Αφηρημένο

Ιστορικό

Ο καρκίνος του πνεύμονα παραμένει η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο παγκοσμίως. Ραδιοαντοχή του καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων οδηγεί σε απαράδεκτο ποσοστό τοπική-περιφερειακή αποτυχία. Αν και ακτινοβολία είναι γνωστό ότι επάγει απόπτωση, πρόσφατη μελέτη μας έδειξε ότι knockdown του προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών Bak και Βαχ ως αποτέλεσμα την αύξηση σε αυτοφαγικά κυτταρικό θάνατο και ραδιοευαισθησία καρκίνο των πνευμόνων

in vitro

. Για να διερευνηθεί περαιτέρω το δυναμικό της αναστολής απόπτωσης ως ένας τρόπος για την ευαισθητοποίηση του καρκίνου του πνεύμονα για θεραπεία, ελέγξαμε M867, μία νέα χημική και αναστρέψιμος αναστολέας της κασπάσης-3, σε συνδυασμό με ιονίζουσα ακτινοβολία

in vivo

και

σε vitro

.

Μέθοδοι και Εκτίμηση

M867 μειωμένη κλωνογονική επιβίωση σε Η460 κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα (DER = 1.27, ρ = 0,007) σε σύγκριση με τα κύτταρα που κατεργάστηκαν υπό αγωγή με όχημα. Βρήκαμε ότι η χορήγηση M867 με ιοντίζουσα ακτινοβολία σε ένα

in vivo

μοντέλο καρκίνου του πνεύμονα άκρων πίσω ποντίκι ήταν καλά ανεκτό και παρήγαγε μια σημαντική καθυστέρηση της ανάπτυξης του όγκου σε σύγκριση μόνο με την ακτινοβολία. Μια δραματική μείωση στην αγγείωση του όγκου παρατηρήθηκε με M867 και ακτινοβολία χρησιμοποιώντας χρώση παράγοντα νοη Willebrand. Επιπλέον, ο δείκτης Κί67 έδειξε & gt? 5-πλάσια μείωση του πολλαπλασιασμού του όγκου στην ομάδα θεραπείας συνδυασμού, παρά τα μειωμένα επίπεδα της απόπτωσης που παρατηρήθηκε με χρώση άκρο επισήμανση dUTP nick τερματικό δεοξυνουκλεοτιδυλοτρανσφεράσης μεσολάβηση. Ραδιοευαισθητοποίησης επίδραση του M867, μέσω αναστολής της κασπασών ελέγχθηκε

χρησιμοποιώντας

κασπάσης-3 /-7 διπλό νοκ-άουτ (ϋΚΟ) μοντέλο εμβρυϊκών ινοβλαστών (MEF) κυττάρων ποντικού. Σύμφωνα με προηγούμενη μελέτη μας, αυτοφαγία συνέβαλαν με το μηχανισμό της αυξημένης κυτταρικό θάνατο, μετά την αναστολή της απόπτωσης. Επιπλέον, δοκιμασία matrigel παρουσίασαν μείωση σε ποσοστό

in vitro

ενδοθηλιακά σχηματισμό σωληναρίου κατά τη διάρκεια της θεραπείας συνδυασμού M867 /ακτινοβολία.

Συμπεράσματα

M867 ενισχύει τα κυτταροτοξικά αποτελέσματα της ακτινοβολίας επί των πνευμόνων καρκίνο και αγγείωση του, τόσο

in vitro

και

in vivo

. M867 έχει τη δυνατότητα να παρατείνει όγκου καθυστέρηση ανάπτυξης με την παρεμπόδιση του πολλαπλασιασμού των όγκων. Οι κλινικές μελέτες που απαιτούνται για τον προσδιορισμό του δυναμικού αυτού του συνδυασμού θεραπείας σε ασθενείς με τοπικά προχωρημένο καρκίνο του πνεύμονα

Παράθεση:. Kim KW, Moretti L, Lu Β (2008) M867, ένα μυθιστόρημα εκλεκτικός αναστολέας της κασπάσης-3 Ενισχύει κυτταρικό θάνατο και Επεκτείνει καθυστέρηση ανάπτυξης του όγκου σε μοντέλα ακτινοβολημένα καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 3 (5): e2275. doi: 10.1371 /journal.pone.0002275

Επιμέλεια: Mark R. Cookson, National Institutes of Health, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 5 Φλεβάρη του 2008? Αποδεκτές: 17 Απρίλη του 2008? Δημοσιεύθηκε: May 28, 2008

Copyright: © 2008 Kim et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίζεται εν μέρει από το αμερικανικό Εθνικό Ίδρυμα Καρκίνου (NCI) Επιχορήγηση 1R01 CA125842-01A1. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό και τη διεξαγωγή της μελέτης, κατά τη συλλογή δεδομένων, την ανάλυση και την ερμηνεία, και την απόφαση να δημοσιεύσει, αξιολόγηση, έγκριση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δήλωσε ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

καρκίνου

πνεύμονα είναι ο συχνότερος καρκίνος παγκοσμίως και η κύρια αιτία θνησιμότητας σχετίζονται με τον καρκίνο παρά τη θεραπεία πολυτροπικότητα, με αποτέλεσμα 160.390 εκτιμώμενη θανάτων σε οι Ηνωμένες Πολιτείες μόλις το 2007 [1]. Δεδομένου ότι τα όρια αντοχής του όγκου αποτελεσματικότητα τρέχουσες θεραπείες [2], [3], [4], όπως ακτινοθεραπεία, η ταυτοποίηση νέων θεραπευτικών στρατηγικών είναι κρίσιμη για τη βελτίωση της έκβασης. Από τις διάφορες διαδικασίες κυτταρικού θανάτου που εμπλέκονται στη θεραπεία του καρκίνου, η απόπτωση ήταν το πιο καλά μελετημένο [5]. Κατά τη διάρκεια της απόπτωσης, οι μεγάλες μεσολαβητές της κυτταρικής καταστροφής είναι τελεστές της κασπάσης-3 και -7, τα μέλη της ασπαρτικής κυστεΐνης πρωτεάσες της οικογένειας, τα οποία διασπούν τις πρωτεΐνες μετά από ένα κατάλοιπο ασπαρτικού [6]. Αν και ακτινοβολία είναι γνωστό ότι επάγει απόπτωση, ακόμη αντιπροσωπεύει ένα μικρό τμήμα του κυτταρικού θανάτου σε ακτινοβολημένα στερεούς όγκους [7], και πρόσφατη μελέτη μας έδειξε ότι knockdown του προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών Bak και Βαχ ως αποτέλεσμα την αύξηση στην ραδιοευαισθησία καρκίνο του πνεύμονα

in vitro

[8]. Autophagy, ένα μη αποπτωτικό τύπος κυτταρικού θανάτου, δείχθηκε να συνεισφέρει στον μηχανισμό του αυξημένο κυτταρικό θάνατο.

Autophagy είναι μια εξελικτικά συντηρημένη διαδικασία και ένας μηχανισμός επιβίωσης που επιτρέπει την ανακύκλωση των μακρόβιων οργανίδια και πρωτεΐνες [ ,,,0],9], [10]. Αυτοφαγία χρησιμεύει επίσης ως ένα μονοπάτι αυτοκτονίας με πλήρη αυτο-χώνευση υπό υπερβολική συνθήκες στρες [11], [12], η οποία έχει χαρακτηριστεί ως προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος τύπου 2 [9], [10]. Κατά τη διάρκεια της αυτοφαγία, αποικοδόμηση οργανιδίων συμβαίνει μέσω του σχηματισμού διπλού κυτταροπλασματικής μεμβράνης κενοτόπια, που ονομάζεται αυτοφαγοσώματα με ανέπαφο πυρήνες [13]. κανονισμού αυτοφαγία υπήρξε αυξανόμενο ενδιαφέρον, λόγω της επίπτωσής της στην ογκογένεση. Επιπλέον, η παρατεταμένη αυτοφαγία μπορεί να οδηγήσει σε θάνατο των καρκινικών κυττάρων, που οδηγεί στην υπόθεση ότι autophagy μπορούν να αξιοποιηθούν ως στόχος θεραπεία του καρκίνου [14], [15], [16], [17].

Για περαιτέρω διερευνήσει τη δυνατότητα αναστολής της απόπτωσης ως ένας τρόπος για την ευαισθητοποίηση του καρκίνου του πνεύμονα για θεραπεία, ελέγξαμε M867, μια νέα χημική και αναστρέψιμος αναστολέας της κασπάσης-3 [18], σε συνδυασμό με ιονίζουσα ακτινοβολία

in vivo

και

in vitro

.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

Πρωτοβάθμια ποντίκι εμβρυϊκών ινοβλαστών (ΠΜΑ) προήλθαν από αγρίου τύπου (WT) και Caspase3

– /- /7

– /- διπλό knockout (ϋΚΟ) ποντικούς και αθανατοποιημένα με επιμόλυνση με ένα πλασμίδιο που περιέχει SV40-T-αντιγόνου (που παρέχεται από τον Dr. Richard Flavell, Πανεπιστήμιο Yale, New Haven, CT). Οι MEF καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ (Invitrogen Corporation) συμπληρωμένο με εμβρυϊκό βόειο 10% (FBS), 1% πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη και 0,5 μmol /L 2-μερκαπτοαιθανόλη. Η460 καρκίνου πνεύμονος κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 (Invitrogen, Grand Island, ΝΥ) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό και 1% πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη στους 37 ° C και υγροποιημένο 5% CO2. HUVECs ελήφθησαν από την Clonetics και συντηρήθηκαν σε μέσο ΕΒΜ-2 συμπληρωμένο με EGM-2 MV μονά κλάσματα (BioWhittaker). M867 ελήφθη από τη Merck & amp? Co., Inc.

κλωνογονική δοκιμασία

Η460 πνεύμονα καρκινικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με DMSO ή M867 (1.4 ηΜ, 5ηΜ και 10ηΜ για 24 ώρες)? WT κύτταρα ΠΜΑ και κασπάσης 3/7 κύτταρα DKO MEFs υποβλήθηκαν σε θεραπεία με DMSO ή M867 (5ηΜ και 10ηΜ για 24 ώρες)? και ΠΜΑ κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τα siRNA κατά της κασπάσης-3 και-7, siRNAs κατά Beclin-1 και ATG5, ή τον έλεγχο. Τα κύτταρα στη συνέχεια ακτινοβολούνται με 0 έως 6 Gy όπως υποδεικνύεται σε ένα ρυθμό δόσης 1,8 Gy /min, με τη χρήση ενός

137 Cs ακτινοβολίας (J.L. Shepherd και Asssociates, Glendale, CA). Μετά την ακτινοβολία, τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C για 8-10 ημέρες. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν για 15 λεπτά με 3: 1 μεθανόλη: οξικό οξύ και βάφτηκαν για 15 λεπτά με 0,5% κρυσταλλικό ιώδες (Sigma) σε μεθανόλη. Μετά τη χρώση, οι αποικίες μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας αποκοπή 50 βιώσιμων κυττάρων. κλάσμα επιβίωσης υπολογίστηκε ως (μέση απαριθμήσεις αποικίας) /(κύτταρα εμβολιάσθηκαν) × (ικανότητα επίστρωσης (ΡΕ)), όπου ΡΕ ορίστηκε ως (μέση απαριθμήσεις αποικίας) /(κύτταρα εμβολιάστηκαν για μη ακτινοβολημένα δείγματα αναφοράς). DER υπολογίστηκε ως η δόση (Gy) για την ακτινοβολία μόνο του διηρημένο με τη δόση (Gy) για την ακτινοβολία συν M867 (κανονικοποιημένη για τοξικότητα M867) που είναι αναγκαία για ένα κλάσμα επιβίωσης των 0,25. Τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν και η μέση, SD, και υπολογίστηκαν οι τιμές Ρ.

Ανοσοαποτύπωσης

Τα κύτταρα (0.5 × 10

6) υποβλήθηκαν σε θεραπεία με διάφορες Gy και τα ναρκωτικά. Αυτά συλλέχθηκαν σε διάφορα χρονικά σημεία, και στη συνέχεια πλύθηκαν με παγωμένο PBS δύο φορές πριν από την προσθήκη του ρυθμιστικού διαλύματος λύσης (20 mM Tris-HCl, ρΗ 7.4, 150mM NaCl, 20mM EDTA, 1% ΝΡ40, 50 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 1 mM NaMO4 και αναστολέα κοκτέιλ (Sigma, 5 μΙ /ml). η συγκέντρωση της πρωτεΐνης ποσοτικοποιηθεί με τη μέθοδο Bio-Rad. Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης φορτώθηκαν σε κάθε φρεάτιο και διαχωρίστηκε με 12,5% γέλη SDS-PAGE, ακολουθούμενη από μεταφορά σε PVDF-μεμβράνες ( . Bio-Rad) Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν με χρήση 5% άπαχο ξηρό γάλα σε PBS-T για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου Τα στυπώματα στη συνέχεια επωάστηκαν με Caspase-3 (κυτταρική σηματοδότηση)?. Caspase-7 (κυτταρική σηματοδότηση)? LC-3 (Medical & amp? Biological Laboratories Co. LTD)? Akt, φωσφο-Akt (Ser-473), S6 ριβοσωμικής πρωτεΐνης, και ριβοσωμική πρωτεΐνη φωσφο-S6 (Ser-240/244) (Cell Signaling)? και ακτίνης αντισωμάτων για 1 ώρα στους 4 . ° C κατσίκας αντι-κουνελιού IgG δευτερεύον (1: 5000, Σάντα Cruse Biotechnologies).. επωάστηκε για 45 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου ανοσοστυπώματα αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα ανίχνευσης χημειοφωταύγειας (PerkinElmer) σύμφωνα με το πρωτόκολλο και αυτοραδιογραφία του κατασκευαστή

Μέτρηση της απόπτωσης

p> Cells

5) τοποθετήθηκαν σε 10 χιλιοστά πιάτα για κάθε σημείο δεδομένων. Μετά από 24 ώρες επώασης στους 37 ° C, Η460 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με M867 (100 ηΜ για 2 ώρες) και αμέσως ακτινοβοληθεί με 5Gy, 10Gy ή 20 Gy, και WT και Caspase3

– /- /7

– /- ϋΚΟ κύτταρα ακτινοβολούνται με 5Gy ή 10Gy. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1 ml του Accutase (κρατώντας όλες επιπλέοντα κύτταρα) για 4min και μετά μετρήθηκαν για κάθε δείγμα. Τα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε 1 χ ρυθμιστικό δέσμευσης σε συγκέντρωση ~ 1 × 10

6 κύτταρα /ml. 100 μΙ του διαλύματος (~ 1 χ 10

5 κύτταρα) μεταφέρθηκαν σε 5 ml σωληνάριο FACS, προστέθηκε με 1,2 μΙ αννεξίνης V FITC και 1,2 μΙ PI. Μετά από επώαση για 30 λεπτά σε RT στο σκοτάδι, 400 μΐ 1 χ ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης προστέθηκαν σε κάθε σωλήνα. Ο ρυθμός της απόπτωσης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τον ισοθειοκυανικό κιτ ανίχνευσης απόπτωσης V-φλουορεσκεΐνη αννεξίνη Ι (Pharmingen) με κυτταρομετρία ροής.

Autophagy Δοκιμασία

Οι MEF κύτταρα επιμολύνθηκαν με 2.5 μg της έκφρασης GFP-LC3 πλασμίδιο (δώρο από τον Dr. Norboru Mizushima) [19] χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο Lipofectamine (Invitrogen Life Technologies). Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5Gy της ακτινοβολίας, με ή χωρίς τη δόση M867. Μετά από 24 ώρες και 48 ώρες, ο φθορισμός της GFP-LC3 παρατηρήθηκε χρησιμοποιώντας συνεστιακό ακτινοσκόπηση.

siRNA Επιμόλυνση

siRNAs έναντι κασπάσης-3 ποντικού και-7, Beclin, και siRNA ελέγχου αγοράστηκαν από την Santa Cruz βιοτεχνολογίες. siRNA ATG5 (ποντικού) συντέθηκε με Dharmacon Research. Οι νόημα και αντινόημα κλώνους ATG5 άρχισαν στο νουκλεοτίδιο, 5′-AACUUGCUUUACUCUCUCAUCAUU-3 ‘(νοηματικό) και 3′-UUUUGAACGAAAUGAGAGAUAGU-5’. (Αντιπληροφοριακό) κύτταρα επιμολύνθηκαν με 25ηΜ της siRNAs χρησιμοποιώντας LipofectAMINE 2000. Τα επιμολυσμένα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για τα πειράματα 24 ώρες αργότερα

ενδοθηλιακών κυττάρων Morphorgenesis δοκιμασία:. Σωληναρίων Σχηματισμός

HUVECs αναπτύχθηκαν σε ~ 70% συρροή υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 ηΜ M867, 3Gy ή θεραπεία συνδυασμού. Τα κύτταρα στη συνέχεια σε επεξεργασία με θρυψίνη και μετρήθηκαν. Μπορούν σπάρθηκαν σε 48.000 ανά φρεάτιο σε πλάκες 24 φρεατίων επικαλυμμένες με 300 μΙ Matrigel (BD Biosciences). Αυτά τα κύτταρα υφίστανται διαφοροποίηση σε τριχοειδή σωλήνα όπως δομές περιοδικά παρατηρήθηκε με μικροσκόπιο. 24h αργότερα, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε) και ελήφθησαν φωτογραφίες μέσω μικροσκοπίου. Ο μέσος αριθμός των σωληναρίων υπολογίστηκε από την εξέταση των τριών ξεχωριστών μικροσκοπικά πεδία (100 ×) και αντιπροσωπευτικές φωτογραφίες λήφθηκαν.

Το μέγεθος του όγκου αξιολόγηση

Ανθρώπινο Η460 πνεύμονα καρκινικά κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος σε θηλυκούς αθυμικούς γυμνούς ποντικούς (ηυ /ηυ), ηλικίας 5-6 εβδομάδων [Harlan Sprague Dawley Inc., Indianapolis, ΙΝ)]. Ένα εναιώρημα από 1 × 10

6 κύτταρα σε όγκο 50 μL εγχύθηκε υποδόρια στην αριστερή οπίσθια πλευρά των ποντικιών χρησιμοποιώντας μια βελόνα 27½-gauge. Οι όγκοι αναπτύχθηκαν για 6-8d μέχρι μέσος όγκος του όγκου έφθασε 0,25 εκατοστά

3. Οι ομάδες θεραπείας αποτελούνταν από τον έλεγχο του οχήματος (σε DMSO), M867, όχημα συν ακτινοβολία, και M867 συν ακτινοβολία. Κάθε ομάδα θεραπείας περιείχε 5 ποντίκια. DMSO ή M867 δόθηκε καθημερινά με ενδοπεριτοναϊκή (ί.ρ.) ένεση σε δόσεις των 2 mg /kg για 7 συνεχόμενες ημέρες. Στην περίπτωση της θεραπείας συνδυασμού, φάρμακο ή όχημα δόθηκε για 2d πριν από την πρώτη δόση της ακτινοβολίας. Οι ποντικοί στις ομάδες ακτινοβολία ακτινοβολήθηκαν 1 ώρα μετά τη θεραπεία φαρμάκου ή οχήματος με ημερήσια κλάσματα 2Gy δίδεται επί 5 διαδοχικές ημέρες. Οι όγκοι στις πλαγιές των ποντικών ακτινοβολήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ακτινοβολίας ακτίνων Χ (Therapax, Agfa NDT, Inc., Πόλη Lewis, PA). Η μη-όγκου που φέρουν τμήματα των ποντικών θωρακισμένο από μπλοκ μολύβδου. Οι όγκοι μετρήθηκαν 2-3 φορές την εβδομάδα σε 3 κάθετες διαστάσεις με χρήση παχυμέτρου και ο όγκος υπολογίστηκε με τη χρήση του τροποποιημένου τύπου έλλειψη όγκος (όγκος = (ύψος χ πλάτος χ βάθος) /2). καθυστέρηση ανάπτυξης υπολογίστηκε για τις ομάδες θεραπείας σε σχέση με τον έλεγχο των όγκων.

ιστολογικές τομές, vWF, Κί67 και TUNEL χρώση

Στα ποντίκια εμφυτεύτηκαν κύτταρα Η460 και υποβλήθηκε σε επεξεργασία όπως περιγράφηκε ανωτέρω στις μελέτες όγκο του όγκου. Μετά 7δ του καθημερινές θεραπείες, τα ποντίκια θυσιάστηκαν και οι όγκοι παραφίνη σταθερό. Διαφάνειες από κάθε ομάδα θεραπείας μετά χρωματίστηκαν για παράγοντα νοη Willebrand (vWF) χρησιμοποιώντας αντι-vWF πολυκλωνικό αντίσωμα (Chemicon). Τα αιμοφόρα αγγεία ποσοτικοποιήθηκαν με τυχαία επιλογή 400 × πεδία και μετρώντας τον αριθμό των αιμοφόρων αγγείων ανά πεδίο. Αυτό έγινε εις τριπλούν και ο μέσος όρος των τριών μετρήσεων υπολογίστηκε. Κί67 και τελικής δεοξυνουκλεοτιδυλοτρανσφεράσης μεσολάβηση dUTP nick τέλος επισήμανση χρώσης (TUNEL) διεξήχθησαν στον πυρήνα παθολογία εργαστήριο του Πανεπιστημίου Vanderbilt με τη χρήση τυποποιημένων πρωτοκόλλων. Αριθμό των θετικών κυττάρων ανά πεδίο βαθμολογήθηκαν και γραφική παράσταση από το μέσο όρο των τριών επαναλαμβανόμενων αξιολογήσεων.

Η στατιστική ανάλυση

Η ανάλυση των αποτελεσμάτων της μελέτης επικεντρώθηκε στην εξέταση των διαφορών του μέσου όγκου του όγκου μεταξύ των ομάδων θεραπείας και διαφορετικό χρόνο σημεία. Η ανάλυση των δεδομένων ολοκληρώθηκε με κλειστή /υπολειπόμενη μέγιστη μοντέλο μεικτού αποτελέσματος πιθανότητα που βασίζεται για να ρυθμίσετε την ισχύ intracorrelation για τα ποντίκια που είχαν πολλαπλές μετρήσεις. Το μοντέλο που αναφέρθηκαν στο έγγραφο επιλέχθηκε με βάση την Bayesian κριτήριο του Schwarz του. Όλες οι δοκιμές σημαντικότητας ήταν 2 όψεων, και οι διαφορές θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές όταν ρ ήταν μικρότερη από 0,05. Ένα στατιστικό πακέτο, SAS v8.2, χρησιμοποιήθηκε για όλες τις αναλύσεις.

Αποτελέσματα

M867 ανέστειλε την απόπτωση, αλλά αυξημένη ευαισθησία ακτινοβολίας στον καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων Η460

Για να δοκιμαστεί η επίδραση της αναστολής της κασπάσης-3 επί της ευαισθησίας του καρκίνου του πνεύμονα στην ακτινοβολία, Η460 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με νέα αναστρέψιμο αναστολέα M867 σε συνδυασμό με ιονίζουσα ακτινοβολία. Επιβίωσαν αποικίες μετρήθηκαν 8 ημέρες αργότερα. Κλωνογονική δοκιμασία επιβίωσης, που φαίνεται στο Σχήμα 1Α, έδειξαν μειωμένη επιβίωση σε διάφορες ομάδες δόσης, με 10ηΜ του M867 με αποτέλεσμα τη μεγαλύτερη ενίσχυση στην ακτινοευαισθησία, σε σύγκριση με τον έλεγχο (DER = 1.27, ρ = 0.007). Το επίπεδο απόπτωσης σε κύτταρα Η460 μετρήθηκε μετά τη θεραπεία M867 (100ηΜ για 2h) και ακτινοβολία με 20 Gy 5Gy να, χρησιμοποιώντας δοκιμασία αννεξίνης-ν. Έχει προηγουμένως δειχθεί ότι δέσμευση αννεξίνης V παρεμποδίστηκε με M867 με IC

50 80 ηΜ [20]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Β, το επίπεδο της απόπτωσης σταδιακά αυξημένα με αυξημένες δόσεις ακτινοβολίας. Το 20% των ακτινοβολημένων κυττάρων Η460 ήταν αποπτωτικά σε 20 Gy. Όταν M867 δόθηκε πριν από την ακτινοβολία, τα αποπτωτικά κύτταρα μειώθηκαν στο μισό τόσο στις χαμηλές όσο και τα υψηλά επίπεδα δόσεων ακτινοβολίας. Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι η ευαισθητοποίηση του καρκίνου του πνεύμονα Η460 κύτταρα σε ιοντίζουσα ακτινοβολία συνδέθηκε με μειωμένη απόπτωση.

(Α) κύτταρα Η460 NSCLC υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO ελέγχου, M867 (κλίμακα δόσης από 1,4 έως 10 ηΜ, για 24 ώρες) με ακτινοβολία. Μετά από 8 d, αποικίες κηλιδώθηκαν και οι δέχεται αποικίες σε γράφημα. Οι καμπύλες επιβίωσης για Η460 κύτταρα ± θεραπεία M867. Σημεία, σημαίνει? μπαρ, SD (

P

= 0,007). Ορατή είναι η μέση τιμή +/- την τυπική απόκλιση τριών ξεχωριστών επανειλημμένα πειράματα. (Β) Δοκιμασία Annexin-V που δείχνει το επίπεδο της απόπτωσης σε Η460 κύτταρα κατεργασμένα είτε με έλεγχο, 100ηΜ του M867 για 2h, η ακτινοβολία (5, 10 ή 20 Gy), και οι δύο τροπικότητα. Αυτό έγινε εις τριπλούν και ο μέσος όρος των τριών μετρήσεων υπολογίστηκε. Στήλες, κατά μέσο όρο? μπαρ, SD.

Η

Συνδυασμένη M867 επεξεργασία /ακτινοβολία παρατείνει καθυστέρηση της ανάπτυξης του όγκου και είναι καλά ανεκτή σε μοντέλο ξενομοσχεύματος πνεύμονα

Αφού διαπιστώθηκε η αποτελεσματικότητα

in vitro

για M867-επαγόμενη ραδιοευαισθητοποίηση των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα, ένα μοντέλο σκέλος ξενομοσχεύματος πίσω του ποντικιού δημιουργήθηκε για να εξερευνήσετε την απόκριση της ακτινοβολίας από M867

in vivo

. Η460 καρκίνου πνεύμονος κύτταρα ενέθηκαν υποδορίως σε αθυμικά γυμνά ποντίκια, και οι όγκοι αφέθηκαν να αναπτυχθούν για περίπου 7 ημέρες για να παράγουν ένα μέσο όγκο του όγκου των 0,25 εκατοστών

3 πριν από τη θεραπεία. Οι ομάδες θεραπείας αποτελούνταν από ένα ελέγχου του οχήματος, M867, όχημα συν ακτινοβολία, και ο συνδυασμός των M867 συν ακτινοβολίας. M867 χορηγήθηκε καθημερινά από 2mg /kg ενδοπεριτοναϊκή ένεση επί 7 διαδοχικές ημέρες. Hind ξενομοσχεύματα όγκου σκέλους Η460 σε ποντίκια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφεται στο κεφάλαιο Υλικά και Μέθοδοι. καθυστέρηση ανάπτυξης υπολογίστηκε ως ο αριθμός των ημερών που απαιτούνται για την επίτευξη ενός όγκου του όγκου 2 cm

3 για τις ομάδες θεραπείας σε σχέση με τον έλεγχο των όγκων. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, μία σημαντική καθυστέρηση της ανάπτυξης του όγκου παρατηρήθηκε με θεραπεία συνδυασμού M867 και ακτινοβολία σε σύγκριση με την ακτινοβολία μόνη της (26 vs 20 ημέρες, ρ & lt? 0.005), και M867 μόνος είχε επίσης να επηρεάσουν σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου σε σύγκριση με τον έλεγχο (~ 4 ημέρες καθυστέρηση, p = 0,003). Αυτό υποδηλώνει ότι M867 θα μπορούσε να αυξήσει ανταπόκριση του όγκου σε συνδυασμό με ακτινοθεραπεία. Επιπλέον, οι μεταβολές του σωματικού βάρους ήταν επίσης παρακολουθούνται στα ποντίκια για να εκτιμηθεί κατά πόσον η θεραπεία με M867, ακτινοβολία, ή θεραπεία συνδυασμού απέδωσε συστηματική τοξικότητα (Σχήμα 2Β). Μόνο ελάχιστη απώλεια βάρους παρατηρήθηκε σε 10 ημέρες μετά τη συνδυασμένη θεραπεία M867 και ακτινοβολία. Μεταβολές στο σωματικό βάρος μετά από αυτό το χρονικό διάστημα αντανακλάται ανάπτυξη του όγκου. Όπως αναμενόταν, η ομάδα θεραπείας συνδυασμού, η οποία είχε την πιο παρατεταμένη καθυστέρηση ανάπτυξης του όγκου, είχαν τη μικρότερη αύξηση του σωματικού βάρους.

Η460 καρκίνου του πνεύμονα κύτταρα ήταν ξενομόσχευμα υποδόρια σε αθυμικούς ποντικούς. Μετά από 6-8 ημέρες, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή καθημερινά για 7 ημέρες, με τον έλεγχο του οχήματος, M867 (2mg /kg), και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε αγωγή 1 ώρα μετά την φαρμακευτική αγωγή με 2 Gy ακτινοβολίας, καθημερινά επί 5 διαδοχικές ημέρες. Tumor αποκόπηκε όταν φθάσει στο μέγεθος περίπου 2,5-3,0 cm

3 και την ανάπτυξη του όγκου καθυστέρηση, όπως ορίζεται από τον αριθμό των ημερών που απαιτούνται για την επίτευξη του όγκου του όγκου από 2 cm

3 μετρήθηκε. (Α) Οι όγκοι μετρήθηκαν τακτικά και καθυστέρηση ανάπτυξης υπολογίστηκε για τις ομάδες θεραπείας σε σχέση με τον έλεγχο των όγκων. Η συνδυασμένη θεραπεία bi-τροπικότητα προκάλεσε μία καθυστέρηση ανάπτυξης αισθητή όγκου σε σύγκριση με την ακτινοβολία μόνη της (26 έναντι 20 ημερών, ρ & lt? 0.005). (Β) Τα σωματικά βάρη μετρήθηκαν κάθε 5 ημέρες και το σωματικό βάρος αναλογία υπολογίστηκε σε σχέση με την αρχική τιμή μέτρησης.

Η

M867 μειώνει δείκτης πολλαπλασιασμού του όγκου παρά αξιοσημείωτη μείωση στην απόπτωση σε ακτινοβολημένα Η460 ξενομοσχεύματος ποντικού

για να προσδιοριστεί ο μηχανισμός που συμβάλλει στην καθυστέρηση ανάπτυξης του όγκου μετά την θεραπεία συνδυασμού, εξετάστηκε Κί67 πολλαπλασιαστική δείκτης που χρησιμοποιούν σταθερά τομές όγκων Η460 σε όλες τις ομάδες θεραπείας. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, M867 συν συνδυασμός ακτινοβολία θεραπεία είχε ως αποτέλεσμα μια 6-φορές (15% vs 92%, ρ & lt? 0.001) και 2-φορές (15% vs 33%, ρ & lt? 0,001) μείωση σε πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα σε σύγκριση με τον έλεγχο και ακτινοβολία μόνο ομάδες, αντίστοιχα. Είμαστε δίπλα αξιολογούνται τα επίπεδα απόπτωσης σε σταθερά τμήματα του όγκου Η460 χρησιμοποιώντας χρώση TUNEL. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Β χρησιμοποιώντας χρώση TUNEL, σε συνδυασμό M867 και θεραπεία ακτινοβολίας οδήγησε σε δύο τρίτα μείωση στην απόπτωση (4,5% vs 15%, ρ & lt? 0.008)., Σε σύγκριση μόνο με την ακτινοβολία

τομές Ιστολογική ελήφθησαν από οι όγκοι των ποντικών σε κάθε ομάδα θεραπείας από τη μελέτη του όγκου του όγκου. Αριθμός θετικών κυττάρων βαθμολογήθηκαν και απεικονίστηκαν γραφικά από το μέσο όρο των τριών επαναλαμβανόμενων αξιολογήσεων. πολλαπλασιαστική δείκτης (A) Μέση Κί67 του κάθε ομάδα αγωγής προσδιορίστηκε από το ποσοστό του Κί67-θετικών κυττάρων ανά μικροσκοπικό πεδίο. Αυτό επαναλήφθηκε τρεις φορές. Στήλες, σημαίνει? μπαρ, SD. χρώση (Β) TUNEL διεξήχθη επίσης σε τμήματα του όγκου, και αποπτωτικό δείκτη παρομοίως υπολογίζεται με ποσοστό των θετικών TUNEL βαμμένων κυττάρων ανά μικροσκοπικό πεδίο. Στήλη, σημαίνει? μπαρ, SD.

Η

M867 μειώνει την πυκνότητα αγγειακή σε ακτινοβολημένα μοντέλο όγκου πνεύμονα και ευαισθητοποιεί HUVECs σε ακτινοβολία

Δεδομένου ότι αγγείωσης του όγκου είναι ένας στόχος για τη θεραπεία του καρκίνου, τα ποντίκια επεξεργάστηκε όμοια με εκείνα η μελέτη καθυστέρηση ανάπτυξης όγκου και σταθερού τομές όγκων του πνεύμονα χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιοριστούν τα αποτελέσματα της M867 και ακτινοβολίας στην αγγείωση του όγκου

in vivo

. Διαφάνειες από κάθε ομάδα αγωγής αναλύθηκαν ακόλουθη παράγοντα von Willebrand (vWF) χρώση για μελέτη αγγειακή πυκνότητα, όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α. Ο αριθμός των σκαφών ανά μικροσκοπικό πεδίο στην συνέχεια προσδιορίζεται για κάθε ομάδα θεραπείας. Η συνδυασμένη θεραπεία του M867 και ακτινοβολίας (1,3? SD = 0.57) είχε ως αποτέλεσμα μια δραματική 5-πλάσια μείωση του μέσου αριθμού των σκαφών ανά μικροσκοπικό πεδίο σε σύγκριση με τον έλεγχο (6? SD = 1? ρ & lt? 0.002) και ένα ~2- πλάσια μείωση σε σχέση με την ακτινοθεραπεία μόνο (2,3? SD = 0,57? ρ & lt? 0.007). (Εικόνα 4Α)

(Α) Ιστολογικές τομές λήφθηκαν από τους όγκους των ποντικών σε κάθε ομάδα θεραπείας από το

in vivo

όγκων μελέτη όγκο, και χρωματίστηκαν για τα αιμοφόρα αγγεία με τη χρήση ενός αντισώματος για vWF. Τα αιμοφόρα αγγεία ποσοτικοποιήθηκαν με τυχαία επιλογή 400 × πεδία και μετρώντας τον αριθμό των αιμοφόρων αγγείων ανά πεδίο. Αυτό έγινε εις τριπλούν και ο μέσος όρος των τριών μετρήσεων υπολογίστηκε. Στήλες, κατά μέσο όρο? μπαρ, SD. (Β) Τα ανθρώπινα ομφαλικά ενδοθηλιακά κύτταρα (HUVECs) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 ηΜ M867 και κατόπιν ακτινοβολείται αμέσως είτε με 0 ή 3 Gy. Έξι ώρες αργότερα, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και επανατοποθετήθηκαν σε πλάκες σε πλάκες 24 φρεατίων επικαλυμμένες με Matrigel. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με Η &? Ε. Οι πλάκες εξετάστηκαν με μικροσκοπία (× 100), και αντιπροσωπευτικά πεδία δεικνύονται. (Γ) βιτρώ σωληνάρια στη συνέχεια μετρήθηκαν σε τρία ξεχωριστά, τυχαία επιλεγμένα πεδία. Στήλες, μέσος αριθμός των σωληναρίων υπολογίζονται ανά μικροσκοπικό πεδίο? μπαρ, SD.

Η

Για να διερευνηθούν περαιτέρω οι επιδράσεις του M867 και ακτινοβολίας επί του σχηματισμού αιμοφόρων αγγείων, τα ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα ομφάλιας φλέβας (HUVECs) χρησιμοποιήθηκαν για την εξέταση του σχηματισμού σωληναρίων για αγγειογενετική λειτουργία

in vitro

. Η δοκιμασία ενδοθηλιακού κυττάρου μορφογένεση έγινε για να εξεταστεί η ικανότητα των επεξεργασμένων HUVECs να παραχθεί με τριχοειδή σαν σωληνοειδείς δομές. Μια αντιπροσωπευτική εικόνα και ο μέσος αριθμός των καταμετρηθέντων σωλήνων σε τρία ξεχωριστά (x100) πεδία που φαίνεται στο Σχήμα 4Β και C, αντίστοιχα. Η θεραπεία με M867 συνδυάστηκαν σε ακτινοβολία μείωσε σημαντικά τον σχηματισμό σωληναρίου σε σύγκριση μόνο με την ακτινοβολία (5.7 vs 1.7, ρ & lt? 0.001). Απουσία ελέγχου θεραπεία είχε 13 σωληναρίων (SD = 1.0) ανά μικροσκοπικό πεδίο και M867 μόνο είχε 9 σωληναρίων (SD = 1.0), προτείνοντας μία αντι-αγγειογενετική δράση του M867 επιπλέον της ραδιοευαισθητοποίησης.

κασπάσης 3 /7 ανεπάρκεια προάγει την ευαισθησία ακτινοβολία με επαγωγή αυτοφαγία, ελλείψει της απόπτωσης

για την επικύρωση εάν η αναστολή των κασπασών συμβάλει στην ενίσχυση της ακτινοθεραπείας, χρησιμοποιήθηκαν κασπάσης-3/7 ανεπάρκεια (ϋΚΟ) MEF κύτταρα. Αυτά τα κύτταρα είναι σε θέση να υφίστανται απόπτωση, αφού στερούνται κασπάσες 3/7, ενώ WT ΠΜΑ μπορεί (Σχήμα 5Α και 5Β). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5C, WT ΠΜΑ κατεργάζεται με M867 ήταν πιο ευαίσθητα στην ακτινοβολία σε σύγκριση με τα WT ΠΜΑ σε επεξεργασία με DMSO (DER = 1,2 για 5ηΜ M867, ρ = 0.017, και DER = 1,62 για 10NM M867, p = 0,001). Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στην επιβίωση μεταξύ των κασπάσης ϋΚΟ ΠΜΑ αγωγή με καμία δόση του M867 σε σύγκριση με DMSO. Επιπλέον, τα κύτταρα WT ΠΜΑ επιμολυσμένα με κασπάση-3/7 siRNAs παρουσίασε επίσης σημαντική αύξηση της ευαισθησίας στην ακτινοβολία, γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτά τα αποτελέσματα δεν οφείλονται στην κλωνική μεταβολή αυτών των κυττάρων (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Με βάση την προηγούμενη μελέτη μας, υποθέτουμε ότι η ενισχυμένη ευαισθησία σε ακτινοβολία κασπάσης κύτταρα ϋΚΟ μπορεί να οφείλεται σε εναλλακτικό προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο όπως autophagy [8]. Για να ελέγξει την υπόθεση αυτή, WT και κασπάσης 3/7 κύτταρα DKO ήταν επιμολυσμένα με το πλασμίδιο GFP-LC3. Κύτταρα με σηματοδότηση στικτή GFP μετρήθηκαν ως αυτοφαγικά κύτταρα επειδή του χαρακτηριστικού λυσοσωματικής εντοπισμό της πρωτεΐνης κατά τη διάρκεια της LC3 autophagy [19]. Μετά WT και κασπάσης ϋΚΟ κύτταρα εκτέθηκαν σε 5Gy της ακτινοβολίας, το ποσοστό των κυττάρων με punctates GFP αυξήθηκαν περίπου 3-φορές σε ακτινοβολημένα κασπάσης κύτταρα ϋΚΟ, σε σύγκριση με ακτινοβολημένα κύτταρα WT (30% έναντι 10%, αντίστοιχα) (Σχήμα 6Α ). Σε 48 ώρες μετά την ακτινοβολία, το ποσοστό των κυττάρων που αυτοφαγικά αυξήθηκε σε -55% σε κασπάση κύτταρα ϋΚΟ σε σύγκριση με 15% στον έλεγχο WT. Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν επίσης από την αξιολόγηση του επιπέδου της επεξεργασμένης πρωτεΐνης LC3, στην οποία τα κύτταρα της κασπάσης ϋΚΟ έδειξαν αυξημένα επίπεδα πρωτεϊνών LC3-Ι και-ΙΙ μετά από ακτινοβόληση, σε σύγκριση με τα κύτταρα WT (Σχήμα 6Β). Επειδή η οδός mTOR είναι γνωστό ότι ρυθμίζει την έναρξη της αυτοφαγία, εξετάσαμε Akt σηματοδότησης /mTOR από τον προσδιορισμό των επιπέδων της φωσφο-Akt και φωσφο-S6 στα ακτινοβολημένα WT και κασπάσης κύτταρα DKO ΥΠΟΙΟ. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6C, οι φωσφο-πρωτεΐνες αυξήθηκαν στα ακτινοβολημένα κύτταρα WT, ενώ μειώθηκαν στην ακτινοβολημένα κύτταρα κασπάσης ϋΚΟ MEF. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η προ-αυτοφαγικά σηματοδότηση είναι προς τα πάνω ρυθμισμένα στα κύτταρα ακτινοβολημένα κασπάσης ϋΚΟ.

(Α) και WT Caspase 3/7 ϋΚΟ MEFs επωάστηκαν με Αννεξίνη V-ισοθειοκυανική φθορεσκεϊνη και ιωδιούχο προπίδιο 24 ώρες μετά ακτινοβολία και αναλύθηκαν με FACScan. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως ο μέσος όρος τριών πειραμάτων S.D. διάσπασης (Β) Caspase προσδιορίσθηκε με ανοσοστύπωση της διασπασμένης κασπάσης-3 μετά WT ή Caspase 3/7 κύτταρα ϋΚΟ MEF υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 0, 2,5, 5, 7,5, και 10 Gy. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά 24. (Γ) ραδιοευαισθητοποίηση WT ή κασπάσης 3/7 ϋΚΟ ΠΜΑ. Τα κύτταρα ακτινοβολούνται με τις υποδεικνυόμενες δόσεις ακτινοβολίας και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με DMSO ή τον έλεγχο M867 (εύρος δόσης από 5 έως 10 ηΜ, για 24 ώρες). Μετά από 10 ημέρες, οι αποικίες χρώθηκαν και βαθμολογήθηκαν. Οι αναφερόμενες τιμές είναι μέση τιμή ± Τ.Α. τριών ξεχωριστών επανειλημμένα πειράματα.

Η

(Α) GFP-LC3 επιμολυσμένα WT ή Caspase 3/7 κύτταρα ϋΚΟ MEF υποβλήθηκαν σε θεραπεία με και χωρίς 5 Gy και στη συνέχεια εξετάστηκαν με μικροσκοπία φθορισμού μετά από 24 ώρες. Το ποσοστό των κυττάρων με στικτή φθορισμού GFP-LC3 υπολογίστηκε σε σχέση με όλα τα κύτταρα GFP-θετικά. Οι ράβδοι σφάλματος φαίνονται ως μέση S.D. (Β) LC-Ι και -II έκφραση προσδιορίστηκε με στύπωμα Western χρησιμοποιώντας προϊόντα λύσης από WT και Caspase 3/7 κύτταρα ϋΚΟ MEF σε επεξεργασία με 0 ή 5 Gy μετά από 24, 48 ώρες. Ακτίνη επεσημάνθη να αποδείξει ίση φόρτωση. (Γ) Επίσης φαίνεται είναι ανοσοστυπώματα φωσφο-Ακί και ρ-S6 χρησιμοποιώντας τα προϊόντα λύσης από WT και Caspase 3/7 κύτταρα ϋΚΟ MEF σε επεξεργασία με 0 ή 5 Gy μετά από 30 λεπτά. (D) WT και Caspase 3/7 κύτταρα ϋΚΟ MEF διαμολύνθηκαν είτε με έλεγχο siRNA ή 25 ηΜ siRNAs που κατευθύνονται έναντι ATG5 και Beclin-1 ή (Ε) επιμολυσμένα με φορέα ή ATG5 και cDNA Beclin-1 που περιέχει πλασμίδια. Αυτά στη συνέχεια ακτινοβολούνται με 0 έως 6 Gy. Μετά από 8 ημέρες, οι αποικίες χρωματίζονται και σκόραρε. Οι τιμές που παρουσιάζονται είναι η μέση τιμή ± Τ.Α. από τρία ξεχωριστά επανειλημμένα πειράματα.

Η

Autophagy μεταβάλλει την ευαισθησία ακτινοβολίας σε κασπάσης 3/7 ανεπάρκεια κύτταρα

Για να προσδιορίσετε αν αυτοφαγία είναι ο μηχανισμός που είναι υπεύθυνος για την τριτοβάθμια ακτινοευαισθησία παρατηρήθηκε σε κασπάσης DKO κύτταρα, η έκφραση του ATG-5 και Beclin-1, δύο απαραίτητες πρωτεΐνες αυτοφαγία [21], [22], [23], τα γκρέμισε σε άγριου τύπου και κασπάσης κύτταρα DKO. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι siRNA κατά Beclin-1 και ATG-5 ρυθμίζεται προς τα κάτω ειδικά ενδογενή έκφραση πρωτεΐνης [8]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6D, η θεραπεία της κασπάσης κυττάρων ϋΚΟ με siRNAs που κατευθύνονται έναντι ATG-5 και Beclin-1 κατήργησε την επίδραση ευαισθητοποίησης που προκύπτει από την κασπάση-3/7 ΔΙΑΓΡΑΦΗ και προκάλεσε σημαντική αύξηση στην κλωνογονική επιβίωση κυττάρων σε σύγκριση με τη θεραπεία ελέγχου siRNA της κασπάσης κύτταρα DKO (DER = 1,34, p = 0,008). Αντιθέτως, η υπερέκφραση του Beclin-1 και ATG-5 σε κασπάσης κύτταρα DKO προκάλεσε σημαντική αύξηση κλωνογονικού κυτταρικό θάνατο κάτω από αυξανόμενη δόση ακτινοβολίας σε σύγκριση με Beclin-1 και ATG-5 υπερέκφραση σε κύτταρα WT (DER = 1,32, p = 0,008) ( Σχήμα 6Ε). Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι η αύξηση ακτινοευαισθησία σε κασπάσης κύτταρα DKO εξαρτάται βασικά μόρια αυτοφαγία.

Συζήτηση

Στην παρούσα έκθεση, η πρώτη μας έδειξαν ότι η θεραπεία M867 είχε ως αποτέλεσμα την αποτελεσματική ραδιοευαισθητοποίηση του πνεύμονα καρκινικά κύτταρα

in vitro

. Οι πιθανές θεραπευτικές επιδράσεις από M867 στη συνέχεια αποδείχθηκε σε μια

in vivo

μοντέλο όγκου οπισθίου άκρου του ποντικιού. Περαιτέρω πειράματα in vitro έδειξαν ότι κασπάσης-3/7-null MEF κύτταρα, ήταν πιο ευαίσθητα στην κυτταροτοξική δράση της ακτινοβολίας, κυρίως λόγω της αυξημένης αυτοφαγία. Αυτή η μελέτη δείχνει επίσης ότι οι επιδράσεις M867 επί των αγγείων μπορεί να συμβάλλει στην παρατηρούμενη αύξηση των πνευμόνων καθυστέρηση ανάπτυξης όγκου σε απόκριση προς την ακτινοβολία.

Ταυτόχρονη χημειοραδιοθεραπεία είναι ένα στήριγμα για τη θεραπεία του προχωρημένου καρκίνου του πνεύμονα, αλλά η πρόγνωση για τους ασθενείς παραμένει σε παγκόσμιο επίπεδο φτωχούς. Ως εκ τούτου, οι νέες στρατηγικές που απαιτούνται για να βελτιωθεί η τρέχουσα αποτελεσματικότητα της θεραπείας, στοχεύοντας μη αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο αφού απόπτωση περιορίζεται παρακάτω συμβατική θεραπεία. Πρόσφατα, έχει υπάρξει μια μεγάλη έμφαση στην αυτοφαγία ως στόχο τη θεραπεία του καρκίνου, εν μέρει καθοδηγείται από τις παρατηρήσεις ότι αντικαρκινικές θεραπείες που προκαλείται από αυτοφαγία, όπως σε ακτινοβολημένα καρκινικά κύτταρα [17], [24]. Δείξαμε πρόσφατα ότι autophagy μπορεί να προκληθεί από την αναστολή του στόχου θηλαστικών ή ραπαμυκίνη (mTOR) οδού [17] ή με αναστολή προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών Bak /Βαχ να ενισχύσει τα αποτελέσματα της ακτινοβολίας

in vitro

[8]. Ένα πολύ ελκυστικό στόχο στο αποπτωτικό μονοπάτι είναι κασπάσης-3, το οποίο έχει έναν κεντρικό ρόλο στην απόπτωση ως την κυρίαρχη κασπάσης τελεστή που εμπλέκονται στην πρωτεολυτική διάσπαση υποστρωμάτων πρωτεΐνης συμπεριλαμβανομένων πρωτεϊνών κυτταροσκελετικών, κινάσες και τα ένζυμα επιδιόρθωσης του DNA. Σε αυτή τη μελέτη, αναλύσαμε τις πιθανές επιπτώσεις της κασπάσης-3 αναστολή με την ανταπόκριση του καρκίνου του πνεύμονα στην ακτινοβολία με τη χρήση του νέου αναστολέα M867. Δείξαμε ότι η χορήγηση M867 σε συνδυασμό με ιονίζουσα ακτινοβολία μειωθεί δραματικά την επιβίωση του καρκίνου του πνεύμονα Η460 κύτταρα (Σχήμα 1), με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Αξίζει να σημειωθεί, παρατηρήσαμε αυξημένη κυτταροτοξικότητα σε συγκέντρωση υψηλότερη από 10 ηΜ σε κλωνογονική δοκιμασία μας. Παρ ‘όλα αυτά, έχει αποδειχθεί ότι M867 είναι ένας ισχυρός και αναστρέψιμη κασπάσης-3 αναστολέα (IC

50 0,0001 μΜ), και ένα λιγότερο ισχυρός αναστολέας κασπάσης-7 (IC

50 0,036 μΜ) [18]. Επιπλέον, βρήκαμε ότι η ραδιοευαισθητοποίησης επίδραση του M867 εξαρτάται από κασπάση-3 και -7, όπως καταδεικνύεται από την απουσία επιπτώσεων της προς κασπάσης 3/7 κύτταρα ϋΚΟ.