχοι τροποποιήθηκε από νιτροσυλίωση [26]. Πράγματι, η κασπάση ενέργειας, της κασπάσης-3, είναι ο στόχος της νιτροσυλίωση που διαμορφώνεται από κυτοσολικές και μιτοχονδριακή συστήματα Τγχ [27]. Ως εκ τούτου, το ΝΟ και το σύστημα TR-Τγχ αποτελούν αναπόσπαστα συστατικά σε κυτταρικές διεργασίες του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου. Στην παρούσα εργασία θα επεκτείνει τη μελέτη της αλληλεπίδρασης αυτής ώστε να συμπεριλάβει τις επιπτώσεις της TR1 σχετικά με τη δραστηριότητα ενός σημαντικού νέου υποψήφιος καρκίνο του θεραπευτικού παράγοντα, JS-Κ.

Αποτελέσματα

θηλαστικών θειορεντοξίνη αναγωγάση χωρίς ένα Sec πιστεύεται ότι έχει ελάχιστη δραστηριότητα? Ωστόσο, πρόσφατες αναφορές δείχνουν ότι Sec με ανεπάρκεια αναγωγάσης θειορεδοξίνης μπορεί να έχουν άλλες δραστηριότητες οξειδοαναγωγής. Ως εκ τούτου, κατασκευάσαμε έναν επαγώγιμο κυτταρική γραμμή όπου θα μπορούσαμε να εκφράζουν ένα C-τερματικό μετάλλαγμα του TR1 που ήταν ανθεκτική σε siRNA knockdown. Μετρήσαμε την έκφραση του TR1 με στύπωση Western και μετρήθηκε η δραστικότητα TR βασίζεται στην μείωση της ινσουλίνης, καθώς και μείωση λιποϊκό οξύ (Σχήμα 1). Το siRNA χτυπήσει αποτελεσματικά κάτω από το ενδογενές TR1 κατά ~ 70% και την επαγωγή τετρακυκλίνης της σταθερά ολοκληρωμένο του C-τερματικού μετάλλαγμα ήταν -75% του επιπέδου του ενδογενούς TR1 (Σχήμα 1Α). Επιπλέον, η knockdown οδήγησε σε ~ 70% μείωση της δραστηριότητας TR όπως μετράται με την βιοχημική δοκιμασία οξείδωσης NADPH με Τγχ ως το ενδιάμεσο και η ινσουλίνη που υπηρετούν στο τελικό αποδέκτη ηλεκτρονίων (Σχήμα 1Β). Δεδομένου ότι μπορεί να μειώσει TR1 εναλλακτικά υποστρώματα για Τγχ

in vitro

, αξιολογήσαμε επίσης την ικανότητα του C-τερματικού μετάλλαγμα του TR1 να μειώσει λιποϊκό οξύ σε μία δοκιμασία που βασίζεται κυττάρων (Σχήμα 1C). Αρκετά κυτταρικά ένζυμα μπορεί να μειώσει Λιποϊκός αλλά κάναμε παρατηρούμε μια ~ 40% μείωση της μείωσης Λιποϊκός στα κύτταρα RKO με ενδογενή TR1 μετριάζει το siRNA και στα κύτταρα που εκφράζουν το C-τερματικό μεταλλαγμένο TR1.

Τα κύτταρα εκτέθηκαν να siRNA που κατευθύνεται έναντι TR1 για συνολικά 96 ώρες, και ένα Sec ανεπάρκεια Ο-τερματικό μεταλλαγμένο TR1 επάχθηκε για τις τελευταίες 24 ώρες. Α) Ανάλυση ανοσοκηλίδας της έκφρασης πρωτεΐνης TR1 ακόλουθες επεξεργασίες siRNA και επαγωγή του TR1 μεταλλαγμένου Sec ανεπάρκεια. Β) TR βιοχημική δραστηριότητα μετρήθηκε στα κυτταρολύματα με παρακολούθηση οξείδωση NADPH σε μια δοκιμασία που εξαρτάται από Τγχ και χρησιμοποιεί την ινσουλίνη είναι το τελικό αποδέκτη ηλεκτρονίων. Η πρώτη γραμμή στην αριστερή αντιπροσωπεύουν τη δραστικότητα του ελέγχου (si-Scramble) χωρίς Τγχ προστίθεται στο μίγμα της αντίδρασης, υποδεικνύοντας σήμα υποβάθρου. Γ) TR δραστηριότητα των κυττάρων με βάση, όπως μετράται με μείωση λιποϊκό οξύ σε μία χρωματομετρική ανάλυση με χρήση αντιδραστηρίου Ellman. Η πρώτη γραμμή στην αριστερή αντιπροσωπεύουν τη δραστικότητα του ελέγχου (si-Scramble) χωρίς λιποϊκό οξύ προστίθεται στο μίγμα της αντίδρασης. Τα λύματα από τα κύτταρα με TR1 γκρέμισε δείχνουν σημαντική μείωση της δραστηριότητας σε σύγκριση με τον έλεγχο (si-Scramble) και στις δύο δοκιμασίες (***, p & lt? 0.001).

Η

Από Trx είναι ένα κύριο υπόστρωμα του TR1 και αφού άλλες Sec-ανεπαρκή TR1 απέδειξαν οξειδωτικό στρες, μετρήσαμε την κατάσταση redox Τγχ να προσδιοριστεί εάν το Sec ελλειμματικών ο-τερματικό μεταλλαγμένο TR1 μετέβαλε την κατάσταση οξειδοαναγωγής του Τγχ. Εκτίμηση της κατάστασης οξειδοαναγωγής Τγχ έγινε με αλκυλίωση με ιωδοοξικό οξύ, αναγωγή των οξειδωμένων Cys με DTT, και στη συνέχεια ιωδοακεταμίδιο αλκυλίωση, όπως έχει περιγραφεί [28]. Δεν υπάρχουν αλλαγές στην οξειδοαναγωγική κατάσταση Trx παρατηρήθηκαν μεταξύ των κυττάρων με ενδογενή TR1, κύτταρα με TR1 νοκ-κάτω, και τα κύτταρα με ενδογενή TR1 νοκ-κάτω συν επαγωγή της Sec ανεπάρκεια C-τελική μετάλλαξη TR1 (π.χ. σύνολο δεδομένων στο Σχήμα 2 και περίληψη πολλαπλών πειραμάτων στον πίνακα 1). Αν τα κύτταρα διεγείρονται με 1 mM διαμιδίου, παρατηρήθηκαν μεταβολές στην κατάσταση οξειδοαναγωγής των Trx, και μια διαφορά μεταξύ των si-TR1 επεξεργασμένα κύτταρα και το si-αγωνίζομαι ήταν προφανές γεγονός που υποδηλώνει ότι η δοκιμασία ανιχνεύει αλλαγές στην οξειδοαναγωγική κατάσταση μετά από οξειδωτική πρόκληση .

στα κύτταρα χωρίς διέγερση (αριστερά τρεις λωρίδες), Trx είναι κατά κύριο λόγο στο μειωμένο κράτος, ακόμη και με TR1 νοκ-κάτω και το C-τελικό μεταλλαγμένο TR1 εκφράζεται. Με 1 mM διαμιδίου διέγερση για 30 λεπτά (δεξιά τρεις λωρίδες), κύτταρα με ενδογενείς TR1 επιδείξουν μεγαλύτερη μειωθεί Trx από τα κύτταρα με ενδογενείς TR1 νοκ-κάτω με siRNA.

Η

Από Sec ανεπάρκεια TR1 απέδειξε ενισχυμένη κυτταροτοξικότητα σε άλλα συστήματα και έτσι μία πιθανότητα ήταν ότι τα κύτταρα με το επαγώγιμο Sec ανεπάρκεια TR1 δεν πολλαπλασιάζονται σε παρόμοιο ποσοστό ως κύτταρα με ενδογενείς TR1. Μετρήσαμε το ρυθμό ανάπτυξης των κυττάρων μετά από siRNA νοκ ντάουν και επαγωγή της έκφρασης του Sec ανεπάρκεια TR1 μετρώντας τους αριθμούς πληθυσμό κυττάρων (Εικόνα 3). Η κυτταρική χρόνος διπλασιασμού για όλες τις τρεις προϋποθέσεις ήταν -24 ώρες, μετά από μια αρχική περίοδο υστέρησης. Ως εκ τούτου, αυτό το μεταλλαγμένο Sec ανεπάρκεια TR1 δεν φάνηκε να μεταβάλει την κινητική ανάπτυξη των κυττάρων RKO και χωρίς σημαντικές διαφορές στις πλαγιές των καμπυλών ανάπτυξης μετρήθηκαν (0.35 ± 0.004 κύτταρα /ώρα για si-Scramble, 0,36 ± 0,006 κύτταρα /hr για si-TR1, και 0.33 ± 0.008 κύτταρα /hr για si-TR1 συν επαγωγή του C-τερματικού μεταλλαγμένο TR1).

ένα περιπλεγμένο siRNA χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος για τη μέτρηση του βασικού ρυθμού ανάπτυξης (συμπληρώθηκε τετράγωνο) TR1 χτυπήθηκε κάτω από siRNA (γεμάτος κύκλος) και με την επαγωγή της Επιτροπής Κεφαλαιαγοράς ανεπάρκεια, C-τερματικό μεταλλαγμένο TR1 (γεμάτο τρίγωνο). Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στα ποσοστά αύξησης παρατηρήθηκαν ως συμπαγείς γραμμές που χρησιμοποιούνται για τον υπολογισμό των ρυθμών ανάπτυξης για αυτές τις συνθήκες είναι σχεδόν παράλληλες.

Η

Δεδομένου ότι η προκαλούμενη έκφραση του Sec-ανεπάρκεια C-τερματικό μεταλλαγμένο κατασκεύασμα TR1 έκανε δεν προκαλούν μία μεταβολή στην κατάσταση οξειδοαναγωγής του Τγχ, αξιολογήσαμε την κυτταροτοξική απόκριση των κυττάρων RKO με ενδογενή TR1 καθώς και κύτταρα όπου ο TR1 εξασθένισε με siRNA προς αντιδραστική οξυγόνου και αζώτου υπό μορφή H

2O

2 , το οξειδωμένο λιπίδιο 4-ΗΝΕ, ή ο δότης ΝΟ JS-Κ (Εικόνα 4). Βιωσιμότητα ακόλουθη H

2O

2 έκθεση δεν ήταν διαφορετική (Σχήμα 4Α)? η έκθεση 4-ΗΝΕ απέδειξαν μια μέτρια, περίπου 2-φορές αυξημένη ευαισθησία στα κύτταρα με TR1 νοκ-κάτω με ένα LC

50 διαφορά των 10,6 ± 0,7 μΜ στα κύτταρα με TR1 γκρέμισε έναντι 24 ± 3.4 μΜ σε τα κύτταρα με ενδογενείς TR1 (Σχήμα 4Β)? ο δότης ΝΟ, JS-Κ, επέδειξε ~ 6 φορές αυξημένη ευαισθησία στα κύτταρα με TR1 εξασθενημένα από siRNA με LC

50 διαφορά των 3.1 ± 0.5 μΜ στα κύτταρα με TR1 γκρέμισε έναντι 19 ± 2 μΜ σε τα κύτταρα με ενδογενείς TR1, όπως μετράται με μια δοκιμασία ΜΤΤ (Σχήμα 4C).

τα κύτταρα με ενδογενείς TR1 (SI-Scramble, γεμάτο τετράγωνο), και τα κύτταρα με TR1 νοκ-κάτω με siRNA (SI-TR1, γεμάτος κύκλος) συγκρίθηκαν σε ισοδύναμες δόσεις των διαμορφωτών οξειδοαναγωγής. Α) RKO κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις H

2O

2 και η βιωσιμότητα μετρήθηκε μετά από μία έκθεση 24 ωρών. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές. Β) κύτταρα RKO υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις 4-ΗΝΕ και η βιωσιμότητα μετρήθηκε μετά από μία έκθεση 24 ωρών. Τα κύτταρα si-TR1 εμφανίζεται περίπου 2-φορές αυξημένη ευαισθησία σε 4-ΗΝΕ. κύτταρα C) RKO υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις του JS-K και η βιωσιμότητα μετρήθηκε μετά από μία έκθεση 24 ωρών. Τα κύτταρα SI-TR1 εμφανίζονται ~ 6 φορές αυξημένη ευαισθησία στο JS-K.

Η

Επειδή το ΝΟ-δότης προώθησε μια πιο εμφανή διαφορά στην βιωσιμότητα μεταξύ των κυττάρων RKO με ενδογενή TR1 σε σύγκριση με τα κύτταρα με TR1 νοκ-κάτω, επιπλέον αξιολόγηση της κατάστασης κυτταρικής οξειδοαναγωγής διεξήχθησαν για να αξιολογηθεί ο μηχανισμός της ΝΟ μεσολάβηση ενισχυμένη κυτταροτοξικότητα. Πρώτον, με βάση τις σημαντικές διαφορές στην βιωσιμότητα των κυττάρων παρατηρήθηκε στην δοκιμασία ΜΤΤ, η οξειδοαναγωγική κατάσταση Τγχ αξιολογήθηκε ακολουθώντας 5 μΜ JS-K επώασης. Το JS-K κατεργασμένων κυττάρων knockdown TR1 εμφανίζεται μια πιο οξειδωμένη διανομή του Τγχ οξειδοαναγωγής μελών ακόλουθα 90 λεπτά επώαση με το ΝΟ προφάρμακο (Πίνακας 2). Στη συνέχεια, μια πιο γενικευμένη αξιολόγηση της οξειδωτικής κατάστασης των κυττάρων αξιολογήθηκε ακόλουθα 5 μΜ θεραπεία JS-Κ για 24 ώρες με μέτρηση της αναλογίας των μειωμένων GSH στα συνολικά επίπεδα GSH. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στη μειωμένη GSH με το σύνολο των GSH παρατηρήθηκαν (Σχήμα 5). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι μια παγκόσμια αλλαγή στην οξειδοαναγωγική κατάσταση δεν παρατηρήθηκε όμως ότι επιλέξτε πρωτεΐνες μπορούν να αποτελέσουν στόχο.

μετρήσεις GSH έγιναν μετά από θεραπεία με 5 μΜ JS-K για 24 ώρες., Και ο λόγος της μειωμένης GSH με το συνολικό GSH μετρήθηκε. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων θεραπείας.

Η

Για να προσδιοριστεί ο μηχανισμός πίσω από τις αλλαγές στην κυτταρική βιωσιμότητα όπως προσδιορίζεται με τη δοκιμασία ΜΤΤ, ανάλυση ανοσοστυπώματος της κασπάσης 3 και της πρωτεΐνης επιδιόρθωσης του DNA πολυ ADP ριβόζη πολυμεράση (PARP) αξιολογήθηκαν (Σχήμα 6). Διασπασμένη κασπάση 3 συνάδουν με την έναρξη της απόπτωσης και το ποσό της κασπάσης 3 διάσπασης φαίνεται να είναι πιο εκτεταμένη όταν TR1 χτυπήθηκε κάτω. Διασπασμένη PARP παρατηρήθηκε επίσης σε αυτά τα πειράματα με δοσοεξαρτώμενο τρόπο.

RKO κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με όχημα, 1,5, ή 5 μΜ JS-Κ για 24 ώρες. Η πρωτεΐνη διαχωρίστηκε με SDS-PAGE και ανιχνεύθηκαν με ανάλυση ανοσοστυπώματος. Μια αύξηση εξαρτώμενη από τη δόση σε διασπασμένη PARP και κασπάσης 3 (CASP3) παρατηρήθηκε με περισσότερο διασπασμένο υλικό στο knockdown TR1. GAPDH αξιολογήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης

Η

Απόδειξη για την έναρξη της απόπτωσης παρατηρήθηκε σε αμφότερα τα 1.5 και 5 μΜ JS-K στην ανάλυση ανοσοστυπώματος.? Ως εκ τούτου, η κυτταρική βιωσιμότητα και κυτταροτοξικότητα όπου επανεκτιμάται εξής 1.5 μΜ επώαση JS-Κ (όπου τα κύτταρα εξακολουθούν να εμφανίζονται & gt? 75% βιώσιμα, Εικόνα 4) με βάση την δραστικότητα της πρωτεάσης χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό MultiTox. Αυτή δοκιμασίες φάνηκε να είναι πιο ευαίσθητη από την δοκιμασία ΜΤΤ, δεδομένου ότι ακόμη και σε αυτή τη χαμηλή δόση, JS-K οδήγησε σε σημαντική κυτταροτοξικότητα ή /και απώλεια της βιωσιμότητας των κυττάρων knockdown TR1 (-45% βιώσιμα) σε σύγκριση με τα κύτταρα με επίπεδα ενδογενούς του TR1 (~68% βιώσιμα, Σχήμα 7Α και 7Β). Στη συνέχεια η σχετική δραστικότητα της κασπάσης-3/7 μετρήθηκε και συνεπής με τα δεδομένα κυτταροτοξικότητας, υπήρξε μια σημαντική αύξηση της δραστηριότητας κασπάσης στα κύτταρα με TR1 νοκ-κάτω (Σχήμα 7C). Σε ξεχωριστά πειράματα, το ευρύ φάσμα ανταγωνιστικό αναστολέα κασπάσης, Ζ-Asp-CH

2-DCB, περιλήφθηκε κατά την διάρκεια της επώασης με JS-K επιβεβαιώνοντας την ενζυματική δραστικότητα που παρατηρήθηκε ήταν προηγουμένως κασπάσης-εξαρτώμενη δραστικότητα.

RKO κύτταρα σε επεξεργασία με 1,5 μΜ JS-Κ για 24 ώρες. αξιολογήθηκαν για Α) βιωσιμότητα, Β) κυτταροτοξικότητα, και Γ) κασπάσης-3/7 Δράση. Σε ξεχωριστά πειράματα, τα κύτταρα επωάστηκαν με Ζ-Asp-CH

2-DCB, ένα ευρύ φάσμα, ανταγωνιστικός αναστολέας της κασπάσης, για να προσδιοριστεί ότι η δοκιμασία της κασπάσης πράγματι αποδεικνύουν δραστηριότητα τελεστή κασπάσης (C). RKO κύτταρα με TR1 νοκ-κάτω καταδεικνύουν σημαντικά μεγαλύτερες απώλειες της βιωσιμότητας, αυξημένη κυτταροτοξικότητα, και την αύξηση της κασπάσης 3-/7 δραστηριότητα μετά τη θεραπεία JS-Κ από κύτταρα RKO με ενδογενή TR1 (**, p & lt? 0,01? ***, σ & lt? 0.001? †††, σ & lt?. 0.001)

Η

Συζήτηση

Αν και τα επίπεδα σεληνοπρωτεϊνης εξαρτώνται γενικά από το σελήνιο και η έλλειψη σεληνίου εμφανίζεται να οδηγήσει σε αυξημένο κίνδυνο θνησιμότητας από καρκίνο [29] , το σύστημα TR1-Τγχ μπορεί να είναι ασυνήθιστο μεταξύ των Σεληνοένζυμα στην ικανότητά του να προάγει τον καρκίνο [8], [30]. Πράγματι, Τγχ είναι συχνά υπερεκφράζεται σε πολλούς όγκους, μπορεί να έχει αντι-αποπτωτική ιδιότητες, και μπορεί να συμβάλλουν σε ορισμένες μορφές αντίστασης θεραπεία [7], [31] – [34]. Από αυτή την άποψη, η αναστολή της TR1 είναι ένα εξαιρετικό στόχο για την αναστολή της μείωσης της θειορεδοξίνης παρουσία επιπλέον οξειδωτικού στρες. Επίσης, αρκετά συχνά χρησιμοποιούμενη θεραπευτικούς παράγοντες, όπως η σισπλατίνη, κυκλοφωσφαμίδη, δοξορουβικίνη και φαίνεται να στοχεύουν θειορεδοξίνης αναγωγάσης, καθώς και του DNA [35] – [39]. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η εξασθένηση του TR1 δεν αρκεί για να αλλάξει την κατάσταση της ανάπτυξης των κυττάρων, αλλά ότι η κατάλληλη οξειδοαναγωγικό στρες μετά από εξασθένηση του TR1 μπορεί να είναι το πιο αποτελεσματικό μέσο για την επίτευξη ενός κυτταροτοξική απάντηση.

αντιαποπτωτικού δραστηριότητα Trx έχει έχουν χωροθετούνται ως σκεπτικό για τη στόχευση του συστήματος TR-Τγχ σε ανθρώπινο καρκίνο [40], [41]. Η πρόσφατη παρατήρηση ότι το σύστημα TR-Τγχ ρυθμίζει τη δράση της κασπάσης-3 σε μια νιτροσυλίωση-εξαρτώμενο τρόπο [27] προτείνει ένα εξέχοντα ρόλο για το σύστημα TR-Τγχ στην ΝΟ-μεσολαβούμενη αποπτωτική δραστικότητα. Σε αυτό το έργο, μπορούμε επίσης να παρατηρήσουμε ότι το προφάρμακο ΟΧΙ, JS-K, αυξάνει την απόπτωση όταν TR1 είναι γκρέμισε με siRNA (σχήματα 4 και 6). Αυτός ο μηχανισμός είναι συνεπής με προηγούμενες μηχανιστική καταδεικνύοντας δεδομένα αυξημένη δραστηριότητα κασπάσης σε οξεία μυελογενή λευχαιμικά κύτταρα [42]. Επιπλέον, το ΝΟ-δότες ασπιρίνη επέδειξε συνεργική δράση όταν συνδυάζονται με ενώσεις χρυσού που περιέχουν που πιστεύεται να στοχεύει πρωτίστως το σύστημα TR-Τγχ [43].

Ο ρόλος του TR1 στην απόπτωση έχει αποτελέσει το αντικείμενο της έρευνας δεδομένου ότι αναγνωρίστηκε ως «GRIM« γονίδιο (δηλαδή, γονίδια που σχετίζονται με ρετινοειδές-ΙΡΝ-επαγόμενης θνησιμότητας, GRIM 12) σε μια οθόνη για γονίδια που σχετίζονται με ρετινοειδές-IFN-επαγόμενη απόπτωση [17]. Πιο πρόσφατα, έχει καταδειχθεί ότι TR1 πρωτεΐνη χωρίς ένα λειτουργικό υπόλειμμα Sec λόγω αλκυλίωση ή περικοπή, όταν εισάγεται σε κύτταρα χρησιμοποιώντας

BioPORTER

, επαγόμενη απόπτωση [16], [44]. Ωστόσο, οι μηχανισμοί του TR-απόπτωσης που διαμεσολαβείται από TR1 SecTRAPs παραμένουν άγνωστα. Το μεταλλαγμένο TR1 που χρησιμοποιούνται, με το C-τελικό άκρο Gly-Ser-Ser-Gly, δεν ήταν ένα λειτουργικό θειορεδοξίνης αναγωγάσης, όπως μετράται με ΝΑϋΡΗ οξειδοαναγωγής /ινσουλίνη, καθώς και μείωση λιποϊκό οξύ (Σχήμα 1)? Ωστόσο, επίσης, δεν φάνηκε να λειτουργεί ως SecTRAP αποπτωτικά εκκινητή όπως περιγράφεται από Arner και συνεργάτες [16]. Παρόμοια με την προηγούμενη έκθεση [45], θα ήταν σε θέση να προσδιορίσει τα βασικά μεταβολές στην Trx ή την κατάσταση κυτταρική οξειδωτική όταν TR1 χτυπήθηκε-κάτω με siRNA (Σχήμα 2, Πίνακας 1), αλλά σεβάστηκε αλλαγμένη Trx οξειδοαναγωγική κατάσταση μετά από θεραπεία JS-Κ ( Πίνακας 2). Επιπλέον, η έκφραση αυτού του Sec ανεπάρκεια μεταλλαγμένο TR1 δεν μετέβαλε την οξειδωτική κατάσταση του Τγχ. Ως εκ τούτου, φαίνεται ότι δεν είναι όλες οι Sec-πρωτεϊνών με ανεπαρκή TR προωθήσει το οξειδωτικό στρες και της απόπτωσης.

Στόχευση TR1 για θεραπεία του καρκίνου μπορεί να μην είναι χωρίς ανεπιθύμητες δυσμενείς επιπτώσεις εάν δεν στοχεύουν στον όγκο. Για παράδειγμα, ο καταστολέας όγκων ρ53, είναι ένας σημαντικός ρυθμιστής της κυτταρικής ανάπτυξης και της απόπτωσης, και TR1 ενισχύει τη λειτουργία ρ53, πιθανώς με τη συμβολή αναγωγικά ισοδύναμα μέσα Τγχ στο ρυθμιστή πυρηνικό οξειδοαναγωγής Ref-1 [12], [13], [46 ], [47]. Αρκετές χρησιμοποιούνται συνήθως θεραπευτικούς παράγοντες, όπως η σισπλατίνη, κυκλοφωσφαμίδη, και δοξορουβικίνη φαίνεται να στοχεύουν TR1, καθώς και του DNA [35] – [39], αλλά ίσως, μια αιτία για μερικές από τις ανεπιθύμητες ενέργειες που παρατηρούνται με αυτά τα κοινά θεραπευτικά, μπορεί να είναι η » off-στόχος «αναστολή του TR1. Μία άλλη οξειδοαναγωγική ένωση ρυθμιστικών που έχει αξιολογηθεί σε κλινικές δοκιμές του καρκίνου, motexafin γαδολίνιο, θεωρήθηκε για να στοχεύουν συγκεκριμένα TR1 [7]. Ωστόσο, motexafin γαδολίνιο φαίνεται να είναι ένα υπόστρωμα για TR1 και δημιουργεί αντιδραστικά είδη οξυγόνου μέσω αυτής της αλληλεπίδρασης καθώς επίσης και όντας ένας αναστολέας της ριβονουκλεοτιδικής ρεδουκτάσης [48]. Εάν κλινική δραστικότητα αυτής της ένωσης είναι πραγματικά οφείλεται σε αλληλεπιδράσεις του με TR1, είναι ακόμα σαφές ποια όγκοι πρέπει να στοχεύουν αφού αυτή η ένωση έχει καταδείξει τα μικτά αποτελέσματα σε κλινικές δοκιμές μέχρι σήμερα [49] – [51], αλλά φαίνεται να κατέχει ιδιαίτερη υπόσχεση ως ευαισθητοποιητής ακτινοβολίας [52], [53].

Ακόμη και με πιθανές επιπλοκές της στοχοθέτησης TR1 σε καρκίνους, τα αποτελέσματα στο παρόν δείχνουν ότι ο συνδυασμός φαρμάκων προσεγγίσεις, όπως το NO-δότη, JS-Κ, μπορεί να είναι πιο αποτελεσματική αν συνδυαστεί με παράγοντες που στοχεύουν TR1.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά |

Για προχωρημένους DMEM, Glutamax, 5,5 ‘, 6,6’-τετρα-1, 1 ‘, 3,3’-tetraethylbenzimidazolyl-καρβοκυανίνη ιωδίδιο (JC-1, MitoProbe JC-1 Assay Kit), 3- (4,5-dimethylthiaxol-2-υλ) -2,5-diphenyltretraxolium (ΜΤΤ), του Hank ισορροπημένο διάλυμα άλατος με Ca και Mg (HBSS), τρις-γλυκίνης 8% γέλες και αλβουμίνη βόειου ορού αγοράστηκαν από την Invitrogen (Carlsbad, CA). Ορός εμβρύου βοός αγοράστηκε από Hyclone (Logan, UT). Η κυτταρική γραμμή RKO αγοράστηκε από την American Tissue Type Culture Collection (Manassas, VA). Τα μονοκλωνικά αντισώματα που κατευθύνονται εναντίον θειορεδοξίνης αναγωγάσης (Β-2, SC-28321, παρτίδα # J1304)? πολύκλωνα αντισώματα που κατευθύνονται εναντίον θειορεδοξίνης (FL-105, SC-20146, παρτίδα # A1907), και GAPDH (FL-335, SC-25778)? γάιδαρος πολύκλωνα αντισώματα αντι-ποντικού και αντι-κουνελιού συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Πρόσθετες πολυκλωνικά αντισώματα που κατευθύνονται έναντι κασπάσης 3 (9661), που διασπάται κασπάσης 3 (9662), και PARP (9532) αγοράστηκαν από την Cell Signaling Technology (Beverly, ΜΑ). Βοοειδή πρότυπο αλβουμίνη ορού και Coomassie Plus Protein αντιδραστηρίων ήταν από την Pierce Biotechnology (Rockford, IL). δισκία κοκτέηλ αναστολέα πρωτεάσης (complete®) αγοράστηκαν από την Roche (Indianapolis, ΙΝ). μεμβράνη PVDF αγοράστηκε από την Millipore (Burlington, ΜΑ). Ο αναστολέας κασπάσης, Ζ-Asp-CH

2-DCB, ήταν από την Peptides International (Louisville, ΚΥ). αντιδραστήρια χημειοφωταύγειας Δυτική φωτισμός ήταν από την PerkinElmer Life Sciences (Boston, MA). JS-K συντέθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [54]. Διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) και κοινά ρυθμιστικά και τα άλατα αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ).

Κυτταροκαλλιέργεια

RKO κόλον καρκινικά κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως αντιπρόσωπος κυτταρική σειρά παχέος εντέρου και διατηρήθηκαν in Advanced ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 1% Glutamax και 2% ορό εμβρύου μόσχου. Προηγουμένως, έχουμε περιγράψει την τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση του C-άκρου του TR1 από Gly-Cys-Sec-Gly σε Gly-Ser-Ser-Gly συν μία σιωπηλή μετάλλαξη εντός της θέσεως ταυτότητα siRNA να κάνουν αυτό το κατασκεύασμα ανθεκτικοί σε siRNA που κατευθύνεται κατά τη ενδογενή TR1. Εμείς υποκλωνοποιήθηκε αυτό μεταλλάχθηκε TR1 κατασκεύασμα σε pcDNA5 /ΡΚΤ /ΤΟ και στη συνέχεια εισάγεται εντός των κυττάρων RKO με σταθερά ενσωματωμένο pcDNA6 /TR και pFRT /

lac

Zeo, καθιστώντας μια επαγόμενη με τετρακυκλίνη μεταλλαγμένο TR1 κυτταρικής γραμμής. Αυτές οι μεταλλάξεις να TR1, καθώς και την siRNA χρησιμοποιηθούν για να διαμορφώσουν ενδογενούς TR1 περιγράφηκαν προηγουμένως [13]. Πειραματικά, τα κύτταρα απλώθηκαν σε 2-3 × 10

5 κύτταρα /τρυβλίο σε 6 φρεατίων και επιμολύνθηκαν με siRNA που κατευθύνεται στο TR1 (si-TR1) ή ελέγχου που παράγονται από την αλληλουχία περίπλεξης si-TR1 (SI-Scramble) για 72 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία ή διεγέρθηκαν με τετρακυκλίνη για 24 ώρες όπως υποδεικνύεται.

ανοσοκηλιδώσεως ανάλυση

Κύτταρα σε πλάκες 6-φρεατίων τοποθετήθηκαν επί πάγου. Το μέσο αναρροφήθηκε και τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν με 1 ml ψυχρού 1 × PBS και το PBS αναρροφήθηκε. Τα κυτταρολύματα συλλέχθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [13]. Οι πρωτεϊνικές συγκεντρώσεις προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας Coomassie Plus Protein Reagent (Pierce). Η απορρόφηση στα 595 nm μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα Perkin-Elmer Victor

αναγνώστη πλάκας 3V. Δέκα έως 15 μg πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν σε είτε πηκτώματα 8% Τπδ-γλυκίνης (για TR1) ή γέλες 10% μητρική ουρία (για Τγχ), μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF, αποκλείστηκαν με 10% μη λιπαρό ξηρό γάλα, επωάστηκε με πρωτογενές αντίσωμα (1:200 για TR, 1:250 για Τγχ, 1:1000 τόσο για κασπάσης 3 και διασπασμένη κασπάση 3, 1:1000 για PARP, και 1:500 για GAPDH) όλη τη νύκτα στους 4 ° C, πλύθηκαν 3 ×, επωάστηκαν με δευτερογενές αντίσωμα (1:5000) για 45 λεπτά στους 22 ° C, πλύθηκαν 3 ×, επωάζονται με αντιδραστήρια χημειοφωταύγεια, και εκτέθηκαν σε φιλμ ακτίνων χ.

δοκιμασίες δραστηριότητας Thioredoxin αναγωγάσης

Κινητή TrxR1 δραστικότητα μετρήθηκε όπως έχει περιγραφεί προηγουμένως [13]. Επιπλέον, μετρήθηκε η μείωση λιποϊκό οξύ παρόμοια με μια δοκιμασία που περιγράφηκε προηγουμένως [55]. Εν συντομία, τα κύτταρα επιστρώθηκαν και υποβάλλεται σε επεξεργασία όπως περιγράφεται. Στη συνέχεια, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν, πλύθηκαν με PBS, και επαναιωρήθηκαν σε ένα διάλυμα 1 ml που περιέχει 5 mM γλυκόζη σε PBS, με ή χωρίς 1 mM λιποϊκό οξύ και 0.2 mM ϋΤΝΒ με ήπια ανακίνηση στους 37 ° C για 15 λεπτά. Τα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν και το υπερκείμενο δείγμα αραιώθηκε 1:01 με νερό και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 412 nm. Ο αρνητικός έλεγχος ήταν μέσο χωρίς κύτταρα. Το κυτταρικό ίζημα πλύθηκε με PBS, λύθηκαν κύτταρα σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης και η πρωτεΐνη μετρήθηκε χρησιμοποιώντας την δοκιμασία Bradford. Η μειωμένη Λιποϊκός κανονικοποιήθηκε με την περιεκτικότητα κυτταρικής πρωτεΐνης.

Redox κατάσταση του Τγχ

Η κατάσταση οξειδοαναγωγής του Τγχ διεξήχθη όπως περιγράφεται [28]. Εν συντομία, τα κύτταρα λύθηκαν σε 8 Μ ουρία ρυθμιστικό με Tris σε ρΗ 8,9 που περιέχει 30 mM ιωδοοξικό οξύ, κατεργασία με υπερήχους, και επωάστηκαν για 15 λεπτά στους 37 ° C. Η πρωτεΐνη καταβυθίστηκε με 10 όγκους παγωμένου ακετόνη-1Ν HCl (98:2, νοί /νοί), φυγοκεντρήθηκε στα 11.000 χ g για 5 λεπτά στους 4 ° C, πλύθηκε με ψυχρή ακετόνη-HCl, επαναιωρήθηκαν σε 95 μΐ ρυθμισμένου ουρία που περιέχει 35 mM DTT, επωάστηκαν για 30 λεπτά στους 37 ° C, 7,5 μΙ 200 mM ιωδοακεταμιδίου ήταν προσθέστε σε κάθε δείγμα, και επωάστηκαν για 15 λεπτά στους 37 ° C. Η συγκέντρωση της πρωτεΐνης υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο πρωτείνης Coomassie Plus.

ΜΤΤ δοκιμασία

κυτταρική βιωσιμότητα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα ΜΤΤ όπως περιγράφηκε προηγουμένως [56], το οποίο βασίζεται σε τετραζολίου μείωση άλατος με NADH σε βιώσιμα κύτταρα ( Berridge

et al.

, 2005).

Η γλουταθειόνη ποσοτικοποίηση

Μείωση της γλουταθειόνης (GSH) και το συνολικό GSH μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας αντιδραστήρια GSH-GLO (Promega). Περίπου 2,5 × 10

3 κύτταρα που είχαν προ-επωάστηκαν με siRNA που κατευθύνεται στο TR1 απλώθηκαν σε λευκό όψης 384 φρεατίων, αφέθηκαν να προσκολληθούν, και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 0 ή 5 μΜ JS-Κ για 24 ώρες. Τα μέσα απομακρύνθηκαν με φυγοκέντρηση, η μειωμένη GSH μετρήθηκε άμεσα σύμφωνα με τις οδηγίες παρασκευής, και η συνολική GSH μετρήθηκε με επώαση των κυττάρων με 1 mM TCEP να μειώσει οξειδωμένο GSH. Αυτή η δοκιμασία είναι μία δοκιμασία τρανσφεράση εξαρτώμενη γλουταθειόνης-S που χρησιμοποιεί για να δημιουργήσει GSH λουσιφερίνη ως υπόστρωμα για λουσιφεράση να παράγουν φως. Η φωταύγεια μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα Perkin-Elmer Victor

αναγνώστη πλάκας 3V.

MultiTox δοκιμασία

Η βιωσιμότητα και κυτταροτοξικότητα μετρήσεις αξιολογήθηκαν από δραστηριότητες απόκλιση πρωτεάσης χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό MultiTox-Fluor Multiplex (Promega) . Αυτή η δοκιμασία χρησιμοποιεί ένα υπόστρωμα GF-AFC που είναι κύτταρο διαπερατό για την αξιολόγηση των βιώσιμων κυττάρων, και ένα υπόστρωμα δις-AAF-R110 που δεν κυτταρική διαπερατό από την αξιολόγηση της δραστικότητας της πρωτεάσης από τα νεκρά κύτταρα. Ο φθορισμός από αυτά τα υποστρώματα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Perkin-Elmer Victor

αναγνώστη πλάκας 3V? το υπόστρωμα βιωσιμότητα GF-AFC μετρήθηκε στα 405 nm διέγερση, 475 nm εκπομπή? και το υπόστρωμα κυτταροτοξικότητα δις-AAF-R110 μετρήθηκε στα 485 nm διέγερση, 535 nm εκπομπή.

δραστικότητα Caspase δοκιμασία

δραστικότητα κασπάσης-τελεστές μετρήθηκε χρησιμοποιώντας την κασπάση-GLO 3/7 Assay ( Promega) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Αυτή είναι μια δοκιμασία όπου ένα πεπτίδιο υπόστρωμα DEVD διασπάται από ενεργό κασπάσες να απελευθερώσει aminoluciferin ως υπόστρωμα για λουσιφεράση για την παραγωγή φωτός. Φωταύγεια μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα Perkin-Elmer Victor

αναγνώστη πλάκας 3V.

Η στατιστική ανάλυση

1-way ANOVA χρησιμοποιήθηκε για να καθοριστεί η στατιστική σημαντικότητα μεταξύ των δειγμάτων (GraphPad INSTAT Έκδοση 3,06). Bonferroni πολλαπλές συγκρίσεις post hoc δοκιμασία χρησιμοποιήθηκε για να καθιερώσει σημασία μεταξύ των ομάδων θεραπείας με ρ & lt? 0,05 θεωρήθηκε σημαντική

.