Αφηρημένο

Ρυθμιστής της Cullins-1 (ROC1) είναι μια βασική υπομονάδα του συμπλόκου πρωτεΐνης Cullin-RING λιγάση (CRL). Η υπερέκφραση του ROC1 πρωτεΐνη συνδέεται με την εξέλιξη του όγκου και κακή πρόγνωση των μη μυϊκών επεμβατική κύστη καρκίνωμα μεταβατικού κυττάρου (NMIBC). Αυτή η μελέτη σχεδιάστηκε για να αξιολογήσει τις επιπτώσεις της ROC1 νοκ ντάουν σε καρκινικά κύτταρα της ουροδόχου κύστης και για τον προσδιορισμό των πιθανών μηχανισμών που εμπλέκονται. Ένα σύνολο 112 δειγμάτων ιστού καρκίνου της ουροδόχου κύστης είχαν προσληφθεί για ανοσοϊστοχημικές αναλύσεις ROC1 υπερέκφραση. καρκινικές κυτταρικές γραμμές της ουροδόχου κύστης χρησιμοποιήθηκαν για να knockdown έκφραση ROC1 χρησιμοποιώντας ROC1 siRNA. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι ROC1 knockdown αξιοσημείωτα ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων καρκίνου της ουροδόχου κύστης, συνελήφθη κύτταρα στην φάση G2 του κυτταρικού κύκλου, και επαγόμενη από την ρ53-εξαρτώμενη κυτταρική γήρανση. Μοριακά, G2 διακοπή συνδέθηκε με προς τα πάνω ρύθμιση του p21, ρ27, κυκλίνη Β1, και πρωτεΐνες Cdc2. ROC1 νοκ ντάουν που προκαλείται-γήρανση λειτουργούσε μέσω μονοπατιού p53 /p21. Knockdown της έκφρασης p21 διασώθηκαν μερικώς ROC1 knockdown επαγόμενη αναστολή της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων. Επιπλέον, γυμνό ξενομοσχεύματος ποντικού αναλύσεις επιβεβαίωσαν αυτές τις

in vitro

δεδομένων. Συμπερασματικά, τα δεδομένα από την τρέχουσα μελέτη δείχνουν ότι ROC1 διαδραματίζει ουσιαστικό ρόλο στην εξέλιξη του καρκίνου της ουροδόχου κύστης και θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως ένα νέο αντικαρκινικό στόχο για κύστης καρκίνωμα από μεταβατικό επιθήλιο (BTCC)

Παράθεση:. Wang W, Liu Ζ, Qu P, Zhou Z, Zeng Υ, Fan J, et al. (2013) Νοκ ντάουν του ρυθμιστή της Cullins-1 (ROC1) Έκφραση Προκαλεί καρκίνο της ουροδόχου κύστης κυτταρικού κύκλου σύλληψης στην G2 φάση και γήρανση. PLoS ONE 8 (5): e62734. doi: 10.1371 /journal.pone.0062734

Επιμέλεια: Xiaolin Zi, του Πανεπιστημίου της Καλιφόρνια Irvine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 16 Γενάρη 2013? Αποδεκτές: 25 του Μαρτίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: May 8, 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Πρόγραμμα της Σαγκάης Ακαδημαϊκό ηγετών του συστήματος Υγείας (Νο XBR2011038). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνου της ουροδόχου κύστης είναι η τέταρτη πιο κοινή μορφή καρκίνου και είναι η όγδοη κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο μεταξύ των ανδρών στον κόσμο [1]. Ιστολογικά, το καρκίνωμα της ουροδόχου κύστης από μεταβατικό επιθήλιο (BTCC) είναι η πιο κοινή υποτύπου και αντιπροσωπεύει -90% όλων των καρκίνων της ουροδόχου κύστης [2]. Κλινικά, το 20% έως 30% των νέων περιπτώσεων καρκίνου της ουροδόχου κύστης έχουν εισβάλλει μέσα στο μυ στρώμα (ονομάζεται διηθητικό καρκίνωμα μεταβατικού κυττάρου, ΜΙ-TCC), ενώ ένα επιπλέον 10% έως 30% του nonmuscle επεμβατικών καρκίνους της ουροδόχου κύστης θα τελικά πρόοδος έως MI-TCC [3]. Μέχρι σήμερα, η θεραπεία του καρκίνου της ουροδόχου κύστης εξαρτάται από το βάθος των όγκος εισβάλλει εντός του τοιχώματος της ουροδόχου κύστης? για τους ασθενείς MI-TCC, σισπλατίνη βασίζεται σε χημειοθεραπεία συνήθως συνιστάται μετά από χειρουργική επέμβαση [2]. Ωστόσο, η σοβαρή τοξικότητα των χημειοθεραπειών και σχετικά χαμηλή αντικαρκινική αποτελεσματικότητα περιοριστεί σε μεγάλο βαθμό η εφαρμογή της στην κλινική και την πλειοψηφία των MI-TCC θα προχωρήσει τελικά και στην επανάληψη, με αποτέλεσμα την κακή πρόγνωση των ασθενών ΜΙ-TCC [2], [4]. Ως εκ τούτου, ο προσδιορισμός νέων αποτελεσματικών αντικαρκινικών στόχων και παραγόντων έχει μεγάλη κλινική σημασία και χρειάζεται επειγόντως.

Προς το σκοπό αυτό, εστιάσαμε στις λιγάσες Cullin-RING (ΚΕΑ) (επίσης γνωστή ως Skp1, Cullin, ή F πρωτεΐνη -κουτί [SCF]), τα οποία είναι η μεγαλύτερη οικογένεια του Ε3 λιγάσες ουβικιτίνης. Λόγω της ικανότητας να μεσολαβήσει ~ 20% ουβικιτινιωμένες πρωτεϊνικών υποστρωμάτων για την αποικοδόμηση πρωτεασώματος στόχευσης [5], CRL παίζουν σημαντικό ρόλο στην ουβικιτινίωση των πρωτεϊνών συνδέονται με τον κύκλο των κυττάρων ή άλλες πρωτεΐνες (π.χ., πρωτεΐνη αντιγραφή του DNA, πρωτεΐνη μεταγωγής σήματος, γονίδιο παράγοντα μεταγραφής) [6]. δυσλειτουργία συνεργάτες της με την ανάπτυξη και την εξέλιξη του όγκου, γεγονός που υποδηλώνει ότι CRL θα μπορούσε να είναι ένας πιθανός στόχος αντικαρκινικό. MLN4924, ένα μικρό μόριο αναστολέα στο αδρανοποιημένο CRL από την αναστολή της δραστικότητας Cullins, θα μπορούσε να αναστείλει αποτελεσματικά την ανάπτυξη των διαφόρων καρκινικών κυττάρων [7], υποδηλώνοντας περαιτέρω την σημασία της CRL στη διατήρηση της ανάπτυξης του όγκου [8], [9]. Ωστόσο, ρυθμιστής του Cullins-1 (ROC1), ένα άλλο βασικό υπομονάδα CRL που ετεροδιμερίζεται με διακριτές Cullins να αποτελούν τα καταλυτικά πυρήνων, των οποίων η λειτουργία που σχετίζεται με τον καρκίνο είναι ανεπαρκώς καταλάβουν [5]. ROC1, επίσης γνωστή ως κουτί δαχτυλίδι πρωτεΐνη-1 (RBX1), περιλαμβάνει ένα μικρό πεδίο σύνδεσης ψευδαργύρου ονομάζεται παράμεσου, είναι μια εξελικτικά συντηρημένη πρωτεΐνη από ζυμομύκητα για την ανθρώπινη και παίζει ουσιαστικό ρόλο στην εμβρυϊκή ανάπτυξη [5]. Η ανώμαλη έκφραση των ROC1 οδηγεί σε δυσλειτουργία CRL και προκαλεί εμβρυϊκή θνησιμότητα [10]. Πρόσφατα, μερικές μελέτες έχουν τονίσει το ρόλο της σε ανθρώπινους καρκίνους αφού ROC1 μπορεί να είναι απαραίτητη για τη διατήρηση της ακεραιότητας του γονιδιώματος [11]. Στο σκεπτικό, η υπερέκφραση του ROC1 προκάλεσε εκτροπή του μεταβολισμού των πρωτεϊνών οφείλεται στην απελευθέρωση της πρωτεΐνης μετα-μεταφραστική ubiquitylation, και τελικά έχουν αντίκτυπο στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου. Πράγματι, η έκφραση ROC1 επηρεάζουν την ανάπτυξη του μελανώματος του δέρματος με τη ρύθμιση cyclinD1 υποβάθμιση [12]. Σταθερά, τα προκαταρκτικά στοιχεία μας έδειξαν ότι η πρωτεΐνη ROC1 υπερεκφράζεται σε μη διηθητικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης, γεγονός που υποδηλώνει το δυναμικό ρόλο της στην ανάπτυξη και την πρόοδο του καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Στην παρούσα μελέτη, προσδιορίσαμε τις επιδράσεις της ROC1 knockdown στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης και των πιθανών υποκείμενων μηχανισμών για την παροχή ενός νέου στόχου για τη θεραπεία του καρκίνου της ουροδόχου κύστης και στο μέλλον.

Υλικά και Μέθοδοι

δείγματα ιστών

σε αυτή τη μελέτη, θα προσληφθούν πρώτα 112 περιπτώσεις δείγματα ιστών BTCC από ασθενείς που υποβλήθηκαν σε χειρουργική επέμβαση στη Σαγκάη Jiao Tong University Affiliate πρώτη Νοσοκομείο μεταξύ Ιανουαρίου 2004 και Μαΐου 2006. οι ασθενείς αυτοί περιλαμβάνονται 83 άνδρες και 29 γυναίκες και είχαν παθολογικά διαγνωστεί με πρωτογενή BTCC και την ηλικία των ασθενών αυτών ήταν μεταξύ 30 και 86 ετών (μέση ηλικία 64 ετών). Εβδομήντα ένας ασθενείς υποβλήθηκαν σε διουρηθρική εκτομή, 24 ασθενείς υποβλήθηκαν σε μερική κυστεκτομή, και 17 ασθενείς υποβλήθηκαν σε ριζική κυστεκτομή. Ο βαθμός και το στάδιο των όγκων αξιολογήθηκαν σύμφωνα με τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας (ΠΟΥ) το 1973 τα κριτήρια και τις αμερικανικές μεικτής επιτροπής για τον Καρκίνο (AJCC) 2002 σύστημα TNM. Επιπλέον, μακρινό φυσιολογικοί ιστοί ουροδόχου κύστης συλλέχθηκαν επίσης ότι ήταν περισσότερο από 5 cm μακριά από το περιθώριο του όγκου για αυτή τη μελέτη. Ένα πρωτόκολλο για τη χρήση ανθρώπινων χειρουργικών δειγμάτων εγκρίθηκε από την Επιτροπή Ιατρικής Δεοντολογίας του Νοσοκομείου της Σαγκάης Πρώτη λαού της Σαγκάης Jiao Tong University (Αριθμός Άδειας: 2011K047) και γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από κάθε ασθενή

Ανοσοϊστοχημεία

Αρχείο παραφίνη-ενσωματωμένες φορμόλη-σταθερά τμήματα ιστού από αυτούς τους ασθενείς κόπηκαν για 4 μm πάχους τομές και χρησιμοποιούνται για ανοσοϊστοχημεία, και το πρωτόκολλο που χρησιμοποιήθηκε ήταν σύμφωνα με την περιγραφή του Πάνα [13]. Ένα πολυκλωνικό αντίσωμα έναντι ROC1 (Abcam, Cambridge, ΜΑ) ή Κί67 (Epitomics, Κίνα) αραιώθηκε σε 1:300 και χρησιμοποιήθηκε για τη χρώση ανοσοϊστοχημικώς αυτά τα τμήματα ιστού χρησιμοποιώντας ένα τυποποιημένο πρωτόκολλο με την Envision διπλής σήμανσης κιτ Polymer (BioGenex, San Ramon, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι τομές στη συνέχεια με αιματοξυλίνη και ανεξάρτητα αξιολογούνται από δύο παθολόγους.

Γραμμές Κυττάρων και Culture

καρκίνος της ουροδόχου κύστης του Ανθρώπου RT4, 5637, BIU87, 253J, Τ24, και κυτταρικές γραμμές EJ αγοράστηκαν από η κινεζική Ακαδημία Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα) και καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 (Gibco, CA, USA) με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS) (Gibco). Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε υγροποιημένο 5% CO

2 περιβάλλοντος στους 37 ° C. Επιπλέον, η κανονική urothelial κύτταρα (NUC) ελήφθησαν από φρέσκο ​​ιστούς κύστη του 2 μικρά δοτών (30 και 32 ετών), και καλλιεργήθηκε στους 37 ° C με 5% CO

2 σε κερατινοκύτταρα μέσο άνευ ορού (KSFM? Gibco) συμπληρωμένο με 1% FBS, 100 IU mL

-1 πενικιλλίνη, και 100 IU mL

-1 στρεπτομυκίνη.

ROC1 siRNA και διαμόλυνση

Διαφορετικές siRNA ολιγονουκλεοτίδια για διάφορους γονίδια (όπως ROC1 ή ρ21) ελήφθησαν από την Invitrogen (Carlsbad, CA) και χρησιμοποιήθηκαν για επιμόλυνση σε κύτταρα καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων όλη τη νύκτα και την επόμενη ημέρα, επιμολύνθηκαν με ROC1 siRNA χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι αλληλουχίες siRNA ROC1 ήταν 5′-GACTTTCCCTGCTGTTACCTAA-3 ‘? για ρ21, 5’-GACCAUGUGGACCUGUCAC-3 ‘? και για το ανακατωμένο έλεγχο, 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3 ‘. Τα κύτταρα στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε εκχύλιση πρωτεΐνης ή άλλες αναλύσεις, όπως παρατίθενται κατωτέρω.

Protein Εκχύλιση και Western Blot

Η κυτταρική πρωτεΐνη εκχυλίστηκε από τα κύτταρα με ή χωρίς γονίδιο διαμόλυνση χρησιμοποιώντας ένα ρυθμιστικό διάλυμα λύσης. Μετά τον ποσοτικό προσδιορισμό, τα προϊόντα λύσης πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν σε ένα πήγμα SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF (Millipore, Billerica, ΜΑ), και ανοσοστυπώθηκαν με ένα αντίσωμα έναντι ROC1 (Abcam), GAPDH, Rb, κυκλίνη Β1 (Epitomics), ρ16 , ρ21, ρ27, ρ53, pRb, D1 κυκλίνης, και cdc2 (Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ) και, στη συνέχεια, με ένα δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας. Το δεσμευμένο αντίσωμα οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας πρότυπη μεθοδολογία χημικής φωταύγειας.

Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού και Αποικίας Δοκιμασίες Σχηματισμού

Για την εκτίμηση των φαινοτύπων αλλαγμένη κύτταρο με knockdown έκφρασης ROC1, επιμολύναμε κύτταρα με siROC1 ή siCONT για 24 h και στη συνέχεια χωρίστηκε και σπάρθηκαν τα κύτταρα πάνω σε πλάκες 96 φρεατίων με 2.000 κύτταρα ανά φρεάτιο εις τριπλούν. Στις 24, 48, 72, 96 και 120 ώρες μετά την επιμόλυνση, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας το Κιτ-8 κιτ Καταμέτρηση κυττάρων (Beyotime, Κίνα) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Για τον σχηματισμό αποικιών, ο διπλές κύτταρα σπάρθηκαν πάνω σε τρυβλία καλλιέργειας 35-mm σε 400 κύτταρα (253J) ή 1000 κυττάρων (5637) ανά φρεάτιο εις τριπλούν. Μετά 9 ημερών επώασης στους 37 ° C, οι αποικίες βάφτηκαν με κρυσταλλικό ιώδες σε 50% μεθανόλη και ο αριθμός των αποικιών των 20 ή περισσότερων κυττάρων μετρήθηκε.

Δοκιμασία κυτταρομετρίας ροής

Για την ανίχνευση αλλαγμένη κατανομή κυτταρικού κύκλου, πρέπει πρώτα επιμολυσμένα siRNA σε καρκινικά κύτταρα κύστης και στη συνέχεια να τους σταθερά σε παγωμένο 70% όλη τη νύκτα αιθανόλη. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με παγωμένο αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) και στη συνέχεια χρωματίζονται με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ? Στα 20 μg /ml, Sigma) διάλυμα για 5 λεπτά. Τα δείγματα των κυττάρων στη συνέχεια αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας FACScan ροής BD κυτταρόμετρο για κατανομές κυτταρικού κύκλου. Για την αξιολόγηση φάση μίτωσης, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με ΡΗ3 /ΡΙ χρησιμοποιώντας το Alexa 647-συζευγμένη φωσφο-ιστόνης Η3-ειδικό αντίσωμα (Τεχνολογία Σηματοδότησης Κυττάρου) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

κυτταρική γήρανση Associated-β-Γαλακτοσιδάσης Δοκιμασία

κυτταρική γήρανση σχετίζεται με την έκφραση του β-γαλακτοσιδάσης (SA-β-Gal) δραστηριότητα μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ ανίχνευσης κυτταρικής γήρανσης (Beyotime, Κίνα) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Κύτταρα με θετική δράση β-γαλακτοσιδάσης (μπλε χρώμα) σε pH 6,0 μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο φωτός και κατά μέσο όρο.

Αξιολόγηση των κυττάρων Μορφολογία και ανοσο fl uorescence χρώση των φωσφο-γH2AX

Μετά την επιμόλυνση με siROC1 ή siCONT για 24 ώρες, τα καρκινικά κύτταρα της ουροδόχου κύστης χωρίστηκαν και επανα-εμβολιάστηκαν σε πλάκες καλλιέργειας των 24 φρεατίων και καλλιεργήθηκαν για 72 ώρες. κυτταρική μορφολογία παρατηρήθηκε υπό ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο. Κύτταρα με διευρυμένη και ισοπέδωσε μορφολογικές αλλοιώσεις θεωρήθηκαν ως γηρασμένα θετικά. Για τη χρώση εστίες γH2AX, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με siROC1 ή siCONT για 96 ώρες και στη συνέχεια μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη, κατέστησαν διαπερατά με 0,5% Triton Χ για 10 λεπτά, και στη συνέχεια δεσμεύτηκαν με αλβουμίνη 5% βόειου ορού (BSA). Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με αντι-φωσφο-γH2AX πρωτογενές αντίσωμα (Epitomics) στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα επωάστηκαν περαιτέρω την επόμενη ημέρα με μια Alexa 548-συζευγμένο δευτερεύον αντίσωμα (Invitrogen, Carlsbad, CA) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, και αντίθετα με 4, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλης διάλυμα (DAPI) (1 μg /mL από Sigma) και επανεξετάζονται και σημείωσε κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού.

Ποσοτική RT-PCR

Ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen) και στη συνέχεια αντίστροφα μεταγράφηκε σε cDNA χρησιμοποιώντας ένα PrimeScript αντίστροφης μεταγραφής Σύστημα (Takara, Κίνα) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα δείγματα cDNA μετά ενισχύθηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ κύριο μείγμα SYBR Green (Takara). Ακολουθίες των εκκινητών που χρησιμοποιούνται είναι διαθέσιμα κατόπιν αιτήματος. Όλες οι μετρήσεις έγιναν εις τριπλούν. Αμπλικόνιο αναλύθηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ΔΔCt [14].

In vivo

ποντίκι Ξενομοσχεύματα Δοκιμασία

Για να αξιολογηθούν οι επιπτώσεις της ROC1 νοκ ντάουν

in vivo

, πραγματοποιήσαμε ένα γυμνό ποντίκι (αθυμικά, BALB C ηυ /ηυ /) δοκιμασία ξενομοσχεύματος, δηλαδή 5 × 10

6 5637 κύτταρα σε 50 μΐ PBS αναμίχθηκαν με ίσο όγκο του Matrigel (BD Biosciences) εγχύθηκαν υποδορίως σε γυμνά ποντίκια (ηλικίας ηλικίας 4-6 εβδομάδων). Μία εβδομάδα μετά τον ενοφθαλμισμό καρκινικών κυττάρων, 12 ποντίκια χωρίστηκαν σε 2 ομάδες (6 ποντίκια σε κάθε ομάδα, η διάμετρος του όγκου είναι περίπου 0,5 cm) και εντός του όγκου ένεση με 5 χ 10

8 αντίγραφα Lenti-shROC1 στην LT -ROC1 ομάδα ή 5 × 10

8 αντίγραφα Lenti-shCONT στην ΕΤ-CONT, αντίστοιχα. ShROC1 ή τον έλεγχο shRNA ακολουθίες ήταν σύμφωνα με μια προηγούμενη μελέτη [15]. Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε κάθε δεύτερη ημέρα χρησιμοποιώντας ένα παχύμετρο, και ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την εξίσωση (L Χ W

2) /2 (όπου L και W αντιπροσώπευε το μεγαλύτερο διαμήκη και εγκάρσια διάμετρο, αντίστοιχα). Μετά 7 εβδομάδες παρατήρησης, τα ποντίκια θανατώθηκαν και ξενομοσχεύματα όγκου απομακρύνθηκαν, ζυγίστηκαν και φωτογραφήθηκαν. Η μελέτη αυτή ακολούθησε το χειρισμό των ζώων και πειραματικές διαδικασίες και εγκριθεί από την Επιτροπή Φροντίδας Ζώων και Χρήση του Νοσοκομείου της Σαγκάης Πρώτη λαού της Σαγκάης Jiao Tong University.

Στατιστικές Αναλύσεις

Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα του μέσου όρου (SEM). Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση της μεθόδου δοκιμής t Bonferroni μετά μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) για σύγκριση πολλαπλών ομάδα. Δύο συγκρίσεις ομάδα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας t-test του Student.

P

& lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Όλες οι στατιστικές εκτιμήσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση SPSS 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL).

Αποτελέσματα

Η υπερέκφραση της πρωτεΐνης ROC1 στο BTCC ιστών Δείγματα και Κυτταρικές Σειρές

αυτή η μελέτη, ανιχνεύσαμε πρώτη έκφραση ROC1 πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημεία σε 112 περιπτώσεις κανονικής και BTCC δείγματα ιστού, και έξι κυτταρικές σειρές. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι ROC1 πρωτεΐνη εκφράζεται ασθενώς σε 18 από 24 (75%) της κανονικής ουροθήλιο της ουροδόχου κύστης, ενώ ROC1 πρωτεΐνη εντόνως εκφρασμένο σε ιστούς καρκίνου της ουροδόχου κύστης (Σχ. 1), δηλαδή, μεταξύ αυτών των 112 δειγμάτων ιστού BTCC, ROC1 πρωτεΐνη ήταν μέτρια ή εκφράζεται έντονα σε 29 (25,9%), και 66 (58,9%) δείγματα, αντίστοιχα. Επιπλέον, ROC1 πρωτεΐνη εκφράστηκε σε όλες τις ανθρώπινες κυτταρικές σειρές BTCC (RT4, 5637, BIU87, 253J, Τ24, και EJ) σε σύγκριση με τα πρωτογενή ανθρώπινα κύτταρα urothelial (Εικ. 1).

Α και Β, Ανοσοϊστοχημεία (μεγέθυνση χ 400). Βιτρώ τμήματα μικροσυστοιχίες ιστών βαθμολογήθηκαν για τέσσερις ομάδες ανάλογα με χρώση ένταση. C, κηλίδα Western αναλύσεις της έκφρασης ROC1 σε διάφορες BTCC κυτταρικές σειρές και φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα ουροδόχου κύστης (NUC).

Η

Αναστολή BTCC Ανάπτυξης Κυττάρων Μετά Νοκ ντάουν της ROC1 Έκφραση

Για να αξιολογηθεί ο ρόλος της ROC1 στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης, εμείς γκρέμισε έκφραση ROC1 σε κυτταρικές σειρές BTCC χρησιμοποιώντας ROC1 siRNA και ένα κωδικοποιημένο siRNA ως μάρτυρες. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι ROC1 siRNA χτυπηθεί επιτυχώς έκφραση της πρωτεΐνης σε ROC1 253J και 5637 κύτταρα (Σχ 2Α και Β).

Α, κύτταρα C, E, 253J. Β, D, F, 5637 κύτταρα. Αυτές οι δύο κυτταρικές σειρές επιμολύνθηκαν παροδικά με siROC1 ή siCONT για 24-120 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε κηλίδα western (Α και Β) αναλύσεις της έκφρασης ROC1 στις 72 ώρες μετά την επιμόλυνση, κυτταρικής βιωσιμότητας CCK8 (C και D), ή το σχηματισμό αποικιών (Ε και F) δοκιμασίας. Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα τριών ανεξάρτητων πειραμάτων φαίνονται ως μέση τιμή ± SEM. **

P

& lt?. 0.01

Η

Ακολούθως, αξιολογήσαμε τις επιδράσεις της siROC1 knockdown σε αυτά τα καρκινικά κύτταρα κύστης και βρέθηκε ότι τα κύτταρα siROC1 αυξήθηκε σημαντικά πιο αργή από εκείνα των κυττάρων siCONT (

P

& lt? 0,01 σε 72 ώρες, 96 ώρες, και 120 ώρες? Σχ. 2C και D). δοκιμασία σχηματισμού αποικίας έδειξε περαιτέρω ότι ο αριθμός των αποικιών μειώθηκε σε 5- έως 10-φορές σε κύτταρα siROC1 σε σύγκριση με εκείνη των κυττάρων siCONT (

P

& lt? 0,01? Σχ. 2Ε και F).

ROC1 Νοκ ντάουν συνελήφθη κύτταρα στην G2 φάση του κυτταρικού κύκλου

Εμείς καθορίζεται κατανομή του κυτταρικού κύκλου μετά από ROC1 νοκ ντάουν στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης κύτταρα και διαπίστωσαν ότι τόσο 253J και 5637 κυττάρων μετά από ROC1 νοκ ντάουν συνελήφθη στο G2-M φάση του κυτταρικού κύκλου. Συγκεκριμένα, τα κύτταρα 253J εξής επιμολυσμένα με ROC1 siRNA για 48, 72, 96, 120 ώρες αύξησε την φάση G2-M για 11,88 ± 0,27%, 15,68 ± 0,56%, 16.8 ± 0.42%, και 10,8 ± 0,78%, αντίστοιχα, σε σύγκριση με 6 σε 8% στα κύτταρα ελέγχου (Εικόνα 3Α), ενώ 5.637 κύτταρα σε 18 ± 1.41%, 35.5 ± 0.73%, 54,5 ± 2,12% και 46,27 ± 4,62%, αντίστοιχα, σε σύγκριση με 11 έως 14% στα κύτταρα ελέγχου ( Σχήμα 3Β). Αυτά τα δεδομένα αποδεικνύουν ότι η G2-M σύλληψης στις δύο κύτταρα έφθασαν κορυφή σε 96 ώρες μετά την επιμόλυνση.

Α και Β, ROC1 knockdown σύλληψης επάγεται G2-M του κυτταρικού κύκλου σε 253J (Α) και 5637 κύτταρα (Β). Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με siROC1 ή siCONT για 48-120h, και το προφίλ του κυτταρικού κύκλου ανιχνεύεται με χρήση FACS αναλύσεις εξής ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ) χρώση. Γ και Δ, ROC1 νοκ ντάουν σύλληψης που προκαλείται G2 του κυτταρικού κύκλου. 253J (C) και 5637 κύτταρα (D) επιμολύνθηκαν με siROC1 ή siCONT για 96 ώρες, και υποβλήθηκε σε ανάλυση FACS μετά φωσφο-ιστόνης 3 (ΡΗ3) /διπλή χρώση ΡΙ. Ε και F, Έκφραση τον κυτταρικό κύκλο πρωτεΐνη που συνδέεται σε 253J (Ε) και 5637 κύτταρα (F) εξετάσθηκαν χρησιμοποιώντας στύπωμα Western μετά την επιμόλυνση στον υποδεικνυόμενο χρονικό διάστημα. Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα τριών ανεξάρτητων πειραμάτων φαίνονται. Στήλες, σημαίνει τριών ανεξάρτητων πειραμάτων? μπαρ, SEM. **

P

& lt?. 0.01

Η

Στη συνέχεια διερευνήθηκε η έκφραση των ρυθμιστικών αρχών G2-M μετάβασης που σχετίζονται, δηλαδή, η G2-M μετάβαση του κυτταρικού κύκλου ρυθμίζεται από ένα συγκρότημα από cdc2 και Β-τύπου κυκλίνης. Πράγματι, τα στοιχεία μας έδειξαν ότι Οάο2 και κυκλίνη εκφράσεις Β1 ήταν ουσιαστικά up-ρυθμίζεται μετά από ROC1 νοκ ντάουν τόσο 253J (Εικ. 3Ε) και 5637 κύτταρα (Εικ. 3F). Προσδιορίσαμε επίσης την έκφραση των αναστολέων CDK, όπως ρ21 και ρ27 και διαπίστωσε ότι ρ21 και ρ27 ήταν σημαντικά συσσωρευτεί κατά ROC1 knockdown σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές (Σχ 3Ε και F). Η κυκλίνη D1, ένας γνωστός ρυθμιστής του κυτταρικού κύκλου του G1 φάση, ήταν επίσης σημαντικά επάγεται από ROC1 knockdown στις δύο κυτταρικές σειρές (Σχήμα 3Ε & amp?. F).

Για να εξεταστεί περαιτέρω ROC1 knockdown συνελήφθη καρκινικά κύτταρα στο G2 ή Μ φάσεις, εκτελέσαμε αναλύσεις FACS εξής φωσφο-ιστόνης Η3 (ΡΗ3) /ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) διπλή χρώση αυτών των κυτταρικών γραμμών. Η ιστόνη Η3 είναι ένας δείκτης της μίτωσης, όταν φωσφορυλιωθεί στη Ser10 κατά τη διάρκεια της Μ φάσης, αλλά όχι κατά τη φάση G2 [16]. Σε σύγκριση με κύτταρα siCONT, siROC1 έδειξε λιγότερο φωσφόρου ιστόνης Η3-θετική χρώση τόσο 253J και 5637 κύτταρα (Σχ 3C και D), υποδεικνύοντας ότι siROC1 συλληφθεί κυττάρων στη φάση G2 και όχι στη φάση Μ. Συνεπής με αυτά τα αποτελέσματα, τη δυτική δεδομένα blot έδειξε ότι ROC1 νοκ ντάουν μειωμένη έκφραση PH3 (Σχήμα 3Ε & amp?. F). Μειωμένη έκφραση πρωτεΐνης ΡΗ3 και μειωμένη μιτωτικά κύτταρα υποδεικνύουν ότι ROC1 knockdown συλληφθεί κύτταρα στη φάση G2, αλλά εμπόδισε κύτταρα να εισέλθουν στην Μ-φάση.

ROC1 Knockdown Induced καρκίνο της ουροδόχου κύστης 253J κυτταρική γήρανση Μέσω του ρ53 /ρ21 Pathway

Μορφολογικά, ROC1 γκρέμισε κύτταρα 253J έγινε διευρυμένη και ισοπέδωσε, μορφολογία που παρατηρείται συνήθως στα γηρασμένα κύτταρα (Εικ. 4Α, κορυφαία πάνελ), αλλά δεν εμφανίστηκε σε 5637 κύτταρα. Έχουμε περαιτέρω αποφασιστική γήρανση σχετιζόμενη β-γαλακτοσιδάσης (SA-β-gal) δραστηριότητα (Σχ. 4Α, μεσαίο πάνελ), ένα ειδικό δείκτη του γηρασμένα κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4Β, περίπου 25% των κυττάρων 253J βάφτηκαν θετικά ακόλουθη 96h διαμόλυνση ROC1 siRNA, συγκριτικά με λιγότερο από 4% θετική χρώση στα κύτταρα ελέγχου (

P

& lt? 0,01). Επιπλέον, αξιολογήσαμε έκφραση φωσφο-γH2AX χρησιμοποιώντας ανοσο fl χρώσης uorescence, η οποία είναι ένας δείκτης για την κυτταρική γήρανση. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι τα κύτταρα που επιμολύνθηκαν με 253J siROC1 είχαν περισσότερες εστίες γH2AX σε σύγκριση με εκείνη των κυττάρων siCONT (Εικ. 4Α, κάτω πάνελ), δεικνύοντας περαιτέρω ότι ROC1 knockdown κυττάρων που επάγεται 253J γήρανση.

Α και Β, 253J κύτταρα επιμολύνθηκαν με siROC1 ή siCONT για 96 ώρες, ακολουθούμενη από την παρατήρηση μορφολογικών (Α, πάνω φύλλα, μεγέθυνση χ 400), χρώση SA-β-gal (Α, μεσαίο πάνελ, μεγέθυνση χ 400) και ποσοτικοποιούνται με θετικώς χρωματισμένων κυττάρων (Β) και ανοσο fl χρώση uorescence της φωσφο-γH2AX (A, κάτω πάνελ, μεγέθυνση χ 400). C, Έκφραση γήρανση-πρωτεΐνης που συνδέεται με μονοπάτι σε κύτταρα 253J εξετάστηκε χρησιμοποιώντας στύπωμα Western μετά την επιμόλυνση στα υποδεικνυόμενα χρονικά διαστήματα. D, ROC1, ρ53, ρ21 mRNA σε κύτταρα 253J στις 72 ώρες μετά την επιμόλυνση εξετάστηκε χρησιμοποιώντας ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου. Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα τριών ανεξάρτητων πειραμάτων φαίνονται. Στήλες, σημαίνει τριών ανεξάρτητων πειραμάτων? μπαρ, SEM. **

P

& lt?. 0.01

Η

Το p16 /RB και p53 /p21 άξονες είναι δύο μεγάλες γήρανση σχετίζεται με πορείες σε απάντηση σε διάφορες πιέσεις. Δεδομένου ότι το γονίδιο p16 είναι homozygousely διαγράφεται σε κύτταρα 253J [17], πρωτεΐνη ρ16 δεν ήταν ανιχνεύσιμη σε κύτταρα 253J πριν και μετά την επιμόλυνση ROC1 siRNA (Σχ. 4C). Ωστόσο, τόσο η συνολική και φωσφορυλιωμένη Rb επίπεδα πρωτεΐνης δεν είχαν συσσωρευθεί κατά ROC1 knockdown (Εικ. 4C), υποδεικνύοντας ότι ROC1 knockdown προκαλούμενη γήρανση κύτταρο 253J είναι ανεξάρτητη της οδού γονίδιο p16 /RB. Τα στοιχεία μας έδειξαν σημαντική αυξητική ρύθμιση των πρωτεϊνών p53 και p21 στα κύτταρα siROC1 σε 96 ώρες και 120 ώρες μετά από ROC1 siRNA επιμόλυνση (Εικ. 4C), και

p53

μαζί με το

p21

mRNA προς τα πάνω ρύθμιση παρατηρήθηκαν επίσης με τη χρήση ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (Εικ. 4D). τρέχοντα δεδομένα μας έδειξαν ότι η οδός γονίδιο p53 /p21 μεσολάβηση των συνεπειών της ROC1 knockdown σε γήρανση κύτταρο καρκίνου της ουροδόχου κύστης, εφόσον τα κύτταρα 253J δεν εκφράζουν ρ16, αλλά έχουν ένα άγριου τύπου ρ53, ενώ 5.637 κύτταρα εξέφρασαν μεταλλαγμένο ρ53.

επιδράσεις της ROC1 Νοκ ντάουν στην αναστολή των όγκων ανάπτυξη των κυττάρων μέσω της έκφρασης p21

για να εξετάσει κατά πόσον p21 έχει συσσωρευτεί τόσο G2 σύλληψη και γήρανση που προκαλείται από ROC1 νοκ ντάουν, προσδιορίσαμε περαιτέρω τον ρόλο της p21 στη διαμεσολάβηση των επιπτώσεων της ROC1 siRNA σχετικά με τη ρύθμιση της ανάπτυξης των κυττάρων καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι η ταυτόχρονη κατάργηση της ρ21 και ROC1 χρησιμοποιώντας siRNAs σημαντικά εξασθενημένων έκφραση της πρωτεΐνης ρ21 (Σχήμα 5Α & amp?. Β) και εξασθενημένα αναστολή ανάπτυξης κυττάρων που προκλήθηκε από ROC1 knockdown τόσο 253J και 5637 κύτταρα (Σχ 5C & amp?. D). Σε κύτταρα 253J, χρώση SA-β-Gal έδειξε ότι knockdown έκφρασης p21 μείωσε το ρυθμό του ROC1 siRNA που προκαλείται κυτταρική γήρανση (Σχ. 5Ε), ενώ σε 5637 κύτταρα, ROC1 σίγασης που επάγεται G2-M σύλληψης ήταν σημαντικά μειώθηκε κατά p21 knockdown (Εικ. 5F).

253J και 5637 κύτταρα επιμολύνθηκαν με την υποδεικνυόμενη siRNA για 96 ώρες, και υποβλήθηκε σε στύπωμα Western αναλύσεις (Α και Β), δοκιμασία CCK8 (C και D), γήρας αναλύσεις με Α.Ε. χρώση β-gal (Ε), και ανάλυση FACS με χρώση ΡΙ (F). Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα τριών ανεξάρτητων πειραμάτων φαίνονται. Στήλες, σημαίνει τριών ανεξάρτητων πειραμάτων? μπαρ, SEM. **

P

& lt? 0,01 και ***

P

& lt?. 0.001

Η

Επιδράσεις της ROC1 siRNA σχετικά με τον κανονισμό του 5637 κυττάρων Ξενομοσχεύματα σχηματισμό και την ανάπτυξη

Έχουμε έδειξε

in vitro

επιπτώσεις της ROC1 νοκ ντάουν σε κυτταρικές σειρές καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Επιδιώξαμε να επιβεβαιώσει τα στοιχεία αυτά ξενομοσχεύματα γυμνού ποντικού. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6Α & amp? C, ενδοογκική ένεση ΕΤ-ROC1 είχε σαν αποτέλεσμα σημαντική μείωση στο ρυθμό ανάπτυξης των όγκων συγκριτικά με την ομάδα ελέγχου που έλαβαν θεραπεία με LT-CONT (

ρ

& lt? 0,01). χρώση Ανοσοϊστοχημεία του Κί67 έδειξαν ότι ένεση ΕΤ-ROC1 ελαττωμένη γυμνούς ποντικούς ξενομοσχευμάτων πολλαπλασιασμό (Σχ. 6Β). Το βάρος του όγκου σε ξενομοσχεύματα LT-ROC1 ήταν σημαντικά χαμηλότερη από εκείνη της ομάδας LT-CONT (

ρ

& lt? 0,05). δεδομένα κηλίδα Western έδειξε ότι η πρωτεΐνη ρ21 ρυθμίζεται αυξητικά στην ομάδα ένεση ΕΤ-ROC1 (Σχ. 6Ε).

Α, Αντιπροσωπευτικές φωτογραφίες των όγκων απομονώνονται από γυμνούς ποντικούς σε κάθε ομάδα 7 εβδομάδες μετά την έγχυση του LTR και LTC. Β, IHC χρώση ξενομοσχευμάτων ιστών με την υποδεικνυόμενη αντίσωμα σε αμφότερες τις ομάδες. Γ και Δ, καμπύλη αύξησης του όγκου (Γ) και το βάρος του όγκου (D) και στις δύο ομάδες. Ε, ROC1 και ρ21 πρωτεΐνης σε εκχυλίζεται πρωτεΐνη από ξενομοσχεύματα σε αμφότερες τις ομάδες καθορίστηκαν χρησιμοποιώντας στύπωμα Western αναλύσεις. Στο τέλος των πειραμάτων, οι ιστοί του όγκου αποκόπηκαν από κάθε ποντίκι και ζυγίστηκε. Στήλες, μέσο βάρος των όγκων 5 από μεμονωμένα ποντίκια σε κάθε ομάδα? μπαρ, SEM. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01 και ***

P

& lt?. 0.001

Η

Συζήτηση

στην παρούσα μελέτη, ανέφερε ότι ROC1 πρωτεΐνη υπερεκφράζεται σε 112 δείγματα ιστών καρκίνου της ουροδόχου κύστης και 6 κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς και τα κύτταρα. Knockdown έκφρασης ROC1 ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων της ουροδόχου κύστης και διακοπή κύκλου που επάγεται G2 κυττάρου και ρ53-εξαρτώμενη κυτταρική γήρανση. Μοριακά, νοκ ντάουν της έκφρασης ROC1 υπερέκφραση του p21, p27, κυκλίνη Β1 και πρωτεΐνες Cdc2. ROC1 knockdown επαγόμενη 253J κύτταρα γήρανση ήταν διαμεσολαβούνται μέσω της οδού του γονιδίου ρ53 /ρ21, και knockdown της έκφρασης p21 μερικώς διασωθεί ROC1 knockdown επαγόμενη αναστολή της ανάπτυξης του καρκίνου στα κύτταρα BTCC. γυμνό ξενομοσχεύματος ποντικού μας αναλύει περαιτέρω επιβεβαίωσε

in vitro

δεδομένων μας. Τα τρέχοντα δεδομένα υποδεικνύουν ότι ROC1 παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη του καρκίνου της ουροδόχου κύστης, και στόχευση ROC1 πρωτεΐνη είναι ένας δυνητικός αντικαρκινικός στρατηγική για τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης.

Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ROC1 υπερέκφραση σε διάφορους καρκίνους και που σχετίζονται με την εξέλιξη του όγκου [15], [18]. Στην παρούσα μελέτη, επιβεβαίωσε αυτά τα δεδομένα στην κύστη καρκινικούς ιστούς και κυτταρικές σειρές. Εκτιμήσαμε περαιτέρω το ρόλο των ROC1 πρωτεΐνης στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης από knockdown έκφρασης πρωτεΐνης ROC1 σε δύο διαφορετικές κυτταρικές σειρές καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Δείξαμε ότι ROC1 νοκ ντάουν ανέστειλε την ανάπτυξη του καρκίνου της ουροδόχου κύστης κυττάρων

in vitro

και

in vivo

. Μηχανιστικά, ROC1 νοκ ντάουν που προκαλείται από τον κυτταρικό κύκλο σύλληψη φάση G2 και κυτταρική γήρανση σε κυτταρικές σειρές καρκίνου της ουροδόχου κύστης.

κυτταρικού κύκλου φάση G2-M είναι ένα κοινό μηχανισμό κυτταρικού κύκλου σημείο ελέγχου σε απάντηση στις εξωτερικές πιέσεις και επαγωγή της G2-M σύλληψη είναι μια χρήσιμη στρατηγική στη θεραπεία διαφόρων καρκίνων του ανθρώπου [19]. Μοριακά, Cdc2 κινάσης και κυκλίνης Β1 αποτελούν φάσης Μ παράγοντα προώθησης (MPF) που ελέγχουν G2-M μετάπτωσης και την εξέλιξη της φάσης Μ [20], δραστικότητα κινάσης των οποίων ρυθμίζεται αρνητικά από CDK-αναστολείς (CDKIs, όπως ρ21, ρ27) και ανασταλτική κινάσες Cdc2 (όπως WEE1) [21]. Στην παρούσα μελέτη μας βρήκαμε ότι ROC1 νοκ ντάουν εντυπωσιακά που προκαλείται G2-M σύλληψης προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης της κυκλίνης Β1 /πρωτεΐνη Cdc2 και στις δύο 5637 και 253J κύτταρα. Επιπλέον, πρόσθετα δεδομένα μας έδειξαν ότι ROC1 νοκ ντάουν συνελήφθη καρκινικά κύτταρα της ουροδόχου κύστης σε φάση G2, αν και οι προσδιορισμένοι μηχανισμοί είναι ασαφείς. Η πιθανή εξήγηση μπορεί να είναι ότι ROC1 νοκ ντάουν που προκαλείται από την αδρανοποίηση CRL που προκάλεσε τη συσσώρευση ορισμένων ειδικών υποστρωμάτων CRL (όπως p21, p27 και WEE1). τρέχοντα δεδομένα μας έδειξαν ότι ROC1 νοκ ντάουν επαγόμενη έκφραση του p21 και p27. Επιπλέον, η κυκλίνη D1, ένα άλλο γνωστό υπόστρωμα CRL [22], ήταν επίσης σημαντικά επάγεται από ROC1 knockdown στις δύο κυτταρικές σειρές. Ωστόσο, εμείς δεν παρατηρούμε σημαντικές αλλαγές στην κυκλίνη D1-συνδέονται σύλληψη φάση G1-S, η οποία μπορεί να είναι από το ROC1 νοκ ντάουν συνελήφθη κύτταρα σε κύτταρα G2-φάση εμποδίζεται η είσοδος στην G0-G1 φάση.

Επιπλέον , έχουμε αποκάλυψε επίσης ότι ROC1 νοκ ντάουν που προκαλείται από ρ53 άγριου τύπου κύστης κύτταρα καρκίνου 253J σε γήρανση μέσω p53-εξαρτώμενο τρόπο. Η επαγωγή της κυτταρικής γήρανσης θεωρήθηκε ως σημαντικό μηχανισμό καταστολής του όγκου [23], [24]. Διάφορες καταπονήσεις (όπως δυσλειτουργία των τελομερών, ογκογονίδιο ενεργοποίησης, βλάβης του DNA, και άλλα ερεθίσματα) μπορούν όλα κινήσει κυτταρικής γήρανσης [23]. Γήρανση διαμεσολαβείται κυρίως από μονοπάτια καταστολέα δύο όγκων: ρ53 /ρ21 και ρ16 /pRB [23], [24]. Η τρέχουσα μελέτη έδειξε ότι ROC1 knockdown επάγεται σημαντική κυτταρική γήρανση σε ρ53 κυττάρων 253J άγριου τύπου, αλλά δεν προκάλεσε p53 μεταλλαγμένα 5637 κύτταρα. Περαιτέρω, ο αποκλεισμός του μονοπατιού ρ53 /ρ21 με knockdown της έκφρασης p21 σημαντικά ανακουφίζονται ROC1 knockdown προκαλούμενη γήρανση. Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι ROC1 knockdown προκαλούμενη γήρανση συνδέεται με μια λειτουργική μονοπάτι ρ53 /ρ21. Ωστόσο, Jia et al. έδειξαν ότι ROC1 knockdown προκαλούμενη γήρανση του τραχήλου της μήτρας καρκινικές κυτταρικές γραμμές σε ένα ρ53- πνεύμονα και ή pRB- ανεξάρτητο τρόπο [15]. Μια άλλη παρόμοια ερώτηση είναι αυτό που καθορίζει τα κύτταρα να υποστούν διακοπή κύκλου κυττάρου ή γήρανση ή άλλους τύπους κυττάρων θάνατο. Ο ακριβής μηχανισμός παραμένει άγνωστος, και υποθέτουμε ότι η επιλογή αυτή μπορεί να σχετίζεται με την εξάρτηση από κυτταρική γραμμή (όπως

σ

53 κατάστασης του γονιδίου, η εξειδίκευση των υποστρωμάτων CRL, διάρκεια του στρες, et.al) και η ένταση της εξωτερικής το στρες [25] (όπως είναι η αντιμετώπιση της βλάβης του DNA, οξειδωτικό στρες, et.al). Έτσι, η περαιτέρω μελέτη είναι απαραίτητη για την αποσαφήνιση των καθορισμένων μηχανισμών που ευθύνονται για ROC1 νοκ ντάουν που προκαλείται από την ουροδόχο κύστη θάνατο των καρκινικών κυττάρων.

Επιπλέον, παρατηρήσαμε επίσης ότι ROC1 νοκ ντάουν αναστέλλει την ανάπτυξη του όγκου των 5637 κυττάρων σε

in vivo

nude ξενομόσχευμα ποντίκι με παρόμοιους μηχανισμούς. Διαφορετικά στάδια καρκίνου της ουροδόχου κύστης έδειξε απόκλιση θεραπευτική ανταπόκριση σε ραδιοθεραπεία και χημειοθεραπεία [26]. Ένας καθοριστικός παράγοντας της θεραπευτικής ευαισθησίες είναι

TP53

κατάστασης του γονιδίου [27]. Κύτταρα με δυσλειτουργική πρωτεΐνη ρ53 έδειξαν αυξημένη αντίσταση σε ακτινοθεραπεία ή χημειοθεραπεία λόγω της μειωμένης απόκρισης βλάβη του DNA [3], [26]. Η παρούσα μελέτη έδειξε ότι ROC1 νοκ ντάουν ανέστειλε την ανάπτυξη καρκίνου της ουροδόχου κύστης κυττάρων ανεξάρτητα από την κατάσταση p53. Το αποτέλεσμα αυτό θα μπορούσε να έχει σημαντικό αντίκτυπο για τη θεραπεία του καρκίνου της ουροδόχου κύστης. ROC1 knockdown χρησιμοποιώντας γονίδιο παρεμβολές ή φαρμακολογική αναστολή θα μπορούσε να είναι μια νέα προσέγγιση για την ενίσχυση της ανταπόκρισης της ακτινοθεραπείας και χημειοθεραπείας των ασθενών με καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Έτσι, η περαιτέρω μελέτη θα διερευνήσει τέτοιες προσεγγίσεις στην ελέγχουν αποτελεσματικά τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης.

Εν κατακλείδι, η παρούσα μελέτη έδειξε ότι ROC1 παίζει σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη BTCC, και ROC1 θα μπορούσε να είναι ένα μυθιστόρημα στόχο την καταπολέμηση του καρκίνου στο BTCC. Περαιτέρω μελέτες αποσαφήνιση των λεπτομερών μηχανισμών συμμετοχής ROC1 στο BTCC που απαιτούνται για την επικύρωση των πρωτογενών αποτελεσμάτων μας.