Abstract

Plasma, η τέταρτη κατάσταση της ύλης, ορίζεται ως ένα μερικώς ή πλήρως ιονισμένο αέριο που περιλαμβάνει ένα μίγμα των ηλεκτρονίων και των ιόντων. Οι πρόοδοι στη φυσική πλάσματος έχουν καταστήσει δυνατή τη χρήση μη θερμικού πλάσματος ατμοσφαιρικής πίεσης (NTP) στην έρευνα για τον καρκίνο. Ωστόσο, προηγούμενες μελέτες έχουν επικεντρωθεί κυρίως σε αποπτωτικό θάνατο των καρκινικών κυττάρων διαμεσολαβείται από NTP ως πιθανή θεραπεία του καρκίνου. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε την επίδραση της ΝΤΡ σε εισβολή ή μετάσταση, καθώς και το μηχανισμό με τον οποίο το πλάσμα επάγει αντι-μετανάστευσης και αντι-εισβολής ιδιότητες σε ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές καρκίνου του θυρεοειδούς θηλώδες (BHP10-3 και TPC1). Επούλωση των πληγών, τραβήξτε προς τα κάτω, και προσδιορισμούς Transwell αποδειχθεί ότι η ΝΤΡ μειωμένη κυτταρική μετανάστευση και την εισβολή. Επιπλέον, ΝΤΡ επάγεται μορφολογικές αλλαγές και αναδιατάξεις του κυτταροσκελετού, όπως ανιχνεύεται με σάρωση ηλεκτρονικού μικροσκοπίου και ανοσοκυτταροχημεία. Εξετάσαμε επίσης μεταλλοπρωτεϊνάσης μήτρας (ΜΜΡ) -2 /-9 και ενεργοποιητή πλασμινογόνου τύπου ουροκινάσης (υΡΑ) δραστηριότητα χρησιμοποιώντας ζυμογραφία ζελατίνης, δοκιμασίες υΡΑ και RT-PCR. FAK, Src, και παξιλλίνης έκφραση ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας αναλύσεις Western blot και ανοσοκυτταροχημεία. NTP μειώθηκε FAK, Src και έκφραση παξιλλίνη καθώς δραστηριότητας MMP /υΡΑ. Εν κατακλείδι, NTP ανέστειλε την εισβολή και τη μετάσταση των κυττάρων BHP10-3 και TPC1 με τη μείωση ΜΜΡ-2 /-9 και υΡΑ δραστηριότητες και αναδιατάσσοντας τον κυτταρικό σκελετό, η οποία ρυθμίζεται από το σύμπλεγμα FAK /Src. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν νέες δράσεις για την NTP και μπορεί να βοηθήσει στην ανάπτυξη νέων θεραπευτικών στρατηγικών για την τοπική επεμβατική και μεταστατικών καρκίνων

Παράθεση:. Chang JW, Kang SU, Shin YS, Kim ΚΙ, Seo SJ, Yang SS, et al. Καρκίνος (2014) Μη-Thermal Ατμοσφαιρική πίεση Plasma Αναστέλλει θυρεοειδούς θηλώδες εισβολή των κυττάρων μέσω του κυτταροσκελετού Modulation, Altered MMP-2 /-9 /υΡΑ δραστηριότητα. PLoS ONE 9 (3): e92198. doi: 10.1371 /journal.pone.0092198

Επιμέλεια: Jian Cao, Stony Brook University, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 13, Νοεμβρίου του 2013? Αποδεκτές: 19 Φεβρουαρίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 25 Μαρτίου 2014

Copyright: © 2014 Chang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε από την Bio & amp? Ιατρική Τεχνολογία Πρόγραμμα Ανάπτυξης της NRF χρηματοδοτείται από την κυβέρνηση της Κορέας (2012M3A9B2052870). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Keunho Lee είναι ο διευθύνων σύμβουλος της PSM America Inc., αφιερωμένο ως τεχνική διαβούλευση στη συσκευή, και αυτό δεν αλλάζει προσήλωση μας στην PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

καρκίνωμα θυρεοειδούς θηλώδη είναι μία από τις πιο κοινές κακοήθειες σε όλο τον κόσμο και γενικά δείχνει νωχελικός χαρακτήρα [ ,,,0],1]. Ωστόσο, μπορεί μερικές φορές να είναι επιθετικό, με εξωκαψική εξάπλωση, λουράκι μυών, παλίνδρομου λαρυγγικού νεύρου, και τραχείας εισβολή, καθώς και μετάσταση στους λεμφαδένες. Σε σπάνιες περιπτώσεις, καρκίνο του θυρεοειδούς θηλώδης μπορεί μετάσταση σε πνεύμονες ή στα οστά [2], [3]. Η παρουσία των τοπικών ή απομακρυσμένων μεταστάσεων επηρεάζει την υποτροπή του όγκου, τα ποσοστά επιβίωσης των ασθενών και την ποιότητα της ζωής, οδηγώντας έτσι σε φτωχή πρόγνωση [4]. Ως εκ τούτου, είναι αναγκαίο να ανακαλύψει νέους τρόπους για την πρόληψη των επιθετικών χαρακτηριστικά της εισβολής και της μετάστασης στον καρκίνο του θυρεοειδούς θηλώδης.

ιατρική Plasma είναι ένα ταχέως αναπτυσσόμενο πεδίο που περιλαμβάνει μία νέα μέθοδος θεραπείας [5], [6]. Διαφορετικές πηγές πλάσματος και συσκευές πλάσματος που χρησιμοποιείται για διάφορες ενδείξεις, συμπεριλαμβανομένης της απολύμανσης [7], επούλωσης τραυμάτων [8], η πήξη του αίματος [9], και θάνατο των καρκινικών κυττάρων [10]. Εξάλλου, οι τεχνολογικές πρόοδοι επέτρεψαν την παραγωγή πλασμάτων σε θερμοκρασία δωματίου και ατμοσφαιρική πίεση (μη-θερμικό πλάσμα ατμοσφαιρική πίεση, ΝΤΡ) [10] – [12]. έχουν NTPs έχουν αναφερθεί ότι έχουν δραστηριότητες κατά του καρκίνου σε διάφορους ιστούς, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του πνεύμονα [5], ορθοκολικό καρκίνο [10] – [12], και το μελάνωμα [13], προτείνοντας μια νέα κατά του όγκου θεραπευτικής τροπικότητα. Επιπλέον, η ομάδα μας έδειξε ότι προηγουμένως ΝΤΡ προκάλεσε μία αναστολή της ανάπτυξης και καθυστερημένος εισβολή όγκου σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα [10], [11]. Ωστόσο, ο μηχανισμός κατά του καρκίνου της ΝΤΡ έχει επικεντρωθεί κυρίως σε μηχανισμούς απόπτωσης που σχετίζονται με αυξημένη αντιδραστικά είδη οξυγόνου ή ανισορροπίες οξειδοαναγωγής [14].

Tumor εισβολή στους περιβάλλοντες ιστούς ή μετάσταση σε απομακρυσμένα όργανα είναι η κυρίαρχη αιτία της θνησιμότητα σε ασθενείς με καρκίνο [15]. Ως εκ τούτου, έμφαση έχει δοθεί στην αναστολή της εισβολής του καρκίνου και της μετάστασης. Πολλές γραμμές αποδείξεως αποδεικνύουν ότι μία σύνθετη διαδικασία αλληλοεξαρτώμενων στάδια, συμπεριλαμβανομένης της μετανάστευσης των κυττάρων, εισβολή, προσκόλληση επιφάνεια, και η υποβάθμιση της εξωκυττάριας ουσίας (ECM), είναι στενά συνδεδεμένη με την εισβολή του όγκου ή /και της μετάστασης και ρυθμίζεται από εξαιρετικά πολύπλοκους μηχανισμούς [ ,,,0],16]. Προηγουμένως, προτείναμε ότι η θεραπεία ΝΤΡ μειωμένη κυτταρική μετανάστευση και εισβολή σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα [10]. Ωστόσο, οι μηχανισμοί που εμπλέκονται στο πλάσμα που προκαλείται από την αναστολή της κυτταρικής μετανάστευσης και εισβολής δεν είναι πλήρως κατανοητοί.

Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να διερευνήσει τις ανασταλτικές επιδράσεις της ΝΤΡ για τη μετανάστευση και την εισβολή των καρκινικών κυττάρων ανθρώπινης θυρεοειδούς γραμμές. Στο καλύτερο της γνώσης μας, αυτή είναι η πρώτη μελέτη αξιολογεί την αντικαρκινική επίδραση της ΝΤΡ για τη μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή συνδέονται με την διαμόρφωση του κυτταροσκελετού και τις αλλαγές του μεταλλοπρωτεϊνάσης μήτρας (ΜΜΡ) -2 /-9 /τύπου ουροκινάσης ενεργοποιητή πλασμινογόνου (υΡΑ ) δραστηριότητες.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές και τα αντιδραστήρια

Οι κυτταρικές σειρές θηλώδες καρκίνωμα του θυρεοειδούς ανθρώπινη BHP10-3 και TPC1 αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (Manassas , VA, USA). Η κανονική θυρεοειδούς κυτταρική σειρά Nthy-ori 3-1 ευγενικά παρουσιάστηκε από τον καθηγητή. Minho Τραγουδιών (Chungnam Εθνικό Πανεπιστήμιο, την Κορέα). BHP10-3 και Nthy-ori 3-1 κύτταρα διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 (Gibco, Carlsbad, CA, USA), ενώ τα κύτταρα TPC1 διατηρήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Eagle /θρεπτικό μείγμα κατά Dulbecco Ham F-12 (DMEM /F12? Gibco ), συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) και 100 U /ml πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη (Gibco). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C με 5% CO

2 υπό συνθήκες υγρασίας.

Πειραματικό προδιαγραφές του συστήματος

Όπως περιγράφηκε προηγουμένως [11], έχουμε σχεδιαστεί και κατασκευαστεί ένα σπρέι τύπου συστήματος NTP με ένα πρόσφατα σχεδιασμένο τόξο-free και αντιστατικό πιάτο που παρέχει ένα ομοιόμορφο πίδακα πλάσματος για τη βιοϊατρική έρευνα εφαρμογές. Αυτό το σύστημα εμφανίζει υψηλή απόδοση για την επιφανειακή τροποποίηση των βιο-δειγμάτων σε χαμηλές θερμοκρασίες, η οποία είναι κρίσιμη για τη βιολογική πειράματα.

Οι τεχνικές προδιαγραφές του συστήματος πλάσματος ( «πυρσό με σπρέι τύπου») που φαίνεται στα Σχ . 1Α και Β Οι προδιαγραφές της παροχής ισχύος για αυτό το σύστημα είναι 2 ελάχιστο kV, 13 kV μέγιστη, και μία μέση συχνότητα 20-30 kHz? Αυτές οι προδιαγραφές μπορεί να ποικίλει με τον τύπο και την ποσότητα του αερίου που χρησιμοποιείται. Σε αυτή τη μελέτη, το ήλιο (He) και οξυγόνο (Ο

2) χρησιμοποιήθηκαν ως αέρια-φορείς, επειδή βρήκαμε προηγουμένως ότι η προσθήκη του O

2 σε ένα πλάσμα Αυτός βελτίωσε την αποτελεσματικότητα της αναστολής των καρκινικών κυττάρων [10]. Τα φάσματα εκπομπής του πλάσματος σύμφωνα με τη δύναμη που χρησιμοποιείται σε αυτή τη μελέτη (2 ή 4 kV) φαίνεται στο Σχ. 1Β.

(Β) Τα φάσματα οπτικής εκπομπής του Αυτός και O

2 πλάσματος μίγμα αερίου σύμφωνα με την ηλεκτρική ένταση (2 ή 4 kV) στην περιοχή των 280-920 nm. (C) Εικόνα της «φακό με σπρέι τύπου» πίδακας πλάσματος με Ο και Ο

2. Η ορατή στο πλάσμα είχε μήκος περίπου 2,5 εκατοστών που μεταβάλλεται με τη ροή του αερίου και της τάσης.

Η

ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης (SEM)

Για SEM, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες και σταθερό για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου σε 4% παραφορμαλδεΰδη σε φωσφορικό ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα (PBS) (ρΗ 7.2). Οι καλυπτρίδες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17]. Τα κύτταρα εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας ένα ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης. (S-4800? Hitachi, Tokyo, Japan) που λειτουργούν σε 10 ή 15 kV

Κυτταροσκελετού χρώση

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και επανα-επιστρώθηκαν σε φιμπρονεκτίνη επικαλυμμένη καλυπτρίδες. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν για 20 λεπτά σε 3.7% φορμαλδεΰδης και επανα-ενυδατωμένο σε PBS με 0.1% Triton Χ-100. Μετά από αποκλεισμό για 45 λεπτά με PBS που περιέχει 5% BSA, τα πλακίδια επωάστηκαν με Texas-Red-συζευγμένο φαλλοειδίνη (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Hoechst 33258 προστέθηκε αιματοξυλίνης οι πυρήνες. Τα πλακίδια αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκοπία φθορισμού (Carl Zeiss, Oberkochen, Γερμανία).

Τραβήξτε προς τα κάτω δοκιμασίες (RhoA, Rac1 και Cdc42 ΘΤΡάσης δοκιμασίες ενεργοποίησης)

Για να προσδιοριστεί περαιτέρω η επίδραση του ΝΤΡ για μορφολογικές μεταβολές που επηρεάζουν την κυτταρική μετανάστευση, ένα κιτ RhoA /Rac1 /Cdc42 Δοκιμασία ενεργοποίησης Combo Biochem (Cytoskeleton Inc., York, UK) χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή με 600 μα ολικής πρωτεΐνης. Εν συντομία, σφαιρίδια συγγένειας rhotekin-RBD περιοχή τελεστή χρησιμοποιήθηκαν για να δεσμεύσει ενεργό RhoA, και χάντρες συγγένεια τομέα PAK-PBD τελεστή χρησιμοποιήθηκαν για να δεσμεύσει ενεργό Cdc42 και Rac1. Μετά από επώαση για 2 ώρες, οι πρωτεΐνες εκλούστηκαν με ρυθμιστικό Laemmli και διαχωρίστηκαν σε 12% ακρυλαμίδη /πηκτές δις-ακρυλαμίδιο. Αρνητικά και θετικά δείγματα αναφοράς διεξήχθησαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για να επιβεβαιωθεί η παρουσία του GTPases στην πρωτεΐνη κυτταρικά εκχυλίσματα, 5% ελέγχου εισόδου επίσης τρέχουν στα πηκτώματα. Τα πηκτώματα μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης, τα οποία επωάζονται όλη τη νύχτα με αντισώματα έναντι Cdc42, Rac1, και RhoA (περιλαμβάνεται στο κιτ) με ήπια ανάδευση. Οι πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ενισχυμένη χημειοφωταύγεια Western blotting kit.

επούλωσης τραυμάτων δοκιμασίες

Για τους προσδιορισμούς μετανάστευσης κυττάρων, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες καλλιέργειας 12 φρεατίων σε πυκνότητα περίπου 1 χ 10

5 /φρεάτιο και αναπτύχθηκαν σε συρροή. Επούλωσης τραυμάτων δοκιμασίες διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [10]. Εν συντομία, η μονοστιβάδα γδαρμένο με ένα στείρο ρύγχος πιπέτας, που ακολουθείται από εκτεταμένη πλύση για την απομάκρυνση κυτταρικών υπολειμμάτων. Τα κύτταρα στη συνέχεια εκτίθενται σε αέριο (He ή O

2 μόνο), 2 ή 4 kV της ΝΤΡ, αντίστοιχα, για 1 s. Οι επουλωτικές των πληγών αναλογίες τεκμηριώθηκε φωτογραφικά μετά από 24 ώρες αφού οι χρόνοι διπλασιασμού για BHP10-3 και TPC1 ήταν 30,0 ± 1,2 ώρες και 29,7 ± 0,8 ώρες, αντίστοιχα. Οι χρόνοι διπλασιασμού υπολογίστηκαν από την καμπύλη ανάπτυξης των κυττάρων σε διάστημα τριών ημερών ως εξής: (ί

2: τελικός χρόνος, t

1: αρχικό χρόνο, q

2: τελικός αριθμός των κυττάρων, q

1 : αρχικός αριθμός κυττάρων)

αναλύσεις κηλίδος Western

τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό λύσης που περιέχει 150 mM NaCl, 1,0% ΝΡ-40, 0.5% δεοξυχολικό νάτριο, 0,1% SDS, 50 mM Tris ( ρΗ 8.0), και κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (ρΗ 7.4? Roche Applied Science, Βιέννη, Αυστρία) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. Τα ακόλουθα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν για την κηλίδωση Western: αντι-κινάση εστιακής προσκόλλησης (FAK), -SRc, -Paxillin, -extracellular σήματος ρυθμίζεται κινάσης (ΕΚΚ), -Akt και -α-τουμπουλίνης (1:1000? Cell Signaling Technology , Danvers, ΜΑ, USA).

Ανοσοκυτοχημεία

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε καλυπτρίδες μικροσκοπίου (Thermo Fisher Scientific, Rochester, NY, USA) και αντιδρά με αέριο (He + O

2 ) μόνο, 2, ή 4 kV της ΝΤΡ, αντίστοιχα. Μετά από 24 ώρες, τα πλακίδια πλύθηκαν με PBS, σταθεροποιήθηκαν για 20 λεπτά σε 3.7% φορμαλδεΰδης, και την εκ νέου ενυδατώθηκαν σε PBS. Μετά από αποκλεισμό για 45 λεπτά σε BSA (σε 5% PBS), τα πλακίδια επωάστηκαν για 1 ώρα με αντι-ρ-FAK και-παξιλλίνη πολυκλωνικά αντισώματα κουνελιού (1:50? Cell Signaling Technology), πλύθηκαν με PBS, και επωάστηκαν για 45 λεπτά με αντισώματα αντι-κουνελιού Alexa 488-επισημασμένο κατσίκα (1:250? Molecular Probes). Μετά την έκπλυση σε PBS, Hoechst 33258 προστέθηκαν για 15 λεπτά της αιματοξυλίνης οι πυρήνες. Τα πλακίδια πλύθηκαν με PBS και στερεώθηκαν με Vectashield (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA) και στη συνέχεια αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκοπία φθορισμού (Carl Zeiss).

Εισβολή (Transwell) δοκιμασίες

Transwell (24-φρεατίων) θαλάμους (Costar, Cambridge, ΜΑ, USA) χρησιμοποιήθηκαν για να αξιολογηθεί κύτταρο εισβολή σύμφωνα με κατεργασία ΝΤΡ όπως περιγράφηκε προηγουμένως [10]. Αρχικά, ινονεκτίνη (2 μg /φίλτρο) διαλύθηκε σε 100 μΐ ΜΕΜ και χύνεται μέσα στο άνω τμήμα του φίλτρου πολυαιθυλενίου (μέγεθος πόρων, 8 μm) .Οι φρεάτια επικαλύφθηκαν όλη τη νύκτα σε απαγωγό στρωτής ροής.

στη συνέχεια, 10

5 κυττάρων (εντός 100 μΐ μέσου ανάπτυξης) προστέθηκαν στην κορυφή του φίλτρου στο άνω φρεάτιο. Ο θάλαμος επωάστηκε για 24 ώρες σε 5% CO

2 στους 37 ° C. Τέλος, προσκολλημένα κύτταρα στο κατώτερο τμήμα βάφτηκαν με Η &?. Ε, και μετρήθηκαν με μικροσκοπία φωτός

Η αντίστροφη μεταγραφή-αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (RT-PCR)

Ολικό RNA εκχυλίστηκε από ομογενοποιημένο κύτταρα χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA). ReverTraAce qPCR RT κύριο μείγμα (Toyobo Co. Ltd., Osaka, Japan) χρησιμοποιήθηκε για την αντίστροφη μεταγραφή του RNA. Ολικό RNA (1 μg) αναμίχθηκε με 10 μg του μίγματος. Αντίστροφη μεταγραφή εκτελέστηκε και cDNA συνετέθη. Το cDNA προστέθηκε σε ένα μίγμα από Taq Quick HS DyeMix (Toyobo Co. Ltd.) και ειδικούς εκκινητές, και ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας ένα Τ100 ™ Thermal Cycler (Bio-Rad, Waltham, ΜΑ, USA). Η μεταλλοπρωτεϊνάσης μήτρας (ΜΜΡ) -2 και ΜΜΡ-9 αλληλουχίες εκκινητών ήταν: MMP-2-F, 5′-ACC TGG ATG CCG TCG TGG AC-3 ‘? ΜΜΡ-2-R, 5’-GGC TGT AGC ACC AGG GCA GC-3 ‘? ΜΜΡ-9-F, 5’-GGG GAA GAT GCT GCT GTT CA-3 ‘? και ΜΜΡ-9-R, 5′-GGT CCC AGT GGG GAT ΤΤΑ CA-3’.After μετουσίωση για 3 λεπτά στους 94 ° C, τα δείγματα ενισχύθηκαν για 35 κύκλους των 30 s στους 94 ° C, 60 ° C, και 72 ° C, με επέκταση 5 λεπτών στους 72 ° C. Τα προϊόντα διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πηκτές αγαρόζης 1,5% και ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας υπεριώδες φως (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

Ζυμογράφημα

2 ΜΜΡ-/-9 δραστικότητα δοκιμάσθηκε χρησιμοποιώντας ζυμογραφία ζελατίνης όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19]. BHP10-3 και TPC1 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αέριο (He + O2) μόνο, 2, ή 4 kV της ΝΤΡ για 1 s, και επωάστηκαν για επιπλέον 24 ώρες. Το υπερκείμενο (100 μΐ) από κάθε δείγμα αναμείχθηκε με 1 μΙ 100 mM 4-αμινοφαινυλυδραργυρικό οξικό, και τα δείγματα ενεργοποιούνται για 1 ώρα στους 37 ° C. Στη συνέχεια, κάθε δείγμα τοποθετήθηκε σε δείγμα ρυθμιστικού για 10 λεπτά και ηλεκτροφορήθηκε σε πηκτές πολυακρυλαμιδίου στα 125 V για 120 λεπτά στους 4 ° C χρησιμοποιώντας ένα σύστημα Novex Xcell II (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Οι πηκτές επωάστηκαν σε ρυθμιστικό αναδιάταξης για 60 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, που ακολουθείται από επώαση για 18 ώρες σε 100 ml ρυθμιστικού διαλύματος ανάπτυξης στους 37 ° C με το φως ανακίνηση. Οι πηκτές στη συνέχεια χρωματίστηκαν για 3 ώρες με Coomassie brilliant blue. Μετά τον αποχρωματισμό σε 400 ml μεθανόλης, 100 ml οξικού οξέος, και 500 ml αποσταγμένου νερού, οι εικόνες ελήφθησαν χρησιμοποιώντας έναν αναλυτή εικόνας.

ενεργοποιητή πλασμινογόνου τύπου ουροκινάσης (υΡΑ) δοκιμασίες

BHP10-3 και TPC1cells (3000 κύτταρα /φρεάτιο) προστέθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων σε πλήρες μέσο που περιείχε 10% FBS. Μετά από ολονύκτια επώαση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αέριο (He + O

2) μόνο, 2, ή 4 kV της ΝΤΡ, αντίστοιχα. Οι πλάκες στη συνέχεια επωάστηκαν για άλλες 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια σε επεξεργασία όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19]. Εν συντομία, τα κύτταρα πλύθηκαν με DMEM που στερείται ερυθρό φαινόλης και τοποθετήθηκαν σε 200 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος αντίδρασης που περιείχε 50% (ν /ν) 0,05 U /ml πλασμινογόνου σε DMEM (χωρίς ερυθρό φαινόλης), 40% (ν /ν) 50 mM Τρις-ρυθμιστικό (ρΗ 8.2) και 10% (ν /ν) 2,25 mM χρωμοένζυμο PL σε 100 mM γλυκίνη. Τα μίγματα επωάστηκαν για 3 h στους 37 ° C σε 5% CO

2. Η απορρόφηση στα 405 nm μετρήθηκε με χρήση ενός αυτόματου αναγνώστη φασματοφωτομετρικής πλάκας

Στατιστικές αναλύσεις

.

Η μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) ακόλουθη δοκιμασία post hoc κατά Tukey πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας SPSS 20.0 στατιστικού λογισμικού ( SPSS, Chicago, IL, USA). Οι παράμετροι των δεδομένων από τρία ανεξάρτητα πειράματα εκφράζονται ως μέσος όρος ± S.D. Ένα

P

& lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική (*

P

& lt? 0,05? **

P

& lt? 0,01? ***

P

& lt?. 0.001)

Αποτελέσματα

ΝΤΡ προκαλεί αλλαγές στην κυτταρική μορφολογία σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του θυρεοειδούς θηλώδης

Τα επιζώντα κύτταρα που προσκολλάται στην επιφάνεια μετά από τη θεραπεία ΝΤΡ παρουσίασαν μια διαφορετική μορφολογία (σχ. 2Α και Β). κύτταρα του θυρεοειδούς θηλώδες κανονικά αναπτύσσονται σε ένα πεπλατυσμένο σχήμα, που χαρακτηρίζεται από πολλούς κυτταροπλασματική προεξοχές (ελασματοπόδια και filopodia) [20]. Μετά την επεξεργασία NTP, τα κύτταρα επέδειξαν πολύ διαφορετική μορφολογία που χαρακτηρίζεται από ένα μικρότερο και συμβατική εμφάνιση, και μειωμένη κυτταροπλασματική microspikes καταλήγοντας σε περιορισμένη εξάπλωση των κυττάρων (Σχ. 2Α).

(Α) Μετά την επεξεργασία με αέριο ( Εκείνος + O

2) μόνο, 2 ή 4 kV της ΝΤΡ για 1 s, αντίστοιχα, τα κύτταρα επωάστηκαν για 24 ώρες. Η μορφολογία των δύο κυτταρικές σειρές στη συνέχεια εξετάστηκαν με μικροσκοπία φωτός. Στις ομάδες που έλαβαν μόνο τον έλεγχο και το φυσικό αέριο, τα κύτταρα ήταν επίπεδη και επιμήκη, με ελασματοπόδια (αστερίσκος) και filopodia (βέλος) που καθιέρωσε επαφές κυττάρου-κυττάρου πλευρικά. Σε αντίθεση, τα ΝΤΡ-κατεργασμένα κύτταρα έδειξαν μορφολογικές μεταβολές που χαρακτηρίζεται από συμβεβλημένο κυτταρόπλασμα, ανέστειλε κύτταρο-προς-κύτταρο επαφή και κατήργησε κυτταροπλασματική προεξοχές (ελασματοπόδια και filopodia). (Β) SEM εικόνες επιβεβαίωσε την επίδραση της ΝΤΡ στη μορφολογία των κυττάρων. Το κυτταρόπλασμα των ΝΤΡ-κατεργασμένα κύτταρα έδειξαν συρρίκνωση και απώλεια οριζόντια πόλωση και κυτταροπλασματική προεξοχές. Επιπλέον, η επιφάνεια των κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με το πλάσμα ήταν σκληρότερες από εκείνη του ελέγχου και του φυσικού αερίου μόνο-κατεργασμένα κύτταρα. (C) δοκιμασίες ανοσοφθορισμού χρησιμοποιώντας Texas-Red-συζευγμένο phalloidin έγιναν για να απεικονίσει τον κυτταρικό σκελετό (F-ακτίνη)? Hoechst 33258 χρησιμοποιήθηκε για σήμανση πυρήνες κυττάρων. Στον έλεγχο και την αγωγή αερίου-κύτταρα, σχηματίστηκαν δέσμες συσταλτική ακτίνης (ίνες στρες) και ένα διαγώνιο πλέγμα νήμα ακτίνης. Ωστόσο, στις ΝΤΡ-αγωγή ομάδες, τα νημάτια ακτίνης διανεμήθηκαν στη συνεσταλμένη κυτταρόπλασμα καταστρέφοντας την αρχιτεκτονική του κυτταροσκελετού, και όχι ο σχηματισμός αξιοσημείωτη ίνα στρες σημειώθηκε. μπαρ κλίμακας = 50 μm. Κάθε φιγούρα ήταν αντιπροσωπευτικά τριών πειραμάτων με εις τριπλούν.

Η

σάρωσης ηλεκτρονίων μικρογραφίες των δύο κυτταρικές σειρές επιβεβαίωσε τα ανωτέρω συμπεράσματα που ελέγχουν και φυσικού αερίου κύτταρα μόνο επεξεργασμένα έδειξε μεσεγχυματικά-όπως χαρακτηριστικά με πολλές κυτταροπλασματικές προβολές. Σε αντίθεση, τα ΝΤΡ-κατεργασμένα κύτταρα είχαν περισσότερο συμπαγής κυτταρικά σώματα και τραχείες επιφάνειες των κυττάρων στα οποία τα προεξέχοντα κυτοπλασμικές διεργασίες προφανώς μειωμένη (Εικ. 2Β).

ΝΤΡ επάγει μία απορρυθμισμένη αρχιτεκτονική κυτταροσκελετικών σε ανθρώπινο καρκίνο του θυρεοειδούς θηλώδη κύτταρα

Χρησιμοποιήσαμε ανοσοκυτταροχημεία κατά ενδοκυττάρια νημάτια ακτίνης με χρωστική συζευγμένο-phalloidin και διαπίστωσε ότι η δομή του κυτταροσκελετού ακτίνης των κυττάρων του πλάσματος που έλαβαν τροποποιήθηκε. Κατά τον έλεγχο και τα κύτταρα του φυσικού αερίου-αγωγή, παρατηρήθηκαν δέσμες συσταλτική ακτίνης (ίνες στρες) και ένα διαγώνιο πλέγμα νήμα ακτίνης. Ωστόσο, τα νημάτια ακτίνης διανεμήθηκαν στη συνεσταλμένη κυτταρόπλασμα, καταστρέφοντας έτσι την αρχιτεκτονική του κυτταροσκελετού, και όχι ο σχηματισμός αξιοσημείωτη ίνα στρες παρατηρήθηκε σε ΝΤΡ-κατεργασμένα κύτταρα (Σχ. 2C).

NTP αναστέλλει τη δράση του Rho GTPases (RhoA, Rac1 και Cdc42)

Η οικογένεια Rho των GTPases είναι γνωστή για τη συμμετοχή της σε κυτταρικές λειτουργίες, όπως η κυτταρική πολικότητα, σχηματισμό ελασματοπόδια ή τΊΙοροάίβ, και τη μετανάστευση των κυττάρων. Συνεπώς, διερευνήσαμε την επίδραση της ΝΤΡ για την οικογενειακή Rho (RhoA, Rac1, και Cdc42) δραστηριότητα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3, η θεραπεία NTP μείωσε σημαντικά τις ενεργές μορφές της RhoA και Rac1.

οικογένειας Rho (Rho, Rac1 και Cdc42) δραστηριότητα αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας κιτ ανίχνευσης pull-down μετά από έκθεση σε φυσικό αέριο (He + O

2) μόνο, 2 ή 4 kV του NTP για 1 s. θεραπεία ΝΤΡ κυττάρων BHP10-3 και TPC1 μείωσε σημαντικά την έκφραση του GTP-RhoA και GTP-Rac1 (οι ενεργές μορφές αυτών των πρωτεϊνών). Κάθε φιγούρα ήταν αντιπροσωπευτικά τριών πειραμάτων με εις τριπλούν.

Η

NTP αναστέλλει τη μετανάστευση των κυττάρων μέσω του συμπλόκου FAK /Src στον ανθρώπινο καρκίνο του θυρεοειδούς θηλώδη κύτταρα

Για να διερευνηθεί αν NTP μειώνει τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων, δοκιμασίες κλείσιμο μηδέν πληγή πραγματοποιήθηκαν. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4Α και Β, τα αποτελέσματά μας αποδεικνύουν ότι η θεραπεία με πλάσμα κατέστειλε σημαντικά τη μετανάστευση των BHP10-3 (

P

& lt? 0,01) και TPC1 (

P

& lt? 0.001) κυττάρων σε όλη την απογυμνωμένη ζώνη. Η επί τοις εκατό αναστολή της κυτταρικής μετανάστευσης ήταν 48,2 και 55,4% σε BHP10-3 κύτταρα και 63,6 και 84,1% σε TPC1 κυττάρων μετά από 24 ώρες επώασης με 2 και 4 kV της ΝΤΡ, αντίστοιχα, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. Αέριο μόνο θεραπεία δεν επηρέασε σημαντικά τη μετανάστευση των κυττάρων σε κάθε γραμμή.

(Α) και BHP10-3 TPC1 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 12 φρεατίων, αναπτύχθηκαν σε συρροή και η μονοστιβάδα τραυματίστηκε με ένα ρύγχος πιπέτας. Επούλωση πληγών τεκμηριώθηκε φωτογραφικά μετά από 24 ώρες επώασης. Κλίμακα bar = 200 μm. (Β) Ποσοτικοποίηση της κυτταρικής μετανάστευσης. Το NTP ανέστειλε σημαντικά τη μετανάστευση των BHP10-3 (

P

& lt? 0.001) και TPC1 (

P

& lt? 0.001) κυττάρων σε όλη την απογυμνωμένη ζώνη. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± S.D. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. NS, μη σημαντικό? **

P

& lt? 0,01, ***

P

& lt?. 0.001

Η

Για να αξιολογηθεί περαιτέρω η επίδραση του ΝΤΡ στην κυτταρική μετανάστευση, αξιολογήσαμε πρωτεΐνη λύματα για την φωσφορυλίωση των FAK, Src, και παξιλλίνης, τα οποία είναι γνωστά για τη στενή σχέση τους με την κυτταρική μετανάστευση, εισβολή, και κυτταροσκελετική αναδιάταξη μέσω της κινάσης FAK /Src συγκρότημα [21]. Μετά τη θεραπεία NTP, παρατηρήσαμε την αναστολή της φωσφορυλίωσης της FAK και συνεπή μείωση στη φωσφορυλίωση της Src και παξιλλίνης, οι οποίες είναι προς τα κάτω του FAK (Εικ. 5Α).

(Α) κηλίδωση Western για ρ-FAK, ρ-Src, και ρ-παξιλλίνη. Η ανοσοκυτταροχημική ανίχνευση για (Β) ρ-FAK και (Γ) π-παξιλλίνη. Στον έλεγχο και την αγωγή αερίου-κύτταρα, FAK ήταν εντοπισμένη στις μικρές δομές προσκόλλησης στο κύτταρο περιφέρεια. Μετά τη θεραπεία NTP, FAK εστιακή συσσώρευση μειώθηκε σημαντικά στις δύο κυτταρικές σειρές. Επιπλέον, ρ-παξιλλίνη χρώση συν-εντοπισμένη με χρώση ρ-FAK. επεξεργασία NTP μειώθηκε επίσης π-παξιλλίνη έκφρασης. μπαρ κλίμακας = 50 μm. Κάθε φιγούρα ήταν αντιπροσωπευτικά τριών πειραμάτων με εις τριπλούν.

Η

Αναλύσαμε επίσης την ενδοκυτταρική κατανομή των φωσφορυλιωμένη (ρ) FAK και φωσφορυλιωμένη (ρ) παξιλλίνη. Κατά τον έλεγχο και αερίου κύτταρα μόνο-θεραπεία, π-FAK συσσωρευτεί σε σαφώς καθορισμένες ζώνες, συμπεριλαμβανομένων περιφέρεια του κυττάρου, ενώ μετά τη θεραπεία ΝΤΡ, χρώση ρ-FAK ήταν σημαντικά μειωμένη (Εικ. 5Β). Συν-εντοπισμό των σημάτων για ρ-παξιλλίνη και ρ-FAK παρατηρήθηκε (Σχ. 5Β και C).

ΝΤΡ αναστέλλει τον κυτταρικό εισβολή με μείωση ΜΜΡ-2 /-9 και δραστικότητα υΡΑ, και Akt και ERK σηματοδότηση σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του θυρεοειδούς θηλώδης

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η FAK ρυθμίζει εισβολή κυττάρων καθώς και τη μετανάστευση, την επιβίωση και τη μετάσταση σε μια ποικιλία κυτταρικών τύπων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του θυρεοειδούς [22], [23]. Για να διερευνηθεί αν ΝΤΡ μειώνει εισβολή όγκου, προσδιορισμούς εισβολής διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας θαλάμους Transwell και Matrigel. Όγκων εισβολή απαιτεί αποικοδόμηση της βασικής μεμβράνης και της ECM, κυτταροπλασματική επέκταση, και τη μετανάστευση των κυττάρων. Φρεατίων δοκιμασίες μιμούνται αυτό το περιβάλλον για την εισβολή του όγκου. Τα προσκολλημένα κύτταρα στο κάτω τμήμα διέρχεται μέσα από το φίλτρο του θαλάμου, υποδεικνύοντας μεταστατικών κυττάρων. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6Α, Η &? Ε-χρώση κυττάρων ήταν παρόντες στην κάτω επιφάνεια της μεμβράνης 24 ώρες μετά την επώαση. Ωστόσο, κατεργασία πλάσματος ανέστειλε σημαντικά τον αριθμό των εισβάλλοντα κύτταρα σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (

P

& lt? 0.001). (Εικ. 6Β)

(Α) και BHP10-3 TPC1 κύτταρα σπάρθηκαν σε φίλτρα (μέγεθος πόρων, 8 μm) επικαλυμμένα με Matrigel στο άνω διαμέρισμα και εκτίθεται σε Εκείνος + O

2 αέριο μόνο, 2 ή 4 kV της ΝΤΡ για 1 s. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα στους πόρους ή τα κύτταρα που συνδέονται με κάτω επιφάνεια της μεμβράνης μετρήθηκαν, και αυτά τα κύτταρα συνδέονται με το κάτω τμήμα βάφτηκαν με Η &? Ε και μετρήθηκαν με μικροσκοπία φωτός (200 Χ). Κλίμακα bar = 100 μm. (Β) Ποσοτικοποίηση των δεδομένων προσδιορισμού εισβολή. θεραπεία NTP μείωσε σημαντικά τον αριθμό των BHP10-3 (

P

& lt? 0.001) και TPC1 (

P

& lt? 0.001) κύτταρα που διείσδυσαν στην μεμβράνη. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± S.D. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01, ***

P

& lt?. 0.001

Η

Για να καταλάβετε ο μηχανισμός με τον οποίο

in vitro

, ζελατίνη zymography για 2 MMP-/-9 δραστηριότητα διεξήχθησαν εισβολή επιπτώσεις NTP όγκου. Τα αποτελέσματά μας αποκάλυψε μια αξιοσημείωτη μείωση της δραστηριότητας ΜΜΡ-2 /-9 όταν BHP10-3 και TPC1 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ΝΤΡ για 1 s (Σχ. 7Α). Για τον εντοπισμό περαιτέρω την επιρροή της ΝΤΡ σε MMPs, RT-PCR χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθεί η έκφραση του mRNA της ΜΜΡ-2 /-9. Όπως φαίνεται στο Σχ. 7Β, θεραπεία ΝΤΡ ανέστειλε σημαντικά την mRNA έκφραση ΜΜΡ-2 /-9. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι η ΝΤΡ ανέστειλε κύτταρο εισβολή μειώνοντας την μεταγραφή της ΜΜΡ-2 /-9 και την αναστολή της δραστηριότητας του υπάρχοντος ενζύμου. Το NTP ανέστειλε επίσης δραστηριότητα υΡΑ όπως αποδεικνύεται από δοκιμασίες υΡΑ (Σχ. 7C).

(Α) Ζελατίνη zymography για MMP-2 /-9. ΝΤΡ εξασθενημένος ΜΜΡ-2 /-9 ενζυματική δραστηριότητα σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές. (Β) RT-PCR για ΜΜΡ-2 /-9. Τα επίπεδα mRNA του MMP-2 /-9 μειώθηκε μετά από αγωγή ΝΤΡ στα δύο κύτταρα. Κάθε αριθμός ήταν αντιπροσωπευτικά τριών πειραμάτων με τριπλούν. δοκιμασίες (C) υΡΑ. επεξεργασία NTP μειώθηκε σημαντικά δραστηριότητας υΡΑ. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± S.D. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. NS, δεν είναι σημαντική, **

P

& lt? 0,01, ***

P

& lt? 0.001. (D) κηλίδωση Western. ERK και Akt έκφραση ήταν σημαντικά μειωμένη μετά την επεξεργασία ΝΤΡ σε ένταση-εξαρτώμενο τρόπο. Κάθε αριθμός ήταν αντιπροσωπευτικά τριών πειραμάτων με τριπλούν.

Η

Τέλος, η έκφραση της πρωτεΐνης του Akt και ERK εξετάστηκε χρησιμοποιώντας κηλίδωση Western. NTP θεραπεία ανέστειλε Akt και έκφραση ERK και στις δύο κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με τον έλεγχο ή αερίου μόνο ομάδα (Σχ. 7D).

Συζήτηση

τρέχοντα δεδομένα μας δείχνουν ότι η ΝΤΡ ασκείται μια αντικαρκινική δράση με αναστολή της μετανάστευσης των καρκινικών κυττάρων και εισβολή. NTP είναι μια πολλά υποσχόμενη και αναδυόμενες τροπικότητα στην έρευνα του καρκίνου, και έχουν αναφερθεί στο παρελθόν ότι τα αντικαρκινικά αποτελέσματα της ΝΤΡ με τη μεσολάβηση ενός διακοπής της ανάπτυξης και θανάτου των κυττάρων [10], [11]. Ωστόσο, το πρώτο σημείο επαφής μεταξύ ΝΤΡ και κυττάρων είναι η κυτταρική μεμβράνη, η οποία περιέχει διάφορες πρωτεΐνες που εκτελούν δυναμικές λειτουργίες. Ως εκ τούτου, σε αυτή τη μελέτη επικεντρώθηκε σε αλλαγές στην εμφάνιση των κυττάρων που έλαβαν χώρα στην επιφάνεια των κυττάρων μετά την αγωγή NTP. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι το πλάσμα-θεραπεία θυρεοειδούς καρκίνου των κυττάρων που χάνονται επίπεδη, ατρακτοειδή οριζόντια πόλωση και είχε μειωθεί κυτοσολικές προβλέψεις, οι οποίες είναι σημαντικές για την κυτταρική κινητικότητα και την περιβαλλοντική αίσθησης, ενώ τα κύτταρα δεν παρουσιάζουν σημαντική απόπτωση με επεξεργασία NTP (συμπληρωματική Εικόνα . S1). Αυτές οι ακτίνης που βασίζεται κυτταρική προεξοχές, που ονομάζεται ελασματοπόδια (πλέγμα ακτίνης) και filopodia (ακτινωτά προσανατολισμένα νήματα ακτίνης), που ελέγχεται από μικρές πρωτεΐνες της οικογένειας Rho πρόσδεσης GTP (Rho-ΟΤΡάσες? RhoA, Rac1, και Cdc42) [24]. Αυτές οι αυστηρές ρυθμίσεις πρωτεΐνες ελέγχουν επίσης την μεσεγχυματικά-όπως πόλωση των κυττάρων και ανακατατάξεις κυτταροσκελετική, τα οποία είναι το πρώτο βήμα στη μετανάστευση [24]. Εμείς επιβεβαίωσε την επαγωγή μορφολογικών αλλαγών από το NTP μέσω χρώσης του κυτταροσκελετού, η οποία αποκάλυψε ακτίνη αναδιάταξη των ινών. Στο σύνολό τους, μετανάστευση μας και τα δεδομένα δοκιμασίας pull-down δείχνουν ότι το πλάσμα ανέστειλε αποτελεσματικά BHP10-3 και TPC1 κυτταρική μετανάστευση, που αφορούν έτσι κυτταρικές αλλαγές μορφολογικές να κυτταροσκελετική αναδιάταξη.

FAK είναι μια κινάση τυροσίνης μη υποδοχέα που εντοπίζεται σε εστιακές συμφύσεις. FAK mRNA και η έκφραση της πρωτεΐνης είναι αυξημένη στη συντριπτική πλειονότητα των επεμβατική και μεταστατικών όγκων, συμπεριλαμβανομένου του ανθρώπινου καρκίνου του θυρεοειδούς [25]. Ωστόσο, FAK είναι ελάχιστα ανιχνεύσιμη σε φυσιολογικούς ιστούς ή μη επεμβατικές όγκους [25] – [28]. Επιπλέον, είναι ένα από τα πιο ευδιάκριτα φωσφορυλιωμένων πρωτεϊνών σε θυρεοειδή θηλώδους καρκίνου κύτταρα [29]. Μελέτες έχουν δείξει ότι FAK προάγει την κυτταρική μετανάστευση μέσω σχηματισμού συμπλόκου με Src, και επακόλουθη φωσφορυλίωση του κυτταροσκελετικών παξιλλίνη μόριο προσαρμογέας από την FAK /Src συγκρότημα [30]. Επιπλέον, παξιλλίνη συνδέεται με το τελεστή Cdc42 /Rac-στόχο, η οποία μπορεί να συνδέσει Cdc42 και Rac σε άλλες κινάσες και κατάντη στόχων [31], [32]. FAK είναι επίσης γνωστό ότι ρυθμίζει την κυτταρική μετανάστευση διαμορφώνοντας τη συναρμολόγηση και αποσυναρμολόγηση του κυτταροσκελετού της ακτίνης μέσω των αποτελεσμάτων της επί της υπο-οικογένειας των μικρών Rho GTPases [33], [34]. Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης είναι σε συμφωνία με τις εν λόγω προηγούμενες μελέτες επειδή βρήκαμε ότι η ΝΤΡ ανέστειλε σημαντικά τη μετανάστευση των κυττάρων καταστέλλοντας την έκφραση του συμπλόκου και παξιλλίνης FAK /Src σηματοδότηση, οι οποίες σχετίζονται με κυτταροσκελετική ρύθμιση.

Εκτός καλώς χαρακτηρισμένου ρόλο της στην κυτταρική μετανάστευση, ΡΑΚ σηματοδότηση συσχετίζεται με την εισβολή του όγκου με έναν αριθμό μηχανισμών [35], [36]. Για παράδειγμα, το σύστημα MMP /υΡΑ παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην αποδόμηση της ECM και είναι ζωτικής σημασίας για τη διευκόλυνση της μετανάστευσης όγκου και εισβολή κατά τη διάρκεια της μετάστασης [37]. Συνεπώς, διερευνήσαμε την επίδραση της ΝΤΡ επί των κυττάρων του όγκου εισβολή και το σύστημα FAK και ΜΜΡ /υΡΑ. Η σχέση μεταξύ FAK και της οδού ΜΜΡ-2 /-9 είχε διερευνηθεί προηγουμένως [22], [38]. αναστολή ΡΑΚ έχει αποδειχθεί ότι μειώνουν MMP-9 έκκριση σε κύτταρα καρκινώματος [39]. Επιπλέον, υΡΑ σύνδεση προς ουροκινάσης υποδοχέα ενεργοποιητή πλασμινογόνου ενεργοποιεί την μετατροπή του πλασμινογόνου σε πλασμίνη. Η ενεργοποιημένη πλασμίνη μεσολαβεί την μετατροπή της προ-ΜΜΡ προς ΜΜΡ. Ως εκ τούτου, η αναστολή της ΜΜΡ /υΡΑ είναι στενά συνδεδεμένη με τη μειωμένη ικανότητα εισβολής των καρκινικών κυττάρων. Σε αυτή τη μελέτη, τα αποτελέσματα με ζυμογραφία και RT-PCR δείχνουν ότι η θεραπεία ΝΤΡ επάγεται μείωση της MMP-2 /-9 εκφράσεις και τις δραστηριότητές τους, επίσης. Αυτά τα δεδομένα ήταν σύμφωνα με τις προηγούμενες δημοσιευμένες μελέτες στις οποίες οι εκφράσεις του προ-ΜΜΡ-2 /-9 και τις ενζυμικές τους συνδέεται στενά με το κακοήθη και /ή μεταστατικό φαινότυπο του καρκίνου [40] – [42]. Λαμβανόμενα μαζί, ρεύμα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ΝΤΡ μειώνει αποτελεσματικά καρκινικών κυττάρων διεισδυτικότητα μέσω του συστήματος /-9 /υΡΑ ΜΜΡ-2, η οποία συνδέεται με Akt και ERK signalings. Προηγούμενα δεδομένα αποκάλυψαν ότι το σύστημα MMP /υΡΑ ρυθμίζεται μέσω του PI3K-Akt και /ή ERK /signalings p38 [22], [43], [44].

Επίσης εξετάσαμε την επίδραση της NTP στο κανονική θυρεοειδούς κυτταρική σειρά (Nthy-ori 3-1). επεξεργασία NTP δεν προκάλεσε σημαντικές αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο σε φυσιολογικά κύτταρα του θυρεοειδούς (Συμπληρωματικές σύκα. S2 και S3). Επιπλέον, σε αντίθεση με τα καρκινικά κύτταρα, τα φυσιολογικά κύτταρα του θυρεοειδούς δεν παρουσιάζουν σημαντικές μορφολογικές μεταβολές (Συμπληρωματική εικ. S4) και μείωση της μετανάστευσης κυττάρων μετά από θεραπεία ΝΤΡ (Συμπληρωματική εικ. S5) προτείνοντας διαφορετική ευαισθησία στη θεραπεία ΝΤΡ μεταξύ καρκινικών κυττάρων και φυσιολογικών θυρεοειδούς κύτταρα. Αυτά τα αποτελέσματα είναι σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες, οι οποίες ανέφεραν την επιλεκτική αντικαρκινική επίδραση της επεξεργασίας πλάσματος [5], [45]. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. μπαρ κλίμακας = 50 μm.