Αφηρημένο

Η παρεκκλίνουσα γλυκοζυλίωση είναι ένα κοινό χαρακτηριστικό πολλών κακοηθειών, συμπεριλαμβανομένων του παχέος εντέρου (CRCs ). Περίπου το 15% των CRC δείχνουν το φαινότυπο μικροδορυφορική αστάθεια (MSI) που σχετίζεται με μια υψηλή συχνότητα διαλληλικών μεταλλάξεις μετατόπισης πλαισίου στην Α10 κωδικοποίησης μονονουκλεοτίδιο μικροδορυφόρων του

αυξητικός παράγοντας μετασχηματισμού βήτα υποδοχέα 2

(

TGFBR2

) γονίδιο. Αν και πόσο διαταραγμένη TGFBR2 σηματοδότηση στα κύτταρα MSI CRC επηρεάζει επιφάνεια του κυττάρου γλυκάνης μοτίβο είναι σε μεγάλο βαθμό ανεξερεύνητη. Εδώ, χρησιμοποιήσαμε το TGFBR2 ανεπάρκεια MSI καρκινώματος κόλου HCT116 κυτταρική σειρά σαν ένα σύστημα μοντέλο. Σταθεροί κλώνοι που παρέχουν δοξυκυκλίνη (DOX) -inducible έκφραση ενός ενιαίου άγριου τύπου αντίγραφο

TGFBR2

διαγονιδίου δημιουργήθηκαν από ανασυνδυάση μεσολάβηση ανταλλαγή κασέτα (RMCE). Σε δύο ανεξάρτητοι κλώνοι, ϋΟΧ-επαγώγιμη έκφραση του άγριου τύπου TGFBR2 πρωτεΐνης και την ανασύσταση της λειτουργίας σηματοδότησης του παρουσιάστηκε. Πειράματα μεταβολικής επισήμανσης με τη χρήση της προδρόμου τριτιωμένο σιαλικό οξύ

N

-ακετυλο-D-μαννοζαμίνη (ManNAc) έδειξε μία σημαντική μείωση (-30%) από την ενσωμάτωσή της σε νεοσυντιθέμενη σιελογλυκοπρωτεΐνες σε TGFBR2-εξαρτώμενο τρόπο. Συγκεκριμένα, εντοπίσαμε μια σημαντική μείωση των σιαλυλιωμένης SS1-ιντεγκρίνης μετά την ανασύσταση TGFBR2 σηματοδότησης οι οποίες δεν επηρεάζουν την SS1-ιντεγκρίνη κύκλου εργασιών πρωτεΐνη. Αξιοσημείωτα, TGFBR2 ανασύσταση δεν επηρέασε τα επίπεδα μεταγραφής οποιασδήποτε από τις γνωστές ανθρώπινες σιαλυλοτρανσφερασών όταν εξετάζεται με ανάλυση σε πραγματικό χρόνο ΚΤ- PCR. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η ανασύσταση TGFBR2 σηματοδότησης σε ένα ισογονιδιακές πρότυπο σύστημα κυτταρικής σειράς MSI μπορούν να διαμορφώσουν σιαλυλίωσης των πρωτεϊνών της κυτταρικής επιφάνειας, όπως SS1-ιντεγκρίνης. Επιπλέον, το μοντέλο μας σύστημα θα είναι κατάλληλο για την αποκάλυψη των υποκείμενων μοριακών μηχανισμών μεταβληθεί glycobiology MSI όγκου

Παράθεση:. Lee J, Ballikaya S, Schönig Κ, Μπάλα CR, Glimm Η Kopitz J, et al. (2013) του μετασχηματισμού αυξητικού παράγοντα βήτα υποδοχέα 2 (TGFBR2) Αλλαγές Σιαλυλίωση στην μικροδορυφορικού ασταθής (MSI) Καρκίνος του παχέος κυττάρων Γραμμή HCT116. PLoS ONE 8 (2): e57074. doi: 10.1371 /journal.pone.0057074

Επιμέλεια: Chih-Hsin Tang, η Κίνα Ιατρικού Πανεπιστημίου, Ταϊβάν

Ελήφθη: 17 Νοέμβρη του 2012? Αποδεκτές: 17 Γενάρη 2013? Δημοσιεύθηκε: 27 Φεβρουαρίου 2013

Copyright: © 2013 Lee et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οικονομική ενίσχυση παρασχέθηκε από DFG (GE592 /6-1) σε JK και Ι.Ο. και DFG (KFO 227) για να C.R.B. και HG Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Περίπου το 15% των κληρονομικών και σποραδικές παχέος όγκους εμφανιστεί η αστάθεια μικροδορυφορικού υψηλής συχνότητας (στο παρόν ονομάζεται MSI) φαινότυπο. MSI εκδηλώνεται ως παραλλαγές μήκος πολλών σύντομο επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες (μικροδορυφόρων) που προκαλείται από την απώλεια της φυσιολογικής επιδιόρθωσης αναντιστοιχία DNA (MMR) λειτουργία σε αυτά τα κύτταρα όγκου. Εάν MSI επηρεάζει κωδικοποίησης μικροδορυφόρων εκφρασμένων γονιδίων οι προκύπτουσες μεταλλάξεις μετατόπισης πλαισίου να οδηγήσει σε πρόωρη τερματισμό μετάφρασης και διαταραγμένη λειτουργία της πρωτεΐνης [1] – [3]. Ένας μεγάλος αριθμός γονιδίων που φιλοξενούν μικροδορυφόρων σε περιοχές κωδικοποίησης τους έχουν ταυτοποιηθεί και βρέθηκε να επηρεάζεται συχνά από μεταλλάξεις μετατόπισης πλαισίου σε MSI παχέος όγκους [4] – [7]. Οι μεταλλάξεις σε έναν περιορισμένο αριθμό από αυτά τα γονίδια που πιστεύεται ότι οδηγεί MSI ογκογένεση.

TGFBR2

είναι ένα από τα πιο ενδιαφέροντα γονίδια στόχους MSI επειδή είναι μέρος ενός κλειδιού μονοπατιού σηματοδότησης σε επιθηλιακά κύτταρα του παχέος εντέρου και βρέθηκε να αδρανοποιούνται σε υψηλή συχνότητα με διαλληλικούς μεταλλάξεις μετατόπισης πλαισίου σε MSI παχέος όγκους [8]. TGFBR2 είναι μια διαμεμβρανική κινάση σερίνης-θρεονίνης που είναι ικανή να καταστείλει τον πολλαπλασιασμό και επάγει την απόπτωση επίσης και διαφοροποίηση προκαλούνται από αυξητικός παράγοντας μετασχηματισμού βήτα (ΤΟΡ-β) ενεργοποίηση [9] – [11]. Κατά την πρόσδεση του συνδέτη ΤΟΡ-SS1 το σχηματισμό ενός συμπλόκου υποδοχέα ετερο-τετραμερείς αποτελείται από τύπου 1 (TGFBR1) και τύπου 2 (TGFBR2) υποδοχείς εκκινεί και κατάντη πρωτεΐνες όπως SMAD2 και Smad3 φωσφορυλιώνονται [10], [12] . Αυτές οι φωσφορυλιωμένες πρωτεΐνες SMAD στη συνέχεια συνδέουν με Smad4 και κατά την μετατόπιση στον πυρήνα άμεση μεταγραφή των διαφορετικών γονιδίων στόχων, όπως

Smad7

[13] ή

SERPINE

[14].

Πολλά πρωτεΐνες, ειδικά πρωτεΐνες κυτταρικής επιφάνειας, είναι γλυκοζυλιωμένη και απαιτούν γλυκάνης τροποποιήσεις για να προσδώσει την κανονική λειτουργία στην επικοινωνία των κυττάρων, την αναγνώριση και την πρόσφυση. Επιπλέον, αλλοίωση της κυτταρικής επιφάνειας γλυκοζυλίωσης έχει ενοχοποιηθεί στην ογκογένεση και τη μετάσταση [15] – [17]. Στον καρκίνο του παχέος εντέρου, η έκφραση του mRNA των διαφόρων γλυκοζυλοτρανσφερασών βρέθηκε να είναι αυξημένη σε σύγκριση με αντίστοιχο φυσιολογικό βλεννογόνο του παχέος εντέρου [18], [19]. Επιπλέον, φουκοσυλίωση των πρωτεϊνών κυτταρικής επιφάνειας έχει επίσης εμπλακεί στον καρκίνο [20]. Οι φουκοσυλοτρανσφεράσες που σχετίζονται με το σχηματισμό των καρκινικών αντιγόνων, όπως σιαλυλο-Le

x και -Le

α [21]. Το σιαλικό οξύ είναι ένα βασικό συστατικό της γλυκοπρωτεϊνών και έχει συσχετιστεί με μετάσταση [22]. Διαφορετικές τοποθέτηση του σιαλικού οξέος επί της επιφανείας του κυττάρου οδηγούν σε συγκάλυψη ή αποκάλυψη των ειδικών σακχαριτών που είναι σημαντικές για τη μετάσταση [23]. Έχει αποδειχθεί, ότι το σιαλικό οξύ συσχετίζεται με

in vivo

tumorgenicity στο CRC κυτταρική γραμμή HCT116 [24].

SS1-Ιντεγκρίνης είναι ένα μέλος μιας μεγάλης πρωτεΐνης οικογένεια πρωτεϊνών προσκόλλησης γνωστών να είναι ιδιαίτερα σιαλυλιωμένη. Οι ιντεγκρίνες είναι γλυκοπρωτεΐνες που σχηματίζουν ετερο-διμερή σύμπλοκα των α- και β-υπομονάδες που προσδίδει διαφορετικό συνδέτη συγγένειες. Από σηματοδότησης από ιντεγκρίνες συμμετέχει σε πολλές βασικές κυτταρικές διαδικασίες όπως η εστιακή πρόσφυση και κινητικότητα, μειωμένη σηματοδότηση ιντεγκρίνης έχει εμπλακεί στην μετάσταση του καρκίνου [25], [26]. Έχει αναφερθεί ότι η πρόσδεση του λεκτίνη SNA να σιαλυλιωμένες SS1-ιντεγκρίνης είναι αυξημένη σε ιστό όγκου κόλου συγκριτικά με φυσιολογικό κολονικό επιθήλιο [27]. Επιπλέον, de-σιαλυλίωση της SS1-ιντεγκρίνης δείχθηκε να διεγείρει την σύνδεση του με γλυκοπρωτεΐνες της εξωκυττάριας μήτρας [28], [29].

Αν και TGFBR2 σηματοδότηση εμπλέκεται στην επικοινωνία κυττάρου-κυττάρου, προσκόλληση κυττάρου και κυττάρου μετανάστευση του ρόλου αυτής της οδού στο πρότυπο γλυκοζυλίωσης των πρωτεϊνών κυτταρικής επιφάνειας είναι σε μεγάλο βαθμό ανεξερεύνητη. Πειραματική απόδειξη προτείνει μια πιθανή σχέση μεταξύ μεταλλαγμένα γονίδια στόχου MSI και το πρότυπο γλυκοζυλίωσης στην κυτταρική επιφάνεια [30]. Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήσαμε το TGFBR2 ανασυσταμένο MSI ορθοκολικού καρκίνου κυτταρική σειρά HCT116 ως πρότυπο σύστημα για την ανάλυση TGFBR2 εξαρτώμενη μεταβολές στην γλυκοζυλίωση πρωτεϊνών. Ανιχνεύσαμε μια μείωση στην παγκόσμια σιαλυλίωσης νεοσυντιθέμενες πρωτεϊνών αντανακλώντας έτσι την αυξημένη αντιστρόφως σιαλυλίωσης παρατηρείται σε πρωτογενείς όγκους παχέος εντέρου. Συγκεκριμένα, εντοπίσαμε TGFBR2 σηματοδότησης ως ρυθμιστής των επιπέδων σιαλυλίωσης της SS1-ιντεγκρίνης.

Υλικά και Μέθοδοι

πλασμίδια

S2F-cLM2CG-FRT3 [31] περιέχει ένα tet-ελεγχόμενη διπλής κατεύθυνσης μονάδα μεταγραφής για την ταυτόχρονη ρύθμιση των δύο γονιδίων ρεπόρτερ πυγολαμπίδας

λουσιφεράση και κόκκινη φθορίζουσα πρωτεΐνη

mCherry.

Αυτό κασέτα έκφρασης πλαγιοκοπείται από δύο θέσεις FLP αναγνώρισης ετερο-ειδικά, μια μεταλλαγμένη F3 και μια θέση φυσικού τύπου F [32]. Για ρετροϊική συναρμολόγηση, χρησιμοποιήθηκαν οι φορείς pVPack-GP και pVPack-VSV-G (Stratagene). Ο ανασυνδυασμός επιτεύχθηκε με τη μεσολάβηση του ενζύμου Flpo-ρεκομπινάσης που κωδικοποιείται από το πλασμίδιο pCAGGS-Flpo-IRES-Puro λαμβάνεται από τον Michael Hahn (DKFZ, Heidelberg). Το πλασμίδιο pE11.F3.HygTK.F [31] το οποίο κωδικοποιεί ένα φωσφοτρανσφεράσης-θυμιδίνης κινάσης (HygTK) μεταγραφική πρωτεΐνη σύντηξης υγρομυκίνη Β χρησιμοποιήθηκε για επιλογή με αντιβιοτικό και παραγωγή του κύριου κυτταρικής γραμμής HCT116-HygTK. Ο ρετροϊικός φορέας S2F-cLM2CG-FRT3-TGFBR2 δημιουργήθηκε με PCR ενίσχυση του άγριου τύπου

TGFBR2

cDNA από το πλασμίδιο έκφρασης pcDNA3.1 /His-TGFBR2 [30] με τη χρήση εκκινητών οι οποίοι φέρουν

EcoRI

ή

NotI

(ΕΕΦ) θέσεις περιορισμού (Πίνακας S1) και την αντικατάσταση του

EcoRI

/

ΝοίΙ mCherry

κομμάτι της S2F-cLM2CG-FRT3. Επαλήθευση της ορθής θέσης εισαγωγής και η αλληλουχία του άγριου τύπου

TGFBR2

γονιδίου επιβεβαιώθηκε με ανάλυση αλληλουχίας DNA.

Κυτταρικές Γραμμές

Όλες οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ (ΡΑΑ) συμπληρωμένο με 10% θερμο-απενεργοποιημένο FBS Gold (ΡΑΑ) και 100 U /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη (ΡΑΑ) χρησιμοποιώντας πρότυπες συνθήκες. Η γονική CRC HCT116 κυτταρική σειρά έχει αγοραστεί από την Ευρωπαϊκή Συλλογή Καλλιεργειών Κυττάρων (ECACC). Αυτό MMR με ανεπάρκεια κυτταρική σειρά επιδεικνύει τον φαινότυπο MSI και είναι ανθεκτική στην ΤΟΡ-β με τη μεσολάβηση σηματοδότηση λόγω διαλληλικοί μεταλλάξεις μετατόπισης πλαισίου στην Α10 κωδικοποίησης μικροδορυφόρου του ενδογενούς

TGFBR2

γονίδιο. Η HCT116 AWE17 (HCT116-Tet-On) κυτταρική γραμμή είναι μία σταθερά διαμολυσμένη παράγωγο της γονικής HCT116 κυτταρική γραμμή προσδίδει συστατική έκφραση της αντίστροφης μεταγραφικής διενεργοποιητή (rtTA) και της πρωτεΐνης EGFP [33]. Η κυτταρική γραμμή HepG2 χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος για SMAD2 σηματοδότηση. κύτταρα 293Τ αποκτήθηκαν από ATCC. Για πειράματα σήμανσης, τα κύτταρα στερήθηκαν τροφής για 17 ώρες υπό την παρουσία και απουσία 1 μg /ml ϋΟΧ (Sigma) και στη συνέχεια επωάστηκαν με 10 ng /ml ανασυνδυασμένου ΤΟΡ-SS1 (Cell Signaling) για 1 ώρα. Πειράματα επιμόλυνσης εκτελέστηκαν χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο επιμόλυνσης Fugene HD σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Roche). Αντιβιοτική επιλογή πραγματοποιήθηκε με τη χρήση υγρομυκίνης Β (Hyg, 100 μg /ml, ΡΑΑ), πουρομυκίνη (1,5 μg /ml, Sigma) και ganciclovir (Gan, 40 μΜ, Roche) για τα υποδεικνυόμενα βήματα.

Δημιουργία HCT116-TGFBR2 κύτταρα

Έχουμε εφαρμοστεί μια προσέγγιση που βασίζεται ρετροϊικό περιγράφηκε προηγουμένως [31]. Εν συντομία, 10

6 κύτταρα 293Τ συν-επιμολύνθηκαν με 3 προϊικό πλασμίδια [34], [35]. 10

5 HCT116-Tet-On κύτταρα (~ 30% συρροή) μολύνθηκαν σε ΜΟΙ 0,01 και 0,05 για να εξασφαλιστεί η ολοκλήρωση της εσωτερικής ιό αντιγραφής. Επιτυχής μετάγονται HCT116-Tet-On κύτταρα επάγονται με 0.2 μg /ml ϋΟΧ και mCherry-θετικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε διαλογή και απομονώθηκαν με FACS (On-Off-On). Ενιαία mCherry-θετικά κύτταρα επιλέχθηκαν για κλωνική επέκταση (HCT116-mCherry). Στο πρώτο στάδιο ανασυνδυασμού (RMCE), 5 × 10

5 κύτταρα HCT116-mCherry συν-επιμολύνθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων με 2 μg pE11.F3.HygTK.F πλασμίδιο που φέρει μια κασέτα έκφρασης Hyg-ΤΚ που πλαισιώνεται από δύο θέσεις ανασυνδυασμού (F3 /F) και 2 μg pCAGGS-Flpo-IRES-Puro (Σχήμα 1Α). Οι προκύπτουσες HCT116-HygTK κλώνους πλοίαρχος κυττάρων, τα οποία είναι ανθεκτικά και ευαίσθητα σε Gan (Hyg

r, Gan

s) Hyg, υποβλήθηκε σε ένα δεύτερο RMCE με αποτέλεσμα HCT116-TGFBR2 κλώνους που ανατίθενται έκφραση DOX επαγόμενο από TGFBR2 και λουσιφεράση ταυτόχρονα (Σχήμα 1Α). Ποσοτικοποίηση των επιπέδων έκφρασης DOX επαγόμενο προσδιορίστηκαν με αναλύσεις λουσιφεράσης.

(Α) Σχηματική περιγραφή του ανασυνδυασμού με τη μεσολάβηση της ανταλλαγής κασέτας (RMCE). Ρετροϊική μεταγωγή πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του φορέως προϊού S2F-cLM2CG-FRT3 που περιέχει μια αμφίδρομη ϋΟΧ-επαγόμενου υποκινητή (Ρ

tetbi) που επιτρέπει ταυτόχρονη έκφραση δύο γονιδίων σήμανσης (

λουσιφεράσης και

mCherry

) στο HCT116-mCherry κλώνους. Οι κασέτες έκφρασης που πλευρίζεται από μεταλλαγμένο (F3) και άγριου τύπου θέσεις στόχους Flp ανασυνδυαστάση-(F) που επιτρέπουν κατευθυνόμενη ανταλλαγή κασέτα μέσω Flpo-ανασυνδυάση. Οι ρετροϊικοί σήμα συσκευασίας (Ψ

+) και μακρές τερματικές επαναλήψεις (LTR) υποδεικνύονται. (Β) Χαρακτηρισμός των τόπων ιική ενσωμάτωση με nrLAM-PCR και αλληλούχιση. Στο επάνω μέρος, θέσεις ενσωμάτωσης κλώνου-ειδική και επηρεάζονται γονιδιωματικής τόπους (ανοικτό πλαίσιο ανάγνωσης (ORF)?

Αλδεΰδη αφυδρογονάση της οικογένειας 1 μέλος L1

(

ALDH1L1

)) απεικονίζονται. Στο κάτω μέρος, 5′- και 3′- οι ιικές αλληλουχίες LTR DNA (μικρά γράμματα), καθώς και οι πλευρικές γονιδιωματικές αλληλουχίες DNA (κεφαλαία γράμματα) που φαίνεται.

Η

PCR και προσδιορισμός αλληλουχίας

Τυπική PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του θερμού FIREPol DNA πολυμεράσης (Solis Biodyne) με τις ακόλουθες συνθήκες κύκλων: αρχική μετουσίωση στους 95 ° C 15 λεπτά? 35 κύκλοι των 95 ° C μετουσίωση για 30 s, 60 ° C ανόπτηση για 30 s, 72 ° C επιμήκυνση επί 1 λεπτό και ένα τελικό στάδιο επιμήκυνσης στους 72 ° C για 2 λεπτά. αλληλούχιση του DNA πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ αλληλούχισης v1.1 BigDye Terminator (Invitrogen). Η ανάλυση πραγματοποιείται σε γενετική αναλυτή ABI3100 (Applied Biosystems).

Γραμμική ενίσχυση διαμεσολαβούμενη (LAM) -PCR

Γενωμικό DNA εκχυλίστηκε από τις κυτταρικές γραμμές, σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή χρησιμοποιώντας DNeasy Blood & amp? Κιτ ιστού (Qiagen). Μη περιοριστικές (nr) LAM-PCR έγινε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [36]. Εν συντομία, 1 μg gDNA προέρχονται από μεταχθέντα κυττάρου κλώνους χρησιμοποιήθηκε για την γραμμική ενίσχυση των κόμβων γονιδιώματος φορέα με βιοτινυλιωμένο εκκινητή (Πίνακας S1). Μετά τον εμπλουτισμό των ενισχυμένων θραυσμάτων μέσω μαγνητικών σφαιριδίων, ο δεύτερος κλώνος του DNA δημιουργήθηκε. Μετά τη σύνδεση ενός γνωστού ολιγονουκλεοτιδίου προς το άγνωστο μέρος των αμπλικονίων, διεξήχθησαν δύο ένθετα εκθετική PCRs. Για περαιτέρω προετοιμασία των δειγμάτων προσαρμογείς προστέθηκαν σε αμφότερα τα άκρα των αμπλικονίων με ένα πρόσθετο εκθετική PCR για να επιτρέψει Roche 454-ειδική ενίσχυση και ανάλυση αλληλουχίας. Για παράλληλο προσδιορισμό της αλληλουχίας των διαφορετικών δειγμάτων χρησιμοποιήθηκε ένα barcode 6-10 bp. 40 ng του DNA ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας το ακόλουθο πρόγραμμα PCR: αρχική αποδιάταξη για 120 s στους 95 ° C? 12 κύκλοι στους 95 ° C για 45 s, 58 ° C για 45 s και 72 ° C για 60 s? τελική επιμήκυνση 300 s στους 72 ° C. Πρώτες ακολουθίες αμπλικόνιο LAM-PCR διαχωρίστηκαν σύμφωνα με την εισήγαγε barcode, περαιτέρω κομμένα και ευθυγραμμίζονται με την αλληλουχία του ανθρώπινου γονιδιώματος με τη χρήση BLAT (Συνέλευση Φεβρουάριος 2009) [37].

λουσιφεράσης Δοκιμασία

Η δραστηριότητα της λουσιφεράσης μετρήθηκε με το Σύστημα δοκιμασίας λουσιφεράσης (Promega) εις διπλούν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και ομαλοποιήθηκε ως προς συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίζεται με δοκιμασία Bradford (BioRad).

Ανάλυση Western Blot

κυτταρικά ιζήματα επαναιωρείται σε ρυθμιστικό RIPA (50 mM Tris-HCl ρΗ 7,4, 150 mM NaCl, 1% Triton Χ-100, 1% νάτριο-δεοξυχολικό, 0,1% SDS, 0,1 mM ΟαΟ

2 και 0.01 mM MgCl

2) . Μετά κατεργασία με υπερήχους, επώαση (1 ώρα, 4 ° C) και φυγοκέντρηση (12.000 g, 20 min, 4 ° C) συγκέντρωση πρωτεΐνης του προϊόντος λύσης μετρήθηκε με δοκιμασία Bradford. Για ανοσοστύπωση, 50 μg πρωτεΐνη διαχωρίστηκε επί 4-12% Bis-Tris Gels (NuPAGE, Invitrogen) και ηλεκτροστυπώθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Μετά τον αποκλεισμό της μεμβράνης για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (RT) σε 5% αποβουτυρωμένο γάλα /TBST (20 mM Tris-HCl ρΗ 7,5, 0,5 Μ NaCl και Tween-20 0,1%), τα ακόλουθα πρωτογενή αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν σε διάλυμα αποκλεισμού: ποντίκι αντι-TGFBR2 (SC-17799? Santa Cruz? 1:500, 4 ° C, όλη τη νύκτα)? ποντικού αντι-SS-ακτίνης (ΜΡ Biomedicals? 1:30,000, RT, 1 ώρα)? κουνελιού αντι-φωσφο-SMAD2 (Ser465 /467? Cell Signaling? 1:1000, 4 ° C, όλη τη νύκτα)? κουνελιού αντι-SMAD2 (86F7? Cell Signaling? 1:1000, 4 ° C, όλη τη νύκτα). Μετά από αρκετά στάδια έκπλυσης (10 λεπτά κάθε φορά σε θερμοκρασία δωματίου) σε TBST, τα στυπώματα επωάστηκαν με το δευτερεύον αντισώματα προβάτου αντι-ποντικού-ΙαΟ HRP (1:5000? GE Healthcare-) και κατσίκας αντι-κουνελιού-IgG HRP (1:2500? Promega) για 1 ώρα σε RT. Μετά από τρία στάδια πλύσης (10 λεπτά η κάθε μία σε RT) σε TBST, τα σήματα ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας Western Lightning Plus ECL (PerkinElmer).

Real-Time ΚΤ-ΡΟΚ

1 μg του συνολικού RNA ήταν απομονωμένος με το RNeasy κιτ (Qiagen) και αντίστροφη μεταγραφή χρησιμοποιώντας εκκινητές ολιγο-άΤ και ανάστροφης μεταγραφάσης SuperScript II σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Invitrogen). Για πραγματικό χρόνο αντίστροφη πειράματα -PCR μεταγραφής (RT), χρησιμοποιήθηκαν ειδικοί εκκινητές (Πίνακας S1 και S2) και PowerSYBR Πράσινη Master Mix (Applied Biosystems). Εις τριπλούν διαφορετικά δείγματα cDNA (-ΟΟΧ έναντι + ϋΟΧ) αναλύθηκαν στην StepOnePlus θερμο-κυκλοποιητή (Applied Biosystems) με το ακόλουθο πρόγραμμα: 95 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 40 κύκλους των 95 ° C για 15 s και 60 ° C για 1 λεπτό. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με StepOne v2.1 Software (Applied Biosystems). γονιδιακή έκφραση ήταν ομαλοποιημένη στην έκφραση των γονιδίων αναφοράς

GAPDH

και

υδροξυμεθυλοχολάνη συνθάσης

(

HMBS

).

Ο πολλαπλασιασμός Δοκιμασία

δοκιμασίες πολλαπλασιασμού MTS πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν με την CellTiter 96 κιτ Υδατικό (Promega) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Ενσωμάτωση με ραδιενεργά σημασμένη μονοσακχαρίτες

5-10 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο σπάρθηκαν εις τριπλούν σε 6-φρεατίων. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα επανα-τροφοδοτήθηκαν με 2 ml νέα μέσα που περιέχουν 0.185 MBq του αντίστοιχου

3Η-επισημασμένου σακχαρίτη (

3Η-ManNAc (

Ν

– [μαννοσαμίνη-6-

3Η]), [185-370 GBq /mmol] ή

3Η-L-φουκόζη (L-6-

3Η), [1,48 – 2,22 TBq /mmol], American Radiolabeled Chemicals, Inc.) και 10 ng /ml ΤΟΡ-SS1. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν υπό την παρουσία ή απουσία 0.5 μg /ml DOX για να ληφθεί ένα συρροή 60-80%. Μετά από 72 ώρες, τα κύτταρα πλύθηκαν 3 φορές με PBS και ξύνεται. Τα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν 5 λεπτά στις 1000 g σε RT και πλύθηκαν με PBS. Το κυτταρικό ίζημα διαλύονται σε 400 μΙ 0.2 Ν NaOH για 1 ώρα στους 56 ° C. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με δοκιμασία Lowry. Προστέθηκαν 1 μg BSA και 400 μΐ 10% TCA για να καθιζάνουν οι πρωτεΐνες με φυγοκέντρηση (10 λεπτά, 12000 g, RT) και για την απομάκρυνση μη ενσωματωμένο επισημασμένο σακχαρίτες. Το δισκίο ακολούθως εναιωρείται εκ νέου εντός 400 μΐ 1 Ν Ν & ΟΗ και εξουδετερώθηκε με 200 μΐ 2.5 Ν οξικού οξέος και αναμίχθηκε με 10 ml κοκτέιλ σπινθηρισμού (Ultima Gold? PerkinElmer). Τα δείγματα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας αναλυτή υγρού σπινθηρισμού (TRI-CARB 2900TR? Packard) και οι μετρήσεις διεξήχθησαν dpm με αυτόματη διόρθωση σβέσεως εφαρμόζοντας το μετασχηματισμένο Φασματικά Δείκτης του εξωτερικού προτύπου /Αυτόματες Απόδοσης Ελέγχου μέθοδο (tSIE /AEC). Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως DPM και κανονικοποιούνται σε ποσότητα πρωτεΐνης (mg).

ραδιενεργή σήμανση και SS1-Ιντεγκρίνης ανοσοκατακρήμνιση (ΙΡ)

Για την διπλή σήμανση με τη χρήση

35S-L-μεθειονίνη [37 TBq /mmol] (American Radiolabeled Chemicals, Inc.) και

3Η-ManNAc, 1-2 × 10

6 κύτταρα σπάρθηκαν εις τριπλούν σε πλάκες των 10 cm. Μετά από 24 ώρες, το μέσο αντικαταστάθηκε με 5 ml νέου μέσου που περιέχει 1,11 MBq του

3Η-ManNAc, 0,37 MBq του

35S-L-μεθειονίνη και 10 ng /ml ΤΟΡ-SS1. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε παρουσία ή απουσία 0.5 μg /ml DOX. Μετά από 72 ώρες, τα κύτταρα πλύθηκαν 3 φορές με PBS και ξύνεται. Τα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν 5 λεπτά σε 1000 g στους 4 ° C και πλύθηκαν με PBS. Το σφαιρίδιο επαναιωρήθηκε σε 150 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος RIPA. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε υπερήχους και επωάστηκαν 1 ώρα στους 4 ° C ενώ περιστρέφεται. Μετά από φυγοκέντρηση στους 4 ° C για 30 λεπτά σε 12,000 g το προκύπτον κυτταρόλυμα χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης πρωτεΐνης με δοκιμασία Bradford. Για SS1-ιντεγκρίνης IP, 1,6 mg λύμα επωάστηκε με 1.7 μg SS1-ιντεγκρίνης αντίσωμα (P5D2 από DSHB, Αϊόβα) σε ένα όγκο 300 μΐ για 2 ώρες στους 4 ° C. Ως έλεγχος για μη ειδική σύνδεση με τα σφαιρίδια, κάθε κύτταρο κλώνος επωάστηκε χωρίς το αντίσωμα σε παρουσία ή απουσία της ΔΟΞ και απαριθμήσεις αφαιρέθηκαν από τα αποτελέσματα. 25 μΙ πρωτεΐνης Α /G αγαρόζης (Oncogene) πλύθηκαν 3 φορές με 1 ml ρυθμιστικό RIPA και στη συνέχεια επωάστηκαν με το προϊόν της λύσης και το αντίσωμα όλη τη νύκτα με περιστροφή στους 4 ° C. Τα σφαιρίδια πλύθηκαν 5 φορές με 500 μΙ RIPA ρυθμιστικού και εκλούστηκε με 2 χ 200 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος 1χ δείγματος πρωτεΐνης (106 mM Tris-HCl, 141 mM βάση Tris, 2% SDS, 10% γλυκερόλη, 0.51 mM EDTA) στους 99 ° C για 5 λεπτά. Τα δείγματα αναμίχθηκαν με 10 ml κοκτέιλ σπινθηρισμού και μετρήθηκαν με έναν αναλυτή luquid σπινθηρισμού εφαρμόζοντας την tSIE /AEC μέθοδο. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως dpm. Ως έλεγχος για μη ειδική δέσμευση του έκλουσης της ΠΕ αναλύθηκε με SDS-PAGE και επακόλουθη χρώση με SYPRO-Ruby (Invitrogen). Παράλληλα, οι αντίστοιχες ζώνες ανιχνεύθηκαν με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας ένα SS1-ιντεγκρίνης αντίσωμα (ΟβΙΙ Signaling) (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Για το πείραμα παλμού-εκδίωξης, τα κύτταρα σπάρθηκαν και υποβλήθηκε σε επεξεργασία όπως περιγράφηκε παραπάνω, δονήθηκαν για 72 ώρες με 1,11 MBq

35S-L-μεθειονίνη /5 ml φρέσκου μέσου και στη συνέχεια συλλέχθηκαν σε 5 διαφορετικά χρονικά σημεία (0h, 4h, 8h , 16h, 24h, Chase). Ακολούθως, τα κύτταρα λύθηκαν όπως περιγράφεται ανωτέρω. 1,5 mg λύμα επωάστηκε με 1.3 μg SS1-ιντεγκρίνης σε ένα συνολικό όγκο 300 μΙ RIPA ρυθμιστικό διάλυμα και περιστράφηκε για 2 ώρες στους 4 ° C. Μετά την προσθήκη της πρωτεΐνης Α /G αγαρόζης, τα δείγματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφεται παραπάνω.

Αποτελέσματα

Δημιουργία δοξυκυκλίνη επαγόμενο κλώνοι HCT116-mCherry

Για να διερευνηθεί TGFBR2- μεταβολές που εξαρτώνται από πρωτεΐνη γλυκοζυλίωσης, επιδιώξαμε να δημιουργήσει ένα πρότυπο σύστημα του παχέος κυτταρική σειρά καρκίνου MSI που επιτρέπει επαγώγιμη ανασύσταση της έκφρασης TGFBR2 σε μια ισογενετικών φόντο. Σε γενικές γραμμές, το σύστημα αυτό αντικατοπτρίζει αντίστροφα την κατάσταση των πρωτογενών MSI ορθοκολικών όγκων που έχουν χάσει έκφραση TGFBR2 κατά την διάρκεια της προόδου του όγκου. Ως πρώτο βήμα, η MSI κυτταρική σειρά HCT116-Tet-On που εκφράζει συστατικώς το DOX-ρυθμιζόμενη rtTA [33] έχει τροποποιηθεί γενετικά από μεταγωγή με αυτο-αδρανοποίηση ρετροϊούς που εκφράζουν tet ελεγχόμενη λουσιφεράσης και mCherry (S2F-cLM2CG-FRT3) σε χαμηλή πολλαπλότητα μόλυνσης (ΜΟΙ) για να ευνοήσει την ενσωμάτωση ενός αντιγράφου. Ποσοτική ανάλυση σταθερών κλώνων ταυτοποιήθηκαν δύο κλώνοι HCT116-mCherry (# 5 και # 22) με 40-70-πλάσια ϋΟΧ ρυθμιζόμενη επαγωγή της έκφρασης του γονιδίου ρεπόρτερ όπως προσδιορίζεται με δοκιμασίες λουσιφεράσης. Ταυτοποίηση και μοριακός χαρακτηρισμός των θέσεων ρετροϊική ενσωμάτωση με nrLAM-PCR και αλληλούχιση επιβεβαίωσε ότι μόνο ένα αντίγραφο είχε εισαχθεί. Ενσωμάτωση του

λουσιφεράσης-mCherry

κασέτα έκφρασης εντοπισμένη στα χρωμοσώματα 1 (

C1orf159)

για τον κλώνο # 5 και στο χρωμόσωμα 5 (

ALDH1L1

) για τον κλώνο # 22, αντίστοιχα (Εικόνα 1Β). Το πιο σημαντικό, ολοκληρωμένο κασέτες έκφρασης δεν μετέβαλε την ανάπτυξη των HCT116-mCherry κλώνων σε σύγκριση με τους HCT116-Tet-On προγόνους. Για την άμεση εισαγωγή και DOX-επαγόμενη έκφραση του

TGFBR2

διαγονιδίου σε ακριβώς αυτές τις γονιδιωματικές θέσεις, θα επιδιωχθεί μια στρατηγική σε δύο στάδια (Σχήμα 1Α). Σε ένα πρώτο βήμα ανασυνδυασμού, η

λουσιφεράσης-mCherry

κασέτα αντικαταστάθηκε από μία κασέτα έκφρασης που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη σύντηξης Hyg-ΤΚ δημιουργώντας έτσι δύο master κυτταρικές σειρές HCT116-HygTK # 5 και # 22 που επιτρέπουν την ενσωμάτωση οποιουδήποτε γονιδίου ενδιαφέροντος σε αυτά τα δύο γονιδιωματική τόπους. Κατά συνέπεια, αντικαταστήσαμε το

HygTK

κασέτα έκφρασης σε ένα δεύτερο RMCE από ένα

λουσιφεράσης-TGFBR2

κασέτα έκφρασης με αποτέλεσμα HCT116-TGFBR2 κλώνοι # 5 και # 22, οι οποίες χαρακτηρίστηκαν και χρησιμοποιήθηκαν για τις επόμενες αναλύσεις .

Χαρακτηρισμός των HCT116-TGFBR2 κλώνοι

στη συνέχεια, αναλύσαμε αυτά τα κύτταρα HCT116-TGFBR2 με περισσότερες λεπτομέρειες. Λουσιφεράσης ανάλυση αποκάλυψε ότι τα επίπεδα επαγωγής του γονιδίου αναφοράς, που αρχικά ελήφθη σε κύτταρα HCT116-mCherry (40-70 φορές), ανιχνεύθηκαν επίσης σε κύτταρα HCT116-TGFBR2. Αυτό αποκλείει οποιαδήποτε αποτελέσματα της στρατηγικής που RMCE βάση ή την κασέτα έκφρασης που χρησιμοποιείται για την επαγωγιμότητα του συστήματος μας μοντέλου. Επιπλέον, όταν χρησιμοποιήσαμε μεταγραφής-ειδικούς εκκινητές σε πραγματικό χρόνο ανάλυση RT-PCR για να συγκριθεί η έκφραση του ενδογενούς μεταλλαγμένου Α9

TGFBR2

μεταγραφής, το διαγονιδιακό Α10

TGFBR2

άγριου τύπου μεταγραφής ή και τα δύο μεταγραφές κατά την έκθεση DOX, καμία αλλαγή στην ενδογενή

παρατηρήθηκε TGFBR2

επίπεδο μεταγραφής. Αντ ‘αυτού, η θεραπεία DOX οδήγησε σε ισχυρή επαγωγή των διαγονιδιακών

TGFBR2

άγριου τύπου μεταγραφής (Σχήμα 2Α). Για να αποκλειστεί, ότι το ανασυσταθέν

TGFBR2

γονίδιο άγριου τύπου θα μπορούσε να αποκτήσει παρόμοιες μεταλλάξεις αδρανοποίησης λόγω της έλλειψης της λειτουργίας του DNA MMR σε αυτά τα κύτταρα, εμείς αλληλουχία μεταγραφής ειδικών

TGFBR2

cDNAs και ταυτοποιείται αποκλειστικά Α9 μεταλλαγμένες ή Α10 επαναλήψεις άγριου τύπου στην ενδογενή ή διαγονιδιακών

TGFBR2

μεταγραφές, αντίστοιχα. Έτσι μετάλλαξης αδρανοποίηση του ανασυσταθέντος

TGFBR2

διαγονιδίου σε αυτές τις MSI και MMR ανεπάρκεια κλώνους HCT116-TGFBR2 θα μπορούσε να αποκλειστεί. Εκτός από αυτές τις αναλύσεις μεταγραφής, εξετάσαμε επίσης την επαγωγιμότητα και τη λειτουργικότητα της πρωτεΐνης TGFBR2 με ανοσοκηλίδωση. Σε περίπτωση απουσίας της ΔΟΞ, καμία πρωτεΐνη TGFBR2 ανιχνεύθηκε ενώ παρουσία του DOX, παρατηρήθηκαν συγκεκριμένες ζώνες πρωτεΐνης TGFBR2 του αναμενόμενου εύρους μεγέθους (75 kDa). Όταν διεξήχθη ανάλυση χρονικής πορείας, τα επίπεδα πρωτεΐνης TGFBR2 έφθασε στο υψηλότερο σημείο μέσα σε 6 ώρες αλλά στη συνέχεια μειώθηκε κατά 24 έως 48h (Σχήμα 2Β). Για την απόδειξη της λειτουργικότητας του ανασυσταθέντος πρωτεΐνης TGFBR2, ερευνήσαμε την ικανότητα σηματοδότησης της. Κατά συνέπεια, η φωσφορυλίωση του SMAD2, το πρώτο καθοδικός τελεστής του TGFBR2 σηματοδότησης, εξετάστηκε με ανάλυση κηλίδος Western (Σχήμα 3Α). Εν απουσία έκφρασης TGFBR2 (-ΟΟΧ), κατεργασία του ΤΟΡ-SS1 επάγεται ένα βασικό επίπεδο pSMAD2 στις δύο γονικά κύτταρα HCT116-Tet-on και HCT116-TGFBR2. Ωστόσο, όταν η έκφραση TGFBR2 επήχθη (+ DOX) παρουσία του συνδέτη, ΤΟΡ-SS1, μια σημαντική αύξηση των επιπέδων pSMAD2 πέρα ​​παρατηρήθηκε το βασικό επίπεδο. Επίσης, αναλύσαμε το αν αυτά

TGFBR2

-reconstituted κύτταρα είναι ικανά να ρυθμίζουν τη μεταγραφή αρκετών γνωστών γονιδίων στόχων TGFBR2 όπως

Smad7

και

SERPINE

. Σε πραγματικό χρόνο ανάλυση RT-PCR αποκάλυψε DOX-εξαρτώμενη

Smad7

και

SERPINE

ρύθμιση προς τα πάνω και έτσι επιβεβαιώνεται η κανονική δραστηριότητα σηματοδότησης (Εικόνα 3Β). Επιπλέον, ο πολλαπλασιασμός μειώνεται όταν σηματοδότηση TGF-β1 έχει επιτευχθεί σε κύτταρα HCT116-TGFBR2 κατόπιν DOX και ΤΟΡ-SS1 θεραπεία σε σύγκριση με τα κύτταρα HCT116-TGFBR2 εκτίθενται σε ΤΟΡ-SS1 απουσία DOX. Ωστόσο, ο πολλαπλασιασμός παρέμεινε ανεπηρέαστη μεταξύ μη επαγόμενο (-ΟΟΧ) και προκαλούμενη από (+ DOX) γονική HCT116-Tet-κύτταρα ή HCT116-TGFBR2 – κυττάρων απουσία του συνδέτη του ΤΟΡ-SS1 (σχήμα S1A) (/+ DOX). Κανένα από αυτά τα κύτταρα έδειξαν κάποια μορφολογικές αλλοιώσεις (Σχήμα S1B). Συνολικά, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι και οι δύο κλώνοι TGFBR2 εκφράζουν λειτουργικά ανέπαφη πρωτεΐνη TGFBR2 και επιδεικνύουν σωστή σηματοδότηση TGFBR2 μεσολάβηση.

(Α) σε πραγματικό χρόνο RT-PCR ανάλυση της ενδογενούς μεταλλαγμένου (Α9), διαγονιδιακά άγριου τύπου (Α10 ) ή και τα δύο

οι TGFBR2

μεταγραφές εν απουσία και παρουσία της ΔΟΞ (1 μg /ml) απεικονίζεται. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο τριών ανεξάρτητων παρατηρήσεων ± Τ.Α. (Β) ανάλυση κηλίδας Western, καταδεικνύοντας την παρουσία του DOX-επαγώγιμου (1 μg /ml) έκφραση TGFBR2 σε έναν χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Τα δεδομένα δείχνονται για HCT116-TGFBR2 κλώνος # 5, αλλά επίσης να εφαρμόζονται για την κλωνοποίηση # 22 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Η

(Α) Φωσφορυλίωση SMAD2 (pSMAD2) ανιχνεύθηκε με ανάλυση στυπώματος Western. Η θεραπεία με DOX (1 μg /ml) και ΤΟΡ-SS1 (10 ng /ml) που εμφανίζονται υψηλότερα επίπεδα pSMAD2 σε σύγκριση προς κύτταρα που αναπτύσσονται απουσία της ΔΟΞ. Η γονική κυτταρική σειρά HCT116 χρησίμευσε ως αρνητικός έλεγχος, ενώ ο ΤΟΡ-SS1 κύτταρα αποκρίνονται HepG2 χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος. Σύνολο SMAD2 έχει χρησιμοποιηθεί ως έλεγχος φόρτωσης. (Β) τη μεταγραφή γονιδίων-στόχος του TGFBR2 σηματοδότησης. Σε πραγματικό χρόνο πειράματα RT-PCR αποκάλυψε DOX-εξαρτώμενη

Smad7

και

SERPINE

ρύθμιση προς τα πάνω. Τα δεδομένα δείχνονται για HCT116-TGFBR2 κλώνος # 5, αλλά επίσης να εφαρμόζονται για την κλωνοποίηση # 22 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Οι τιμές αντιπροσωπεύουν το μέσο τριών ανεξάρτητων πειραμάτων ± SD

Η

TGFBR2-εξαρτώμενη Μεταβολές γλυκανών

Από τη στιγμή που δεν εντοπίζονται τυχόν αλλαγές στα επίπεδα σταθερής κατάστασης των πρωτεϊνών της κυτταρικής επιφάνειας με λεκτίνη FACS ανάλυση (Εικόνα S2) και λεκτίνη-κηλίδωση Western (Σχήμα S3), πραγματοποιήσαμε ραδιενεργά πειράματα σήμανσης με τη χρήση δύο ανεξάρτητων

3Η-σημασμένο μονοσακχαρίτες, ManNAc και L-φουκόζη. Με αυτή την προσέγγιση εστιάσαμε τις μετρήσεις μας την νεοσυντιθέμενη γλυκοπρωτεΐνες. Σε αρχικά πειράματα, εξετάστηκαν διαφορετικές χρονικές περιόδους (24, 48 και 72 ώρες). Η ενσωμάτωση του

3Η-ManNAc, έναν πρόδρομο του σιαλικού οξέος, αυξήθηκε με την πάροδο του χρόνου με μια κορυφή στους περίπου 72 ώρες. Κατά την έκθεση DOX και προσθήκη του ΤΟΡ-SS1 για 72 ώρες, σε σημαντική μείωση του ενσωματώνεται

3Η-ManNAc εμφανίστηκαν σε δύο κλώνους TGFBR2 αλλά όχι στην γονική κυτταρική γραμμή Tet-On (Σχήμα 4Α). Ως εκ τούτου, αναλύσαμε τα 20 γνωστά σιαλυλοτρανσφερασών και δύο σιαλιδασών (Neu1 και Neu3) σε πραγματικό χρόνο RT-PCR σε 24, 48 και 72 ώρες μετά την επαγωγή (Πίνακας S2). Ωστόσο, δεν ήμασταν σε θέση να ανιχνεύουν τυχόν αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης του mRNA (Σχήμα S4). Re-έκφραση του TGFBR2 οδήγησε σε σημαντική μείωση της πρωτεΐνης φουκοσυλίωση σε μία από τις δύο κλώνων χρησιμοποιώντας

3Η-L-φουκόζη (Σχήμα 4Β). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι TGFBR2 ρυθμίζει σιαλυλίωσης

de novo

πρωτεΐνες.

Τα ραδιενεργά πειράματα επισήμανσης διεξήχθησαν με την παρουσία και απουσία του DOX (0,5 μg /ml) και με έκθεση σε ΤΟΡ-SS1 ( 10 ng /ml) για 72 ώρες. (Α) Η επώαση με

3Η-ManNAc οδήγησε σε σημαντική μείωση της ενσωματωμένης ManNAc στο TGFBR2 κλώνους # 5 και # 22, αλλά όχι στην γονική κυτταρική γραμμή HCT116-Tet-On. (Β) Ενσωμάτωση

3Η-L-φουκόζη ήταν ελαφρώς μειωμένη παρουσία της DOX σε δύο κλώνους TGFBR2 σε αντίθεση με HCT116-Tet-On κύτταρα. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο τριών ανεξάρτητων πειραμάτων ± SD

Η

SS1-ιντεγκρίνης Έκφραση και Σιαλυλίωση

Δεδομένου ότι είναι γνωστό ότι η SS1-ιντεγκρίνης είναι μια εξαιρετικά σιαλυλιωμένη πρωτεΐνη της οποίας η έκφραση μεταβάλλεται από TGF -ß1 [38], μπορούμε επόμενο εξέτασε κατά πόσον SS1-ιντεγκρίνης σιαλικυλίωση μπορεί να επηρεαστεί από την έκφραση TGFBR2 και σηματοδότηση. Με βάση την παρατήρηση μας ότι TGFBR2 φαίνεται να ρυθμίζει μόνο σιαλυλίωσης

de novo

πρωτεΐνες, εκτελέσαμε ραδιενεργά πειράματα διπλής σήμανσης (

3Η-ManNAc και

35S-L-μεθειονίνη) για να καθορίσει την ενσωμάτωση της σιαλικό οξύ και ως έλεγχος η σύνθεση του SS1-ιντεγκρίνης σε TGFBR2-επαγόμενα κύτταρα (Σχήμα 5). Μετά την επισήμανση για 72 ώρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και SS1-ιντεγκρίνης ήταν ανοσο-καταβυθίστηκε. Ενώ ανασυσταθεί σηματοδότηση TGFBR2 οδήγησε σε αυξημένη έκφραση του SS1-ιντεγκρίνης mRNA (2 φορές) (δεν φαίνεται) και πρωτεΐνη όπως προσδιορίζεται από μεταβολική σήμανση (Σχήμα 5Α), η ενσωμάτωση των ManNAc έδειξαν TGFBR2 εξαρτώμενη μείωση (Σχήμα 5Β). Με την ομαλοποίηση την ενσωμάτωση σιαλικού οξέος προς SS1-ιντεγκρίνης σύνθεσης η επίδραση του TGFBR2 στην SS1-ιντεγκρίνης μπορεί να απεικονισθεί περισσότερο εντυπωσιακά, φαίνεται στο Σχήμα 5C. Προκειμένου να καθοριστεί αν η επίδραση της TGFBR2 στην έκφραση SS1-ιντεγκρίνης οφείλεται στην επίδραση των τροποποιημένων σιαλυλίωσης σε SS1-ιντεγκρίνης σταθερότητα, ένα πείραμα παλμού έγινε. Όπως υποδεικνύεται στο Σχήμα 5ϋ την ημιζωή του SS1-ιντεγκρίνης πρωτεΐνη ήταν περίπου 16 ώρες και το ποσοστό αυτό του κύκλου εργασιών παρέμεινε αμετάβλητο με την παρουσία ή απουσία της έκφρασης TGFBR2. Συνολικά, τα στοιχεία αυτά δείχνουν ότι TGFBR2 σηματοδότηση ρυθμίζει την σιαλυλίωσης του

de novo

πρωτεϊνών γενικά και της SS1-ιντεγκρίνης ιδίως χωρίς να επηρεάζει τον κύκλο εργασιών της.

(Α-Γ) Διπλή σήμανση των κυττάρων με

3Η-ManNAc και

35S-L-μεθειονίνη πραγματοποιήθηκε σε παρουσία και απουσία του DOX (0,5 μg /ml) και με την παρουσία του ΤΟΡ-SS1 (10 ng /ml) για 72 ώρες.