Αφηρημένο

Η ιονίζουσα ακτινοβολία (IR) -Βελτιωμένη εισβολής όγκου αναδύεται ως μια συνεισφορά στον περιορισμένο όφελος της ακτινοθεραπείας? Ωστόσο, ο μηχανισμός του είναι ακόμα ασαφής. Έχουμε στο παρελθόν έδειξαν ότι υποκλωνοποιημένο αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα Α549 (P κύτταρα), η οποία επέζησε 10 Gy IR (κύτταρα IR), απέκτησε υψηλή εισβολής

in vitro

. Εδώ, προσπαθήσαμε να προσδιορίσει τον μηχανισμό με τον οποίο τα κύτταρα IR αυξάνουν εισβολής τους με την εξέταση αλλοιωμένη έκφραση γονιδίων και οδών σε κύτταρα IR σηματοδότηση σε σύγκριση με εκείνα P κύτταρα. Για την προσομοίωση της μικροπεριβάλλον

in vivo

, τα κύτταρα ενσωματώνονται σε ένα τρισδιάστατο (3D) κολλαγόνου τύπου Ι γέλης, στην οποία τα κύτταρα IR επιμηκύνθηκαν, ενώ τα Ρ κύτταρα ήταν σφαιρικά. Η ιντεγκρίνη πρότυπο έκφρασης ερευνήθηκε, και τα επίπεδα έκφρασης του α2 ιντεγκρίνης και υπομονάδων β1 ήταν σημαντικά αυξημένα σε κύτταρα IR. Knockdown έκφρασης α2 ή λειτουργικών αποκλεισμό της ιντεγκρίνης α2β1 οδήγησε σε μια στρογγυλή μορφολογία των κυττάρων ΙΚ, και κατήργησε εισβολή τους στη μήτρα κολλαγόνου, γεγονός που υποδηλώνει ουσιαστικό ρόλο του μορίου σε κύτταρο εξάπλωση και εισβολή σε 3D κολλαγόνου. υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) παρουσίασε επίσης ενισχυμένη έκφραση και ενεργοποίηση σε κύτταρα IR. Η θεραπεία με αναστολέα της τυροσίνης κινάσης του EGFR, PD168393, μείωσε την αναλογία του επιμήκους κυττάρων και κυτταρικών διεισδυτικότητα. Σηματοδοσίας μόρια, συμπεριλαμβανομένων των εξωκυτταρικών σημάτων ρυθμιζόμενης κινάση-1/2 (Erk1 /2) και Akt, επέδειξαν υψηλότερη ενεργοποίηση σε κύτταρα IR. Η αναστολή της ενεργοποίησης Akt με κατεργασία με φωσφοϊνοσιτιδίου 3-κινάσης (ΡΙ3Κ) LY294002 μειώθηκε εισβολή κυττάρων IR, ενώ η αναστολή της ενεργοποίησης Erk1 /2 με ενεργοποιείται από μιτογόνο κινάση πρωτεϊνικής κινάσης (ΜΕΚ) αναστολέα U0126 δεν το έκανε. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ιντεγκρίνης α2β1 και EGFR προωθήσει συνεργατικά υψηλότερο εισβολής του IR-επέζησαν του καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων, διαμεσολαβείται εν μέρει από τον /μονοπατιού σηματοδότησης Akt PI3K, και θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως εναλλακτική λύση στόχων σε συνδυασμό με ακτινοθεραπεία

Αιτιολογική αναφορά.: Li Χ, Ishihara S, Yasuda Μ, Nishioka Τ, Mizutani Τ, Ishikawa Μ, et al. (2013) καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα που επιβιώνουν Ιονίζουσες Ακτινοβολίες Εμφάνιση Αυξημένη Ενσωματίνης α2β1- και EGFR-εξαρτημένων ικανότητα εισβολής. PLoS ONE 8 (8): e70905. doi: 10.1371 /journal.pone.0070905

Επιμέλεια: Ferenc Gallyas, Πανεπιστήμιο του Πετς Ιατρική Σχολή, την Ουγγαρία

Ελήφθη: 26 του Απρίλη του 2013? Αποδεκτές: 26, Ιουνίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 8 του Αυγούστου 2013

Copyright: © 2013 Li et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις-in-ενισχύσεις για JSPs Fellows (11J06280) με SI, την επιστημονική Έρευνα (Α) (21.249.065) σε ΕΣ και Η.Η., την Επιστημονική Έρευνα (Β) (24.390.285) σε Μ.Υ., Τ.Ν. και Η.Η., την Επιστημονική Έρευνα για τα καινοτόμα Περιοχές (24106502) για να Τ.Μ., και διερευνητική έρευνα (23651099) για να Κ.Κ. από το Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστημών και Τεχνολογίας, την Ιαπωνία. Η έρευνα αυτή υποστηρίζεται επίσης εν μέρει από την Ειδική Δαπάνες για «Αντίστροφη Μεταγραφική έρευνα από Advanced Medical Technology στο Advanced Life Science» για να Μ.Ι., H.S. και Η.Η. χρηματοδοτείται από το Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστημών και Τεχνολογίας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία θνησιμότητας από καρκίνο που σχετίζονται με ολόκληρο τον κόσμο, με μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) που αντιπροσωπεύουν την πλειοψηφία των περιπτώσεων. Οι θεραπευτικές επιλογές για NSCLC περιλαμβάνουν χειρουργική επέμβαση, χημειοθεραπεία, ακτινοθεραπεία, και διαδοχική ή ταυτόχρονη θεραπεία συνδυασμού [1]. Ακτινοθεραπεία είναι η ιατρική χρήση της ιονίζουσας ακτινοβολίας (IR), και θεωρείται μια μη επεμβατική τοπική θεραπεία, επηρεάζοντας κυρίως τα κύτταρα και τους ιστούς που βρίσκονται μέσα στην ακτίνα του IR. Χωρίς αμφιβολία, έχει αποδειχθεί ως ένα θεμελιώδες εργαλείο που διατίθεται στη μάχη κατά του καρκίνου.

Ωστόσο, η αύξηση πειραματικά δεδομένα δείχνουν ότι, υπό συνθήκες που δεν έχουν ακόμη κατανοηθεί, ακτινοθεραπεία της πρωτοπαθούς όγκου θα μπορούσε να ευνοήσει τη μετάσταση, η οποία μπορεί να εξηγήσει γιατί καλύτερο τοπικό έλεγχο της ακτινοβολίας δεν μεταφράζεται σε μεγαλύτερο χρόνο επιβίωσης, χωρίς απομακρυσμένες μεταστάσεις [2]. Ως εκ τούτου, εκτός από σημαντικές προσπάθειες για την ενίσχυση της ραδιοευαισθησία [3] – [6], η ταυτοποίηση των μορίων και οι μηχανισμοί της IR-επαγόμενης μεταστατική εξέλιξη του καρκίνου είναι απαραίτητες για τη βελτίωση της αποτελεσματικότητας της ακτινοθεραπείας και ποσοστό επιβίωσης των ασθενών. Πολλές μελέτες έχουν αποδείξει ότι η ακτινοβόληση μπορεί να προωθήσει εισβολή ή /και τη μετάσταση με προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων και ενεργοποίηση των οδών που εμπλέκονται στη μεταστατική διαδικασία σηματοδότησης. Μεταξύ αυτών, υποδοχείς κυτταρικής επιφάνειας, όπως ιντεγκρίνες και τους υποδοχείς αυξητικού παράγοντα, είναι συχνά μεταβάλλονται από IR και είναι ικανά να ενεργοποιούν πολλές διαφορετικές οδούς σηματοδότησης με πολλαπλές κυτταρικές αποκρίσεις. Για παράδειγμα, τα επίπεδα έκφρασης των ανβ3 ιντεγκρίνης σε κύτταρα γλοιώματος [7] και α5β1 σε καρκίνο του παγκρέατος [8] ρυθμίζεται προς τα πάνω με IR, διευκολύνοντας τόσο κυτταρική μετανάστευση και εισβολή. Ιντεγκρίνη α3β1 υπερεκφράζεται μετά IR, προωθώντας τη μετανάστευση των κυττάρων μηνιγγίωμα μέσω κινάσης εστιακής προσκόλλησης (ΡΑΚ) και εξωκυτταρικό σήμα κινάση ρυθμιζόμενη (ERK) [9]. Η ομάδα μας [10] και άλλοι [11] έδειξε έναν κεντρικό ρόλο της ιντεγρίνης β1 σε IR-επαγόμενη διεισδυτικότητα στον καρκίνο του πνεύμονα και μυελοβλάστωμα, αντίστοιχα. IR μπορεί επίσης να ενισχύσει την εισβολή μέσω της ενεργοποίησης του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) και του υποδοχέα που μοιάζει με ινσουλίνη αυξητικού παράγοντα 1 (IGFR1) [12], [13], και την έκκριση του αυξητικού παράγοντα ηπατοκυττάρων (HGF) [14].

Εδώ, επιδιώξαμε να κατανοήσουμε καλύτερα το μηχανισμό βασίζεται η αύξηση της εισβολής του καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων που επιβίωσαν IR. Έχουμε αποδείξει ότι ιντεγκρίνης α2β1 ρυθμίζεται αυξητικά επιλεκτικά σε IR κύτταρα και απαιτείται για την επιθετική φαινότυπο και εισβολή κυττάρων IR στο τρισδιάστατο (3D) γέλη κολλαγόνου. EGFR ήταν επίσης υπερεκφράζεται και πιο δραστήρια στα κύτταρα IR, συμβάλλοντας σε IR εισβολής, καθώς και. Διερεύνηση αρκετών σημαντικών μορίων σηματοδότησης έδειξαν ενεργοποίηση εξωκυτταρικό σήμα ρυθμιζόμενης κινάση-1/2 (Erk1 /2) και Akt σε κύτταρα IR, αλλά μόνο φωσφοϊνοσιτιδίου 3-κινάσης (ΡΙ3Κ) /Akt μεσολάβηση της μεταστατικής μεταγωγή σηματοδότησης από ιντεγρίνης α2β1 και EGFR . Η κατανόηση του πώς IR προωθεί η εισβολή των καρκινικών κυττάρων μπορεί να παρέχει τη διορατικότητα σε μετάσταση και τους πιθανούς θεραπευτικούς στόχους για να αποφευχθεί η επανάληψη της δευτερογενούς όγκους μετά την ακτινοθεραπεία.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture

ανθρώπινο αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα Α549 κυτταρική γραμμή ελήφθη από την American Type Culture Collection (ATCC? Manassas, VA). P κύτταρα και κύτταρα IR δημιουργήθηκαν προηγουμένως δημοσιευθεί [10]. Αμφότερες οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε Dulbecco Τροποποιημένο Eagle του Dulbecco (DMEM? Sigma, St. Louis, ΜΟ) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS? Equitech-Bio, Kerrville, ΤΧ) και 1% μίγμα αντιβιοτικού πενικιλλίνης /στρεπτομυκίνης (Sigma ). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε υγροποιημένο επωαστή στους 37 ° C με 5% CO

2.

Αντιδραστήρια

αναστολέα κινάσης EGFR PD168393 (Calbiochem, Merck KGaA, Damstadt), αναστολέα ΡΙ3Κ LY294002 ( Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ), και ενεργοποιημένα από μιτογόνο κινάση πρωτεϊνικής κινάσης (ΜΕΚ) αναστολέα U0126 (Cell Signaling Technology, Beverly, ΜΑ) χρησιμοποιήθηκαν στην υποδεικνυόμενη συγκέντρωση σε DMSO. Ένα αντίσωμα λειτουργία αποκλεισμού έναντι ιντεγκρίνης α2β1 (BHA2.1) αγοράστηκε από την Millipore (Billerica, ΜΑ). Western κηλίδωση αντισωμάτων ειδικών για τις ιντεγκρίνης α2 και β1 υπομονάδων αγοράστηκαν από BD BioScience (San Jose, CA). Το αντίσωμα ρ-EGFR (Tyr1068) αγοράστηκε από Signalway αντισωμάτων (College Park, Maryland). Αντισώματα ειδικά για EGFR, Akt, ρ-Akt (Ser473), ρ44 /42 Raf-ενεργοποιείται από μιτογόνο ΜΑΡΚ κινάσης πρωτεΐνης (Erk1 /2), ρ-ρ44 /42 ΜΑΡΚ (Erk1 /2) (Thr202 /Tyr204), αισθητήριο σήμα και ενεργοποιητής της μεταγραφής 3 (Stat3), ρ-Stat3 (Ser727), ρ38 ΜΑΡΚ, και ρ-p38 ΜΑΡΚ (Thr180 /Tyr182) αγοράστηκαν από την Cell Signaling Technology (Beverly, ΜΑ). αντίσωμα GAPDH αγοράστηκε από Ambion (Austin, ΤΧ). MFP488 phalloidin αγοράστηκε από Μο Bi Tec (Μοριακή Biologische Technologie, Göttingen).

3D Πολιτισμού κολλαγόνο

Ένα διάλυμα κολλαγόνου 1,6 mg /mL παρασκευάστηκε με ανάμιξη 3 mg /mL κολλαγόνου τύπου χοίρων IP διαλύματος (Nitta Gelatin, Osaka), 2,6 × μέσου DMEM (Sigma), και ρυθμιστικό (Nitta Gelatin) σε αναλογία 7:05: 1 επί πάγου. Ένα πιάτο 30-mm είχε πρώτα επικαλύπτεται με 150 μL του διαλύματος κολλαγόνου και αφέθηκε να πολυμεριστεί στους 37 ° C για 30 λεπτά, στη συνέχεια ξεπλένεται με μέσο. Στη συνέχεια, 10 μL 2 × 10

5 κύτταρα σε εναιώρημα αναμίχθηκε πλήρως με 150 μL διαλύματος κολλαγόνου και τοποθετήθηκαν στο κατώτερο στρώμα του πήγματος κολλαγόνου. Μετά τον πολυμερισμό του κολλαγόνου στους 37 ° C για 30 λεπτά, το κύτταρο-κολλαγόνου μείγμα καλύφθηκε με 2 mL FBS περιέχον μέσον και καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C και 5% CO

2 για περαιτέρω ανάλυση. Για την ανάλυση μορφολογίας και παρατήρηση time-lapse, ένα γυάλινο πιάτο υποκαταστάθηκε για το πλαστικό πιάτο. Για ευκολότερη παρατήρηση της κίνησης των κυττάρων στο ίδιο επίπεδο, χρησιμοποιήθηκε καλλιέργεια πηκτώματος άμμο. Τα κύτταρα πρώτα επιστρώνονται και αφήνονται να προσκολληθούν επί της κάτω γέλη και, μετά από 16 ώρες, το ανώτερο γέλη αποτέθηκε και πολυμερίζεται στους 37 ° C για 30 λεπτά. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε 2 κ.εκ. FBS που περιέχει μέσο στους 37 ° C και 5% CO

2.

Κυτταρική μορφολογία Ανάλυση

μορφολογία κυττάρων αναλύθηκε αφού στη γέλη κολλαγόνου 3D για 24 ώρες. Όταν ενδείκνυται, αναστολείς ή αντισώματα προστέθηκαν στο μέσο. εικόνες αντίθεσης φάσης λαμβάνονται τυχαία από 4 πεδία ανά δείγμα, και το ποσοστό των επιμήκων κυττάρων προσδιορίστηκε από τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα, συμπεριλαμβανομένων πάνω από 100 μεμονωμένα κύτταρα. Ένα κύτταρο θεωρήθηκε επίμηκες, όταν η μεγαλύτερη διάστασή της, ήταν δύο φορές η μικρότερη απόσταση, και όταν έδειξε τουλάχιστον μία προεξοχή, όπως έχει ήδη αναφερθεί [15].

Time-lapse μικροσκοπία και ποσοτικοποίηση της ταχύτητας των κυττάρων Εισβολή

2 × 10

4 κύτταρα καλλιεργήθηκαν με τη δοκιμασία gel-άμμου 3D για 24 ώρες, και παρατηρείται σε θάλαμο στους 37 ° C από ένα μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης (TE300, Nikon Instech, Τόκιο). Εικόνες τυχαία επιλεγμένα κύτταρα ελήφθησαν κάθε 5 λεπτά για 6 ώρες. Για τα πειράματα αναστολής, αναστολείς ή αντισώματα προστέθηκαν στο μέσο καλλιέργειας μετά από γέλη επικάλυψης όταν αυτό ενδείκνυται. Για την ποσοτικοποίηση της ταχύτητας των κυττάρων, έχουμε παρακολουθούνται οι κινήσεις των μεμονωμένων κυττάρων από Image-Pro λογισμικού (Media Cybernetics Inc., Silver Spring, MD). Η ταχύτητα των κυττάρων εισβολή υπολογίστηκε ως απόσταση (μm) ανά λεπτό από τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα, συμπεριλαμβανομένων 50 μεμονωμένα κύτταρα.

3D σφαιροειδές εισβολή Δοκιμασία

παρήχθησαν χρησιμοποιώντας το σύστημα βαρύτητας Plus σφαιροειδή (InSphero , Ζυρίχη, Ελβετία) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, 40 μΙ κυτταρικού εναιωρήματος που περιέχει 10

3 κύτταρα εμβολιάστηκε σε κάθε φρεάτιο της πλάκας για 4 d, και σφαιροειδή μεταφέρθηκαν σε γέλη κολλαγόνου και επικαλύπτονται αμέσως μετά. Αφού στην ζελατίνη στους 37 ° C για 30 λεπτά, προστέθηκε μέσο με FBS, και τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες. Όταν ενδείκνυται, αναστολείς ή αντισώματα προστέθηκαν κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας. Στη συνέχεια, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεϋδη σε PBS, κατέστησαν διαπερατά με 0,5% Triton Χ-100 σε PBS, και χρωματίστηκαν με MFP488 φαλλοϊδίνη. εικόνες φθορισμού ελήφθησαν με συνεστιακή μικροσκοπία σάρωσης με λέιζερ (σύστημα απεικόνισης συνεστιακού C1?. Nikon Instech, Tokyo). Η περίμετρος και η περιοχή του σφαιροειδή προσδιορίσθηκαν με λογισμικό ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland), όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [16]. Εν συντομία, να αλλάξετε την εικόνα με τον τύπο του 8-bit, και χρησιμοποιήστε τη λειτουργία όριο για τη μετατροπή τομείς ενδιαφέροντος προς κορεσμένα μαύρες περιοχές με ομοιόμορφο τρόπο για να έχουν ένα δυαδικό (μαύρο & amp? Λευκό) εικόνα. Στη συνέχεια αποκλείσει όλα τα σωματίδια λιγότερο από 3 pixels σε μέγεθος και αφαιρέστε τυχόν αντικείμενα, συγκρίνοντας τη δυαδική εικόνα με τις εικόνες φθορισμού. Χρησιμοποιήστε το πλαίσιο διαλόγου μετρήσεις που να προσδιορίζουν περιοχή και την περίμετρο. Χρησιμοποιήστε το πλαίσιο διαλόγου αναλύσει σωματιδίων να μετρήσει όλα τα σωματίδια και να δημιουργήσει μια «έκθεση σωματίδιο» για κάθε εικόνα στην οποία η έκταση και την περίμετρο των μεμονωμένων σωματιδίων και η περιοχή του αθροίσματος των μεμονωμένων σωματιδίων είναι τεκμηριωμένη. Η αναλογία υπολογίζεται από την περίμετρο

2 /[4π (περιοχή)]. Μια υψηλότερη αναλογία διαστάσεων σημαίνει μια πιο ακανόνιστη, διεισδύοντας δομή σφαιροειδές. Τα αποτελέσματα προσδιορίστηκαν από 3 ανεξάρτητα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

Western Blotting

Cells σε 3D καλλιέργεια κολλαγόνου μονιμοποιήθηκαν σε 500 μι παγωμένου τριχλωροξικού οξέος (TCA) για 3 λεπτά, και υπέστη πέψη με 200 μL 0.1% κολλαγενάση στους 37 ° C για 1 ώρα. Οι σβώλοι κυττάρων συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση στις 14.000 rpm για 2 λεπτά, επαναιωρήθηκαν σε 100 μL ρυθμιστικού διαλύματος Laemmli, και θερμάνθηκε στους 95 ° C για 5 λεπτά, πριν από την λύματα που υπερήχους για 30 δευτερόλεπτα και φυλάχθηκαν στους -20 ° C μέχρι τη χρήση. Για την εκτέλεση κηλίδωση Western, λύματα κυττάρων διαχωρίστηκαν σε πήκτωμα 12% SDS-πολυακρυλαμιδίου, και μεταφέρθηκε σε μία μεμβράνη διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (Millipore, Bedford, ΜΑ). Η μεμβράνη μπλοκαρίστηκε με 5% ανασυσταθέν αποβουτυρωμένο γάλα σε σκόνη σε διάλυμα TBST (10 mM Tris-HCl που περιέχει 150 mM NaCl και 0.05% Tween 20, ρΗ 7,5). Τα στυπώματα επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα αραιωμένα σε TBST ή μπορεί να πάρει Signal ανοσοαντίδραση Enhancer Λύση 1 (Toyobo, Osaka) στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Μετά την πλύση με TBST, συζευγμένο με υπεροξειδάση δευτερογενή αντισώματα χρένο αραιωμένο σε TBST ή μπορεί να πάρει σήμα ανοσοαντίδραση Enhancer Λύση 2 εφαρμόστηκαν και οι κηλίδες αναπτύχθηκαν από τον Ενισχυμένη σύστημα χημειοφωταύγειας ανίχνευσης (Perkin Elmer, Waltham, ΜΑ). Επίπεδα ανοσοσύμπλοκα GAPDH χρησιμοποιήθηκαν ως εσωτερικό πρότυπο για ίση φόρτωση. Ποσοτικοποίηση της έντασης του σήματος διεξήχθη χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ και ομαλοποιήθηκε ως προς την τιμή ελέγχου.

RT-PCR

Τα κύτταρα λύθηκαν με TriPure (Roche Applied Science, Indianapolis, ΙΝ) για την εκχύλιση RNA, και η αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής διεξήχθη με ReverTra Ace qPCR RT Kit (Toyobo). Για κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 3D γέλη κολλαγόνου, η εκχύλιση διεξήχθη δύο φορές. PCR πραγματοποιήθηκε με Taq πολυμεράσης σε ThermoPol Buffer (ΕΕΦ, Ίπσουιτς, ΜΑ). Εκκινητών ήταν ως εξής: ιντεγκρίνης α1:5′-GCCTCCTTTCTTGCTGTGTC-3 ‘(Forward), 5′-TGGGTGCTTATTGGTTCTCC-3′ (Reverse)? ιντεγκρίνη α2:5’-GAGCACCAGCAACAAAGTGA-3 ‘(Forward), 5′-CGGGTGTGTGTTCTGACATC-3′ (Reverse)? ιντεγκρίνη α4:5’-GAGATTTTCCCCTTGCATGA-3 ‘(Forward), 5′-GAGTGCAATGCAGACCTTGA-3′ (Reverse)? ιντεγκρίνη α5:5’-CACAGAGTTGCCCCGAGCACA-3 ‘(Forward), 5′-GCAGGGCTAGTGCCAGGGTTT-3′ (Reverse)? ιντεγκρίνη β1:5’-AATGAAGGGCGTGTTGGTAG-3 ‘(Forward), 5′-CCTCGTTGTTCCCATTCACT-3′ (Reverse)? και GAPDH: 5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 ‘(Forward), 5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’ (Reverse)

Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (qRT-PCR)

qRT-PCR. διεξήχθη με PikoReal (Thermo Scientific, Waltham, ΜΑ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, ολικό RNA (1 μ§) μεταγράφηκε αντίστροφα με τη χρήση των ειδικών εκκινητών ως ακολούθως: ιντεγκρίνης α2:5′-CACAGAGTTGCCCCGAGCACA-3 ‘(Forward), 5′-GCAGGGCTAGTGCCAGGGTTT-3′ (αντίστροφο)? ιντεγκρίνη β1:5’-GACGCCGCGCGGAAAAGATG-3 ‘(Forward), 5′-GCACCACCCACAATTTGGCCC-3′ (Reverse)? EGFR: 5’-CGCAGATAGTCGCCCAAAG-3 ‘(Forward), 5′-CCATCAGGGCACGGTAGAA-3′ (Reverse)? και β-ακτίνης: 5’-GAGCCTCGCCTTTGCCGATCC-3 ‘(Forward), 5′-ACATGCCGGAGCCGTTGTCG-3’ (αντίστροφο), το οποίο χρησιμοποιήθηκε ως γονίδιο αναφοράς για την ομαλοποίηση

μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) επιμόλυνση.

τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με siRNA κατά της αλληλουχίας-στόχου ιντεγκρίνης α2 5′-AACCAAAGAAGAAATGATTGTAG-3 ‘(αλληλουχία νόημα, siα2-1) ή 5′-AACAAGAATGCTCAGATAATTCT-3′ (αλληλουχία νόημα, siα2-2) χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη Αντιδραστήριο RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA). Ένα siRNA κατά της αλληλουχίας-στόχου Azami Πράσινο 5’-AGCAGATATTCAGGACTATTTCA-3 ‘(αλληλουχία με νόημα) χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος.

Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού

2 × 10

4 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 3D γέλη κολλαγόνου σε πλάκα 24 φρεατίων, και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με αναστολείς ή αντισώματα όταν ενδείκνυται κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας. Μέσο με ή χωρίς αναστολείς ή αντισώματα αλλάζονται κάθε δύο ημέρες. Τα κύτταρα σε 3D καλλιέργεια κολλαγόνου μονιμοποιήθηκαν σε 200 μί παγωμένου TCA για 3 λεπτά, και υποβάλλεται σε πέψη με 200 μL 0.1% κολλαγενάση στους 37 ° C για 1 ώρα, με πιπέτα σε βάθος και να συνεχίσει προς πέψη για άλλη 1 ώρα. Οι σβώλοι κυττάρων συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση, και επαναιωρήθηκαν με PBS. Η πυκνότητα κυττάρων προσδιορίσθηκε με ένα αιματοκυτταρόμετρο. Όλοι οι προσδιορισμοί εκτελέστηκαν εις τριπλούν σε 3 ανεξάρτητα πειράματα.

Στατιστική Ανάλυση

Κάθε πειραματική συνθήκη επαναλήφθηκε τουλάχιστον 3 φορές. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση ± δ.ϋ. Η στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση του μαθητή

t-test

, και μια τιμή Ρ ≤0.05 θεωρήθηκε σημαντική.

Αποτελέσματα

IR κύτταρα που υπάρχουν Ανώτατης Επεμβατική Δυνατότητα

Για να εξεταστεί κατά πόσον ο IR μπορεί να προωθήσει καρκινικών κυττάρων εισβολής, φαινότυπος κυττάρων πρώτη σύγκριση μεταξύ P και τα κύτταρα IR. Σε αντίθεση με παρόμοια μορφολογία σε 2D άκαμπτο υπόστρωμα, μορφολογίες κυττάρου διαφέρουν σημαντικά όταν ενσωματώνονται σε ένα 3D τζελ κολλαγόνου, όπου P κύτταρα είναι σφαιρικά? κύτταρα IR είναι πιο επίμηκες με προεξοχές [10].

Ποσοτικοποίηση της ταχύτητας εισβολής των μεμονωμένων κυττάρων έδειξε ότι τα κύτταρα ΙΚ κινείται ταχύτερα από περίπου δύο φορές από ό, τι τα κύτταρα Ρ σε γέλη κολλαγόνου (Εικ. 1Α). Επιπλέον, οι τροχιές των κυττάρων IR ήταν μακρύτερες και πιο κατευθυνόμενη από εκείνα του P κυττάρων, με κύτταρα συχνά στρέφονται γύρω (Εικ. 1Β). Αυξημένη διεισδυτικότητα των κυττάρων IR επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με δοκιμή σφαιροειδές εισβολή 3D για να μιμηθεί το χαρακτηριστικό των όγκων

in vivo

(Εικ. 1 C). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι, μετά ενσωματώνονται σε γέλη κολλαγόνου για 24 ώρες, τόσο Ρ και σφαιροειδή IR αυξήθηκαν σε όγκο κατά περίπου 20-40% (Εικ. 1 D), ενώ IR σφαιροειδή επεκταθεί μαζική προεξοχές, με ορισμένα κύτταρα που έχουν ήδη διαφύγει από το σώμα , και παρουσιάζεται ως μια υψηλότερη αναλογία από εκείνη της P κύτταρα (Εικ. 1 Ε), γεγονός που υποδηλώνει μια υψηλότερη εισβολής των κυττάρων IR σε microtissues.

(Α) Ποσοτικοποίηση της ταχύτητας εισβολής στο Ρ και κύτταρα IR παρουσιάζονται ως μέση τιμές ± SD, *** p & lt? 0.001. (Β) διαγράμματα που αντιπροσωπεύουν τις τροχιές εισβολή των 4 αντιπροσωπευτικών κυττάρων από Ρ και κύτταρα IR σε 3D κολλαγόνου γέλης άμμος καλύπτονται για 6 ώρες. προέλευση των κυττάρων ορίζεται ως (0,0), και η μονάδα κλίμακα είναι μm. (C) Ομοεστιακή εικόνες του εκπροσώπου MFP488 phalloidin-βάφονται P και σφαιροειδή IR σε γέλη κολλαγόνου σε 0 h ή 24 h. μπαρ κλίμακα, 200 μm. (Δ) Ποσοτικοποίηση της περιοχής του σφαιροειδή από το λογισμικό ImageJ. (Ε) Η αναλογία των σφαιριδίων υπολογίστηκε από την περίμετρο

2 /[4π (περιοχή)]. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσες τιμές ± SD (*** ρ & lt? 0.001) από 3 ανεξάρτητα πειράματα εις τριπλούν

Η

Ιντεγκρίνης α2β1 υπερεκφράζεται σε κύτταρα IR, και είναι απαραίτητη για την επιμήκυνση και διηθητικότητα IR. τα κύτταρα σε 3D κολλαγόνο

οι ιντεγκρίνες είναι επιφανειακή συγκολλητική κυτταρικούς υποδοχείς που σχηματίζονται από α και β υπομονάδες, οι οποίες συνδέονται με πρωτεΐνες (ECM) εξωκυττάρια μήτρα. Integrin-προσκόλληση στην ECM πυροδοτεί ενδοκυτταρικά μονοπάτια σηματοδότησης για να ρυθμίζει κυτταρική μορφολογία, τη μετανάστευση, εισβολή, τον πολλαπλασιασμό και την επιβίωση [17]. Η δραματική μορφολογική αλλαγή των κυττάρων ΙΚ σε σύγκριση με το Ρ κύτταρα όταν περιβάλλεται από μια μήτρα κολλαγόνου μας ενθάρρυνε να ερευνήσει το μοτίβο έκφρασης ιντεγκρίνης. Σε προηγούμενη μελέτη μας, δείξαμε ότι knockdown της ιντεγρίνης β1 με siRNA ή θεραπεία με ανασταλτικές ΑΙΙΒ2 αντίσωμα της επαγόμενης σφαιρική μορφολογία των κυττάρων IR σε 3D γέλη κολλαγόνου, που είναι παρόμοια με Ρ κύτταρα [10]. Δεδομένου ότι το κολλαγόνο τύπου Ι και φιμπρονεκτίνης (απομονωμένος από τους FBS στο μέσο και εκκρίνονται από τα κύτταρα) είναι τα κύρια συστατικά ECM στο μοντέλο μας κολλαγόνου γέλης, το πρότυπο έκφρασης των ιντεγκρινών, συμπεριλαμβανομένων α1β1, α2β1, α4β1 και α5β1, διερευνήθηκε με RT-PCR. Μεταξύ αυτών, α1β1 και α2β1 αναφέρονται ως τα κύρια υποδοχείς κολλαγόνου, ενώ α4β1 και α5β1 αναφέρονται ως τα κύρια υποδοχείς φιμπρονεκτίνης [18]. Τα αποτελέσματα της RT-PCR, δείχνουν ότι, σε IR κύτταρα, τα επίπεδα μεταγραφής των α2 και β1 αυξημένο, το επίπεδο της α1 μειώθηκε, και δεν υπήρχε εμφανής μεταβολή στα επίπεδα των α4 και α5 (Εικ. 2Α). Τα αποτελέσματα της qRT-PCR επιβεβαίωσε περαιτέρω ότι το επίπεδο μεταγραφής του α2 ενισχύθηκε κατά 4,8 φορές, και ότι από β1 ενισχύθηκε κατά 2,2 φορές (Σχ. 2Β). Επιπλέον, κηλίδωση Western διεξήχθη για την ανίχνευση των επιπέδων τους σε πρωτεΐνες, και μια παρόμοια ανύψωση παρατηρήθηκε (Σχ. 2C). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ιντεγκρίνης α2β1 μπορεί να παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην αλλαγμένη αλληλεπίδραση μεταξύ των κυττάρων και IR ECM. Για να επιβεβαιωθεί κατά πόσο η αυξημένη έκφραση της ιντεγρίνης α2β1 είναι απαραίτητη για τη διεισδυτικότητα κυττάρων IR, knockdown του α2 έκφραση σε κύτταρα IR με δύο είδη siRNA ειδικά για ιντεγκρίνης α2 πραγματοποιήθηκε, και το αποτέλεσμα επιβεβαιώθηκε με RT-PCR (Εικ. 3Α, αριστερά). Πράγματι, νοκ ντάουν της α2 μειωμένη επιμήκυνση των κυττάρων IR (Εικ. 3Α, δεξιά) και εισβολή σε γέλη κολλαγόνου (Ταινία S1, S2).

(Α) Ημι-ποσοτική ανάλυση των επιπέδων mRNA των υπομονάδων ιντεγκρίνης, συμπεριλαμβανομένων α1, α2, α4, α5, και β1, από Ρ και κύτταρα IR με RT-PCR. (Β) Ποσοτική ανάλυση των επιπέδων mRNA του ιντεγκρίνης α2 και β1 υπομονάδων από Ρ και κύτταρα IR με qRT-PCR. Ένταση των σημάτων ποσοτικοποιήθηκε με πυκνομετρία και κανονικοποιήθηκε με β-ακτίνη. Εκπροσώπηση είναι μέση τιμή ± Τ.Α της σχετικής επίπεδο mRNA (** p & lt? 0,01) από 3 ανεξάρτητα πειράματα, αναφέρονται ως φορές μεταβολής σε σχέση με το P κύτταρα. (C) Ανάλυση των επιπέδων πρωτεΐνης ιντεγκρίνης α2 και β1 υπομονάδων από κύτταρα Ρ και IR καλλιεργούνται σε 3D γέλη κολλαγόνου με κηλίδωση Western. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

(Α) εξόντωση της ιντεγκρίνης α2 υπομονάδας σε κύτταρα IR οδήγησε σε μια στρογγυλή μορφολογία σε 3D γέλη κολλαγόνου. κύτταρα IR που επιμολύνθηκαν με 2 siRNAs ειδικά για ιντεγκρίνης α2 (siα2-1 ή siα2-2), ή μια συγκεκριμένη siRNA στοχεύει Azami-Πράσινο (siAG) σαν δείγμα αναφοράς, μεταφέρθηκαν σε ένα 3D πηκτή κολλαγόνου και καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες . Αριστερά: Αποτελέσματα RT-PCR για να επαληθευτεί η επίδραση συγκεκριμένων knockdown του ιντεγκρίνης α2. Δεξιά: αντιπροσωπευτικό εικόνες των κυττάρων μορφολογίες. Η μεγέθυνση των μεμονωμένων κυττάρων αντιπροσωπεύεται από τα λευκά κουτιά. μπαρ κλίμακα, 20 μm. (Β) Λειτουργική μπλοκάρισμα της ιντεγρίνης α2β1 προκάλεσε μία αναστρέψιμη σύμπτυξη των προεξοχών και διηθητικότητας των κυττάρων IR. παρατήρηση time-lapse των κυττάρων IR αντιμετωπίζονται με BHA2.1 σε 3D κολλαγόνο γέλη άμμο. Οι αντιπροσωπευτικές εικόνες των κυττάρων IR που ήταν μη-επεξεργασμένα (ΝΤ), υποβλήθηκε σε επεξεργασία με BHA2.1 (BHA2.1), ή να πλυθεί (Πλένουμε έξω) με φρέσκο ​​μέσο δείχνονται. Λευκά κουτιά περιγράψει τη συγκεκριμένη περιοχή που μεγεθύνεται. μπαρ κλίμακα, 100 μm. (C) Ανάλυση μορφολογία κυττάρων του BHA2.1-κατεργασμένων κυττάρων IR έναντι των ελέγχων σε 3D γέλη κολλαγόνου με την ποσοτικοποίηση του ποσοστού των επιμήκων κυττάρων σε σύνολο, εκφράζονται ως μέσες τιμές ± SD (*** ρ & lt? 0.001) από 3 ανεξάρτητα πειράματα συμπεριλαμβανομένων περίπου 100 κύτταρα. (Δ) Ποσοτικοποίηση της ταχύτητας σε Ρ και κύτταρα IR σε 3D κολλαγόνου γέλης άμμου για 6 ώρες, εκφράζονται ως μέσες τιμές ± Τ.Α (*** ρ & lt? 0.001) από 3 ανεξάρτητα πειράματα, συμπεριλαμβανομένων περίπου 50 κύτταρα. (Ε) Ομοεστιακή εικόνες του εκπροσώπου του MFP488 phalloidin-βάφονται Ρ και IR σφαιροειδή σε γέλη κολλαγόνου σε 0 h ή 24 h. μπαρ κλίμακα, 200 μm. (F) Ποσοτικοποίηση της περιοχής του σφαιροειδή από το λογισμικό ImageJ. (Ζ) Η αναλογία των σφαιριδίων υπολογίστηκε από την περίμετρο

2 /[4π (περιοχή)]. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσες τιμές ± SD (*** ρ & lt? 0.001). από 3 ανεξάρτητα πειράματα εις τριπλούν

Η

Από ιντεγκρίνες δεσμεύονται άμεσα συστατικά του ECM και παρέχουν την απαραίτητη για την κυτταρική κινητικότητα και εισβολή έλξη , θα εξεταστεί κατά πόσον η αλληλεπίδραση μεταξύ των ιντεγκρινών α2β1 και την ECM ήταν σημαντική για την κυτταρική IR εισβολή. Η BHA2.1 αντίσωμα λειτουργία αποκλεισμού (400 ng /mL) που αναγνωρίζει την περιοχή Ι του α2, η θέση δέσμευσης για κολλαγόνα, χρησιμοποιήθηκε για τη θεραπεία κύτταρα IR στην πηκτή. παρατήρηση Time-lapse έδειξε ότι η αναστολή της ενεργοποίησης των ιντεγκρινών α2β1 επάγεται τόσο η συστολή των κυτταρικών προεξοχών και χαμηλή διεισδυτικότητα σύντομα μετά τη θεραπεία, και την αφαίρεση του αντισώματος με την προσθήκη φρέσκου μέσου αποκατασταθεί εισβολή (Σχ. 3Β, Ταινία S3). θεραπεία BHA2.1 μείωσε σημαντικά την αναλογία της επιμήκους φαινότυπο (Σχ. 3C) και της ταχύτητας εισβολή σε κύτταρα IR (Εικ. 3D), και κατήργησε σφαιροειδούς εισβολή (Σχ. 3Ε-3G), γεγονός που υποδηλώνει ότι η λειτουργική α2β1 ιντεγκρίνη απαιτείται για IR κυτταρική εισβολή.

αυξημένη έκφραση EGFR και ενεργοποίηση σε κύτταρα IR ασχολείται με IR κυττάρων εισβολή

EGFR είναι ένας υποδοχέας κινάσης τυροσίνης που συχνά υπερεκφράζεται ή λιμάνια συστατικά ενεργός μεταλλάξεις σε NSCLC [19]. Έτσι, ελέγξαμε κατά πόσο οι διάφορες τροποποιήσεις του EGFR συνέβη στο IR κύτταρα. Απροσδόκητα, τόσο EGFR μεταγραφικό επίπεδο και το επίπεδο της πρωτεΐνης ήταν πολύ αυξημένα σε κύτταρα IR, σε σύγκριση με εκείνους σε P κύτταρα (Σχ. 4Α, 4Β). Μια σταθερά υψηλού επιπέδου ενεργοποίησης EGFR επί του υπολείμματος σηματοδότησης που σχετίζονται με Tyr1068 παρατηρήθηκε επίσης σε κύτταρα IR χωρίς διέγερση από συνδέτη EGFR (Εικ. 4Β). Ως εκ τούτου, ένας ειδικός αναστολέας στόχευση της τυροσινικής κινάσης του EGFR, PD168393 (10 μΜ), χρησιμοποιήθηκε για τη θεραπεία κύτταρα IR, και δείχθηκε να μειώνει τη φωσφορυλίωση του EGFR (Εικ. 4C), η αναλογία του επιμήκους κυττάρων IR (Σχ. 4D , 4Ε), και η ταχύτητα εισβολή (Σχ. 4F). Όπως ιντεγκρίνης α2β1 αναστολή, PD168393 επεξεργασμένα σφαιρίδια IR παρέμεινε τακτική σφαιροειδή χωρίς αύξηση του όγκου (Σχ. 4G, 4Η) ή προεξοχή (Σχ. 4G, 4I). Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν την υπόθεση ότι η οδός σηματοδότησης EGFR εμπλέκεται στην αυξημένη ικανότητα εισβολής των κυττάρων IR.

(Α) Ποσοτική ανάλυση των επιπέδων EGFR mRNA από κύτταρα Ρ και IR με qRT-PCR, που απεικονίζεται ως μέσες τιμές ± SD από σχετικό επίπεδο mRNA (*** p & lt? 0.001) από 3 ανεξάρτητα πειράματα, αναφέρονται ως φορές μεταβολής σε σχέση με το P κύτταρα. (Β) Ανάλυση των επιπέδων της πρωτεΐνης του συνολικού EGFR και φωσφορυλιωμένο EGFR (Tyr1068) με κηλίδωση Western. Ένταση σημάτων ποσοτικοποιήθηκαν με πυκνομετρία και κανονικοποιήθηκε με GAPDH. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσες τιμές ± Τ.Α του σχετικού επιπέδου πρωτεΐνης (** ρ & lt? 0,01) από 3 ανεξάρτητα πειράματα, που υποδεικνύεται ως φορές μεταβολής σε σχέση με το Ρ κύτταρα. (Ο-Ε) Αναστολή της ενεργοποίησης EGFR προκάλεσε μία στρογγυλή μορφολογία των κυττάρων IR. κύτταρα IR σε 3D γέλη κολλαγόνου έλαβαν θεραπεία με 10 μΜ PD168393 αναστολέα EGFR ή DMSO σαν ένας έλεγχος για 24 ώρες. (C) Ανάλυση έκφρασης φωσφορυλιωμένου EGFR (Tyr1068) και η συνολική EGFR από PD168393- και DMSO-επεξεργασμένα δείγματα με κηλίδωση Western. GAPDH χρησιμοποιήθηκε σαν ένας έλεγχος. (D) Αντιπροσωπευτικές εικόνες του κυττάρου μορφολογίες των δειγμάτων PD168393 αγωγή έναντι του ελέγχου DMSO-θεραπεία. (Ε) Το ποσοστό των επιμήκων κυττάρων ποσοτικά από 3 ανεξάρτητα πειράματα, συμπεριλαμβανομένων περίπου 100 κύτταρα, *** p & lt? 0.001. (F) Ποσοτικοποίηση της ταχύτητας σε DMSO-ή PD168393-επεξεργασμένα κύτταρα IR σε 3D κολλαγόνο γέλη άμμο για 6 ώρες παρουσιάζονται ως μέσες τιμές ± Τ.Α (*** p & lt? 0.001) από 3 ανεξάρτητα πειράματα, συμπεριλαμβανομένων περίπου 50 κυττάρων. (G) Ομοεστιακή εικόνες των αντιπροσωπευτικών MFP488 σφαιροειδή IR φαλλοϊδίνης χρώση σε γέλη κολλαγόνου για 0 ​​ώρες και σφαιροειδή IR αντιμετωπίζονται με DMSO ή PD168393 επί 24 ώρες. μπαρ κλίμακα, 200 μm. (H) Ποσοτικοποίηση της περιοχής του σφαιροειδή από το λογισμικό ImageJ. (Ι) Η αναλογία των σφαιριδίων υπολογίστηκε από την περίμετρο

2 /[4π (περιοχή)]. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσες τιμές ± SD (*** p & lt? 0.001). από 3 ανεξάρτητα πειράματα εις τριπλούν

Η

ιντεγκρίνη α2β1 και EGFR Προώθηση IR κυττάρων Εισβολή εν μέρει μέσω PI3K /Akt

Για να προσδιορίσετε περαιτέρω τον μηχανισμό της α2β1- ιντεγκρίνης και EGFR που εξαρτώνται από την εισβολή των κυττάρων IR, εμείς που ρωτήθηκαν πολλά σημαντικά μεταγενέστερα μόρια σηματοδότησης που ρυθμίζονται από ιντεγκρίνης α2β1 ή /και EGFR, συμπεριλαμβανομένων των ΜΕΚ /Erk1 /2 [20], [21] , PI3K /Akt [21], [22], Stat3 [23], και της p38 MAPK [24], [25]. Μεταξύ αυτών, western αποτύπωση έδειξε μόνο Erk1 /2 και ενεργοποίηση Akt να απορυθμίζεται σημαντικά σε IR κύτταρα, με συνολική και φωσφορυλιωμένη επίπεδα πρωτεΐνης των διαμορφωτών »σχετικά με τις αναγκαίες για μεταγωγή σήματος (Εικ. 5Α) υπολείμματα. Για να επιβεβαιωθεί αν η ενεργοποίηση τους σχετίζεται με διεισδυτικότητα κυττάρων IR, χρησιμοποιήθηκαν ειδικοί αναστολείς στόχευσης ανάντη κινάσες τους, συμπεριλαμβανομένων U0126 αναστολέα ΜΕΚ (10 μΜ) για Erk1 /2 και αναστολέα ΡΙ3Κ LY294002 (50 μΜ) για Akt. Η ενεργοποίηση του Akt και Erk1 /2 καταργήθηκε από μειωμένη φωσφορυλίωση μετά την αναστολή της ανάντη μορίων τους (Σχ. 6Α). ανάλυση έδειξε ότι η μορφολογία θεραπεία LY294002 μείωσε το ποσοστό του επιμήκους κύτταρα (Σχ. 5C) και, ως εκ τούτου, την ταχύτητα εισβολή (Σχ. 5D), ενώ η θεραπεία U0126 δεν το έκανε. Σταθερά, 3D σφαιροειδή δοκιμασία εισβολή έδειξε ότι εισβολή των κυττάρων ΙΚ σε γέλη κολλαγόνου κατεστάλη μόνο μετά από αγωγή με LY294002, ενώ U0126 είχε μικρή επίδραση (Σχ. 5Ε, 5G), έστω και αν σφαιροειδές επέκταση ανεστάλη ελαφρά (Εικ. 5F). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν την εμπλοκή της PI3K /Akt, αλλά δεν MEK /Erk1 /2, στην επεμβατική μεταγωγής σήματος στα κύτταρα IR.

(Α) ανάλυση της έκφρασης του συνόλου και φωσφορυλιωμένες μορφές της Akt (Ser473), Erk1 /2 (Thr202 /Tyr204), ρ38 (Thr180 /Tyr182) και Stat3 (Ser727) με western αποτύπωση. Ένταση των σημάτων ποσοτικοποιήθηκε με πυκνομετρία και κανονικοποιήθηκε με GAPDH. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσες τιμές ± Τ.Α του σχετικού επιπέδου πρωτεΐνης (** ρ & lt? 0,01) από 3 ανεξάρτητα πειράματα, που υποδεικνύεται ως φορές μεταβολής σε σχέση με το Ρ κύτταρα. (Β-Ο) Επιδράσεις της αναστολής της Akt και ενεργοποίηση Erk1 /2 στη μορφολογία των κυττάρων IR. (Β) εικόνες αντίθεσης φάσης του αναστολέα ΡΙ3Κ LY294002 (50 μΜ) ή ΜΕΚ αναστολέα U0126 (10 μΜ) επεξεργασμένων κυττάρων IR έναντι DMSO-κατεργασμένα κύτταρα IR για 24 ώρες σε 3D γέλη κολλαγόνου (γ) το ποσοστό των επιμήκων κυττάρων ποσοτικοποιήθηκε από 3 ανεξάρτητα πειράματα, συμπεριλαμβανομένων περίπου 100 κύτταρα, *** p & lt? 0.001. (Δ) Ποσοτικοποίηση της ταχύτητας σε DMSO-50 μΜ LY294002-, ή 10 μΜ U0126-επεξεργασμένα κύτταρα IR σε 3D κολλαγόνου γέλης άμμου για 6 ώρες, που απεικονίζεται ως μέσες τιμές ± SD (*** ρ & lt? 0.001) από 3 ανεξάρτητες πειράματα, συμπεριλαμβανομένων περίπου 50 κυττάρων. (Ε) Ομοεστιακή εικόνες των αντιπροσωπευτικών MFP488 σφαιροειδή IR φαλλοϊδίνης χρώση σε γέλη κολλαγόνου για 0 ​​ώρες και σφαιροειδή IR αντιμετωπίζονται με DMSO, LY294002, ή U0126 για 24 ώρες. μπαρ κλίμακα, 200 μm. (F) Ποσοτικοποίηση της περιοχής του σφαιροειδή από το λογισμικό ImageJ. (G) Ο λόγος διαστάσεων της σφαιροειδή υπολογίστηκε από την περίμετρο

2 /[4π (περιοχή)], και τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσες τιμές ± SD (*** ρ & lt? 0.001). Από 3 ανεξάρτητα πειράματα εις τριπλούν

(Α) κανονισμός του EGFR σε PI3K /Akt και μονοπάτια /Erk1 /2 σηματοδότησης ΜΕΚ. κύτταρα IR σε 3D γέλη κολλαγόνου έλαβαν θεραπεία με DMSO (έλεγχος), EGFR αναστολέας PD168393 (10 μΜ), ο αναστολέας ΡΙ3Κ LY294002 (50 μΜ), ή ΜΕΚ αναστολέα U0126 (10 μΜ) για 24 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, και τα ποσά των φωσφορυλιωμένη και το συνολικό Akt (Ser473) και Erk1 /2 (Tyr202 /Tyr204) αναλύθηκαν με western αποτύπωση.