Αφηρημένο

Επιγενετική απενεργοποίηση της χρωματίνης παίζει σημαντικό ρόλο στον καθορισμό του φαινοτύπου των κυττάρων σε φυσιολογικά και καρκινικά κύτταρα, αλλά οι γνώσεις μας εξακολουθεί να είναι ελλιπής σε σχέση με οποιαδήποτε πιθανή μο- νοαλληλική φύση του φαινομένου. Έχουμε γονότυπος DNA που απομονώθηκε από χρωματίνη δύο ορθοκολικού καρκίνου που προέρχεται από τις γραμμές και μία καλλιέργεια φυσιολογικών ανθρώπινων εντερικών επιθηλιακών κυττάρων (HIEC), που ανοσοκαταβυθίστηκε με αντισώματα προς ακετυλιωμένη εναντίον μεθυλιωμένο H3K9 ιστόνης, και παρουσίασε τα δεδομένα ως διαφορές συχνότητας αλληλόμορφου Β επί πολλαπλές πολυμορφισμό μονού νουκλεοτιδίου (SNP) κινητούς μέσους όρους παράθυρο. [Αλληλόμορφο Β είναι ένα αυθαίρετο όρος ορίζεται ως ένα από τα δύο αλληλόμορφα σε κάθε δεδομένη SNP, με το όνομα Α και Β]. Τρεις διαφορετικές δοκιμές επικύρωσης επιβεβαίωσε ότι κορυφές εμφανίζουν διαφορές εκπροσωπούνται μο- νοαλληλική τομείς. Αυτές οι συμπληρωματικές εξετάσεις επιβεβαίωσαν τα ακόλουθα: 1) τα γονίδια στις περιοχές υψηλής B διαφορά συχνότητας αλληλόμορφου εκφράστηκαν monoallelically? 2) σε φυσιολογικά κύτταρα όλες οι περιοχές ελέγχου πέντε αποτύπωση που πραγματοποιείται ετερόζυγη SNPs είχαν χαρακτηρίζεται από κορυφές διαφορά αλληλόμορφο Β? και 3) οι απλότυποι στις κορυφές διαφορά αλληλόμορφο Β πιστά διατηρήθηκαν στο χρωματίνη ανοσοκαταβυθίστηκαν με τα αντίστοιχα αντισώματα. Και στις δύο δείγματα τα περισσότερα από τα μο- νοαλληλική πεδία βρέθηκαν στα όρια μεταξύ των περιοχών των ανοικτών και κλειστών χρωματίνης. Όσον αφορά την γραμμή του καρκίνου, αυτό υποστηρίζει την καθιερωμένη έννοια της εξάπλωσης διαμόρφωση, αλλά τα αποτελέσματα από τα φυσιολογικά κύτταρα ήταν απροσδόκητη. Δεδομένου ότι αυτά τα κύτταρα ήταν πολυκλωνικά, τα μο- νοαλληλική δομές μάλλον δεν καθορίζεται με τυχαία επιλογή, όπως συμβαίνει σε Χ-αδρανοποίηση, έτσι προτείνουμε ότι επιγενετικές αδρανοποίηση σε ορισμένες περιοχές μπορεί να είναι κληρονομική και πολυμορφικά σε φυσιολογικά ανθρώπινα κύτταρα

Αιτιολογική αναφορά.: di Paola D, Raelson J, Rampakakis Ε, BASIK Μ, Ζαννή-Χατζόπουλο Μ, Bradley WEC (2013) μο- νοαλληλική χρωματίνης Διάπλαση πλαισίωσης Long-Range κατασιγασμένου Domains στον Καρκίνο-Παράγωγα και φυσιολογικά κύτταρα. PLoS ONE 8 (5): e63190. doi: 10.1371 /journal.pone.0063190

Επιμέλεια: Brian P. Chadwick, Πολιτειακό Πανεπιστήμιο της Φλόριντα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 15 του Φλεβάρη του 2013? Αποδεκτές: 27 Μαρ 2013? Δημοσιεύθηκε: May 16, 2013

Copyright: © 2013 Di Paola et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Cancer Research Society και εσωτερικών κεφαλαίων του Κέντρου Καρκίνου Goodman, το Πανεπιστήμιο McGill. DDP ήταν ο αποδέκτης της υποτροφίας από το Fonds de Recherche en Santé du Québec. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Ιωάννης Raelson πρώην μισθωτός από Genizon Biosciences Inc., που δεν είχε καμία επιρροή επί του συντακτικού περιεχομένου του χειρογράφου. Κανένας από τους άλλους συγγραφείς δηλώνουν κάθε σύγκρουση. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Επιγενετική έλεγχο της γονιδιακής έκφρασης είναι μια σημαντική πηγή φαινοτυπική διακύμανση του καρκίνου. Σε επίπεδο χρωμοσωμικό, αυτός ο έλεγχος εκδηλώνεται με μεταβολές στη χρωματίνη διαμόρφωση που συνδέεται με τις τροποποιήσεις των ιστονών, όπως μεθυλίωση ή /και ακετυλίωση των καταλοίπων λυσίνης σε Ν-τερματικό ουρές των ιστονών, και με μεθυλίωση υπολειμμάτων C σε CpG πλούσιων σε νησιά ή κοντά σε υποκινητές γονιδίων. Αυτές οι αλλαγές έχει χρησιμοποιηθεί εκτενώς ως δείκτες για τον προσδιορισμό της επιγενετική κατάσταση ενός δεδομένου γονιδίου, και πρόσφατες εξελίξεις στην τεχνολογία γονιδιώματος επέτρεψαν εκτίμηση των επιγενετικών αδρανοποίησης πάνω εύρη μεγαβάση? είναι τώρα πιστεύεται ότι αυτές οι αλλαγές μπορεί να εξαπλωθεί σε μεγάλες εκτάσεις [1]. Οι γνώσεις μας στον τομέα αυτό είναι, ωστόσο, ατελής για διάφορους λόγους: πρώτον, CpG νησί μεθυλίωση αποδίδει μόνο τα στοιχεία των μεμονωμένων γονιδίων που σχετίζονται με νησίδες CpG, και αυτό μόνο σε περιπτώσεις όπου το γονίδιο αδρανοποίησης αντιστοιχεί πραγματικά με την κατάσταση μεθυλίωσης. Δεύτερον, αν και αυτές οι πρόσφατες μελέτες έχουν αποδείξει ότι πράγματι μπορεί να συμβεί επιγενετικές αλλαγές μεγάλης κλίμακας, λίγοι εξαντλητικός αναλύσεις γονιδιώματος σε επίπεδο σύγκρισης φυσιολογικών και καρκινικών κυττάρων που λαμβάνονται έχουν αναληφθεί.

Μια άλλη πτυχή αυτού του φαινομένου η οποία έχει παραμείνει σχετικά ανεξερεύνητη είναι ο βαθμός στον οποίο επιγενετικές αδρανοποίηση μπορεί να περιορίζεται σε ένα αλληλόμορφο. Εντός φυσιολογικά κύτταρα, αλληλόμορφο-ειδικό γονίδιο αδρανοποίησης είναι γνωστό ότι εμφανίζεται σε μια σειρά από τόπους, συμπεριλαμβανομένων γονιδίων μέσα εντυπωμένα τομέων (όπου η επιλογή των οποίων είναι αδρανοποιημένο αλληλόμορφο εξαρτάται από την μητρική προέλευσης), τα περισσότερα γονίδια σε ένα Χ-χρωμόσωμα σε θηλυκά κύτταρα, οσφρητικών υποδοχέων, και σε έναν αριθμό γονιδίων που εμπλέκονται σε φλεγμονή και την ανοσολογική απόκριση (ανασκόπηση από [2]). Μηχανισμοί ελέγχου για ορισμένα από αυτά τα γεγονότα αδρανοποίησης φάνηκε να μεταβάλλεται σε καρκινικά κύτταρα, έτσι ώστε, για παράδειγμα, αποτυπώνεται τόποι συχνά biallelically εκφράζονται σε καρκίνο (που επισκοπείται στο [3]). Ωστόσο, ο βαθμός στον οποίο συμβαίνει de novo μο- νοαλληλική αδρανοποίηση σε καρκινικά κύτταρα είναι άγνωστη. Πρόωρη εργασία από εμάς [4], [5] και από άλλους [6] ανέφεραν ότι στο μοντέλο κυτταρική σειρά θηλαστικού CHO, μο- νοαλληλική αδρανοποίηση μπορούν να εξαπλωθούν σε ένα φάσμα μεγαβάσης τέτοια ώστε η επιλογή κατά την έκφραση ενός ενιαίου αλληλόμορφου σε ένα τόπο οδήγησε σε καταστολή από ένα αλληλόμορφο σε μια δεύτερη, που συνδέεται τόπο. Τέτοια εξάπλωση δείχθηκε να συμβαίνουν σε υψηλή συχνότητα και δεν συνεπάγονται μεθυλίωση του υποκινητή που σχετίζεται με CpG νησί για τουλάχιστον ένα από τα γονίδια που εμπλέκονται [7]. Πιο πρόσφατα, έχουμε δείξει ότι σε περίπου το ήμισυ του όγκου που προέρχονται από κυτταρικές γραμμές στις οποίες RaRb, ένα γονίδιο με όγκο κατασταλτική επίδραση, ήταν εντελώς απενεργοποιημένο, ο υποκινητής του μόνο ένα από τα δύο αλληλόμορφα μεθυλιώθηκε [8], και πάλι υποδηλώνοντας έναν μηχανισμό αδρανοποίησης μεθυλίωσης-ανεξάρτητη, η οποία μπορεί να είναι μο- νοαλληλική στη φύση.

σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε αντιορούς έναντι ιστόνης Η3 ακετυλιωμένη στο K9 /14 (H3Ac) και ιστόνης Η3 τρι-μεθυλιωμένη στο K9 (H3M) σε πειράματα τσιπ στον δύο ορθοκολικού καρκίνου που προέρχεται από τις γραμμές (HCT116 και ΟοΙο205) και μία καλλιέργεια ανθρώπινων εντερικών επιθηλιακών κυττάρων (HIEC), τα οποία είναι μη-αθανατοποιημένη και πολύκλωνα. Αυτά τα σήματα ιστόνης συνδέονται με ανοικτή και κλειστή διαμόρφωση χρωματίνης, αντίστοιχα, και επιλέχθηκαν μεταξύ περισσότερων είναι γνωστό ότι σχετίζονται με διαμόρφωση εν μέρει επειδή οι τροποποιήσεις είναι αμοιβαία αποκλειόμενες και μπορεί να υπάρχει μια μεγαλύτερη πιθανότητα ότι τα δεδομένα θα είναι αδιαμφισβήτητη. Αυτό απλοποίησε επίσης τον προσδιορισμό των αλληλόμορφων προκατάληψη στην διαμόρφωση σε κάθε SNP που χρησιμοποιούνται για την γονοτυπική ανάλυση του DNA που εξάγεται από το ανοσοκαταβυθισμένο χρωματίνη, αφού θα μπορούσαμε να υπολογίσει τη διαφορά στις συχνότητες αλληλόμορφο Β προσδιορίζεται σε κάθε SNP των μικροσυστοιχιών HAP550k. Όχι απροσδόκητα, βρέθηκαν μεγάλες «ερήμους γονίδιο» να χαρακτηρίζεται από τα τμήματα του γενικά κλειστού χρωματίνης και σε φυσιολογικά και καρκινικά κύτταρα. Ενδιαφέροντος, διαπιστώσαμε ότι μο- νοαλληλική διάπλασης ήταν κατά προτίμηση εντοπισμένο στα όρια αυτών μεγάλα τμήματα των κλειστών χρωματίνης διάπλαση, γεγονός που υποδηλώνει τη διάδοση του ανενεργό (ή ενεργό) διαμόρφωση.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Για να δημιουργούν εικόνες μεγάλου βεληνεκούς της χρωματίνης διάπλασης, οι τιμές έντασης φθορισμού, εκφράζονται ως λόγοι LOGR, ήταν κατά μέσο όρο πάνω από κινούμενα παράθυρα που περιλαμβάνουν 21 ή περισσότερα SNPs, και συναρτήσει της χρωμοσωμική θέση. Όπως ήταν αναμενόμενο, με βάση τα στοιχεία που παρέχονται στο πρόγραμμα περιήγησης επιγονιδιώματος UCSC, το γονίδιο-φτωχών περιοχές του γονιδιώματος χαρακτηρίζονται από τμήματα χαμηλής LOGR για αντι-H3Ac-καθιζάνει χρωματίνης και αντίστοιχα υψηλή LOGR για αντι-H3M. Αυτό απεικονίζεται στο Σχ. 1, που δείχνει έναν τομέα 15 Mb του CHR5 φιλοξενούν λιγότερα από 10 γονίδια, πέντε εκ των οποίων είναι μέλη της οικογένειας cadherin. Στα φυσιολογικά κύτταρα (και λιγότερο συχνά, στις καρκινικές κυτταρικές γραμμές) οι περιοχές αυτές ήταν συνήθως διακόπτονται από μικρά νησιά των ανοικτών διάπλαση χαρακτηρίζεται από κορυφές του οικοπέδου αντι-H3Ac, αντικατοπτρίζεται γούρνες του οικοπέδου αντι-H3M. Μερικές φορές, αλλά όχι πάντα, αυτά αντιστοιχούσαν στους υποστηρικτές των σπάνιων γονιδίων στον τομέα (Εικ. 1,

CDH18

και

CDH9

και το μη χαρακτηρισμένο θραύσμα γονιδίου σε 21,5 Mb, κατάντη του

CDH12

). Οι κορυφές σε αυτούς τους τομείς συχνά πεπλατυσμένο στα καρκινικά προερχόμενα γραμμές, και το οικόπεδο που παρουσιάζονται στο Σχ. 1 υποδηλώνει ότι η μετατόπιση του ορίου δεξιά μπορεί να έχουν συμβεί έτσι ώστε

CDH6

είναι σε κλειστή χρωματίνη σε κύτταρα HCT116. Είναι πιθανό ότι αυτή η φαινομενική μετατόπιση είναι τουλάχιστον μερικές φορές μέρος της διαδικασίας εξέλιξης του όγκου (βλέπε παρακάτω).

Σχεδιάζονται τιμές αντιπροσωπεύουν τις μέσες αναγνώσεις ενός κινούμενου παραθύρου 21-SNP. HCT116, μία ορθοκολικού καρκίνου που προέρχεται από κυτταρική σειρά? HIEC, φυσιολογικά ανθρώπινα εντερικά επιθηλιακά κύτταρα. Τα γονίδια (από UCSC γονιδίωμα Browser, hg18) που απεικονίζεται κάτω από τα οικόπεδα LOGR.

Η

Τα πρότυπα των αναλογιών LOGR για το σύνολο των CHR9 φαίνονται στο Σχ. 2, με Browser «πυκνή» οθόνη UCSC γονιδίωμα των γονιδίων στο κάτω μέρος του κάθε τμήματος γράφημα. Και πάλι, το γονίδιο-φτωχών τομέων (για παράδειγμα, εκείνες που επικεντρώνεται γύρω από 10 Mb, 82 Mb, 105 Mb) χαρακτηρίζονται από χαμηλές τιμές LOGR αντι-H3Ac διακόπτεται από εντοπισμένη κορυφές οι οποίες ενίοτε πεπλατυσμένο στις γραμμές καρκίνου (δεδομένα H3M δεν περιλαμβάνονται στο κύριο μέρος του σχήματος για λόγους απλότητας). Στο ένθετο του Σχ. 2 Εμφανίζεται μια κορυφή στο CHR9 και για τα τρία από τα δείγματα αντι-ακετυλιωμένο τσιπ με ταυτόχρονη γούρνα για όλες τις τρεις από τις αντι-μετουσιωμένο μάρκες, σύμφωνα με τις προσδοκίες μας από καθρέφτη-εικόνες στα οικόπεδα LOGR των δύο ανοσοκαταβυθίστηκαν δείγματα. Υπάρχει μόνο ένα γονίδιο στην περιοχή, C9orf123, του οποίου η 5 ‘άκρο βρίσκεται πολύ κοντά στον αντίστοιχο μέγιστα και ελάχιστα επίπεδα.

Δεδομένα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφεται στην επεξήγηση του σχ. 1. Ένθετο, η περιοχή μεταξύ 7,7 Mb και 7,9 Mb, που δείχνει τις κορυφές τσιπ χρησιμοποιώντας αντι-ακετυλιωμένο αντιορό εναντίον των γούρνες τσιπ που χρησιμοποιούν αντι-μεθυλιωμένο ορού, που συμπίπτει με την περιοχή του υποκινητή της C9orf123. LOGR Τα οικόπεδα της αντι-μεθυλιωμένο ChIP παραλείπονται από την κεντρική φιγούρα για λόγους σαφήνειας.

Η

Στη συνέχεια προσδιορίστηκε τα πρότυπα της προκατάληψης αλληλομόρφων σε χρωματίνη διάπλασης για τα δύο δείγματα σχεδόν διπλοειδή κυττάρων (HCT116 και HIEC), εκφράζονται ως συχνότητα αλληλόμορφο Β (BAF) η διαφορά μεταξύ των δύο δειγμάτων ChIP κατά μέσο όρο πάνω από 11-δείκτη κινείται παράθυρα (βλέπε Μέθοδοι). Βρήκαμε περισσότερες από 60 κορυφές πάνω από συντηρητική μας cut-off 0,35 (βλέπε κείμενο στο S1 αρχείου), η οποία παρατείνεται για όσο το 10 Mb σε μια λωρίδα στη γραμμή που λαμβάνεται από καρκίνο HCT116. Περίπου 35 τέτοιες κορυφές παρατηρήθηκαν στα κύτταρα HIEC, η ευρύτερη καλύπτουν ένα εύρος περίπου 400 kb (πλάτος της κορυφής στο ήμισυ του ύψους? Βλέπε σχήμα 3 για επισκοπήσεις πολλών χρωμοσωμάτων.)

Όπως περιγράφεται. στο κείμενο, για κάθε SNP ετερόζυγη απόλυτες τιμές των BAF διαφορές μεταξύ των δύο δειγμάτων ChIP υπολογίστηκαν και 11 σήμανσης κινητοί μέσοι παράθυρο σε κάθε χρωμόσωμα απεικονίσθηκαν. Μπλε, HCT116? κοράλλια, HIEC. Τα γονίδια (UCSC γονιδίωμα Browser) που απεικονίζεται κάτω από τα οικόπεδα LOGR.

Η

Για την επικύρωση αυτών των δεδομένων θα πραγματοποιείται τόσο δομικές και λειτουργικές δοκιμές (λεπτομέρειες στο Μέθοδοι). Πρώτον, κατά τη διάρκεια μιας κορυφής διαφορά BAF μια σχετικά κλειστή διαμόρφωση θα πρέπει να εκτείνεται χωρίς διακοπή σε ένα ομόλογο και ένα ανοικτό διαμόρφωση στην άλλη. Αυτό έδειξε να είναι η περίπτωση πάνω από τρεξίματα των SNPs σε υψηλές ανισορροπία σύνδεσης (LD), όπως βρήκαμε τέλεια αντιστοιχία μεταξύ φάσης απλότυπο και την αλληλουχία των αλληλόμορφων εμπλουτισμένο σε αντίστοιχα δείγματα πλινθίου (διωνυμική p = 1,4 × 10

-45 για HCT116, 5.8 × 10

-11 για HIEC? δεδομένων στα σχήματα S1 και S2 σε S1 αρχείου).. Δεύτερον, βρήκαμε ότι επτά από επτά γονιδίων που κατοικούν σε κορυφές BAF διαφορά ήταν monoallelically εκφράζονται (Εικ. S3 σε File S1). Τρίτον, δείξαμε ότι πέντε κορυφές BAF διαφορά στην HIEC, συμπεριλαμβανομένης της κύρια κορυφή στα 22,9 Mb χρωμοσώματος 15 (Εικ. 3), αντιστοιχούσε ακριβώς με περιοχές ελέγχου αποτύπωση (έκθεση ICR), των κοντών monoallelically μεθυλιωμένο DNA αλληλουχίες οι οποίες κατευθύνουν αποτύπωση (άλλα τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). (Άλλες έκθεση ICR έχουμε ερωτηθεί ήταν ομοζυγώτες στο HIEC). Συνολικά, οι τρεις δοκιμές που πραγματοποιήθηκαν κάνει μια συγκλονιστική υπόθεση που BAF διαφορές αντικατοπτρίζουν τις αυθεντικές αλληλομόρφων διαφορές στη διαμορφωτική δομή της χρωματίνης.

Όταν οι αναλογίες LOGR και BAF διαφορές των κυττάρων HCT116 χαράχθηκαν μαζί παρατηρήθηκαν δύο γενικές τάσεις (βλέπε Σχ. 4 το οποίο δείχνει οκτώ από τις κορυφές στο χρωμόσωμα 18, αριθμημένα I-VIII). Όπως θα ήταν αναμενόμενο, μερικές αιχμές διαφορά BAF αντιστοιχούσε στενά με απομονωμένο κορυφές ή /και κοιλότητες των αντίστοιχων δειγμάτων chip. Εκείνοι στους 35 Mb και 57 Mb (κορυφές III και VIII) εμπίπτουν στην κατηγορία αυτή, μαζί με περίπου το ένα τέταρτο του υπόλοιπου αυτών των κορυφών σε όλο το γονιδίωμα. Όπως πολλοί ως τα δύο τρίτα των κορυφών, ωστόσο, εμφανίστηκε στα όρια μεταξύ χαμηλών και υψηλών τιμών LOGR, δηλαδή, μεταξύ των τομέων των ανοικτών και κλειστών διαμόρφωση χρωματίνης. Κορυφές I, II, V – VII και ίσως IV είναι σε αυτή την κατηγορία (σχήμα 4? Η τελευταία είναι λιγότερο βέβαιη, λόγω της uninformative ομοζυγωτίας αλληλοεπικαλυπτόμενων στην κορυφή.). Στις περισσότερες περιπτώσεις, τα οικόπεδα διαφορά LOGR και BAF ήταν ουσιαστικά επιτιθέμενες πάνω από την άμεση περιοχή ενδιαφέροντος, υποδεικνύοντας ότι η απόκλιση μεταξύ των αλληλόμορφα ξεκίνησε στο ίδιο σημείο, όπως στην αρχή του διακόπτη από τη μια διαμόρφωση στην άλλη. Περιέργως, τα όρια που συμπίπτει με BAF κορυφές διαφορά ήταν συνήθως εκείνα για τα οποία η σχετική μετατόπιση παρατηρήθηκε σε αναλογίες LOGR, όπως φαίνεται για κορυφές Ι, VI και VII (η τελευταία είναι μικρότερη, αλλά πραγματική, με μια μετατόπιση των 100 kb). Το όριο στην κορυφή II μπορεί επίσης να θεωρηθεί ως εκτοπισμένοι, από μια μεγαλύτερη απόσταση περίπου 2 Mb.

Άνω πάνελ, BAF διαφορές σε όλη του χρωμοσώματος 18 για HCT116. Κάτω πάνελ, οικόπεδο HCT BAF διαφορά (Red? Δεξιά κλίμακα) επάνω σε οικόπεδα των HCT και HIEC, αναλογίες LOGR (αριστερά κλίμακα) πάνω στο χρωμόσωμα 18 τομείς που αναφέρονται στο άνω φύλλο

Η

. εμείς ερμηνεύουν αυτό ως ένδειξη ότι είτε ανοικτή ή κλειστή περιοχές έχουν εξαπλωθεί σε αυτά τα όρια και ότι η εξάπλωση ήταν είτε μο- νοαλληλική ή συνέβησαν σε διαφορετικούς βαθμούς στις δύο ομόλογα, δημιουργώντας έτσι έναν τομέα της μο- νοαλληλική χρωματίνης διάπλασης. Εναλλακτικές ερμηνείες είναι επίσης δυνατές, αλλά προτιμούμε το σενάριο διασποράς εν μέρει επειδή φαίνεται απλό να οραματίζονται ένα τέτοιο μηχανισμό, για την οποία υπάρχει κάποια προηγούμενο σε κύτταρα θηλαστικών, με τη μορφή Χ-αδρανοποίηση εξαπλώνεται σε αυτοσωματικό χρωματίνη στα σημεία σύντηξης των X-αυτοσωμικό μετατόπιση [9].

Θα πραγματοποιηθεί, επίσης, τις ίδιες αναλύσεις με στοιχεία από κύτταρα HIEC. Το χρωμόσωμα Χ απέδωσε καθόλου διαφορές BAF πάνω από το θόρυβο υποβάθρου (τα δεδομένα δεν δείχνονται), αν και H3K9 ακετυλίωση /μεθυλίωση εμπλέκεται σε Χ-αδρανοποίηση [10]. Αυτό είναι όπως αναμένεται για τυχαία αδρανοποίηση, θεωρώντας ότι τα κύτταρα HIEC είναι πολυκλωνικά, και το αποτέλεσμα επιβεβαίωσε ότι τα τυχαία γεγονότα αδρανοποίηση δεν πρέπει να συγχύσει τα αποτελέσματά μας. Ανάμεσα στα αυτοσωμικά, κρίναμε 13/32 BAF κορυφές διαφορά ότι αντιστοιχεί σε απομονωμένες κορυφές αναλογία LOGR /Κατώτερα των δειγμάτων H3Ac /H3M chip. Ωστόσο, το υπόλοιπο, το οποίο περιλαμβάνει την πλειοψηφία των κορυφών διαφορά BAF συνέπεσε με όρια μεταξύ ανοικτών και κλειστών διαμόρφωση της χρωματίνης (παραδείγματα φαίνονται για το χρωμόσωμα 22 στο Σχ. 5 με την κορυφή II είναι στην πρώτη κατηγορία και οι άλλοι δείχνουν μο- νοαλληλική επιδράσεις όριο βάρδια). Αυτό ήταν ένα απροσδόκητο αποτέλεσμα, το οποίο, ωστόσο, θεωρούμε ότι είναι πραγματική, με δεδομένη την αυστηρότητα της διαδικασίας επικύρωσης μας. Η δική μας ερμηνεία αυτού του αποτελέσματος είναι όπως περιγράφεται παραπάνω, δηλαδή ότι στα όρια του ανοικτή /κλειστή διαμόρφωση της χρωματίνης, κάποιο βαθμό εξάπλωσης της διάπλασης μπορεί να συμβεί μο- νοαλληλική.

Άνω πάνελ, BAF διαφορές σε όλη του χρωμοσώματος 22 για HIEC . Κάτω πάνελ, HIEC BAF οικόπεδο διαφορά (Red? Δεξιά κλίμακα) επάνω σε HCT και HIEC, LOGR αναλογίες οικόπεδα (αριστερά κλίμακα) πάνω στο χρωμόσωμα 22 τομείς που αναφέρονται στο άνω φύλλο

Η

Σε ποιο. μπορούμε να αποδώσουμε αυτή την προφανή εξαπλώνεται; Η πολυκλωνική φύση των HIEC μας επιτρέπει να αποκλείει μερικές δυνατότητες. Πρώτον, είναι απίθανο να οφείλεται στον ίδιο μηχανισμό όπως και η διαδεδομένη μο- νοαλληλική έκφραση περιγράφεται από Gimelbrant et al. [11], δεδομένου ότι η τελευταία φάνηκε να είναι τυχαία. Μπορούμε ομοίως μπορεί να αποκλείσει το ενδεχόμενο ότι οι κορυφές αντανακλούν μια προκαρκινική κατάσταση, όπως φαίνεται με μεθυλίωση του όγκου γονίδια καταστολής σε φυσιολογικό ιστό των ασθενών με καρκίνο, δεδομένου ότι αυτό θα ήταν επίσης τυχαία σε σχέση με την επιλογή του αλληλόμορφου. Εν πάση περιπτώσει, τα κύτταρα HIEC είναι εμβρυϊκής προέλευσης και όχι αθανατοποιημένες [12], και θα, ως εκ τούτου, δεν πρέπει να αναμένεται να έχει οποιεσδήποτε προκαρκινικών χαρακτηριστικά. Μια άλλη ερμηνεία, η οποία, ωστόσο, δεν υποστηρίζεται έντονα από τα δεδομένα, είναι ότι αυτές οι κορυφές των BAF διαφορά είναι προηγουμένως άγνωστη τυπωμένα τα πεδία. Πρόσφατα στοιχεία από τις αναζητήσεις του γονιδιώματος σε επίπεδο καταδεικνύουν ότι τα περισσότερα γνήσια τυπωμένα πεδία είναι πλέον γνωστό, έτσι δίνεται ο αριθμός τους (περίπου 20) και η παρουσία τους στα όρια άνοιγμα-κλείσιμο της χρωματίνης (σε αντίθεση με τα αποτύπωση που σχετίζονται με κορυφές που είχαμε εντοπίσει) αυτό φαίνεται απίθανο, αν και αυτό το θέμα δεν μπορεί να αντιμετωπιστεί χωρίς αμφιβολία χρησιμοποιώντας τον πειραματικό σχεδιασμό μας. Μια ερμηνεία που θεωρούμε ότι είναι σύμφωνο με τα δεδομένα είναι ότι οι αλληλόμορφες διαφορές ανιχνεύονται αντανακλούν τις συνταγματικές επιγενετικές μεταβολές, δηλαδή, ότι οι μο- νοαλληλική κορυφές θα είναι παρούσα σε όλους τους ιστούς του εν λόγω ατόμου. Τέτοια φαινόμενα έχουν περιγραφεί για έναν περιορισμένο αριθμό των ογκοκατασταλτικών γονιδίων, συμπεριλαμβανομένων των

MGMT

[13], από το ότι αυτά τα γονίδια έχουν βρεθεί να σιγήσει σε φυσιολογικά σωματικά κύτταρα, και πιστεύεται ότι έχει ως αποτέλεσμα μία καρκινογόνες προδιαθέτουν φαινότυπο. Υπάρχουν προτάσεις στη βιβλιογραφία ότι αυτές οι «συνταγματικές epimutations» μπορεί να είναι γενετικής προέλευσης [14], [15]. Άλλες ομάδες έχουν εκτελέσει μελέτες συσχέτισης γονιδιώματος σε επίπεδο της έκφρασης αλληλόμορφων [16] και έχουν βρει πολλές SNPs να σχετίζεται με τα επίπεδα έκφρασης. Σε όλες αυτές τις περιπτώσεις, ο μο- νοαλληλική αποτέλεσμα περιορίζεται σε ένα γενετικό συστατικό, όπως ένα SNP ή τον προαγωγό ενός γονιδίου. Δεν υπήρξε καμία ιδιαίτερη συσχέτιση σε αυτές τις μελέτες των μο- νοαλληλική έκφρασης με χρωματίνης διαμόρφωσης ή με την εγγύτητα στο γονίδιο ερήμους, οπότε εξακολουθεί να είναι άγνωστο αν τα μο- νοαλληλική πρότυπα έκφρασης αυτοί οι συγγραφείς περιγράφουν μπορεί να επικαλύπτονται με αυτές που περιγράφουμε.

Η μελέτη μας ανοίγει νέους ορίζοντες σε δύο σημεία. Πρώτον, εντοπίζεται μία σημαντική πηγή του μο- νοαλληλική δομής της χρωματίνης σε περιοχές αμέσως δίπλα σε τομείς του κλειστού χρωματίνης διαμόρφωση. Ως εκ τούτου, προτείνει ένα μηχανισμό για την παρούσα επιγενετικές πολυμορφισμό, η οποία μπορεί να μοιάζει με ένα ελεγχόμενο έκδοση του εξάπλωσης ότι εμείς και άλλοι προτείνουν να είναι μια σημαντική πηγή φαινοτυπική μεταβολή στον καρκίνο. Δεύτερον, αν η ερμηνεία μας είναι ακριβής, αυξάνει την προοπτική ενός γενετικού στοιχείου σε αυτή την πηγή της επιγενετικής μεταβολής. Είναι γνωστό ότι κατά τη αποτύπωση

IGF2R Ιστοσελίδα για chr6q είναι πολυμορφικό, και ίσως μπορεί να υπάρχουν μερικά στοιχεία της κληρονομικές επιγενετικών έλεγχο της χρωματίνης διάπλασης, η οποία εκδηλώνονται ως τομείς της μο- νοαλληλική διάπλασης που έχουμε τεκμηριωμένα. Ένα ανεξήγητο φαινόμενο, που μπορεί να σχετίζονται είναι διαγενεαλογική κληρονομιά [17], στην οποία οι γενετικοί παράγοντες επηρεάζουν φαινότυπο σε διαδοχικές γενιές, χωρίς τα γονίδια καθορισμό ευθέως ότι φαινότυπο που κληρονόμησε. Σε κάθε περίπτωση, τα νέα στοιχεία των αποτελεσμάτων μας μπορεί να οδηγήσει σε μια βαθύτερη κατανόηση της κληρονομικότητας, και αυτή τη στιγμή διερευνά περαιτέρω αυτά τα αποτελέσματα.

Μέθοδοι

Cells

HIEC- 6 είναι πολύκλωνα μη αθανατοποιημένη εντερικά επιθηλιακά κύτταρα καλλιεργημένα από ένα θηλυκό έμβρυο 20 εβδομάδων. Είχαν την καλοσύνη επιπλωμένα σε χωρίο 17 από τον Jean-François Beaulieu, και αναπτύχθηκαν σύμφωνα με δημοσιευμένες μεθόδους [12]. Τα πειράματα διεξήχθησαν μέσα σε 6 χωρία της υποδοχής στο εργαστήριο μας. HCT116 και ΟοΙο205 είναι ορθοκολικού καρκίνου που προέρχεται από κυτταρικές σειρές αρχικά ελήφθη από την ATCC, και αναπτύχθηκαν σε RPMI όπως περιγράφηκε προηγουμένως.

χρωματίνης Ανοσοκαθίζηση (μάρκας)

ακολούθησε εκείνη που περιγράφεται από τη διαδικασία [18] . Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλήρες μέσο πλύθηκαν με προθερμασμένο PBS και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 1% φορμαλδεΰδη για 10 λεπτά για να συνδέσει εγκάρσια πρωτεΐνες και DNA

in vivo

? αυτοί στη συνέχεια πλύθηκαν και αποξέστηκαν σε παγωμένο PBS και επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (50 mM ΗΕΡΕδ-ΚΟΗ ρΗ 7,5, 140 mM NaCl, 1% Triton Χ-100, 2 mM EDTA) συμπληρωμένο με ένα δισκίο πλήρες αναστολέα πρωτεάσης (Roche Molecular Biochemicals). Μετά τη διέλευση μέσω μιας βελόνας 21-G τρεις φορές, οι πυρήνες συλλέχθηκαν, επαναιωρήθηκαν σε ένα συσκευασμένο πυρηνικό όγκο του ρυθμιστικού λύσης, και υφίσταται κατεργασία με υπερήχους έως ότου θραύσματα DNA του & lt? Ελήφθησαν 1 kb. Χρωματίνης μέγεθος παρακολουθήθηκε με ηλεκτροφόρηση. Ανοσοκαταβύθιση (IP) διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως, με τις ακόλουθες τροποποιήσεις: Εν συντομία, ψαλιδισμένα λύματα χρωματίνη (500 μg) προ-καθαριστεί με επώαση με 50 μΙ πρωτεΐνης Α /G αγαρόζης (Roche Molecular Biochemicals) για να μειωθεί φόντο προκαλούνται από μη ειδική προσρόφηση στα σφαιρίδια, επωάστηκαν για 6 ώρες με είτε 20 μg αντι-ακετυλιωμένης H3K9 /14 (Upstate), αντι-τριμεθυλιωμένη H3K9 (Upstate) ή κανονικό ορό κουνελιού (NRS) στους 4 ° C με σταθερή περιστροφή. Πρωτεΐνη Α /G αγαρόζης (50 μΙ) προστέθηκε και επωάστηκε όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Τα σφαιροποιημένα σφαιρίδια πλύθηκαν διαδοχικά δύο φορές με 1 ml ρυθμιστικού διαλύματος λύσης για 15 λεπτά κάθε στους 4 ° C, ακολουθούμενο από 1 ml του WB1 (50 mM Tris-HCl ρΗ 7.5, 500 mM NaCl, 0,1% ΝΡ40, 0.05% δεοξυχολικό νάτριο, δισκίο πλήρης αναστολέα πρωτεάσης), 1 ml του WB2 (50 mM Tris-HCl ρΗ 7,5, 0,1% ΝΡ40, 0.05% δεοξυχολικό νάτριο, πλήρης πρωτεάσης δισκίο αναστολέα) και 1 ml αποστειρωμένου ΤΕ. Τα σφαιρίδια επαναιωρήθηκαν σε 200 μΐ ΤΕ /1% SDS, επωάζονται σε θερμοκρασία δωματίου (RT) για 15 λεπτά και φυγοκεντρήθηκαν στις 3.000 σ.α.λ. για 1 λεπτό σε θερμοκρασία δωματίου. Το ήμισυ του υπερκειμένου στη συνέχεια επωάστηκε όλη τη νύκτα στους 65 ° C για να αντιστρέψει τις διασυνδέσεις, που ακολουθείται από 100 μ§ πρωτεϊνάσης Κ στους 55 ° C για 2 ώρες. Το DNA καθαρίστηκε με χρήση κιτ καθαρισμού QIAquick PCR (Qiagen, Valencia, CA, USA) και εκλούεται σε 100 μΐ ΤΕ.

γονοτυπικός

DNA από HIEC και HCT116 ήταν γονότυπου στο μικροσυστοιχίες Illumina HAP550 από την υπηρεσία προσδιορισμού του γονότυπου του Genizon Biosciences Inc., σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και όπως έχει περιγραφεί [19]. DNA από ΟοΙο205 ήταν γονότυπου στη συστοιχία δίδυμο 1 Μ, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για να ληφθεί υπόψη για τη διαφορά στην κατασκευή μικροσυστοιχιών, θα πολλαπλασιάσει τις αναλογίες LOGR από τη συστοιχία 1 Μ με 2,0 για την παρουσίαση με τα εν λόγω οικόπεδα που δημιουργούνται από τη συστοιχία HAP550. Αυτό επέτρεψε την παρουσίαση των οικοπέδων με ισοδύναμο πλάτος. Τα δεδομένα μικροσυστοιχιών κατατεθεί στο δρυάς. (doi: 10.5061 /dryad.43h8c)

Υπολογισμός Β αλληλόμορφων Διαφορές Συχνότητα

χαράσσεται Β-αλληλόμορφο συχνότητας (BAF) διαφορές κατά χρωμοσωμική θέση, παρουσιάζοντας τα δεδομένα με δύο τρόπους. Πρώτα υπολογίσαμε την απόκλιση από το BAF του παρασκευάσματος χρωματίνης ελέγχου καταβυθίστηκε με φυσιολογικό ορό κουνελιού για καθένα από τα δύο ανοσοκαταβυθίστηκαν δείγματα. Η διαφορά μεταξύ αυτών των τιμών υπολογίστηκε σε κάθε SNP, η απόλυτη τιμή προήλθε και 11-δείκτη κινητούς μέσους όρους παράθυρο χαράχθηκαν έναντι χρωμοσωμική θέση. Δεύτερον, για κάθε SNP απλά αφαιρείται BAF για το δείγμα H3Ac από ότι για το δείγμα H3M (κανονικοποιημένη) και οι απόλυτες τιμές των διαφορών αυτών υπολογίστηκαν κατά μέσο όρο πάνω από 11-δείκτη μετακίνηση παραθύρων ως ανωτέρω και σχεδιάστηκαν εναντίον θέση. Ουσιαστικά δεν υπήρχε διαφορά μεταξύ των δύο μεθόδων υπολογισμού, και παρουσιάζουμε μόνο τα δεδομένα που προκύπτουν από τη δεύτερη από τις δύο μεθόδους. Τρεις δοκιμές έγιναν για την επικύρωση των αποτελεσμάτων, όπως περιγράφεται στην επόμενη ενότητα.

Εκκαθάριση των BAF αιχμές Διαφορά ως Εκπροσωπώντας Τα αλληλόμορφα Bias

Για την επικύρωση αυτών των δεδομένων θα πραγματοποιείται τόσο δομικές και λειτουργικές δοκιμασίες. Πρώτον, εάν κορυφές BAF διαφορά αντανακλούν την πραγματική προκατάληψη διαμορφωτικό αλληλόμορφων, τότε μια ανοιχτή διαμόρφωση θα πρέπει να εκτείνεται κατά το μήκος του BAF διαφορά σε ένα ομόλογο και κλειστή διαμόρφωση στην άλλη. Έτσι, τα πρότυπα των διαφορών BAF στα αντίστοιχα δείγματα ChIP θα πρέπει να εμφανίζονται ως απλότυποι του ενός ή του άλλου ομολόγου. Βρήκαμε τα πρότυπα να είναι απόλυτα συνεπής (διωνυμική p = 1.4 × 10

-45 για HCT116, 5.8 × 10

-11 για HIEC? Τα δεδομένα για αρκετές μπλοκ LD εντός δύο κορυφές που αναφέρονται στο Αρχείο S1, Εικόνα 2 , Εικ. 3). Η δεύτερη δοκιμή επικύρωσης βασίστηκε στην προσδοκία ότι εντός μιας κορυφής του BAF διαφορά, μόνο ένα από τα αλληλόμορφα έφερε ένα γονίδιο σε ανοικτή διαμόρφωση, έτσι το πρότυπο έκφρασης του γονιδίου αυτού πρέπει τείνουν να είναι μο- νοαλληλική. Δείγματα cDNA από επτά γονιδίων σε αυτές τις περιοχές που πραγματοποιούνται ετερόζυγη cSNPs αναλύθηκαν και βρέθηκαν να έχουν σημαντική ή πλήρη εμπλουτισμό για ένα αλληλόμορφο (File S1, Σχ. S3). Η τρίτη δοκιμή έγινε με βάση την προσδοκία ότι τουλάχιστον κάποιες από τις κορυφές διαφορά BAF σε κύτταρα HIEC πρέπει να αντιστοιχούν σε γνωστές περιοχές του μο- νοαλληλική έκφραση σε φυσιολογικά κύτταρα. Δεδομένου HIEC είναι πολύκλωνα, δεν πρέπει να ανιχνεύσουν οποιαδήποτε προκατάληψη αλληλική στο Χ χρωμόσωμα ή σε άλλες θέσεις που υπόκεινται σε τυχαία αδρανοποίηση αλληλόμορφη (S1 File)? Ωστόσο, σε έντυπη τομείς, αλληλικές αδρανοποίηση δεν είναι τυχαία, αλλά γονέα-ειδικό, έτσι ώστε όλα τα κύτταρα σε έναν πληθυσμό πολυκλωνικό θα πρέπει να φέρουν το σήμα αποτύπωση στο ίδιο αλληλόμορφο. Επομένως, βρήκαμε πέντε από τις κορυφές διαφορά HIEC BAF, συμπεριλαμβανομένης της κύρια κορυφή στα 22,9 Mb χρωμοσώματος 15 (Εικ. 3), αντιστοιχούσε ακριβώς με έκθεση ICR (S1 File). Όλες οι άλλες έκθεση ICR που ερωτηθούν, συμπεριλαμβανομένων εκείνων που ελέγχουν το σύμπλεγμα Η19, είναι ομόζυγο σε HIEC και ως εκ τούτου μη ανιχνεύσιμο.

Υποστήριξη Πληροφορίες

αρχείου S1.

Στήριξη Κείμενο και αριθμοί S1, S2 και S3. Εικόνα S1. Επικύρωση ότι BAF κορυφές διαφορά αντανακλά συνεχόμενες περιοχές σε HCT116. Σκεφθήκαμε ότι εάν τα BAF διαφορές αντιπροσωπεύονται αυθεντικό διαφορές μεταξύ των δύο ομόλογα, το υλικό immunoprecitated από αντι-Me πρέπει κυρίως να προέρχεται από ένα ομόλογο, και ότι με την αντι-Ac κυρίως από το άλλο σε όλο το μήκος της υψηλής LD. Δύο περιοχές κάτω από την μεγάλη κορυφή της BAF διαφορά CHR1 (άνω τμήμα) αποτελέσματα για τους οποίους τα δεδομένα HapMap έδειξε πολύ υψηλή LD (r

2 περισσότερο από 0,9 σε όλη). Η κύρια συχνότητα αλληλόμορφο παραστάθηκε γραφικά για αντι-Ac (μπλε) και αντι-Me (κοράλλι) για κάθε SNP εντός της οριοθετημένης τρέξιμο υψηλής LD. Για κάθε SNP, το αντι-Ac ChIP απέδωσε ένα υψηλότερο BAF από το αντι-Me ChIP, υποδεικνύοντας την τέλεια ομοιομορφία μεταξύ απλότυπου και ανοσοκατακρημνίσθηκαν υλικό. Εικόνα S2. Επικύρωση ότι BAF κορυφές διαφορά αντανακλά συνεχόμενες περιοχές σε HIEC. Δείτε το μύθο με το σχήμα S1. Οι τρεις περιοχές υψηλής LD για CHR7 δείξει. Και πάλι τέλεια σύμπτωση παρατηρήθηκε μεταξύ απλότυπος και ανοσοκαταβυθισμένο υλικό. Εικόνα S3. Επικύρωση ότι BAF κορυφές διαφορά αντιπροσωπεύουν τομείς της μο- νοαλληλική έκφρασης σε SPRY2 (σε 80,1 Mb, CHR13). Γονιδιωματικό DNA και cDNA γύρω rs504122 (C /T ετερόζυγη τόσο HCT116 και HIEC) ενισχύθηκαν από τις δύο γραμμές και προσδιορίστηκε η αλληλουχία. Άνω πάνελ, και τα δύο αλληλόμορφα εκφράζονται σε HIEC, μόνο το C σε HCT116. Κάτω πάνελ, BAF διαφορές αποτυπώνονται και για τις δύο κυτταρικές σειρές, που δείχνει HCT116, αλλά δεν HIEC, με BAF διαφορές

doi:. 10.1371 /journal.pone.0063190.s001

(DOC)

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς ευχαριστήσω τον Δρ Jean-François Beaulieu για την παροχή των πολιτισμών HIEC και ο Δρ Πάτρικ Δίον για την συντακτική βοήθεια.