Αφηρημένο

προέρχεται μυελοειδή κατασταλτικά κύτταρα (MDSCs) την επέκταση στον καρκίνο φέρουν οικοδεσπότες και να συμβάλει στην ογκοάνοση φοροδιαφυγής. M2 μακροφάγα αποτελούν ένα σημαντικό κυτταρικό συστατικό φλεγμονής που σχετίζονται με τον καρκίνο. Ωστόσο, ο συσχετισμός μεταξύ κυκλοφορούντων MDSCs και διεισδύοντας M2 μακροφάγα σε καρκινικούς ιστούς από ασθενείς με καρκίνο του οισοφάγου (ECA), και τις πιθανές σχέσεις της με την πόλωση των Th2 κυττάρων παραμένουν ασαφείς. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε το επίπεδο της MDSCs στα PBMC και Arg1 στο πλάσμα ήταν σημαντικά αυξημένα σε ασθενείς ECA, και η αυξημένη αναλογία των MDSC σε PBMC ήταν στενά συνδεδεμένη με την έκφραση του CD163 σε ιστούς του καρκίνου. Επιπλέον, οι ασθενείς παρουσίασαν ECA αξιοσημείωτες αυξήσεις των επιπέδων mRNA της IL-4 και GATA3, καθώς και τα επίπεδα της πρωτεΐνης του IL-13 και IL-6, αλλά ΙΡΝ-γ και IL-12 στο περιφερικό αίμα μειώθηκαν. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι οι αυξημένες κυτοκίνες Th2 σχετίζονται με MDSCs και M2 μακροφάγα πόλωση, και την προώθηση της διείσδυσης των CD163

+ M2 μακροφάγα σε καρκινικούς ιστούς, οι οποίες προάγουν το σχηματισμό των ανοσοκατασταλτικών μικροπεριβάλλον σε ασθενείς ΕΕΣ.

Παράθεση: Gao J, Wu Υ, Ζ Su, Αμόα Barnie P, Jiao Ζ, Bie Q, et al. (2014) Διείσδυση Εναλλακτικά ενεργοποιημένα μακροφάγα σε ιστό καρκίνου συνδέεται με MDSC και Th2 πόλωσης σε ασθενείς με καρκίνο του οισοφάγου. PLoS ONE 9 (8): e104453. doi: 10.1371 /journal.pone.0104453

Επιμέλεια: Jacques Zimmer, Centre de Recherche Δημόσια de la Santé (CRP-Santé), το Λουξεμβούργο

Ελήφθη: 4, Μάρτη, 2014? Αποδεκτές: 9 Ιούλη του 2014? Δημοσιεύθηκε: 21, Αυγούστου του 2014

Copyright: © 2014 Gao et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (31270947, 31170849 και 30972748, https://www.nsfc.gov.cn/), Φυσικό Ίδρυμα Επιστημών της επαρχίας Jiangsu (BK2011472) και το Ίδρυμα Μεταδιδακτορικός της Κίνας (2012M511705 ). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

οισοφάγου καρκίνου (ECA) είναι μία από τις πιο κοινές κακοήθειες σε όλο τον κόσμο και η τέταρτη κύρια θανάτου από καρκίνο στις China [1] – [3]. Υπάρχουν αυξανόμενες ενδείξεις του κρίσιμου ρόλου του ανοσοποιητικού συστήματος σε κακοήθεις όγκους, αλλά οι ακριβείς μηχανισμοί του ανοσοποιητικού διαφοροποίησης σε ασθενείς ΕΕΣ παραμένουν ασαφείς. Κατά την τελευταία δεκαετία, ο ρόλος του ανοσοκατασταλτικού και του καρκίνου που προάγουν μυελομονοκυτταρική διαμέρισμα εντός του περιβάλλοντος του όγκου έχει επίσης λάβει μεγάλη προσοχή [4]. Αν και μηχανισμοί δεν είναι εντελώς κατανοητό, ο καρκίνος προάγει τη συσσώρευση ενός ετερογενούς πισίνα οστού ανώριμων προέρχονται από μυελό, πενιχρά διαφοροποιημένο μυελομονοκυτταρική κύτταρα (μονοκύτταρα, ουδετερόφιλα, ανώριμα μακροφάγα και τα δενδριτικά κύτταρα), που ονομάζεται προερχόμενα μυελοειδή κατασταλτικά κύτταρα (MDSCs), οι οποίες είναι σημαντικές ξενιστή συστατικό που συμβάλλουν στην ανοσοκατασταλτική περιβάλλον. Σε παθολογικές καταστάσεις, μία μερική μπλοκ στη διαφοροποίηση των ανώριμων μυελοειδών κυττάρων σε ωρίμασαν αποτελέσματα μυελοειδή κύτταρα σε μια επέκταση του MDSCs [5]. Πρόσφατα, έχει γίνει σαφές ότι η κατασταλτική δράση των MDSCs απαιτεί διάφορους παράγοντες που προωθούν την επέκτασή τους ή επάγουν την ενεργοποίηση τους. Αυτοί οι παράγοντες, που περιλαμβάνουν IL-4, IL-13, συνδέτες για υποδοχείς τύπου ΤοΙΙ (TLRs), και αυξητικό παράγοντα μετασχηματισμού-β (ΤΟΡ-β), ενεργοποιούν αρκετές διαφορετικές οδούς σηματοδότησης σε MDSCs που περιλαμβάνουν STAT6 και πυρηνικός παράγοντας-κΒ (NF-κΒ).

Παρόμοια με MDSCs, μακροφάγα αποτελούν ένα ποικιλόμορφο πληθυσμό μυελοειδών κυττάρων τα οποία υποβάλλονται σε ειδική διαφοροποίηση ανάλογα με τις παράγοντες διέγερσης, όπως τεκμηριώνεται εκτενώς. Πρόσφατες ανοσολογικές μελέτες έχουν εντοπίσει δύο διαφορετικές καταστάσεις της ενεργοποίησης πολωμένου μακροφάγων: η κλασική ενεργοποιηθεί (ή M1) και τα εναλλακτικά ενεργοποιηθεί (ή Μ2) φαινότυποι των μακροφάγων. Τα Μ1 μακροφάγων τυπικά ενεργοποιούνται από ΙΡΝ-γ και LPS, ενώ τα M2 μακροφάγα ενεργοποιούνται από IL-4 και IL-13 [6]. M1 μακροφάγα είναι ογκοκτόνο και την προώθηση της απόρριψης του όγκου, ενώ M2 μακροφάγα προώθηση της προόδου όγκου [7] – [9]. Και οι δύο μακροφάγα και MDSCs Μ2 είναι μια σημαντική πηγή της ανοσοκαταστολής που επιτρέπει σε όγκο απόδραση από αποτελεσματικές απαντήσεις κατά του καρκίνου, αλλά δεν υπάρχουν πληροφορίες για τη σχέση μεταξύ μακροφάγα Μ2 και MDSCs στην ανάπτυξη του καρκίνου του οισοφάγου είναι προς το παρόν διαθέσιμο.

Μια συναρπαστική παρατήρηση έχει περιγραφεί στο εργαστήριο του Δρ Teramoto, του οποίου η ομάδα δείχνουν ότι η ταυτόχρονη ενεργοποίηση της λειτουργίας Th1 μπορεί να αυξήσει την ισχύ των δενδριτικών κυττάρων με βάση ανοσοθεραπεία καρκίνου [10]. Σε προηγούμενη μελέτη μας, έχουμε βρει ότι υπάρχει ένα κυρίαρχο Th2 φαινότυπο σε ασθενείς με καρκίνο του στομάχου [11]. Εικάζεται ότι η ανισορροπία του Th1 /Th2 μπορεί να συμβάλλει στην εμφάνιση και την ανάπτυξη του όγκου. MDSCs ή /και Μ2 μακροφάγα, ως κύρια συστατικά ξενιστή που συμβάλλουν στην κατασταλτική περιβάλλον ανοσίας όγκου [12], πόλωση τους θα πρέπει να σχετίζονται με τις διαταραχές του ανοσοποιητικού ισορροπία. Στην παρούσα μελέτη, αναλύσαμε τα επίπεδα των μακροφάγων και Μ2 σε ασθενείς MDSCs ECA, ανίχνευσε την έκφραση κάποιων σχετικών παραγόντων που περιλαμβάνουν κυτοκίνες τύπου Th1 /Th2 και αξιολόγησε τη σχέση μεταξύ των κυττάρων Th2 και μακροφάγα Μ2 ή MDSCs. Ο γενικός στόχος της μελέτης ήταν να συμβάλει στην καλύτερη κατανόηση της σημασίας των MDSCs και μακροφάγα M2 από ασθενείς με καρκίνο του οισοφάγου σε Th2 κατάσταση των κυττάρων πόλωσης.

Υλικά και Μέθοδοι

Ασθενείς

Πενήντα νεοδιαγνωσθέντες ασθενείς ΕΕΣ που λαμβάνουν θεραπεία στο Νοσοκομείο Ενταγμένο Λαϊκό Πανεπιστήμιο Jiangsu συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη αυτή: 38 άνδρες και 12 γυναίκες, με μέση ηλικία 61,97 ± 1,24 χρόνια. Κανένας από τους ασθενείς είχαν υποβληθεί σε ακτινοθεραπεία ή χημειοθεραπεία πριν από την έναρξη της τρέχουσας μελέτης. Τα χαρακτηριστικά των ασθενών Ελεγκτικού Συνεδρίου συνοψίζονται στον πίνακα 1. Όλα τα πρωτογενή κρούσματα όγκου ανέβηκε κλινικά σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές της Διεθνούς Ένωσης για τον έλεγχο του καρκίνου και αμερικανικές μεικτής επιτροπής για τον Καρκίνο (UICC-AJCC) ενημερώνεται από όγκο κόμβο-μετάσταση (TNM) σύστημα καρκίνο στάσης [13]. Τριάντα υγιείς εθελοντές χωρίς χρόνια φλεγμονώδης πάθηση μελετήθηκαν ταυτόχρονα ως έλεγχο, που περιλαμβάνει 24 άνδρες και 6 γυναίκες. Εγγραφή πραγματοποιήθηκε μεταξύ Μαρτίου 2011 και Δεκεμβρίου 2012. Η μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας του Πανεπιστημίου Jiangsu, και γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλα τα άτομα.

Η

τηλέφωνα προετοιμασία

Περιφερειακά συλλέχθηκαν δείγματα αίματος από ασθενείς ΕΕΣ και υγιείς εθελοντές. Μονοπυρηνικά κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMCs) απομονώθηκαν με Ficoll-Hypaque φυγοκέντρηση βαθμίδωσης πυκνότητας (GE Healthcare). Τα κυτταρικά εναιωρήματα χωρίστηκαν σε δύο ίσα κλάσματα? ένας χρησιμοποιήθηκε αμέσως για τα πειράματα. Η άλλη ήταν σε βαθιά κατάψυξη στους -80 ° C και αποψύχθηκαν για τη δοκιμή σε μεταγενέστερη ημερομηνία

κυτταρομετρία ροής

MDSCs πληθυσμός ορίστηκε ως HLA-DR

-. /CD14

– /CD11b

+ /CD33

+. Ηπαρινισμένο φλεβικό αίμα προσφάτως ελήφθησαν από ασθενείς ECA ή υγιείς εθελοντές. PBMCs απομονώθηκαν με πρότυπες φυγοκέντρηση πυκνότητας Ficoll-Hypaque, και χρωματίστηκαν με το ακόλουθο μίγμα αντισώματος: FITC-συζευγμένο αντι-ανθρώπινο HLA-DR, PerCP-Cy5.5-συζευγμένο αντι-ανθρώπινο CD14, ΑΡΟ-συζευγμένο αντι-ανθρώπινο CD11b, ή ΡΕ-συζευγμένο αντι-ανθρώπινο CD33. Το αντίσωμα ελέγχου ισοτύπου χρησιμοποιήθηκε σε όλες τις περιπτώσεις. Η απόκτηση δεδομένων και ανάλυση εκτελέστηκαν σε κυτταρόμετρο ροής FACSCalibur (Becton Dickinson, CA, USA) χρησιμοποιώντας το λογισμικό CellQuest (Becton Dickinson, CA, USA).

εκχύλιση RNA και ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου

Ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή, το συνολικό RNA εκχυλίστηκε από PBMCs χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA). Συμπληρωματικό DNA συντέθηκε από 1 μα συνολικού RNA χρησιμοποιώντας RT κιτ αντιδραστηρίου (Takara, Ohtsu, Japan). Για την ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου, αντίστροφη μεταγραφή cDNA (2 μΙ) ενισχύθηκε με PCR πραγματικού χρόνου με το κιτ SYBR Green Πρόμιγμα ΕΧ Taq (Takara, Ohtsu, Japan). Κάθε δείγμα αναλύθηκε εις διπλούν με την CFX-96 Cycler (θερμική) και το επίπεδο κανονικοποιημένο σήμα υπολογίστηκε με βάση την αναλογία του προς το αντίστοιχο σήμα housekeeping β-ακτίνης. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν στην PCR ήταν έδειξε στον Πίνακα 2.

Η

Ένζυμο-συνδεδεμένη ανοσορροφητική δοκιμασία (ELISA)

Για την ποσοτική ανίχνευση της ΙΡΝ-γ, IL-4, IL-6, IL -13 και Arg1 στο πλάσμα, εμπορικώς διαθέσιμα κιτ ELISA χρησιμοποιήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Biovender). Όλα τα δείγματα αναλύθηκαν σε παρτίδες να ελαχιστοποιηθεί η μεταβλητότητα εντός του προσδιορισμού και ποσοτικοποιείται χρησιμοποιώντας μια πρότυπη καμπύλη.

Ανοσοϊστοχημεία

ιστούς ECA και αντιστοιχισμένο γειτονικούς ιστούς σταθεροποιήθηκαν σε 10% διάλυμα ρυθμισμένης φορμαλίνης και εγκλείστηκαν σε παραφίνη . Διαδοχικές τομές από 4 μm κόπηκαν από τα τεμάχια παραφίνης. CD68 ή CD163 αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε αντίστοιχα για τον εντοπισμό των μακροφάγων και Μ2 υποτύπου μακροφάγων. Ως αρνητικοί έλεγχοι, τα πρωτογενή αντισώματα αντικαθίστατο από IgG1 αντι-ποντικού άσχετο ισότυπου. Η ανοσοϊστοχημική ανίχνευση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το αβιδίνης-βιοτίνης-υπεροξειδάσης μέθοδο. Ένα multiheaded μικροσκόπιο χρησιμοποιήθηκε για να διαβάσει ανοσοϊστοχημική αποτελέσματα, τα κύτταρα ανιχνεύθηκαν αντιμετωπιστεί σε 10 τυχαίως επιλεγμένων περιοχών από τρεις διαφορετικούς ερευνητές στο × 40 μεγέθυνση. Το τελικό αποτέλεσμα εκτιμήθηκε ανάλογα με το βάθος χρώματος των κυττάρων και το ποσοστό των χρωματισμένων κυττάρων.

Η στατιστική ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση έγινε με GraphPad Prism, έκδοση 5.0, το λογισμικό (San Diego, CA , ΗΠΑ). Οι συσχετίσεις μεταξύ των μεταβλητών προσδιορίστηκαν με συντελεστή συσχέτισης του Spearman. Οι συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας αταίριαστα ή ζεύγη

t

test του Student. Οι διαφορές θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές όταν το

P

-τιμή & lt?. 0.05

Αποτελέσματα

Αυξημένα MDSCs συσχετίζεται με αυξημένο επίπεδο πλάσματος της Arg1 στην ECA ασθενείς

MDSCs, που ορίζονται ως HLA-DR

– /CD14

– /CD11b

+ /CD33

+ κύτταρα, προσδιορίστηκαν με κυτταρομετρία ροής και υπολογισμένο ως% PBMC. Το επίπεδο των μεμονωμένων MDSCs ήταν σημαντικά αυξημένο σε ασθενείς ECA σε σύγκριση με υγιείς μάρτυρες (

P

& lt? 0,05? Σχήμα 1). Όπως φαίνεται στον Πίνακα 3, το ποσοστό των MDSCs σε ασθενείς με προχωρημένο καρκίνο ήταν σημαντικά υψηλότερη από ότι σε ασθενείς με πρώιμο καρκίνο (2,56 ± 0,25% έναντι 0,77 ± 0,15%?

P

& lt? 0,05). Επιπλέον, το ποσοστό των MDSCs σε ασθενείς με μετάσταση στους λεμφαδένες ήταν υψηλότερες από εκείνες χωρίς λεμφαδένα μετάσταση (3,71 ± 0,34% έναντι 1,47 ± 0,13%?

P

& lt? 0,0001). Ωστόσο, δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές μεταξύ του ποσοστού των MDSCs και την ηλικία των ασθενών, το φύλο, τη θέση του όγκου, το μέγεθος του όγκου, ή το βάθος διηθούντα όγκου. Μετρήσαμε επίσης τη συγκέντρωση του Arg1, η οποία είναι μία από τις πιο σημαντικές κατασταλτική παράγοντες [14], [15] στο πλάσμα. Το αποτέλεσμα έδειξε ότι το πλάσμα ελέγχου είχε ελάχιστη Arg1 σύγκριση με τους ασθενείς ECA (9,57 ± 1,51 ng /ml έναντι 28.28 ± 4.10 ng /ml?

P

& lt? 0.001). Επιπλέον, ένας θετικός συσχετισμός βρέθηκε μεταξύ του ποσοστού των MDSCs από PBMC και το επίπεδο στο πλάσμα του Arg1 σε ασθενείς ECA σε επόμενες δοκιμές.

Η συχνότητα των MDSCs στα PBMC αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής, οι ασθενείς και υγιείς μάρτυρες που χρησιμοποιούνται σε αυτό το πείραμα είχε συνδυαστεί με το φύλο, την ηλικία και τον αριθμό. α: Εκπρόσωπος διάγραμμα ανάλυση κυτταρομετρίας ροής για την κυκλοφορία MDSCs από υγιείς μάρτυρες. β: Εκπρόσωπος διάγραμμα ανάλυση κυτταρομετρίας ροής για την κυκλοφορία MDSCs από ασθενείς ΕΕΣ. MDSCs, μυελοειδή προερχόμενα κατασταλτικών κυττάρων? ΕΕΣ, καρκίνο του οισοφάγου? FSC, εμπρόσθια σκέδαση? FITC, ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη? PerCP-Cy5.5, peridinin χλωροφύλλης πρωτεΐνη-Cyanin 5.5? PE, φυκοερυθρίνη? APC, αλλοφυκοκυανίνη.

Η

Ενισχυμένη μακροφάγα Μ2 σε ασθενείς ECA

CD163 είναι ένας υποδοχέας οδοκαθαριστής, ρυθμίζεται προς τα πάνω από τα μακροφάγα με αντι-φλεγμονώδη περιβάλλοντα [16] και θεωρείται ως εξαιρετικά ειδικές μονοκυττάρων /μακροφάγων δείκτης για M2 μακροφάγα [17] – [19]. Τα περισσότερα χαρτιά στο μετα-ανάλυση που χρησιμοποιείται CD68 ως δείκτης για τα μακροφάγα που σχετίζονται με όγκους (ΤΑΜ) [20]. CD68, ωστόσο, αναγνωρίζει τόσο Μ1 και Μ2 μακροφάγα [21]. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιείται CD68 και CD163 ως δεικτών των μακροφάγων και των μακροφάγων Μ2 αντίστοιχα. Για να αναλυθεί το κατά πόσον ο εντοπισμός του CD163

+ και CD68

+ μακροφάγα είχε μια συσχέτιση με κλινικά χαρακτηριστικά, την κατανομή των CD163

+ και CD68

+ μακροφάγων στον όγκο και όγκο χωρίς ιστούς εκτιμήθηκε χωριστά (Σχήμα 2). Οι κατηγορίες χρώση αρχικά δέχεται από 0 έως 3 σε μακροφάγων πυκνότητα διήθηση. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι περισσότεροι καρκινικοί ιστοί είχαν υψηλότερες πυκνότητες του CD163

+ και CD68

+ μακροφάγων διείσδυση από εκείνους στους ιστούς του όγκου-free. Οι θετικές τιμές έκφραση CD163

+ και CD68

+ ήταν 68% και 78% αντίστοιχα σε ιστούς του καρκίνου σε σύγκριση με 4% και 6% στους παρακείμενους ιστούς του καρκίνου. Επιπλέον, η αυξημένη αναλογία των MDSC σε PBMC από ασθενείς ECA ήταν στενά συνδεδεμένη με την έκφραση του CD163 σε καρκινικούς ιστούς (Πίνακες 4-5).

Αντιπροσωπευτικά ανοσοϊστοχημική εικόνες έδειξαν την έκφραση του CD68 σε καρκίνο παρακείμενο ιστό (ένα). και ένα καρκινικό ιστό (Β). Αντιπροσωπευτικά ανοσοϊστοχημική εικόνες έδειξαν την έκφραση του CD163 σε μια καρκίνο γειτονικό ιστό (γ). και ένας ιστός καρκίνου (δ). Φυσιολογικό οισοφαγικό πλακώδες επιθήλιο (αιματοξυλίνη-ηωσίνη /HE χρώση) (ε). Πλακώδες καρκίνωμα του οισοφάγου (ΗΕ χρώση) (στ). Ανάλυση του αριθμού των CD68

+ μακροφάγα (g). και CD163 + μακροφάγα (h). στον καρκίνο και καρκίνο παρακείμενους ιστούς, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι περισσότεροι ιστοί καρκίνος είχε μεγαλύτερο αριθμό CD68 + και CD163 + μακροφάγων διείσδυση από ότι στα καρκινικά-γειτονικών ιστών.

Η

Η

Αυξημένη IL -4 και GATA3 mRNA ενώ μειώθηκε IFN γ-mRNA σε PBMC από ασθενείς ECA

Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης των γονιδίων που κωδικοποιούν κυτοκίνη IL-4, IL-6, IL-12, IL-13 και ΙΡΝ-γ, καθώς επίσης και παράγοντες μεταγραφής GATA3 και Τ-στοίχημα αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας PCR πραγματικού χρόνου. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3, οι ασθενείς ECA είχε αυξηθεί εκφράσεις της IL-4 και GATA3 mRNA σε σύγκριση με τους υγιείς ελέγχους (

P

& lt? 0,05). IFN-γ, IL-12, και του mRNA της IL-13 εκφράσεις στην ομάδα του Ελεγκτικού Συνεδρίου ήταν σημαντικά χαμηλότερα από αυτά της ομάδας ελέγχου (όλα

P

& lt? 0,05). Αλλά δεν βρέθηκε σημαντική διαφορά από την άποψη της έκφρασης του mRNA της Τ-bet μεταξύ των δύο ομάδων (

P

& gt? 0,05).

Τα επίπεδα mRNA της IFN-γ (α), Τ- στοίχημα (β), IL-4 (γ), GATA3 (δ) και IL-12 (ε) προσδιορίστηκαν με PCR πραγματικού χρόνου. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με t-test του Student. *

P

& lt? 0,05, ***

P

& lt? 0.001 vs. ομάδα ελέγχου. NS, καμία σημαντική διαφορά. ΕΕΣ, καρκίνο του οισοφάγου? PCR, αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης? IFN, ιντερφερόνη? IL, ιντερλευκίνη. Οι ασθενείς και υγιείς μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν στο πείραμα αυτό είχε συνδυαστεί με το φύλο, την ηλικία και τον αριθμό.

Η

Αύξηση της IL-6, IL-13, Arg1 στο πλάσμα ασθενών ΕΕΣ

Plasma IFN-γ, IL-4, IL-6, IL-13, και Arg1 προσδιορίστηκαν με ELISA. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4, IL-6 και IL-13 οι συγκεντρώσεις ήταν σημαντικά υψηλότερα στους ασθενείς ECA σε σύγκριση με τα άτομα ελέγχου (

P

& lt? 0,05 και

P

& lt? 0.001). Επιπλέον, ένα υψηλότερο επίπεδο Arg1 βρέθηκε στο πλάσμα ασθενών ECA. Ωστόσο, δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στην ΙΡΝ-γ ή της συγκέντρωσης της IL-4 μεταξύ των δύο ομάδων.

Οι ασθενείς και υγιείς μάρτυρες που χρησιμοποιούνται σε αυτό το πείραμα ήταν ανάλογη με το φύλο, την ηλικία και τον αριθμό. Οι συγκεντρώσεις πλάσματος της IFN-γ (Α), IL-4 (β), IL-6 (γ), Arg1 (d) και IL-13 (ε) προσδιορίστηκαν με ELISA. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με t-test του Student. *

P

& lt? 0,05, ***

P

& lt? 0.001 vs. ομάδα ελέγχου. NS: δεν υπάρχει σημαντική διαφορά, ΕΕΣ: καρκίνο του οισοφάγου, ELISA: ανάλυση ELISA, IFN: ιντερφερόνη, IL: ιντερλευκίνη, Arg1: αργινάσης 1.

Η

Ανάλυση συσχέτισης μεταξύ των διαφόρων κυτοκινών σε ασθενείς ΕΕΣ

Οι συσχετίσεις μεταξύ των διαφόρων κυτοκινών σε ασθενείς ΕΕΣ αναλύθηκαν. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5, υπήρχε μια σημαντική θετική συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων Arg1 (MDSCs και Μ2 συνδέονται κυτοκίνης) και IL-13 (Th2 τύπου κυτοκίνη) στο πλάσμα από τους ασθενείς ECA. IL-4, όπως μία κυτοκίνη Th2 του, η έκφραση mRNA αυξήθηκε μετά την ενίσχυση Arg1 πλάσμα, αλλά ένας αρνητικός συσχετισμός βρέθηκε μεταξύ IFN-γ και Arg1. Επιπλέον, η συγκέντρωση της IL-13 στο πλάσμα έδειξαν θετική συσχέτιση με το επίπεδο του mRNA της IL-4 σε PBMC (r = 0,45,

P

& lt? 0,05)

Α:. Συσχέτιση μεταξύ της συγκέντρωσης στο πλάσμα του Arg1 και τα ποσοστά των κυκλοφορούντων MDSCs σε ασθενείς ΕΕΣ. Θετική συσχέτιση βρέθηκε μεταξύ Arg1 και MDSCs (r = 0,493,

P

= 0,006). b: Συσχετισμός μεταξύ συγκέντρωσης στο πλάσμα του Arg1 και το επίπεδο mRNA της IL-4 από τους ασθενείς ECA. Θετική συσχέτιση βρέθηκε μεταξύ Arg1 και IL-4 mRNA (r = 0.510,

P

= 0,009). γ: Συσχέτιση μεταξύ των συγκεντρώσεων στο πλάσμα της Arg1 και IL-13 από τους ασθενείς του Ελεγκτικού Συνεδρίου. Θετική συσχέτιση βρέθηκε μεταξύ Arg1 και IL-13 (r = 0,455,

P

= 0,017). d: Συσχέτιση μεταξύ του επιπέδου του mRNA της IL-4 και το πλάσμα επίπεδο IL-13 από ασθενείς ECA. Θετική συσχέτιση βρέθηκε μεταξύ της IL-4 και IL-13 (r = 0,484,

P

= 0,016). e: Συσχέτιση μεταξύ του επιπέδου του mRNA της ΙΡΝ-γ και το επίπεδο στο πλάσμα του Arg1 από ασθενείς ECA. Αρνητική συσχέτιση βρέθηκε μεταξύ IFN-γ και Arg1 σε ασθενείς ECA (r = -0,381,

P

= 0,038). στ: Συσχέτιση μεταξύ του αριθμού των CD163

+ μακροφάγα σε καρκινικούς ιστούς και τα ποσοστά των κυκλοφορούντων MDSCs σε PBMC από ECA ασθενών (r = 0.410,

P

= 0,003). g: Συσχέτιση μεταξύ του αριθμού των CD163

+ μακροφάγα σε ιστούς του καρκίνου και η συγκέντρωση στο πλάσμα της IL-13 από τους ασθενείς ECA (r = 0,405,

P

= 0.036)

Η

Συζήτηση

MDSCs, υπό κανονικές συνθήκες μεταναστεύουν σε διαφορετικές περιφερικά όργανα και διαφοροποιούνται σε δενδριτικά κύτταρα, μακροφάγα και /ή κοκκιοκύτταρα. Ωστόσο, παράγοντες που παράγονται στο μικροπεριβάλλον του όγκου, μόνος του ή σε συνδυασμό, να προωθήσει τη συσσώρευση MDSCs, εμποδίζουν τη διαφοροποίησή τους και να επάγουν την ενεργοποίηση τους. Στο περιβάλλον του όγκου, MDSCs μπορούν επίσης να διαφοροποιηθούν σε ΤΑΜ, το οποίο είναι ένα μοναδικό φαινότυπο του οποίου η λειτουργία είναι διαφορετική από MDSCs [5]. Τα μακροφάγα είναι πλαστικά κυττάρων, δεδομένου ότι μπορούν να αλλάξουν από μια ενεργοποιημένη κατάσταση M1 πίσω σε μια κατάσταση Μ2 /ΤΑΜ, και αντίστροφα, με την επαγωγή ειδικών σημάτων. Τα μακροφάγα που διηθούν σε καρκινικούς ιστούς αναφέρονται ως ΤΑΜ, οι οποίοι συμμετέχουν ενεργά στην ανάπτυξη του μικροπεριβάλλον του όγκου. Η ετερογένεια των φαινοτύπων παρατηρείται μεταξύ των ΤΑΜ σε διάφορους κακοήθεις όγκους, και ένα σημαντικό ποσοστό των ΤΑΜ /Μ2 φαινότυπος συνδυάζεται με χειρότερη κλινική πρόγνωση και υψηλού βαθμού κακοήθειας [22]. Το 2007, Sinha et al. [23], που χρησιμοποιείται στην αυθόρμητα μεταστατικό καρκίνωμα του μαστού 4Τ1 ποντικού, και απέδειξαν ότι MDSCs εξασθενημένη ανοσία όγκου καταστέλλοντας την ενεργοποίηση των Τ κυττάρων, καθώς και την αλληλεπίδραση με τα μακροφάγα να αυξήσουν την IL-10 και μειώνουν παραγωγή IL-12, προωθώντας έτσι ένα τύπο όγκου προάγει 2 απόκριση, μια διαδικασία η οποία μπορεί να αντιστραφεί εν μέρει από gemcitabine. Με βάση αυτό, η μελέτη μας στοχεύει ΕΕΣ και να διερευνηθεί MDSCs στο περιφερικό αίμα, μακροφάγων στους ιστούς του όγκου και τα επίπεδα ορισμένων σχετικών παραγόντων. Όπως ήταν αναμενόμενο, η αυξημένη MDSCs βρέθηκαν στο περιφερικό αίμα, και κάποια ποσότητα του Μ2 μακροφάγων διεισδύσει εντός των θέσεων των όγκων, η οποία έδειξε ότι οι κυτταρικοί πληθυσμοί είχαν εμπλακεί στην παθογένεση του ECA. Επιπλέον, το αυξημένο επίπεδο των Arg1, η οποία συσχετίστηκε με MDSCs και μακροφάγα M2 λειτουργίες του πλάσματος, βρέθηκε επίσης σε ασθενείς ΕΕΣ. Αξίζει να σημειωθεί ότι η αυξημένη αναλογία των MDSCs σε ΜΚΠΑ από ασθενείς με ECA ήταν στενά συνδεδεμένη με την έκφραση του CD163 σε καρκινικούς ιστούς.

Προηγουμένως δείξαμε ότι υπήρχε ένα κυρίαρχο Th2 φαινότυπο σε ασθενείς με γαστρικό καρκίνο, και θεωρήθηκε ότι οι Th2 συνδέονται κυτταροκινών IL-4, IL-13, IL-6 και μεταγραφικών παραγόντων GATA3 μπορούσε στενά να σχετίζεται με την πόλωση του Μ2 και MDSCs, και προωθείται ένα ανοσοκατασταλτικό περιβάλλον σε ασθενείς με καρκίνο. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι οι ασθενείς ECA εμφάνισαν αξιοσημείωτες αυξήσεις στα επίπεδα του mRNA της IL-4 και GATA3, καθώς και τα επίπεδα της IL-13 και IL-6 στο πλάσμα. Αντίθετα, το επίπεδο της ΙΡΝ-γ και τα επίπεδα του mRNA της ΙΡΝ-γ και IL-12 στο πλάσμα μειώθηκαν. Υπήρχε θετική συσχέτιση μεταξύ του επιπέδου του mRNA της IL-4 και το πλάσμα επίπεδο IL-13, και οι δύο αυτές κυτοκίνες αυξήθηκε μετά την αύξηση Arg1 στο πλάσμα. Εν τω μεταξύ, μια αρνητική συσχέτιση μεταξύ της ΙΡΝ-γ και Arg1. Τα παρόντα δεδομένα έδειξαν ότι υπήρχε ένα κυρίαρχο Th2 φαινότυπο σε ασθενείς ECA και ήταν συνεπής με αυξημένο επίπεδο Arg1, η οποία ήταν MDSCs και Μ2 συνδέονται κυτοκίνης. Πρόσφατα, Gabitass et al. [24], ανέφεραν ότι MDSCs ήταν αυξημένα σε παγκρεατικά και γαστρικό καρκίνο, και απέδειξαν ότι ήταν ένα ανεξάρτητο προγνωστικούς παράγοντες και συνδυάζεται με σημαντική αύξηση της κυτοκίνης Th2 IL-13. Τα αποτελέσματα αυτά ήταν εν μέρει σύμφωνες με τα δεδομένα μας. Θα πρέπει να αναφερθεί ότι το mRNA IL-4 ήταν αυξημένη σε PBMC, ενώ η έκφραση πρωτεΐνης IL-4 στο πλάσμα ήταν αμετάβλητη σε ασθενείς με καρκίνο. Δεν ήταν ένα εντελώς συνεπής αποτέλεσμα, το οποίο θα μπορούσε να οφείλεται σε IL-4 μεταγραφή του γονιδίου και έκκριση της πρωτεΐνης της δεν ήταν σύγχρονη, περαιτέρω έρευνα ήταν απαραίτητο να διερευνηθεί αυτό με περισσότερες λεπτομέρειες.

Μερικοί ερευνητές πιστεύουν ότι η IL-4 και IL-13 είναι αρκετά για να παίζουν σημαντικούς ρόλους στην ενεργοποίηση των μακροφάγων Μ2 [6]. Επιπλέον, Gabitass RF et al. [24] και Pesce JT et al. [25], έδειξαν ότι οι κυτοκίνες Th2: IL-4 και IL-13 μπορεί να ρυθμίζει προς τα πάνω δραστικότητα αργινάσης αυξάνοντας έτσι τη λειτουργία του κατασταλτική MDSCs και μακροφάγων Μ2. Ως εκ τούτου, προτείνουμε ότι η IL-4, IL-13 και Arg1 είναι βασικοί παράγοντες που μεσολαβούν τη διανομή MDSCs και μακροφάγων Μ2, και είναι στενά συνδεδεμένα με πόλωση κυττάρων Th2. Ostrand-Rosenberg et al. [26], δείχνουν ότι η διασταυρούμενη ομιλία μεταξύ MDSCs και μακροφάγων προωθεί συνέργεια μεταξύ αυτών των κυττάρων με τον τρόπο αυτό αυξάνει το ανοσοποιητικό κατασταλτικά αποτελέσματα των επιμέρους κυτταρικών πληθυσμών. Ως αποτέλεσμα, MDSCs και μακροφάγα στο μικροπεριβάλλον του όγκου είναι άρρηκτα διασυνδέονται έτσι ώστε οι λειτουργίες ενός πληθυσμού επηρεάζεται από την ποσότητα των άλλων πληθυσμών [27] – [30]. Σε μια πρόσφατη ανασκόπηση της επιβίωσης αναλύσεις, διαπιστώθηκε ότι πολλές μελέτες έχουν δείξει κλινικά και παθολογικά χαρακτηριστικά των ασθενών με καρκίνωμα του οισοφάγου ως επεξηγηματικές μεταβλητές σε σχέση με την επιβίωση, και έδειξε ένα καλύτερο ποσοστό επιβίωσης για τις γυναίκες ή τους νέους ασθενείς. Οι λόγοι για αυτό είναι πιθανό να περιλαμβάνουν ένα συνδυασμό καλύτερη γενική υγεία και πιο αποτελεσματική ανοσολογική κατάσταση [31] – [32]. Ωστόσο, υπήρχαν περιορισμοί με την παρούσα μελέτη, στην οποία ο συσχετισμός μεταξύ MDSCs% και των κλινικών παθολογικών παραγόντων των ασθενών ΕΕΣ δεν αναλύθηκαν, πρέπει να ληφθεί υπόψη στις μελλοντικές εργασίες μας.

Συμπέρασμα

εμείς αποκάλυψε μια ενδιαφέρουσα σύνδεση μεταξύ των κυττάρων Th2 συνδέονται κυτοκινών και MDSCs ή μακροφάγα Μ2 στο Ελεγκτικό Συνέδριο. Οι αλλαγές ανιχνεύθηκαν στην IL-4, IL-6, IL-13 και GATA3 επίπεδα συσχετίζονται θετικά με MDSCs και ενεργοποίηση μακροφάγων Μ2, αλλά ΙΡΝ-γ έπαιξε το αντίθετο αποτέλεσμα. Η στενή σχέση μεταξύ κυκλοφορούντων MDSCs και διείσδυση ιστού του Μ2 μακροφάγων έδειξε ότι η διείσδυση του Μ2 μακροφάγων σε ιστούς ECA μπορεί να σχετίζεται με MDSCs πόλωση που περιλαμβάνουν Th2 πλεονέκτημα. Αυτά τα αποτελέσματα παρέχουν καλύτερη κατανόηση των συστηματική ανοσοκαταστολή, όπως η αλληλεπίδραση μεταξύ Τ κυττάρων και MDSCs ή μακροφάγα Μ2, συστημική κυτοκίνες και μονοπάτια σηματοδότησης τους, και μπορεί να συμβάλει στην ενεργοποίηση νέων στρατηγικών για την αντικαρκινική θεραπεία, οι οποίες βασίζονται σε διαμόρφωση των ανοσοκατασταλτικών επιδράσεων του όγκου -associated MDSCs, μακροφάγα Μ2 και τα Th2 κύτταρα.

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς είναι ευγνώμονες προς Zhijian Zhang, Sheng Xia, Qixiang Shao και Peifang Yang για την εξαιρετική τεχνική βοήθεια. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (31270947, 31170849 και 30972748), Φυσικό Ίδρυμα Επιστημών της επαρχίας Jiangsu (BK2011472) και Μεταδιδακτορικός Ίδρυμα της Κίνας (2012M511705).